用于治疗炎性关节障碍的钙黏着蛋白-11EC1结构域拮抗剂
阅读：928发布：2024-02-02
专利汇可以提供用于治疗炎性关节障碍的钙黏着蛋白-11EC1结构域拮抗剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 钙 黏着蛋白-11拮抗剂以及包括钙黏着蛋白-11拮抗剂的组合物。本发明还涉及通过给予 治疗 有效量的一种钙黏着蛋白-11拮抗剂来治疗 哺乳动物 受试者体内的炎性关节障碍(例如，类 风 湿性关节炎)的方法。，下面是用于治疗炎性关节障碍的钙黏着蛋白-11EC1结构域拮抗剂专利的具体信息内容。
1.一种分离的抗体，其中所述抗体是由ATCC登录号PTA-9699的杂交瘤H1M1或ATCC登录号PTA-9701的杂交瘤H14产生的整个抗体或其抗原结合片段。
2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中该抗原结合片段是选自下组，其组成为：一种Fab、Fab’、F(ab’)2以及scFv。
3.分离的抗体在制备用于治疗有需要的哺乳动物受试者体内的类风湿性关节炎的药物中的用途，其中所述抗体是由ATCC登录号PTA-9699的杂交瘤H1M1或ATCC登录号PTA-9701的杂交瘤H14产生的整个抗体或其抗原结合片段。
4.如权利要求3所述的用途，其中该哺乳动物受试者是人。
5.如权利要求3所述的用途，其中所述药物是用于全身给药的药物。
6.如权利要求3所述的用途，其中所述药物是用于静脉内给药的药物。
7.如权利要求3所述的用途，其中所述药物是用于通过直接注射到一个关节中来进行给药的药物。
8.如权利要求3所述的用途，其中所述药物还包含一种缓解疾病的抗风湿药。
9.如权利要求8所述的用途，其中该缓解疾病的抗风湿药是甲氨蝶呤。
10.如权利要求3所述的用途，其中所述药物还包含一种抗炎剂。
11.如权利要求10所述的用途，其中该抗炎剂是一种NSAID或类固醇。
12.如权利要求10所述的用途，其中该抗炎剂是一种缓解疾病的抗风湿药物或一种重组蛋白。
13.一种药物组合物，包括一种分离的抗体以及一种药学上可接受的载体，其中所述抗体是由ATCC登录号PTA-9699的杂交瘤H1M1或ATCC登录号PTA-9701的杂交瘤H14产生的整个抗体或其抗原结合片段。
14.如权利要求13所述的药物组合物，进一步包括一种缓解疾病的抗风湿药。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其中该缓解疾病的抗风湿药是甲氨蝶呤。
16.如权利要求13所述的药物组合物，进一步包括一种抗炎剂。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中该抗炎剂是一种NSAID或类固醇。
18.如权利要求16所述的药物组合物，其中该抗炎剂是一种缓解疾病的抗风湿药物或重组蛋白。
19.一种分离的核酸，该核酸编码如权利要求1所述的抗体。
20.一种载体，其包含如权利要求19所述的分离的核酸。
21.一种分离的细胞，该细胞表达如权利要求1所述的抗体。
22.一种表达与哺乳动物钙黏着蛋白-11蛋白的EC1结构域特异性结合的抗体的细胞，其中该细胞是ATCC登录号PTA-9699的杂交瘤H1M1的细胞。
23.一种表达与哺乳动物钙黏着蛋白-11蛋白的EC1结构域特异性结合的抗体的细胞，其中该细胞是ATCC登录号PTA-9701的杂交瘤H14的细胞。
24.一种与哺乳动物钙黏着蛋白-11蛋白的EC1结构域特异性结合的抗体，其中所述抗体由ATCC登录号PTA-9699的杂交瘤H1M1产生。
25.一种与哺乳动物钙黏着蛋白-11蛋白的EC1结构域特异性结合的抗体，其中所述抗体由ATCC登录号PTA-9701的杂交瘤H14产生。
用于治疗炎性关节障碍的钙黏着蛋白-11EC1结构域拮抗
剂
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求了于2008年1月11日提交的美国临时申请号61/010,734的权益。以上申请的全部传授内容都通过引用结合在此。
[0003] 发明背景
[0004] 患有晚期慢性关节炎症的患者忍受着严重的关节退化(包括骨和软骨破坏)，这导致长期疼痛、畸形、关节功能损失、运动减少、并且缩短的寿命。关节炎症与关节中细胞和炎性物质的数量增加相关联，这引起了刺激、软骨的磨损、以及关节内层(joint lining)的肿胀。已知几种不同的自身免疫障碍在关节中触发了不适当的或错误导向的炎症，在遭受这些疾病的个体的关节中导致了慢性炎症。常见的炎性关节障碍(inflammatory joint disorder)包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、莱特尔氏综合征、以及强直性脊柱炎。
[0005] 类风湿性关节炎(RA)是最常见的炎性关节炎形式，并且据估计影响美国大约1％的人口、或大约210万美国人。RA是一种慢性病，其特征在于关节的内层、或滑膜的炎症，并且随着时间可以导致显著的骨和软骨的损害。与男性相比，RA在女性中更为常见，并且多达3％的女性在她们的一生中可能发展成类风湿性关节炎。目前，RA的病因是未知的。
[0006] RA可以导致长期的关节损害，这造成了慢性疼痛、功能损失以及失能。此外，最近的研究表明患有RA的人、特别是那些疾病没有被很好控制的人，可能具有更高的心脏病和中风的风险。因此，RA是一种主要的国家健康负担，并且对于开发用于防止和治疗类风湿性关节炎、以及其他炎性关节障碍的新型药剂存在着一种迫切的需要。
[0007] 发明概述
[0008] 在一个实施方案中，本发明涵盖了：一种钙黏着蛋白-11拮抗剂，该钙黏着蛋白-11拮抗剂特异性地结合到一种哺乳动物钙黏着蛋白-11蛋白的一个细胞外结构域(EC1)上，并且抑制了表达该哺乳动物钙黏着蛋白-11的细胞的聚集。在一个具体的实施方案中，该钙黏着蛋白-11拮抗剂是一种抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，该钙黏着蛋白-11拮抗剂是一种融合蛋白，该融合蛋白包括一种钙黏着蛋白-11蛋白的EC1结构域(例如，SEQ ID NO：3)。
[0009] 在另一个实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物受试者(例如，人)体内的炎性关节障碍的多种方法。该方法包括对该哺乳动物受试者给予本发明的治疗有效量的一种钙黏着蛋白-11拮抗剂，由此在该哺乳动物中产生一种令人希望的治疗效应。在一种具体的实施方案中，本发明的这些方法可用于治疗类风湿性关节炎。
[0010] 在另一个实施方案中，本发明涵盖了一种药物组合物，该药物组合物包括本发明的一种钙黏着蛋白-11拮抗剂以及一种药学上可接受的载体。在一个实施方案中，该药物组合物进一步包括一种第二试剂，如，一种缓解疾病(disease-modifying)的抗风湿药或抗炎剂。
[0013] 图1A是一种蛋白质印迹，示出了使用抗Cad-11抗体23C6、13C2、以及27F3来检测钙黏着蛋白-11-EC1-5-Fc融合蛋白(见实心箭头)。这些抗体并未识别也存在于该膜上的钙黏着蛋白-11-EC1-Fc以及钙黏着蛋白-11-EC1/2-Fc融合蛋白(见空心箭头，指出在该印迹上钙黏着蛋白-11-EC1-Fc以及钙黏着蛋白-11-EC1/2-Fc蛋白的位置)。
[0014] 图1B是一个图示，描绘了公布的钙黏着蛋白-11抗体13C2、23C6、以及5F82与人类Cad-11-EC1-5-Fc融合蛋白(而非Cad-11-EC1-Fc融合 蛋白)的结合，正如通过ELISA所确定。相比之下，EC1抗体H1M1与Cad-11-EC1-Fc融合蛋白以及Cad-11-EC1-5-Fc融合蛋白这两者相结合。
[0015] 图2是涉及到钙黏着蛋白结合的人类Cad-11的EC1结构域的前34个氨基酸(SEQ ID NO：3)、MN-Cad的EC1结构域的前34个氨基酸(SEQ ID NO：4)、以及Cad-8(SEQ ID NO：5)的EC1结构域的前34个氨基酸的氨基酸序列比对。包含延伸至一种钙黏着蛋白反受体的口袋中的多个残基的供体序列是通过在序列的左侧一半作下划线来表示的，并且该口袋序列的多个残基是通过在SEQ ID NO：3中的序列的右侧一半作下划线来表示的。
[0016] 图3是一个图示，描绘了一种钙黏着蛋白-11-结合Fab与一种人类Cad-11-EC1结构域肽、连同Cad-11-EC1-Fc融合蛋白(而非Cad-8或MN-Cad EC1结构域肽)的结合，正如通过ELISA所确定。克隆7证明了显著结合到Cad-11EC1结构域肽以及融合蛋白上，而非MN-Cad或Cad-8EC1结构域肽。
[0017] 图4是一个图示，描绘了来自体外Cad-11细胞聚集测定的数据。加入到培养基中的Cad-11拮抗剂(如，由抗Cad-11抗体13C2制备的一种Fab)、或不同浓度的抗钙黏着蛋白-11EC1Fab(它针对钙黏着蛋白-11的EC1结构域的前35个氨基酸)(被指定为EC1Fab克隆7)阻止了Cad-11介导的431-D-11细胞的聚集。抗钙黏着蛋白-11EC1Fab(克隆7)在所有测试浓度(在0.3μg/ml至10μg/ml的范围内)下抑制了一种431-D-11表皮样癌细胞的聚集。相比之下，由13C2抗钙黏着蛋白-11抗体制备的Fab仅在10μg/ml的浓度下抑制细胞的聚集。
[0018] 图5是一个图示，描绘了来自第二种体外Cad-11细胞聚集测定的数据。431-D-11细胞的聚集百分率是在加入SME培养基(被指定为对照)、不同浓度的一种融合蛋白(包括融合至人类IgG2铰链域、CH2以及CH3结构域上的Cad-11的EC1结构域)(被指定为Cad-11-EC1-Fc)、不同浓度的一种抗钙黏着蛋白-11EC1Fab(它针对钙黏着蛋白-11的EC1结构域的前35个氨基酸)(被指定为Cad-11EC1Fab)、或不同浓度的一种 对照抗绿色荧光蛋白(抗-GFP)Fab(被指定GFPfAb)之后40分钟示出的。抗钙黏着蛋白-11EC1Fab(克隆7)在3μg/ml、1μg/ml、以及0.1μg/ml的浓度下抑制了表达Cad-11的431-D-11细胞的聚集。EC1-Fc融合蛋白在3μg/ml的浓度下抑制了431-D-11细胞的聚集。相比之下，抗-GFP Fab在任何这些测试浓度下都没有显著地抑制细胞的聚集。
[0019] 图6是一个图示，描绘了通过不同的抗钙黏着蛋白-11EC1Fab来抑制Cad-11介导的细胞聚集，这些抗钙黏着蛋白-11EC1Fab具有对于单独的Cad-11(EC1fAb克隆7以及克隆4)、Cad-11与Cad-8(EC1fAb克隆6)、或Cad-11与MN-Cad(EC1fAb克隆5)的结合特异性，这是使用体外细胞聚集测定来进行的。相对于对照物(D-11SME；左柱)所测试的所有Fab抑制了431-D-11细胞的聚集。
[0020] 图7是一个图示，描绘了通过抗-Cad-11Fab来抑制Cad-11介导的细胞的聚集，这些抗-Cad-11Fab具有对于单独的Cad-11(EC1fAb克隆7)、或Cad-11与MN-Cad(EC1fAb克隆8)的结合特异性，这是使用体外细胞聚集测定来进行的。所测试的这些Fab的特异性在每种Fab名称旁边的括号中示出。相对于对GFP特异性的对照Fab(左柱)，这两种钙黏着蛋白特异性Fab均抑制了细胞聚集(中间柱和右柱)。
[0021] 图8显示人类Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1融合蛋白(Cad-11-EC1-Fc)的核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NO：6)。这种人类钙黏着蛋白-11胞外域的序列以斜体字显示，Bg1II位点是加下划线的，并且对这种人类IgG2-Fc1区域进行编码的序列以黑体字母显示。
[0022] 图9示出了人类Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1融合蛋白(Cad-11-EC1-Fc)的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。这种人类钙黏着蛋白-11胞外域的序列以斜体字显示，由Bg1II位点编码的序列是加下划线的，并且这种人类IgG2-Fc1区的序列以黑体字母显示。
[0023] 图10是已经用考马斯蓝染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶的图像，它对应地示出了对应于纯化的Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1(中间泳道)以及Cad-11-EC1/2-hIgG2-Fc1(右侧泳道)融合蛋白的单体形式的主导强条带，之后使用蛋白A柱从细胞培养基中纯化。分子量标准显示在左侧泳 道中。
[0024] 图11是蛋白质印迹，示出了使用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗人IgG抗体来检测人类Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1(中间泳道)以及Cad-11-EC1/2-hIgG2-Fc1(右侧泳道)融合蛋白。在每个泳道中所观察到的主导条带对应于这些融合蛋白的单体形式的位置。这些融合蛋白的二聚体形式的位置由于不完全的还原条件也是可见的(见不太强的更高的分子量条带)。分子量标准显示在左侧泳道中。
[0025] 图12是一个图示，描绘了与未经处理的细胞相比Cadd-11-EC1-Fc融合蛋白以及小鼠抗-Cad-11抗体13C2在所指示的浓度下抑制了表达Cad-11的人类成纤维细胞样滑膜细胞侵入到基质胶塞中，标记为侵入。数据是从两个独立实验汇集的。
[0026] 图13A和B是图示，描绘了来自两种体外Cad-11细胞聚集测定的数据。表达Cad-11的431-D-11细胞的聚集百分率是在加入SME培养基(被指定为对照)或一种Cad-11融合蛋白之后40分钟而示出的。图13A示出了在不同浓度的一种融合蛋白(包括融合至人类IgG 2铰链域、CH2以及CH3结构域上的Cad-11的5个胞外域)(被指定为Cad-11-EC1-5-Fc)的存在下对聚集的抑制。图13B示出了不同浓度的一种融合蛋白(包括融合至人类IgG2铰链域、CH2以及CH3结构域的Cad-11的N端胞外域(EC1结构域))(被指定为Cad-11-EC1-Fc)、或Cad-11-EC1-5-Fc)对聚集的抑制。
[0027] 图14A至C示出了人类钙黏着蛋白-11cDNA序列(SEQ ID NO：1；见Genbank登记号NM 001797)。
[0028] 图15示出了人类钙黏着蛋白-11蛋白序列(SEQ ID NO：2；见Genbank登记号NP001788)。
[0029] 图16是一个图示，描绘了在来自肽4杂交瘤(HL)的培养基、或对照杂交瘤培养基(Media)中的抗体与包含Cad-11、Cad-8、或MN-Cad的EC1-2结构域的蛋白的结合水平，正如通过ELISA所确定。
[0030] 图17A至C是代表性的图示，描绘了细胞染色的强度(MFI；平均荧光强度)作为H14抗体与表达Cad-11-的431-D-11细胞的结合的一种量度。
[0031] 图17D至F是代表性的图示，描绘了相对于图17A至C、431-D细胞染色的缺失(MFI；平均荧光强度)，这表明H14抗体与Cad-11阴性细胞的结合的缺乏。
[0032] 图17G至I是代表性的图示，描绘了细胞染色的强度(MFI；平均荧光强度)作为H1M1抗体与表达Cad-11-的431-D-11细胞的结合的一种量度。
[0033] 图18A是一个图示，描绘了在不同浓度的抗体下H14抗体与表达Cad-11-的细胞的结合、以及H14与Cad-11阴性对照细胞结合的缺失，正如由细胞染色的强度(MFI；平均荧光强度)所测量。
[0034] 图18B是一个图示，描绘了在不同浓度的抗体下H1M1抗体与表达Cad-11-的细胞的结合、以及H1M1与Cad-11阴性对照细胞结合的缺失，正如由细胞染色的强度(MFI；平均荧光强度)所测量。
[0035] 图19A是一个图示，描绘了在不同的抗体浓度下H14抗Cad-11抗体与Cad-11以及Cad-8EC1结构域肽的结合程度，正如通过ELISA所确定。
[0036] 图19B是一个图示，描绘了在不同的抗体浓度下H14抗Cad-11抗体与Cad7、MNCad、Cad9、Cad18、Cad20、或Cad24EC1结构域肽的结合的缺失，正如通过ELISA所确定。
[0037] 图20是一个图示，描绘了在不同的抗体浓度下H1M1抗Cad-11抗体与Cad-11以及Cad-8EC1结构域肽的结合，正如通过ELISA所确定。
[0038] 图21A是一个图示，描绘了H1M1抗Cad-11抗体与不同的Cad-11EC1结构域肽免疫原(PEP1、PEP2、PEP3、以及PEP4)、连同Cad-11EC1结构域融合蛋白(EFL)以及人类IgG对照(Fc段)(Fc block)的结合程度，正如通过ELISA所确定。
[0039] 图21B是一个图示，描绘了H14抗Cad-11抗体与不同的Cad-11EC1结构域肽免疫原(PEP1、PEP2、PEP3、以及PEP4)、连同Cad-11EC1 结构域融合蛋白(EFL)以及人类IgG对照(Fc段)的结合程度，正如通过ELISA所确定。
[0040] 图22个是一种示意图，描绘了人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域的前37个氨基酸的序列、以及由肽1-4中的每一个所涵盖的这种序列的部分。肽3上游的由肽2和4共有的氨基酸残基在加框区中被加强显示。直接参与Cad-11与Cad-11结合的多个氨基酸是加下划线的。
[0041] 图23A是一个照片，示出了用一种对照同种型抗体处理的聚集的表达Cad-11的细胞大块。
[0042] 图23B是一个照片，示出了H1M1处理的表达Cad-11-的细胞小簇，这些细胞小簇未发展形成在图23A中所观察到的大块。
[0043] 图23C是一个照片，示出了未经处理的亲本Cad-11阴性细胞保持为单细胞群或双细胞群。
[0044] 图23A是一个照片，描绘了表达Cad-11的细胞的培养物，该培养物具有聚集的细胞大块。
[0045] 图23B是一个照片，描绘了在用H14Cad-11EC1结构域抗体处理之后表达Cad-11的细胞的培养物，该培养物主要具有单细胞，这些单细胞相对于在图24A中所示的细胞具有小而稀少的细胞簇。
[0046] 图25是一个图示，描绘了与未经处理的对照小鼠相比在用增加剂量的H1M1抗Cad-11抗体处理的小鼠中对与关节炎相关的关节肿胀的抑制。
[0047] 图26是一个图示，描绘了与未经处理的对照小鼠相比在每隔一天用0.3mg的H14或H1M1抗Cad-11抗体处理的小鼠中对与关节炎相关的关节肿胀的抑制。
[0048] 图27是一个图示，示出了与未经处理的对照物相比在小鼠模型中用0.3mg的H1M1或H14抗体进行处理延迟了关节炎的发展。
[0049] 图28是一个图示，描述了来自肽3杂交瘤的培养基(HL)或对照杂交瘤培养基(Media)、包含抗体的培养基与Cad-11、Cad-8、以及MN-钙黏着蛋白、或Cad-11EC1-Fc融合蛋白的EC1-2结构域的结合程度。
[0050] 图29是一个图示，描绘来自这些肽3杂交瘤的抗Cad-11抗体与表达人类Cad-11蛋白的细胞(见箭头)以及表达Neos、未表达Cad-11的对照细胞的结合程度。
[0051] 发明详细说明
[0052] 定义
[0053] 如在此所使用的，术语“钙黏着蛋白-11”、“Cad-11”、以及“OB-钙黏着蛋白”是指一种自然发生的或内源性钙黏着蛋白-1((例如，哺乳动物，例如人类)蛋白，并且指具有一种氨基酸序列的多个蛋白，该氨基酸序列与自然发生的或内源性钙黏着蛋白-11蛋白的氨基酸序列相同(例如，重组蛋白、合成的蛋白)。因此，术语“钙黏着蛋白-11”、“Cad-11”、以及“OB-钙黏着蛋白”(它们在此是可互换使用的)包括一种钙黏着蛋白-11蛋白(例如，哺乳动物、人类)的多态的或等位基因的变体以及其他同种型，它们是通过(例如)在哺乳动物(例如人类、非人的灵长类)中自然发生的替代性剪接或其他细胞加工所产生的。优选地，这种钙黏着蛋白-11蛋白是一种人类蛋白，该蛋白具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列(见Genbank登记号NP001788和图15)。
[0054] 如在此所定义的，一种“钙黏着蛋白-11拮抗剂”是一种试剂(例如，抗体、融合蛋白、肽、模拟肽、小分子、核酸)，该试剂特异性地结合到一种钙黏着蛋白-11蛋白的一个EC1结构域上并且在细胞中抑制(例如，减少、防止)一种或多种钙黏着蛋白-11-介导的活性。钙黏着蛋白-11-介导的活性包括但不限于：一种钙黏着蛋白-11蛋白以一种同型方式与一种或多种其他钙黏着蛋白-11蛋白的结合、表达钙黏着蛋白-11的细胞的聚集、酶(例如，胶原酶、丝氨酸蛋白酶、MMP1、MMP3、MMP13)的表达或活性的诱导、以及细胞因子或生长因子(例如，IL-6、IL-8、或RANKL、或TRANCE)的诱导。在一个实施方案中，该钙黏着蛋白-11拮抗剂可以抑制一种钙黏着蛋白-11蛋白与一种或多种其他钙黏着蛋白-11蛋白的结合，这是通过(例如)阻断在一种Cad-11蛋白(例如，在一种细胞的表面上表达的一种Cad-11蛋白)的EC1结构域中的供体 序列与一个或多个其他Cad-11蛋白(例如，在另一种细胞的表面上表达的一种或多种Cad-11蛋白)的EC1结构域中的口袋序列之间的相互作用来进行的。
[0055] 如在此所使用的，“特异性地结合”到一种钙黏着蛋白-11蛋白的一个EC1结构域上的钙黏着蛋白-11拮抗剂是指一种钙黏着蛋白-11拮抗剂，该钙黏着蛋白-11拮抗剂以一种亲和力(例如，一种结合亲和力)结合到(例如，在生理条件下)一种钙黏着蛋白-11蛋白的一个EC1结构域上，该亲和力比该钙黏着蛋白-11拮抗剂结合到另一种钙黏着蛋白蛋白(例如，MN--钙黏着蛋白、钙黏着蛋白-8)的一个EC1结构域上的亲和力大至少约5倍、优选至少约10倍。在一种具体的实施方案中，特异性地结合到一种钙黏着蛋白-11蛋白的一个EC1结构域上的钙黏着蛋白-11拮抗剂以一种亲和力与一种表位相结合，该表位存在于SEQ IDNO：3、人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域的N端部分中，该亲和力比该钙黏着蛋白-11拮抗剂与存在于SEQ ID NO：4、人类MN钙黏着蛋白的EC1结构域的N端部分中的一种表位相结合的亲和力以及该钙黏着蛋白-11拮抗剂与存在于SEQ ID NO：5、人类钙黏着蛋白-8的EC1结构域的N端部分中的一种表位相结合的亲和力大至少约5倍、优选至少约10倍。
[0056] 如在此使用的，术语“抗体”旨在涵盖整个抗体以及抗体片段(例如，抗体的抗原结合片段，例如Fv、Fc、Fd、Fab、Fab′、F(ab′)、以及dAb片段)。“抗体”是指多克隆和单克隆抗体，并且包括自然发生的以及工程化处理的抗体。因此，术语“抗体”包括例如：人类的、嵌合的、人源化的、灵长源化的(primatized)、镶饰的(veneered)、单链的、以及结构域抗体(dAb)。(参见例如Harlow et al.，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
[0057] 术语“表位”是指由一种免疫球蛋白VH/VL对常规地结合的一种结构单元。一种表位限定了对一种抗体的最小结合部位，并且因此代表一种抗体的靶特异性。
[0058] 术语“融合蛋白”是指一种自然发生的、合成的、半合成的、或重组的单一蛋白分子，该蛋白分子包括两种或多种异源多肽的的全部或一部分。
[0059] 术语“多肽”是指一种氨基酸聚合体，而没有特定的长度；因此，肽、低聚肽、以及蛋白是包括在一种多肽的定义之内的。
[0060] 如在此所使用的，术语“肽”是指一种化合物，该化合物由从大约2个至大约100个氨基酸残基组成，其中一个氨基酸的氨基基团是通过一种肽键而连接至另一种氨基酸的羧基基团上的。此类肽在长度上典型地是小于约100个氨基酸残基，并且优选为约10、约20、约30、约40、或约50个残基。
[0061] 如在此使用的，术语“模拟肽”是指多种分子，这些分子不是肽或蛋白、但是它们模拟了这些肽或蛋白的结构的多个方面。模拟肽拮抗剂可以是通过常规的化学方法来制备的(参见，例如Damewood J.R.“Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry”in Reviews in Computational Biology，2007，Vol.9，pp.1-80，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1996；Kazmierski W.K.，“Methods of Molecular Medicine：Peptidomimetic Protocols，”Humana Press，New Jersey，1999)。
[0062] 如在此所定义的、“治疗”是将一种具体的治疗性或预防性(prophalytic)试剂给予受试者(例如，一种哺乳动物、人)，这产生了对于该受试者的一种令人希望的治疗性或预防性益处。
[0063] 如在此所定义的，一种“治疗方案”是一种方案，其中将一种或多种治疗性或预防性试剂以一种具体的剂量(例如，水平、量值、数量)并且在一种具体的时间表上或以具体的间隔(例如，数分钟、数天、数周、数月)给予哺乳动物受试者。
[0064] 如在此所定义的，一种“治疗有效量”是一种量值，该量值足以在给药条件下达到所希望的治疗性或预防性效应，例如足以在一个关节中抑制(即降低、防止)炎症(例如，通过抑制细胞(例如，表达钙黏着蛋白-11的滑膜细胞)的聚集)的一种量值。一种治疗效力(例如，在 一个关节中降低炎症和/或在一个关节中防止炎症)可以是通过适当的方法(例如，成像方法，如MRI、NMR、CT)来确定的。
[0065] 钙黏着蛋白
[0066] 钙黏着蛋白属于Ca2+依赖性黏附分子大家族，这些分子以一种同型的方式通过结合到其他钙黏着蛋白上而介导了细胞黏附(MJ Wheelock and KR Johnson，Ann.Rev.Cell Dev.Biol.19：207-235(2003))。经典的钙黏着蛋白是单次跨膜蛋白质，它们含有五个细胞外钙黏着蛋白(EC)结构域(每个的长度大约为110个氨基酸)、一个跨膜区、以及一个保守的胞质域。钙黏着蛋白基于在这些EC结构域之间的同源性程度而被分成I型或II型钙黏着蛋白。II型钙黏着蛋白包括人类钙黏着蛋白-5、-6、-8、-11、以及-12、以及MN-钙黏着蛋白。这些胞外域中的每一个在介导细胞间结合中的作用的相对重要性是不清楚的。
[0067] 钙黏着蛋白-11在滑膜细胞中的活性
[0068] 钙黏着蛋白-11在可活动的关节的滑液内层中介导了滑膜细胞与滑膜细胞的结合(Valencia et al.，J.Exp.Med.200(12)：1673-1679(2004)；Kiener and Brenner，Arthritis Res Ther.7(2)：49-54(2005))。一种融合蛋白(该融合蛋白包括人类钙黏着蛋白-11的所有五种细胞外钙黏着蛋白结构域、融合至人类IgG2的铰链-CH2-CH3结构域上)在体外抑制了滑膜细胞内层的形成(Kiener et al.，Am.J.Pathol.168(2006))。另外，拮抗性的抗钙黏着蛋白-11抗体以及一种融合蛋白(包括鼠钙黏着蛋白-11的EC1-5、融合至鼠IgG2a的铰链-CH2-CH3结构域上)在类风湿性关节炎的鼠模型中抑制了炎症和关节肿胀(Lee et al.，Science 315：1006-1010(2007))。
[0069] 钙黏着蛋白-11拮抗剂
[0070] 本发明的一种钙黏着蛋白-11拮抗剂可以是特异性地结合到一种钙黏着蛋白-11蛋白的一个EC1结构域上、并且在细胞中抑制(例如，减 少、防止)一种或多种钙黏着蛋白-11-介导的活性的任何试剂。钙黏着蛋白-11-介导的活性包括但不限于：在细胞表面上表达钙黏着蛋白-11的细胞的聚集、以及多种因子(例如像，胶原酶、丝氨酸蛋白酶、MMP1、MMP3、IL-6、IL-8、或RANKL/TRANCE)的表达或分泌。该试剂除其他之外还可以是一种抗体、融合蛋白、肽、模拟肽、小分子、或核酸。
[0071] 钙黏着蛋白-11抗体
[0072] 如在此所说明的，与人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域的N端部分(它包括Cad-11的供体序列和钙黏着蛋白结合口袋)(例如SEQ IDNO：3)内的一种表位相结合的抗体与结合到这种蛋白的其他区域中的表位的抗体相比，在体外更加有效地阻断了钙黏着蛋白-11活性(见实例1和2)。
[0073] 因此，在一个实施方案中，本发明提供看一种抗体或它的抗原结合片段，它与一种表位相结合(例如，特异性地结合)，该表位存在于一种钙黏着蛋白-11蛋白的EC1结构域的N端部分中，该部分包括Cad-11的供体序列和钙黏着蛋白结合口袋。术语“抗体”旨在涵盖所有类型的多克隆和单克隆抗体(例如，人类的、嵌合的、人源化的、灵长源化的、镶饰的、单链、结构域抗体(dAb))、以及抗体的抗原结合片段(例如Fv、Fc、Fd、Fab、Fab′、F(ab′)、dAb)。(参见，例如Harlow et al.，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。在一种具体的实施方案中，这种Cad-11EC1结构域特异性抗体是一种人类抗体或人源化抗体。Cad-11EC1结构域特异性抗体还可以被直接或间接地连接至一种细胞毒剂上。
[0074] 特异性地结合到一种Cad-11蛋白的EC1结构域的N端部分上并且抑制该Cad-11蛋白活性的其他抗体或抗体片段还可以通过常规的方法或其他适用的技术来进行生产、构建、工程化处理、和/或分离。例如，对于一种钙黏着蛋白-11的EC1结构域特异的抗体可以对抗一种适当的免疫原而产生，例如一种重组哺乳动物(例如，人类)钙黏着蛋白-11EC1结构域肽(例如SEQ ID NO：3)或它的一部分(包括合成分子，例如合 成肽)。已经说明了不同的方法(参见，例如Kohler et al.，Nature，256：495-497(1975)以及Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Milstein et al.，Nature 266：550-552(1977)；Koprowski et al.，U.S.Patent No.4,172,124；Harlow，E.and D.Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY)；Current Protocols In Molecular Biology，Vol.2(Supplement 27，Summer′94)，Ausubel，F.M.et al.，Eds.，(John Wiley & Sons：New York，NY)，Chapter 11，(1991))。抗体还可以通过用表达钙黏着蛋白-11的EC1结构域的细胞(例如，癌细胞/细胞系)或被工程化处理为表达钙黏着蛋白-11的EC1结构域的细胞(例如，转染的细胞)对一种适当的宿主(例如，小鼠)进行免疫而产生。(参见，例如Chuntharapai et al.，J.Immunol，152：1783-1789(1994)；
Chuntharapai等的美国专利号5,440,021)。为了生产单克隆抗体，可以通过将一种适当的无限增殖性细胞系(例如，一种骨髓瘤细胞系，如SP2/0或P3X63Ag8.653)与产生抗体的细胞进行融合而产生一种杂交瘤。这些产生抗体的细胞可以是从用所感兴趣的抗原进行免疫的人或其他适当的动物的外周血、或优选脾或淋巴结而获得的。这些融合的细胞(杂交瘤)可以是使用选择性培养条件来分离的，并且通过有限稀释而被克隆。具有所希望的特异性的、产生抗体的细胞可以通过一种适当的测定来进行选择(例如，ELISA)。
Chuntharapai等的美国专利号5,440,021)。为了生产单克隆抗体，可以通过将一种适当的无限增殖性细胞系(例如，一种骨髓瘤细胞系，如SP2/0或P3X63Ag8.653)与产生抗体的细胞进行融合而产生一种杂交瘤。这些产生抗体的细胞可以是从用所感兴趣的抗原进行免疫的人或其他适当的动物的外周血、或优选脾或淋巴结而获得的。这些融合的细胞(杂交瘤)可以是使用选择性培养条件来分离的，并且通过有限稀释而被克隆。具有所希望的特异性的、产生抗体的细胞可以通过一种适当的测定来进行选择(例如，ELISA)。
[0075] 抗体片段可以是通过酶促切割或通过重组技术而产生的。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可以对应地产生Fab或F(ab′)2片段。具有必要的底物特异性的其他蛋白酶也可以用于产生Fab或F(ab′)2片段。还可以使用抗体基因来产生不同的平截形式的抗体，在这些基因中一种或多种终止密码子已经被引入该自然的终止位点的上游。例如，对一个F(ab′)2重链部分进行编码的嵌合基因可以被设计成包括对该重链的CH1结构域和绞链区进行编码的DNA序列。单链抗体，以及人类的、嵌合的、人源化的、或灵长源化的(CDR移植的)、或镶饰的抗体，连同嵌合的、CDR移植的、或镶饰的单链抗体(包括由不同物种衍生的部分)，以及类似物也由本发明以及术语“抗体”所涵盖。这些抗体的不同部分可以 由常规技术通过化学方式连接在一起，或可以使用遗传工程技术制备为一种连续蛋白。例如，可以对编码了一种嵌合的或人源化的链的核酸进行表达以产生一种连续蛋白。参见，例如Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利号0,125,023B1；Boss等人，美国专利号4,816,397；Boss等人，欧洲专利号0,120,694B1；Neuberger，M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人，欧洲专利号0,194,276B1；Winter，美国专利号5,225,539；Winter，欧洲专利号0,239,400B 1；Queen等人，欧洲专利号0 451 216B1；以及Padlan，E.A.等人，EP 0 519 596A1。还参见Newman，R..et al.，BioTechnology，10：
1455-1460(1992)(关于灵长源化的抗体)，以及Ladner等人，美国专利号4,946,778和Bird，R.E.et al.，Science，242：423-426(1988))(关于单链抗体)。
1455-1460(1992)(关于灵长源化的抗体)，以及Ladner等人，美国专利号4,946,778和Bird，R.E.et al.，Science，242：423-426(1988))(关于单链抗体)。
[0076] 人源化的抗体可以使用标准方法或其他适当的技术、使用合成或重组DNA技术来进行生产。对人源化的可变区进行编码的核酸(例如cDNA)序列还可以使用PCR诱变方法进行构建，从而改变对一种人类或人源化的链进行编码的DNA序列，例如来自一种之前被人源化的可变区的DNA模板(参见，例如Kamman，M.，et al.，Nucl.Acids Res.，17：5404(1989))；Sato，K.，et al.，Cancer Research，53：851-856(1993)；Daugherty，B.L.et al.，Nucleic Acids Res.，19(9)：2471-2476(1991)；以及Lewis，A.P.and J.S.Crowe，Gene，101：297-302(1991))。使用这些或其他适当的方法，还可以容易地产生多种变体。在一个实施方案中，可以对经克隆的可变区(例如dAb)进行突变，并且可以选择具有令人希望的特异性的编码变体的序列(例如，来自一种噬菌体文库；参见，例如Krebber等人，美国
5,514,548；Hoogenboom等人，WO 93/06213，于1993年4月1日公布)。
5,514,548；Hoogenboom等人，WO 93/06213，于1993年4月1日公布)。
[0077] 可以使用产生或分离具有这些必需特异性的抗体的其他适当方法，包括例如从一个文库(例如，噬菌体展示文库)中选择一种重组抗体或抗体结合片段(例如，dAb)的方法、或依赖于对转基因动物(例如，小鼠)进行免疫的方法。能够生产人类抗体表达谱的转基因动物在本领域中是众所周知的(例如， (Abgenix，Fremont，CA))，并且 是可以使用适当的方法来生产的(参见，例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-2555(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258(1993)；
Lonberg等人，美国专利号5,545,806；Surani等人，美国专利号5,545,807；Lonberg等人，WO 97/13852)。
Lonberg等人，美国专利号5,545,806；Surani等人，美国专利号5,545,807；Lonberg等人，WO 97/13852)。
[0078] 在一个实施方案中，本发明涵盖了一种Cad-11抗体，该Cad-11抗体与一种表位相结合，该表位存在于人类Cad-11的EC1结构域的前大约37个氨基酸(SEQ ID NO：13)中。在一种具体的实施方案中，本发明涉及一种Cad-11抗体，该Cad-11抗体与一种表位相结合，该表位存在于SEQ ID NO：10中。在另一个实施方案中，本发明涉及一种Cad-11抗体，该Cad-11抗体与一种表位相结合，该表位包括SEQ ID NO：11。在另一个实施方案中，本发明涉及一种Cad-11抗体，该Cad-11抗体与一种表位相结合，该表位存在于SEQ ID NO：12中。
[0079] 在一个实施方案中，本发明涉及由杂交瘤H1M1(ATCC登录号PTA-9699)产生的一种Cad-11抗体，该抗体已经于2009年1月8日保存在美国种质保存中心(ATCC)，P.O.Box1549，Manassas，Virginia20108，美国。在另一个实施方案中，本发明提供了由杂交瘤H14(ATCC登录号PTA-9701)产生的一种Cad-11抗体，该抗体已经于2009年1月8日保存在美国种质保存中心(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，Virginia 20108，美国。
[0080] 本发明还涵盖多种抗体，这些抗体与由杂交瘤H1M1产生的一种Cad-11抗体和/或由杂交瘤H14产生的一种Cad-11抗体特异性地竞争结合到一种人类Cad-11蛋白或它的一种含EC1-结构域的部分上(例如SEQID NO：3、10、12、13)。在一个具体的实施方案中，特异性地与由杂交瘤H1M1和/或杂交瘤H14产生的一种Cad-11抗体进行竞争的抗体阻断(例如，抑制、减少、防止)由杂交瘤H1M1和/或杂交瘤H14产生的一种Cad-11抗体与一种人类Cad-11蛋白或它的含EC1-结构域的部分(例如，SEQ ID NO：3、10、12、13)的结合。
[0081] 此外，本发明涵盖了多种抗体，这些抗体具有对于一种人类Cad-11蛋白或它的含EC1-结构域的部分(例如，SEQ ID NO：3、10、12、13) 的结合亲和力，该结合亲和力是至少与由杂交瘤H1M1产生的一种Cad-11抗体和/或由杂交瘤H14产生的一种Cad-11抗体对于一种人类Cad-11蛋白或它的含EC1-结构域的部分的结合亲和力一样大。
[0082] 钙黏着蛋白-11融合蛋白
[0083] 此外，与包括Cad-11的EC区域的一种更大部分的一种融合蛋白(它包含所有5个EC结构域)相比，仅包含人类Cad-11的EC1结构域(例如，与人类IgG的一部分相融合的人类Cad-11的EC1结构域)的免疫球蛋白融合蛋白在体外更加有效地抑制了Cad-11活性。
[0084] 钙黏着蛋白-11拮抗剂还涵盖了嵌合的、或融合的蛋白，这些蛋白包括可操作地连接至一种异源蛋白质的全部或一部分上的人类Cad-11的EC1结构域的至少约N-端的35个氨基酸(SEQ ID NO：2)。“可操作地连接”是指该Cad-11EC1结构域的部分与该异源蛋白质被框内融合(fused in-frame)。该异源蛋白质可以被融合至该蛋白的N-端或C-端上。例如，该融合蛋白可以是一种GST融合蛋白，其中这些蛋白序列被融合到一种GST序列的C端上。其他类型的融合蛋白包括但不限于：酶性的融合蛋白，例如β-半乳糖苷酶融合蛋白、酵母双杂交GAL融合蛋白、聚组氨酸融合体、FLAG-标记的融合蛋白、GFP融合蛋白、以及免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。这种融合蛋白可以促进纯化(例如，一种重组融合蛋白的纯化)。在某些宿主细胞中(例如，哺乳动物的宿主细胞)，可以通过使用一种异源的信号序列来增加一种蛋白的表达和/或分泌。因此，在另一个实施方案中，该融合蛋白在其N端包含一种异源的信号序列。
[0085] EP-A-O464533披露了多种融合蛋白，这些融合蛋白包括免疫球蛋白恒定区的不同部分。该Fc在治疗和诊断方面是有用的，并且因此产生了(例如)改进的药物代谢动力学特性(参见，例如EP-A0232262)。在药物发现方面，例如，出于高通量筛选测定的目的，已经将人类蛋白与Fc部分进行融合以识别拮抗剂(Bennett et al.，Journal of Molecular Recognition 8：52-58(1995)；Johanson et al.，J.Biol.Chem.， 270(16)：9459-9471(1995))。因此，这项发明还涵盖了可溶的融合蛋白，这些融合蛋白包含本发明的一种蛋白Cad-11拮抗剂、以及不同子类的免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定区的不同部分(例如，IgG、IgM、IgA、IgE)。本发明的免疫球蛋白融合蛋白的优点包括以下各项中的一个或多个：(1)由于得到的二价的二聚融合蛋白，对于多价配体的增加的亲合力，(2)更长的血清半衰期，(3)经由该Fc结构域激活效应细胞的能力，(4)易于纯化(例如，通过蛋白A层析)、(5)对于Cad-11的亲和力以及，(6)阻断Cad-11介导的活性的能力。
[0086] 因此，在具体的实施方案中，该Cad-11拮抗剂是一种融合蛋白，该融合蛋白包括一种钙黏着蛋白-11蛋白的胞外区的一部分，它包括可操作地连接至一种哺乳动物免疫球蛋白的全部或一部分上的EC1结构域的N-端部分(SEQ ID NO：2的氨基酸54-90)。在一个具体的实施方案中，本发明的这些免疫球蛋白融合蛋白并不包括钙黏着蛋白-11的胞外区的一部分，该部分包括在SEQ ID NO：2的氨基酸1-609内所包含的全部5个EC结构域。在某些实施方案中，该人类钙黏着蛋白-11胞外区的部分可以包括例如SEQ ID NO：2的氨基酸1-160、氨基酸1-259、或氨基酸1-269。在一个具体的实施方案中，该融合蛋白缺乏人类钙黏着蛋白-11的前导序列和前体区域(pro-region)(SEQ ID NO：2的氨基酸1-53)，并且使用了一种异源性(heterogologous)前导序列。该免疫球蛋白部分可以来自任何脊椎动物来源，如鼠类，但优选地是一种人类免疫球蛋白。在一个实施方案中，该哺乳动物免疫球蛋白是一种人类IgG2蛋白或它的一部分，例如人类IgG2的铰链-CH2-CH3部分。
[0087] 本发明的一种嵌合的或融合的蛋白可以通过标准的重组DNA技术进行生产。例如，对不同的蛋白序列(例如，一种Cad-11EC1结构域肽以及一种哺乳动物免疫球蛋白)进行编码的DNA片段按照常规的技术一起进行框内连接在另一个实施方案中，该融合基因可以通过多种常规技术(包括自动化的DNA合成仪)进行合成。可替代地，可以使用锚定引物进行核酸片段的PCR扩增，这些锚定引物在两个连续的核酸片段之间产生互补的突出端，这些核酸片段随后可以进行退火和再扩增从而 产生一种嵌合的核酸序列(参见，Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，1992)。此外，许多表达载体是可商购获得的，它们已经编码了一个融合部分(例如，一个GST部分、一个Fc部分)。可以将编码了蛋白Cad-11拮抗剂的一种核酸分子克隆到这种表达载体中，这样使得该融合部分(例如，免疫球蛋白)被框内连接至该蛋白上。
[0088] 本发明的免疫球蛋白融合蛋白可以作为单体、二聚体、四聚体、或其他多聚体(例如，聚合体)进行提供。例如，该融合蛋白的免疫球蛋白部分的可变域可以通过以下方式连接在一起以形成多价配体，例如在每个V结构域的C端提供一种绞链区以及在这些绞链区中的半胱氨酸之间提供二硫键；或提供多种重链，这些重链中的每一个在该结构域的C端上具有一个半胱氨酸，这些半胱氨酸由二硫键连接在一起；或产生V-CH和V-CL以产生一种Fab形式；或使用肽接头(例如，Gly4Ser接头)从而产生二聚体、三聚体、以及其他多聚体。例如，这类配体可以与一种抗体Fc区相连接，该Fc区域包括CH2和CH3结构域的一个或这两者、以及可任选的一个绞链区。例如，对多种配体进行编码的载体(作为一种单一的核苷酸序列与一个Fc区相连接)可以用于制备此类配体(例如，通过表达)。
[0089] 本发明的免疫球蛋白融合蛋白可以与其他部分相偶联，这些部分包括但不限于：聚乙二醇(PEG)的多聚体或它们的衍生物(例如，聚甲基乙二醇)、放射性核素、细胞毒性
212
试剂和药物，并且随后用于体内治疗。放射性核素的例子除其他之外还包括包括：Bi、
131 186 90
I、 Re、以及 Y。这些放射性核素通过局部照射这些细胞来发挥它们的细胞毒性效应，导致不同的细胞内损害，正如放疗领域内所已知。可以与这些融合蛋白相偶联的细胞毒性药物包括但不限于：柔红霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、以及丝裂霉素C。细胞毒性药物类妨碍了关键的细胞加工，包括DNA、RNA、以及蛋白质合成。对于这些类别的药物(它们在本领域中是已知的)、以及它们的作用机制的更加充分的展示，参见Goodman，A.G.，et al.，Goodman and Gilman ′ s The Pharmacological Basis of Therapeutics，8th Ed.，Macmillan Publishing Col，1990，Katzung，ed.，Basic and Clinical Pharmacology，Fifth Edition，p 768-769，808-809，896，Appleton and Lange，Norwalk，Conn。
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试剂和药物，并且随后用于体内治疗。放射性核素的例子除其他之外还包括包括：Bi、
131 186 90
I、 Re、以及 Y。这些放射性核素通过局部照射这些细胞来发挥它们的细胞毒性效应，导致不同的细胞内损害，正如放疗领域内所已知。可以与这些融合蛋白相偶联的细胞毒性药物包括但不限于：柔红霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、以及丝裂霉素C。细胞毒性药物类妨碍了关键的细胞加工，包括DNA、RNA、以及蛋白质合成。对于这些类别的药物(它们在本领域中是已知的)、以及它们的作用机制的更加充分的展示，参见Goodman，A.G.，et al.，Goodman and Gilman ′ s The Pharmacological Basis of Therapeutics，8th Ed.，Macmillan Publishing Col，1990，Katzung，ed.，Basic and Clinical Pharmacology，Fifth Edition，p 768-769，808-809，896，Appleton and Lange，Norwalk，Conn。
[0090] 如在此所使用的，术语“免疫球蛋白融合蛋白”包括本发明的这些免疫球蛋白融合蛋白的片段。此类片段旨在本发明的范围内。例如，一旦这些分子被分离，可以用蛋白酶对它们进行切割从而产生仍然能够与人类Cad-11的EC1结构域相结合的片段。
[0091] 肽拮抗剂
[0092] 本发明的钙黏着蛋白-11拮抗剂还可以是与一种钙黏着蛋白-11蛋白的EC1结构域相结合的肽。这种肽可以包括任何适当的L-和/或D-氨基酸，例如常见的α-氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸)、非-α-氨基酸(例如，β-丙氨酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、肌氨酸、抑胃酶氨酸(statine))、以及不常见的氨基酸(例如，瓜氨酸、同型瓜氨酸(homocitruline)、同型丝氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸)。在一种肽上的氨基、羧基和/或其他官能团可以是游离的(例如，未被修饰)或用一种适当的保护基团进行保护的。针对氨基基团和羧基基团的适当的保护基团、以及用于加入或去除保护基团的方法在本领域内是已知的，并且被披露于例如Green and Wuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，John Wiley and Sons，1991。一种肽的官能团还可以使用领域已知的多种方法进行衍生(例如，烷基化)。
[0093] 若希望，这种肽Cad-11拮抗剂可以包括一种或多种修改(例如，氨基酸接头、酰化作用、乙酰化作用、酰胺化作用、甲基化作用、末端修饰剂(例如，环化修饰作用))。这种肽还可以含有化学修饰作用(例如，N-甲基-α-氨基取代)。此外，这种肽拮抗剂可以是一种已知的和/或自然发生的肽的类似物，例如具有一种或多种保守的氨基酸残基取代的肽类似物。这些修饰可以改进这种肽的不同的特性(例如，溶解度、结合性)，包括它的钙黏着蛋白-11拮抗剂活性。
[0094] Cad-11拮抗剂(它们是肽)可以是直链的、支链或环状的，例如具有一种杂原子环状结构(包括若干酰胺键)的肽。在一个具体的实施方 案中，该肽是一种环肽。此类肽可以由本领域的普通技术人员使用标准的技术来进行产生。例如，一种肽可以通过酶促或化学切割从一种天然蛋白衍生或去除，或可以通过适当的方法进行合成，例如固相肽合成(例如，梅里菲尔德型合成(Merrifield-type synthesis)(参见，例如Bodanszky et al.“Peptide Synthesis，”John Wiley & Sons，Second Edition，1976))。作为钙黏着蛋白-11拮抗剂的肽还可以使用(例如)重组DNA方法学或其他适当的多种方法进行生产(参见，例如Sambrook J.and Russell D.W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，rd3 Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，
2001)。
2001)。
[0095] 这些肽可以被合成并且装配到文库种，这些文库包括少许至许多离散的分子种类。此类文库可以使用组合化学的方法户必须报告制备，并且可以使用任何适当的方法进行筛选以确定该文库是否包括具有一种令人希望的生物活性的肽。然后，可以使用适当的方法将此类肽拮抗剂分离。
[0096] 模拟肽拮抗剂
[0097] 钙黏着蛋白-11拮抗剂还可以是模拟肽。例如，可以制备具有与肽类具有相同官能团的多糖。可以对多种模拟肽进行设计，这是(例如)通过在该环境中建立一种肽试剂的三维结构来进行的，其中该试剂结合到或将要结合到一种靶分子上。该模拟肽包括至少两种组分：这种或这些结合部分以及主链或支撑结构。
[0098] 这些结合部分是以下化学原子或基团，它们将与一种靶分子(例如，与Cad-11的EC1结构域中具有氨基酸)进行反应或与其形成一种复合物(例如，通过疏水性或离子相互作用)。例如，在一种模拟肽中这些结合部分可以与在一种肽或蛋白拮抗剂中的那些相同。这些结合部分可以是一种原子或化学基团，它与该受体按照与该肽拮抗剂中的结合部分相同或相似的方式进行反应。例如，计算化学可用于设计一种钙黏着蛋白-11蛋白的EC1结构域的供体序列的肽模拟物，例如它可以与在Cad-11蛋白的EC1结构域中的口袋序列相结合。适合用于针对一种肽中的碱 性氨基酸进行设计的模拟肽的结合部分的例子包括含氮基团，如胺类、铵类、胍类、以及酰胺类或磷鎓类。适合用于针对一种酸性氨基酸进行设计的模拟肽的结合部分的例子包括：例如羧基、低级烷基羧酸酯、磺酸、一种低级烷基磺酸酯、或亚磷酸或它的酯。
[0099] 该支撑结构是以下化学实体，该化学实体当这种或这些结合部分结合时提供了该模拟肽的三维构型。该支撑结构可以是有机的或无机的。有机支撑结构的例子包括：多糖、聚合物、或有机合成的聚合物的寡聚体(如聚乙烯醇或聚丙交酯)。优选的是该支撑结构基本上具有与该肽主链或支撑结构相同的大小和尺寸。这可以通过计算或测量这种肽和模拟肽的原子和键的大小而确定。在一个实施方案中，这种肽键的氮可以用氧或硫取代，例如形成一条聚酯主链。在另一个实施方案中，该羰基可以用一种磺酰基基团或亚磺酰基基团取代，从而形成一种聚酰胺(例如，一种聚磺酰胺)。可以制备这种肽的反向酰胺(例如，将一种或多种-CONH-基团置换为一种-NHCO-基团)。在又另一个实施方案中，这种肽主链可以用一条聚硅烷主链取代。
[0100] 可以通过已知的方法来制造这些化合物。例如，一种聚酯模拟肽可以通过将一种羟基基团取代为在多种氨基酸上的对应的α-氨基基团来进行制备，由此制备了一种羟酸，并且将这些羟酸顺序地酯化、可任选地将这种碱性和酸性侧链阻挡以使副反应最小化。确定一种适当的化学合成路线大体上很容易在确定该化学结构时进行鉴定。
[0101] 可以合成多种模拟肽并且将其装配到文库中，这些文库包括少许至许多离散的分子种类。可以使用熟知的组合化学方法来制备此类文库，并且可以对其进行筛选以确定该文库是否包括一种或多种模具有所希望的活性的拟肽。然后，可以通过适当的方法将此类模拟肽拮抗剂分离。
[0102] 小分子拮抗剂
[0103] 钙黏着蛋白-11拮抗剂还可以是多种小分子。多种小分子的例子包括：有机化合物类，有机金属化合物类，无机化合物类，以及有机物的、有机金属化合物的或无机化合物的盐类。在一种小分子中的原子典型地 通过共价的和/或离子键连接在一起。在一种小的有机分子中原子的安排可以表示一条链(例如，一条碳-碳链或一条碳-杂原子链)、或可以表示一种包含多个碳原子的环，例如苯或一种聚环的系统、或碳与多个杂原子的组合，即多个杂环，例如嘧啶或喹唑啉。尽管小分子可以具有任何分子量，它们大体上包括小于约5,000道尔顿的分子。例如，此类小分子可以是小于约1000道尔顿，并且优选是小于约750道尔顿、或更优选是小于约500道尔顿。多种小分子以及其他非肽性钙黏着蛋白-11拮抗剂可以在自然界中发现(例如，识别的、分离的、纯化的)和/或合成产生的(例如，通过传统的有机合成、生物-介导的合成、或它们的一种组合)。参见，例如Ganesan，Drug Discov.Today 7(1)：47-55(2002年1月)；Lou，Drug Discov.Today，6(24)：1288-1294(2001年12月)。自然发生的多种小分子的例子包括但不限于：激素类、神经递质类、核苷酸类、氨基酸类、糖类、脂质类、以及它们的衍生物。
[0104] 根据本发明的一种小分子钙黏着蛋白-11拮抗剂以及它的生理学可接受的盐类可以抑制一种钙黏着蛋白-11蛋白的同型结合(例如，通过直接与一种Cad-11的EC1结构域中的供体序列竞争结合到另一种钙黏着蛋白-11的结合口袋上，通过直接与一种Cad-11蛋白的EC1结构域中的结合口袋竞争结合到另一种钙黏着蛋白-11的供体序列上)。
[0105] 核酸拮抗剂
[0106] 本发明的Cad-11拮抗剂还可以是与一种人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域相结合的核酸分子(例如，寡核苷酸)。适当的核酸Cad-11拮抗剂包括适体类，它们能够以高亲和力以及特异性通过除经典的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对以外的交互作用结合到一种具体的感兴趣的分子上(例如，人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域)(Tuerk and Gold，Science 249：505(1990)；Ellington and Szostak，Nature 346：818(1990))。
[0107] 适体类，与通过噬菌体展示或单克隆抗体(MAb)所产生的肽类一样能够特异性地结合到选定的靶标上，并且通过结合、阻断它们的靶标发挥作用的能力。已经针对超过100种蛋白产生了由一种体外选择过程 从随机序列寡核苷酸的集合体中生成的多种适体，这些蛋白包括生长因子类、转录因子类、酶类、免疫球蛋白类、以及受体类。一种典型的适体其大小为10至15kDa(30至45个核苷酸)、以亚纳摩尔的亲和力与其靶标相结合、并且与密切相关的靶标相区分(例如，将典型地不与来自相同基因家族的其他蛋白相结合)。一系列的结构性研究已经显示多种适体能够使用在抗体-抗原复合物中驱动亲和力和特异性的相同类型的结合相互作用(氢键、静电的互补性、疏水性接触、位阻排阻、等等)。
[0108] 与所感兴趣的一种靶标相结合的适体(例如，一种人类Cad-11蛋白的一种EC1结构域)可以使用一种被称为“通过指数富集对配体的系统进化”(SELEX)的标准方法而进行产生和鉴定，该方法说明于(例如)美国专利号5,475,096和美国专利号5,270,163。
[0109] 钙黏着蛋白-11拮抗剂的鉴定
[0110] 具有钙黏着蛋白-11结合特异性的多种试剂(包括多种小分子)可以在一种筛选中进行鉴定，例如多种化学化合物和/或文库(例如，化学的、肽、核酸文库)的高通量筛选。
[0111] 特异性地结合到人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域上的多种抗体可以(例如)通过筛选可商购的组合抗体文库进行鉴定(Dyax Corp.，MorphoSys AG)。筛选这些文库的多种适当的组合抗体文库和标准方法说明于Hoet et al.，Nature Biotechnology 23(3)：344-348(2005)以及Rauchenberger et al.，J.Biol.Chem.278(40)：38194-38205(2003)，通过引用将其内容结合在此。此类文库或多种分子的集合还可以使用熟知的化学方法进行制备。
[0112] 可替代地，特异性地结合到人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域上的多种鼠抗体可以(例如)通过用多种EC1蛋白结构域或EC1肽连同一种佐剂对小鼠进行免疫从而破坏对该抗原的耐受性来进行鉴定。可以对这些抗体筛选所希望的特异性和活性，并接着使用已知的技术使其人源化以产生用于治疗人类疾病的适当试剂。
[0113] 可以从许多可供使用的化学化合物文库中鉴定多种化合物或小分子，这些文库例如来自国家癌症研究所的化学资料档案库(the Chemical Repository of the National Cancer Institute)、以及分子文库小分子资料档案库(the Molecular Libraries Small Molecules Repository)(PubChem)、连同哈佛大学化学和细胞生物学研究所文库、以及可以从商业来源中获得的其他文库(例如Chembridge，Peakdale，CEREP，MayBridge，Bionet)。此类文库或多种分子的集合还可以使用熟知的化学方法(例如，熟知的组合化学方法)进行制备。可以对这些文库进行筛选以鉴定结合并抑制钙黏着蛋白-11的多种化合物。
[0114] 经鉴定的多种化合物可以充当前导化合物用于使用药物化学的多种熟知的方法来进行进一步多样化。例如，可以制备和筛选用于钙黏着蛋白-11结合和/或抑制活性的多种化合物的集合(它们是该前导物的结构变体)。这可以导致将这些化合物的结构与生物活性联系起来的一种结构活性关系的开发。具有适当的结合和抑制活性的化合物可以被进一步开发用于体内用途。
[0115] 可以对于钙黏着蛋白-11相结合的试剂进一步评价钙黏着蛋白-11拮抗剂活性。例如，包括一种钙黏着蛋白-11蛋白的组合物可用于一种筛选或结合测定，从而检测和/或鉴定结合并拮抗该钙黏着蛋白-11蛋白的多种试剂。适合使用的多种组合物包括，例如自然表达一种钙黏着蛋白-11蛋白的细胞(例如，一种滑膜细胞)、此类细胞的提取物、以及重组钙黏着蛋白-11蛋白。
[0116] 可以在一种竞争性结合测定中鉴定与一种钙黏着蛋白-11蛋白相结合的试剂，例如其中评估了一种测试试剂抑制钙黏着蛋白-11与一种参比试剂进行结合的能力。该参比试剂可以是一种全长Cad-11蛋白或它的包括该EC1结构域的一部分。该参比试剂可以用一种适当的标记物(例如，放射性同位素、表位标记物、亲和力标签(例如，生物素和抗生物素蛋白或链霉亲和素)、自旋标签、酶、荧光基团、化学发光基团、染料、金属(例如金、银)、磁珠)进行标记，并且可以确定在该测定中要求对该钙黏着蛋白-11蛋白进行饱和的经标记的参比试剂的量值。在 该钙黏着蛋白-11蛋白与该测试试剂之间的复合物的形成的特异性可以使用一种适当的对照物(例如，未标记的试剂、单独的标签)进行确定。
[0117] 一种测试试剂抑制在该参比试剂与一种钙黏着蛋白-11蛋白之间形成一种复合物的能力可以被确定为对于经标记的参比试剂的特异性结合的50％抑制作用(IC50值)所要求的测试试剂的浓度。特异性结合被优选地定义为总结合(例如，在复合物中总标签)减去该非特异性结合。非特异性结合被优选地定义为在过量的未标记参比试剂存在下所形成的仍可在复合物中检出的标签的量值。在该方法中适合使用的参比试剂包括多种分子和化合物，它们特异性地结合到钙黏着蛋白-11上，例如与钙黏着蛋白-11相结合的抗体。
[0118] 拮抗一种钙黏着蛋白-11蛋白的试剂可以通过对以下试剂进行筛选来鉴定，这些试剂具有一种拮抗(降低、防止、抑制)钙黏着蛋白-11的一种或多种活性(例如像一种结合活性(例如，同型的Cad-11结合))的能力。此类活性可以使用一种适当的体外或体内测定来进行评估。对于钙黏着蛋白-11活性的示例性测定之前已经进行了说明(Patel，SD，et al.，Cell 124：_1255-1268(2006)；Lee et al.，Science 315：1006-1010(2007))。
[0119] 一旦鉴定了一种钙黏着蛋白-11拮抗剂，可以评估该钙黏着蛋白-11拮抗剂在细胞中干扰(例如，降低、抑制、防止)与钙黏着蛋白-11活性相关联的一种或多种生物学功能或特性的能力，这是例如使用一种基于细胞的、被设计成测量与钙黏着蛋白-11相关联的一种具体的生物学功能或特性的测定来进行的。已知与钙黏着蛋白-11表达和/或活性相关联的多种生物学功能和特性包括但不限于：细胞黏附、细胞迁移、细胞侵入、细胞分选、细胞凝聚、细胞重排、组织完整性和结构的维持、细胞增殖的接触抑制、以及多种癌(例如肿瘤)细胞的恶性转化(Kiener and Brenner，Arthritis Res Ther.7(2)：49-54(2005))。此外，Cad-11拮抗剂在此被显示为抑制由多种滑膜细胞所产生的活性MMP。用于评估钙黏着蛋白的一种或多种生物学功能的适当测定对于本领域的普通技术人员而言是已知的(参见，例如Patel，SD，et al.，Cell 124：_1255-1268(2006))，并且包括例如在此说明的细胞聚集测定(见例证、材料和方法部分)。
[0120] 治疗的方法
[0121] 不希望被任何一种理论所束缚，据信Cad-11的EC1结构域的前大约35个氨基酸(例如，大约33至大约37个氨基酸)是同型的钙黏着蛋白结合所要求的，并且特异性地结合到Cad-11的这个区域的多种试剂可以有效地抑制在多个Cad-11分子之间的结合。因此，此类试剂在多种炎性关节障碍(例如，类风湿性关节炎)的治疗和预防方面是有用的，这些疾病与发炎关节中的滑膜细胞以及其他细胞类型中的Cad-11表达和活性相关联。因此，本发明的一个方面涉及一种用于治疗哺乳动物受试者体内的炎性关节障碍的方法，包括对该受试者给予治疗有效量的一种Cad-11拮抗剂，该Cad-11拮抗剂结合到一种人类Cad-11EC1结构域肽(SEQ ID NO：3)上。
[0122] 使用本发明的这些方法，哺乳动物(例如，人)体内的炎性关节障碍可以通过给予一个量值的本发明的一种钙黏着蛋白-11拮抗剂(例如，抗体类、融合蛋白类、小分子类、核酸类、肽类、模拟肽类)来进行治疗，该量值足以提供一种治疗益处，这是例如通过抑制细胞的聚集、或抑制细胞的迁移、或抑制由在一个可活动的关节中表达钙黏着蛋白-11的细胞(例如，滑膜细胞)中所表达的活性蛋白酶或多种炎性分子来进行。
[0123] 因此，本发明的一个方面涉及一种用于治疗哺乳动物受试者体内的炎性关节障碍的方法，包括对该受试者给予本发明的治疗有效量的一种Cad-11拮抗剂。该炎性关节障碍可以是与一个可活动的关节的细胞(例如，滑膜细胞)中钙黏着蛋白-11表达相关联、或以其为特征的任何障碍。可以由本发明治疗的多种炎性关节障碍的例子包括但不限于：类风湿性关节炎、银屑病关节炎、莱特尔氏综合征、以及强直性脊柱炎。在一种具体的实施方案中，该炎性关节障碍是类风湿性关节炎。
[0124] 在一个方面，治疗有效量的一种钙黏着蛋白-11拮抗剂被给予需要它的患者。有待给药的钙黏着蛋白-11拮抗剂的量值(例如，一种治疗有效量)可以由临床医生使用在此提供的指导及在本领域内的其他已知的 方法来进行确定，并且取决于几种因素，包括例如所选定的具体试剂、该受试者的年龄、敏感性、对药物的耐受性、以及总体健康状况。例如，对于作为抗体的Cad-11拮抗剂的适当的剂量可以是每次治疗从大约0.01mg/kg至大约300mg/kg体重，并且优选每次治疗从大约0.01mg/kg至大约100mg/kg、从大约0.01mg/kg至大约10mg/kg、从大约1mg/kg至约10mg/kg体重。对于一种小分子Cad-11拮抗剂适当的剂量可以是每此治疗从大约0.001mg/kg至大约100mg/kg、从大约0.01mg/kg至大约100mg/kg、从大约0.01mg/kg至大约10mg/kg、从大约0.01mg/kg至大约1mg/kg体重。对于作为蛋白或肽(直链的、环状的、模拟的)的钙黏着蛋白-11拮抗剂的适当的剂量将导致该肽从大约0.1μg/ml至大约200μg/mL的血浆浓度。确定针对一种具体的试剂、患者以及癌症的剂量是完全在本领域中的普通技术人员的能力之内的。优选地，该剂量并未引起、或产生最小限度的不良副作用(例如，免疫原性应答、恶心、眩晕、胃部不适(gastric upset)、高粘稠度综合征、充血性心力衰竭、中风、肺水肿)。
[0125] 治疗有效量的一种钙黏着蛋白-11拮抗剂可以被单独给药、或与一种或多种其他的治疗剂(例如，抗炎性剂)进行组合。用于治疗多种炎性关节障碍(特别是RA)的适当的抗炎剂(它们可以与本发明的Cad-11拮抗剂相组合而进行给药)包括但不限于：(i)非甾体抗炎药物(NSAID；例如，酮洛芬(detoprofen)、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸(meclofenameate)、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮(nabumeone)、萘普生钠、奥沙普秦、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、塞来考昔、罗非考昔、阿司匹林、水杨酸胆碱、双水杨酸酯(salsalte)、以及水杨酸钠和水杨酸镁)；(II)类固醇类(例如，可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙)；(iii)DMARD，即缓解疾病的抗风湿性药物(例如，环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、羟氯喹、柳氮磺吡啶、D-青霉胺、米诺环素、以及金)；或(iv)重组蛋白质类(例如， (依那西普，一种可溶的TNF受体)、 (英利 昔单
抗，一种嵌合的单克隆抗TNF抗体)、 (阿巴西普(abatabacept)，一种可溶
的CTLA4受体)、 (妥珠单抗，针对IL-6受体的一种单克隆抗体)、以及
(利妥昔单抗，针对CD20的一种单克隆抗体)。
抗，一种嵌合的单克隆抗TNF抗体)、 (阿巴西普(abatabacept)，一种可溶
的CTLA4受体)、 (妥珠单抗，针对IL-6受体的一种单克隆抗体)、以及
(利妥昔单抗，针对CD20的一种单克隆抗体)。
[0126] 因此，一种钙黏着蛋白-11拮抗剂可以作为一种联合治疗的部分(例如，与一种或多种其他治疗剂一起)进行给药。该Cad-11拮抗剂可以在一种或多种其他的治疗剂之前或同时被给药的。在一些实施方案中，该钙黏着蛋白-11拮抗剂以及其他治疗剂可以作为单独的配制品或作为一种联合配制品被同时地(例如，共同地)进行共同给药。可替代地，这些试剂可以作为单独的组合物、在由有经验的临床医生所确定的一个适当的时间框(例如，足以允许这些疗法的药物效应的叠加的一段时间)之内进行顺序地给药。该钙黏着蛋白-11拮抗剂以及一种或多种其他治疗剂能够以一种单一剂量或以多个剂量、以一种次序并且在适于达到一种令人希望的治疗效应(例如，关节炎症的减少和/或抑制)的时间表上进行给药。适当的剂量以及给药方案可以由临床医生来确定，并且取决于所选择的这种或这些试剂、药物配制品以及给药途径、不同的患者因素以及其他考虑。
[0127] 一种治疗效力(例如，关节炎症的减少或消除和/或关节炎症的防止或抑制)可以通过任何适当的方法(例如，成像(MRI、NMR))被确定。
[0128] 根据本发明的这些方法，将治疗有效量的一种Cad-11拮抗剂给予哺乳动物受试者以治疗一种炎性关节障碍。术语“哺乳动物受试者”在此被定义为包括多种哺乳动物：如灵长类动物(例如，人类)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠、或其他的牛、绵羊、马、犬科、猫科、啮齿动物以及鼠科物种。
[0129] 作为Cad-11拮抗剂的试剂可以由不同的途径给予哺乳动物受试者。例如，该试剂可以由任何适当的胃肠外的或非胃肠外的途径进行给药，包括例如局部的(例如，乳剂、软膏)、或鼻的(例如，溶液、悬浮液)。肠胃外给药可以包括例如：关节内、肌内、静脉内、心室内、动脉内、 鞘内、皮下、或腹膜内的给药。该试剂还可以通过以下途径进行给药：口服(例如，以胶囊、悬浮液、片剂、或饮食)、经皮、真皮内、局部、通过吸入(例如，支气管内、鼻内、口服吸入或鼻内滴剂)、穿粘膜、或经直肠。给药在适当时可以是局部的或全身性的，并且若希望，可以同时使用超过一种途径。一种Cad-11拮抗剂的局部化给药可以通过关节内注射(例如，将该试剂直接注射到一个关节中)而实现。优选的给药模式可以根据所选择的具体试剂而发生变化。然而，全身性静脉内的或皮下的给药对于抗体是大体上优选的。
[0130] 递送还可以是通过注到患者的脑部或体腔内、或通过使用一种定时释放或持续释放的基质递送系统、或通过使用微粒、凝胶以及脂质体的原位递送。雾化装置、粉末吸入器、以及气溶胶化的溶液是代表性的方法，这些方法可以用于将此类制备品给予呼吸道。递送可以在体外、在体内、或离体。
[0131] 作为蛋白(例如，融合蛋白)的多种试剂可以是经由重组蛋白的体内表达来进行给药的。体内表达可以根据适当的方法、通过体细胞表达来实现(参见，例如美国专利号5,399,346)。此外，还可以将对该蛋白进行编码的一种核酸结合到逆转录病毒的、腺病毒的、或其他适当的载体种(优选的是，一种复制缺陷型感染性载体)用于递送，或可以将其引入到能够表达该蛋白的一种转染的或转化的宿主细胞中用于递送。在后者的实施方案中，可以将这些细胞以一个量值进行植入(单独或在一种阻挡装置中)、注射或以其他方式引入，该量值对于以一种治疗有效量表达该蛋白是有效的。
[0132] 基于核酸的钙黏着蛋白-11拮抗剂(例如，适体)能够以多种方式引入到所感兴趣的一种哺乳动物受试者中。例如，核酸可以从表达载体或PCR产物在宿主细胞中内源性地表达，或被包装到合成的或工程化处理的组合物中(例如，脂质体、聚合体、纳米颗粒)，然后这些组合物可以被直接引入到哺乳动物受试者的血流中(通过，例如，注射、输注)。抗钙黏着蛋白-11核酸或核酸表达载体(例如，逆转录病毒的、腺病毒的、腺相关的以及单纯性疱疹病毒的载体、工程化处理的载体、非病毒 介导的载体)还可以使用已建立的基因治疗策略和科学试验计划而直接引入到哺乳动物受试者中(参见，例如Tochilin V.P.Annu Rev BiomedEng 8：343-375，2006；Recombinant DNA and Gene Transfer，Office ofBiotechnology Activities，National Institutes of Health Guidelines)。
[0133] 作为钙黏着蛋白-11拮抗剂的试剂(例如，小分子)可以作为一种药物的或生理学的组合物的一部分来给予哺乳动物受试者，例如作为包括一种钙黏着蛋白-11拮抗剂以及一种药学上可接受的载体的药物组合物的一部分。包括一种钙黏着蛋白-11拮抗剂的配制品或组合物，或包括一种钙黏着蛋白-11拮抗剂以及一种或多种其他治疗剂(例如，一种抗炎剂)的组合物将根据所选择的给药途径(例如，溶液、乳剂、或胶囊)而发生变化。适当的药用载体可以含有惰性成份，这些成分并未与这种钙黏着蛋白-11拮抗剂相互作用。可以采用多种标准的药物配制品技术，如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中所说明的那些方法。用于肠胃外给药的适当的药用载体包括，例如无菌水、生理盐水、抑菌盐水(含大约0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、Hank′s溶液、林格氏乳酸盐以及类似物。配制品还可以包括少量的物质，这些物质增强了该活性成分(例如，乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂、润湿剂)的效力。胶囊化组合物的方法(如，在硬明胶或环葡聚糖的包衣中)在本领域内是已知的。为了吸入，可以将该试剂溶解并且载入到一种适当的用于给药的分配器中(例如，一种雾化器或喷雾器或加压气溶胶分配器)。
[0134] 该药用试剂可以作为一种中性化合物或作为一种盐或酯来进行给药。药学上可接受的盐类包括与多种游离的氨基基团形成的那些盐，如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、或酒石酸的那些盐；以及与多种游离的羧基基团形成的那些盐，如衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因、等等的那些盐。可以获得含有一种胺或其他碱性基团的化合物的盐类，这是例如通过与一种适当的有机酸或无机酸(如，氯化氢、溴化氢、乙酸、高氯酸以及类似物)反应来进行的。具有一种季铵基团的化 合物还包含一种反阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、醋酸根、高氯酸根以及类似物。包含一种羧酸或其他酸性官能团的化合物的盐类可以通过与一种适当的碱(例如，一种氢氧化物碱)反应来制备。酸性官能团的盐类包含一种反阳离子，如钠离子或钾离子。
[0135] 本发明现在将通过以下实例进行说明，这些实例并非旨在以任何方式进行限制。
[0136] 例证
[0137] 实例1：具有针对人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域的N端35个氨基酸内一种表位的结合特异性的Fab的鉴定。
[0138] 材料和方法
[0139] 蛋白质印迹法
[0140] 通过SDS-PAGE将多种蛋白分离，并且使用标准方法将它们转移到硝酸纤维素(NC)膜上。简言之，用Tris缓冲的-盐水-吐温(TBST)(8.8g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、3g/L的Tris碱、500ul/L的Tween-20、pH至7.4)漂洗NC膜。将该膜用溶解于TBST中的
4％BSA在22℃下封闭小时。将该NC膜用TBST漂洗3次，每次5分钟。将小鼠抗人Cad-11抗体在TBST中稀释至0.5μg/ml，并且在22℃下将该NC孵育达1小时。将该NC膜用TBST漂洗3次，每次5分钟。将偶联着辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠Ig抗体在TBST中稀释至1μg/ml，并且在22℃下在室温(RT)下将该NC在第二溶液中孵育最短1小时。将该NC膜在TBST中漂洗3次，每次5分钟。使用标准HRP方法使信号显色。
4％BSA在22℃下封闭小时。将该NC膜用TBST漂洗3次，每次5分钟。将小鼠抗人Cad-11抗体在TBST中稀释至0.5μg/ml，并且在22℃下将该NC孵育达1小时。将该NC膜用TBST漂洗3次，每次5分钟。将偶联着辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠Ig抗体在TBST中稀释至1μg/ml，并且在22℃下在室温(RT)下将该NC在第二溶液中孵育最短1小时。将该NC膜在TBST中漂洗3次，每次5分钟。使用标准HRP方法使信号显色。
[0141] ELISA
[0142] 将该抗原(5μg/ml或50μg的Cad-11-EC-1-Fc或5μg/ml的钙黏着蛋白肽)在一种缓冲液中稀释并且将其用于在4℃下对这些板包被过夜。 将这些板洗涤并且用1.5％BSA、5％低脂奶粉(处于PBS稀释缓冲液中：5％BSA、2.5％低脂奶粉、0.1％Tween-20，在PBS中)封闭。然后，将这些板用包含该抗Cad-11人fAb或纯化的抗Cad-11人fAb的细菌裂解液孵育达小时。洗涤之后，将二抗(Cy5-偶联的一种人Fab，1/100稀释)施用达25分钟。然后，洗涤这些板，并接着读取得到的荧光。
[0143] 结果
[0144] 对三组之前报道的钙黏着蛋白-11-特异性抗体测试与人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域相结合的能力。这些抗体包括：对抗钙黏着蛋白-11敲除或缺陷的小鼠中的一种小鼠钙黏着蛋白-11-Fc融合蛋白免疫原所产生的抗体(Lee et al.，Science 315：1006-1010(2007))，在钙黏着蛋白-11野生型小鼠中产生的抗体，这些抗体对抗已经在CHO细胞中产生的一种人类钙黏着蛋白-11-Fc融合蛋白免疫原(Valencia et al.，J Exp.Med.200(12)：1673-1679(2004))，以及在钙黏着蛋白-11野生型小鼠中产生的抗体，这些抗体对抗包含人类钙黏着蛋白-11的EC1-3结构域的一种通过细菌产生的蛋白。通过蛋白质分析对这些抗体测试了结合融合蛋白的能力，这些融合蛋白仅包含人类Cad-11的EC1结构域(钙黏着蛋白-11-EC1-Fc)、Cad-11的EC1以及EC2结构域(Cad11-EC1/2-Fc)、或Cad-11的所有5个EC结构域(钙黏着蛋白-11-EC1-5-Fc)。在蛋白质印迹上，所测试的这些抗体都没有识别EC1-Fc或EC1-2-Fc融合蛋白(图1A)。然而，来自所测试的三组中每一组的抗体识别了包括胞外域1至5的人类Cad-11-Fc融合蛋白(图1B)。这些结果表明所测试的这些抗体并不结合人类Cad-11的EC1或EC2结构域，但却识别在这种蛋白的胞外区中其他地方的多种表位。
[0145] 可以获得的已公布的抗Cad11抗体(这些抗体结合了表达Cad11的细胞)：13C2、23C6、5F82(Lifespan Science)以及283416(R&D Systems)、连同Cad11EC1-结合抗体H1M1、以及对照抗体MOPC是通过ELISA针对与以下融合蛋白相结合的能力进行测试，这些融合蛋白仅包含人类Cad-11的EC1结构域(钙黏着蛋白-11-EC1-Fc)或Cad-11的所有5种 EC结构域(钙黏着蛋白-11-EC1-5-Fc)。所测试的可以获得的已公布的抗Cad11抗体都没有识别EC1-Fc(图1B，空心柱)(在此没有显示对于283416的数据)。然而，Cad11EC1结合的H1M1抗体结合了钙黏着蛋白-11-EC1-Fc以及钙黏着蛋白-11-EC1-5-Fc这两者(图
1B实心柱)。对照MOPC抗体对两种融合蛋白均不结合。这些结果表明这些可以获得的已公布的抗Cad11抗体没有与人类Cad-11的EC1结构域相结合，但却在这种蛋白的胞外区中的其他地方识别了多种表位。
1B实心柱)。对照MOPC抗体对两种融合蛋白均不结合。这些结果表明这些可以获得的已公布的抗Cad11抗体没有与人类Cad-11的EC1结构域相结合，但却在这种蛋白的胞外区中的其他地方识别了多种表位。
[0146] 为了产生对人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域的N端35个氨基酸之内的一种表位具有特异性的抗体，对编码了人类Fab的噬菌体展示文库(MorphoSys AG)进行筛选。使用两个选择指标对候选的Fab进行鉴定：针对与一种肽(该多肽包括人类钙黏着蛋白-11EC1结构域的前35个氨基酸)相结合的一种阳性选择，以及针对与相应肽(来自两个密切相关的并且高度同源的钙黏着蛋白(钙黏着蛋白-8和MN-钙黏着蛋白)的EC1结构域)相结合的一种阴性选择(图2)。使用ELISA来评估结合。
[0147] 进行两种筛选。在第一种筛选中，通过ELISA对结合钙黏着蛋白-11EC1肽的96种Fab克隆进行鉴定。七(7)种候选的Fab结合了Cad-11EC-1肽；然而，这些Fab中仅有两种与EC-1肽以及EC1-2-Fc融合蛋白这二者相结合。这两种Fab之一还与MN-Cad肽相结合。因此，这7种Fab克隆中仅有一种特异性地结合到EC1-Fc融合蛋白上，但不结合到MN-Cad以及钙黏着蛋白-8EC1结构域肽这两者上。在第二筛选中，观察到了相似的结果，因为96种Fab中仅有1种(克隆F9)显示对于钙黏着蛋白-11EC1肽和EC1-2-Fc融合蛋白的特异性，不能结合到MN-Cad和钙黏着蛋白-8EC1结构域肽上(图3)。所测试的结合Cad-11EC1结构域的Fab中的大多数显示出与MN-Cad肽的交叉反应性，这种肽含有与Cad-11的EEY CAR序列重叠的EEY CAR序列。
[0148] 实例2：与钙黏着蛋白-11的EC1结构域相结合的Fab在体外测定中抑制了Cad-11介导的细胞聚集
[0149] 材料和方法
[0150] 体外钙黏着蛋白-11聚集测定
[0151] 431-D细胞悬浮生长并且在正常情况下不表达任何钙黏附蛋白并且不聚集。已经将431-D-11细胞进行遗传修饰以表达Cad-11。431-D-11细胞在培养基中单独孵育，并且它们开始聚集超过40分钟，并且这些细胞簇沉积在孔的底部，并且可以测量剩余的未聚集的、处于悬浮状态的细胞，并且计算聚集的431-D-11的百分数。对于这项聚集测定，431-d-11细胞(D-11细胞)在烧瓶中生长至亚会合状态，并接着使用0.05％胰蛋白酶加上
6
0.53mM EDTA将其从该烧瓶移出。将大约2x10个431-D-11细胞加到2ml的SME培养基中(Dulbecco’s Modified Eagle’s高葡萄糖培养基、0.1M Hepes、pH7.4、以及5U/mlDNA酶)，并且在一种测试试剂(例如，抗体、Fab、融合蛋白)不存在或存在时在冰上将其预孵化15分钟。在与该测试试剂预孵化之后，将这些细胞转移至24-孔板上的一种圆底孔中并且在
37℃下进行孵育，同时在旋转摇床上以130rpm进行旋转。当细胞聚集时，它们沉到该孔的底部。在0分钟和40分钟时，从该孔中、从该样品的中央去除200μl并且将其与25μl的
8％戊二醛进行混合以固定这些细胞。将200μl的所固定的细胞样品加入到9.8ml的库尔特粒度仪等渗盐水溶液中，并且使用设置在8μm至24μm阈值的库尔特粒度仪进行计数。
每个样品记录了3次细胞计数。计算了与在0分钟时间点相比在40分钟时间点时细胞减少或聚集细胞的百分比。
6
0.53mM EDTA将其从该烧瓶移出。将大约2x10个431-D-11细胞加到2ml的SME培养基中(Dulbecco’s Modified Eagle’s高葡萄糖培养基、0.1M Hepes、pH7.4、以及5U/mlDNA酶)，并且在一种测试试剂(例如，抗体、Fab、融合蛋白)不存在或存在时在冰上将其预孵化15分钟。在与该测试试剂预孵化之后，将这些细胞转移至24-孔板上的一种圆底孔中并且在
37℃下进行孵育，同时在旋转摇床上以130rpm进行旋转。当细胞聚集时，它们沉到该孔的底部。在0分钟和40分钟时，从该孔中、从该样品的中央去除200μl并且将其与25μl的
8％戊二醛进行混合以固定这些细胞。将200μl的所固定的细胞样品加入到9.8ml的库尔特粒度仪等渗盐水溶液中，并且使用设置在8μm至24μm阈值的库尔特粒度仪进行计数。
每个样品记录了3次细胞计数。计算了与在0分钟时间点相比在40分钟时间点时细胞减少或聚集细胞的百分比。
[0152] 结果
[0153] 具有对于在钙黏着蛋白-11EC1结构域的N端35个氨基酸之内的一种表位的结合特异性的候选Fab(克隆F9)(它不与MN-Cad或Cad-8的EC1结构域相结合)，是使用一种体外钙黏着蛋白-11细胞的聚集测定对于抑制Cad-11介导的细胞聚集的能力进行测试。该候选的Fab在1μg/ml或更低的浓度下显著地抑制了钙黏着蛋白-11介导的细胞聚集。
(图4和5)。相比之下，由13C2抗体(它结合到EC1/2结构域之外的Cad-11 胞外区中的一种表位上)制备的Fab仅仅在10μg/ml的浓度下就抑制了钙黏着蛋白-11的聚集，这提示F9Fab与结合到Cad-11胞外域的其他部分上的多种抗体相比以更低的浓度更加有效地抑制了Cad-11活性。
(图4和5)。相比之下，由13C2抗体(它结合到EC1/2结构域之外的Cad-11 胞外区中的一种表位上)制备的Fab仅仅在10μg/ml的浓度下就抑制了钙黏着蛋白-11的聚集，这提示F9Fab与结合到Cad-11胞外域的其他部分上的多种抗体相比以更低的浓度更加有效地抑制了Cad-11活性。
[0154] Cad-11介导的细胞聚集也被不同的抗-钙黏着蛋白-11EC1结构域Fab抑制，这些Fab对于单独的Cad-11、Cad-11与Cad-8，Cad-11与MN-Cad、或Cad-11、Cad-8与MN-Cad是特异的(图6和7)。相对于这些对照样品(例如，SME培养基)(图6))、对GFP特异的一种Fab(图7)，所测试的所有钙黏着蛋白-EC1-结构域特异性Fab都在体外抑制了细胞的聚集。
[0155] 实例3：包含人类钙黏着蛋白-11的EC1结构域的钙黏着蛋白-11/免疫球蛋白融合蛋白的产生。
[0156] 这种钙黏着蛋白-11EC1区是从一种载体制备的，该载体编码了全长人类钙黏着蛋白-11cDNA(将人类Cad-11克隆到 载体的Not1和Kpn-1位点)，这是在标准条件下使用聚合酶链式反应(PCR)进行的，使用1以下寡核苷酸引物从而将EcoR1和Bg1II位点(参见，对应地在正向和反向引物中的下划线序列)引入到所扩增的产物中：正向引物：
[0157] Tttttttttgaattcatgaaggagaactactgtttacaagc(SEQ ID NO：8)
[0158] EcoR1
[0159] 反向引物：
[0160] Tttttttttagatctctggaccttgacaatgaattccgacgg(SEQ ID NO：9)
[0161] Bg1II
[0162] 用限制性内切酶EcoR1和Bg1II将所扩增的产物消化，并且将这种消化产物分离并且使用对应的EcoR1和Bg1II位点将其连接到pFUSE-hIgG2e1-Fc1载体中(InvivoGen)。按照制造商所说明的用这种连接产物将TOP10感受态细菌(Invitrogen)转化，并且用新霉素(zeomycin)选择具有钙黏着蛋白-11-EC1-Fc质粒的细菌。将钙黏着蛋 白-11-EC1-Fc质粒分离、测序、并接着用于瞬时转染293F细胞。收集条件培养基，并且使用切向流过滤之后跟随在50/50混合的A/蛋白G柱(在20mM HEPES、pH7.4、137mM NaCl、3mM KCl、以及
1mM CaCl2中平衡)上分离而将钙黏着蛋白-11-EC1-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：9)纯化。使用0.1M甘氨酸(pH 3)和1mM CaCl2将纯化的钙黏着蛋白-11-EC1-Fc融合蛋白从该柱子中洗脱，并且进入包含200μl的1M Tris、pH7.4、以及1mM CaCl2的管中。然后，将这些具有Cad-11融合蛋白的洗脱液对20mM Hepes(pH7.4)、137mM NaCl、3mM KCl、以及1mMCaCl2进行透析。通过SDS PAGE证实了这种蛋白的大小(图10)，并且使用识别这种人类Fc区域的抗体通过蛋白质印迹分析以及对N端进行测序(未显示)证实了身份(图11)。使用与如上说明的那些相似的技术和条件产生Cad-11-EC1-2-Fc。
1mM CaCl2中平衡)上分离而将钙黏着蛋白-11-EC1-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：9)纯化。使用0.1M甘氨酸(pH 3)和1mM CaCl2将纯化的钙黏着蛋白-11-EC1-Fc融合蛋白从该柱子中洗脱，并且进入包含200μl的1M Tris、pH7.4、以及1mM CaCl2的管中。然后，将这些具有Cad-11融合蛋白的洗脱液对20mM Hepes(pH7.4)、137mM NaCl、3mM KCl、以及1mMCaCl2进行透析。通过SDS PAGE证实了这种蛋白的大小(图10)，并且使用识别这种人类Fc区域的抗体通过蛋白质印迹分析以及对N端进行测序(未显示)证实了身份(图11)。使用与如上说明的那些相似的技术和条件产生Cad-11-EC1-2-Fc。
[0163] 实例4：Cad-11-EC1-Fc免疫球蛋白融合蛋白在体外测定中抑制了Cad-11介导的细胞聚集
[0164] 材料和方法
[0165] 细胞侵入/迁移到基质胶塞中
[0166] 在FLS培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s高葡萄糖培养基[Sigma#D7777]、10 ％ 胎 牛 血 清[Benchmark#100-106]、1 ％ 青 霉 素(Pencillin)- 链 霉 素 [Gibco
315140-122]、1％L-谷氨酰胺[Gibco#25030]、0.5％庆大霉素[Gibco#15710-064])中在基
4
质胶ECM包被的转移孔(transwell)中评定了FLS的迁移活性。将在包含1x10个细胞的FLS培养基中的人类FLS细胞悬液加入到设置在24孔板的孔中的对照插入物或基质胶包被的插入物中，该24-孔板含有0.750mL的FLS培养基。然后，将这些板在37℃下、5％CO2大气压下、在一种增湿的组织培养孵育器中孵育达22个小时。
315140-122]、1％L-谷氨酰胺[Gibco#25030]、0.5％庆大霉素[Gibco#15710-064])中在基
4
质胶ECM包被的转移孔(transwell)中评定了FLS的迁移活性。将在包含1x10个细胞的FLS培养基中的人类FLS细胞悬液加入到设置在24孔板的孔中的对照插入物或基质胶包被的插入物中，该24-孔板含有0.750mL的FLS培养基。然后，将这些板在37℃下、5％CO2大气压下、在一种增湿的组织培养孵育器中孵育达22个小时。
[0167] 为了计算迁移的细胞的数目，通过用棉签擦拭将非侵入性细胞从对照插入物的膜的上表面移出。使用由FLS培养基沾湿的棉签重复第二次 擦拭。然后，将对照插入物固定，并且使用分化染色试剂盒[Fisher#122-911]进行染色。插入物允许被干燥，并且使用具有10x物镜的显微镜在该对照插入物的4个象限中对细胞进行计数。对插入物进行计数，重复三次，并且将总数进行平均。
[0168] 为了计算侵袭这些基质胶插入物的细胞的数目，通过用棉签进行擦拭将非侵入性细胞从该基质胶插入物的表面轻轻地去除。使用由FLS培养基沾湿的棉拭重复进行第二次擦拭。然后，将插入物固定，并且使用分化染色试剂盒[Fisher#122-911]进行染色。插入物允许被干燥，并且使用具有10x物镜的显微镜在该对照插入物的4个象限中对细胞进行计数。对插入物进行计数，重复三次，并且将总数进行平均。
[0169] 结果
[0170] Cad-11-EC1-Fc在3μg/ml的浓度下显著地抑制了细胞的聚集，而包含人类Cad-11的全部5个EC结构域的全长Cad-11-EC1-5-Fc蛋白在100μg/ml的浓度下抑制了Cad-11介导的聚集(图13)。这些数据显示Cad-11-EC1-Fc免疫球蛋白融合蛋白在体外测定中有效地抑制了Cad-11介导的细胞聚集。
[0171] 此外，体外测试了Cad-11-EC1-Fc免疫球蛋白融合蛋白抑制人类成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)侵入基质胶塞的能力。FLS侵入到基质胶中是一种复杂的过程，该过程涉及由FLS表达的MMP1、MMP-3、MMP-13、丝氨酸蛋白酶、及其他蛋白以降解该基质胶连同FLS迁移到基质胶中。在一种分开的测定中，我们没有看见对FLSA迁移通过正常纤维插入物的抑制。这提示这种EC-Fc或13C2单克隆抗体的作用是抑制该基质胶(一种关节软骨的代用品)的降解。在两个独立的实验中，Cad-11-EC1-Fc以及鼠抗Cad-11单克隆抗体13C2这两者均抑制了FLS侵入到基质胶塞中。
[0172] 实例5：对抗人类钙黏着蛋白-11的一种EC1结构域肽的抗体的产生。
[0173] 材料和方法
[0174] 用0.01mg的一种肽在足垫处对Balb/c小鼠进行免疫，每周两次(bi-weekly)，一个月9次，这种肽与人类Cad-11EC1结构域的前33个氨基酸(GWVWN QFFVI EEYTG PDPVL VGRLH SDIDS GDG(SEQID NO：10))相对应，以共价键与BSA连接。这种肽在此被称为肽4。从经免疫的小鼠得到脾，并且将其与一种鼠融合伴侣P3X63-Ag8.653进行融合，从而生成产生抗体的杂交瘤。以10、3或0.个5细胞/孔将这些杂交瘤扩展并且亚克隆，并且在ELISA中对来自这些杂交瘤的、含有抗Cad-11抗体的培养基筛选与在细菌中产生的、包含Cad-11EC1-2结构域的蛋白特异性地结合的能力。同时，对来自这些肽4杂交瘤的、包含抗-Cad-11抗体的培养基筛选与涵盖人类Cad-8和MN-钙黏着蛋白的EC1-2结构域的蛋白相结合的缺失。在4℃下用0.05ml的0.0至0.3mg/ml的EC1-2Cad蛋白中的每一种将
96-孔EIA板包被过夜，并接着用盐水缓冲液洗涤若干次。然后，用0.25ml的酪蛋白-PBS缓冲液封闭这些板，并且用盐水缓冲液洗涤若干次。在22℃下将包含这种抗Cad-11抗体的杂交瘤培养基在每个孔中进行未稀释地孵育达1小时，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100μl的一种羊抗小鼠IgG二抗的1/1000稀释液加入到每个孔中，在22℃下孵育30分钟，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100μl/孔的室温TMB(3，3’，5，
5’-四甲基联苯胺)试剂加入到每个孔中，并且允许在22℃下显色5分钟。用100μl的室温的2N硫酸将该反应终止，并且在Wallac 1420酶标仪上在450nm下读取该板。
96-孔EIA板包被过夜，并接着用盐水缓冲液洗涤若干次。然后，用0.25ml的酪蛋白-PBS缓冲液封闭这些板，并且用盐水缓冲液洗涤若干次。在22℃下将包含这种抗Cad-11抗体的杂交瘤培养基在每个孔中进行未稀释地孵育达1小时，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100μl的一种羊抗小鼠IgG二抗的1/1000稀释液加入到每个孔中，在22℃下孵育30分钟，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100μl/孔的室温TMB(3，3’，5，
5’-四甲基联苯胺)试剂加入到每个孔中，并且允许在22℃下显色5分钟。用100μl的室温的2N硫酸将该反应终止，并且在Wallac 1420酶标仪上在450nm下读取该板。
[0175] 使用ELISA进一步测试了H1M1和H14抗Cad-11抗体对抗Cad-11、Cad-7、Cad-8、Cad-20、Cad-24、Cad-9、Cad-18、以及MN-Cad的EC1结构域的前33个氨基酸的特异性。合成了与Cad-7、Cad-8、Cad-20、Cad-24、Cad-9、Cad-18、MN-Cad的区域(该区域与Cad-11EC1结构域的G1-G33区域重叠)相对应的肽，并且将这些肽与生物素相偶联。将100μl的这些肽中每一种的在PBS-Tween中(0.05％)的30ng/ml溶液在4℃下在96-孔Netravidin板的每个孔中孵育2-3小时，并接着用 PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。在22℃下将不同浓度的抗Cad-11抗体在每个孔中孵育1小时，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100μl的一种羊抗小鼠IgG二抗的1/1000稀释液加入到每个孔中，在22℃下孵育30分钟，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100ul/孔的室温TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)试剂加入到每个孔中，并且允许在22℃下显色5分钟。用100μl的室温的2N硫酸将该反应终止，并且在Wallac 1420酶标仪上在450nm下读取该板。
[0176] 对来自含有阳性抗Cad-11抗体杂交瘤的多个孔的培养基测试与Cad-11表达细胞相结合的能力。使冰冻的表达Cad-11的431D细胞解冻，并且在Hanks平衡盐水溶液(HBSS)2+
中洗涤两次，这种HBSS含有Ca (0.137M NaCl、5.4mM、KCl 0.25mM Na2HPO4、0.44mM KH2PO4、
2+ 6
1.3mM CaCl2、1.0mM MgSO4、以及4.2mM NaHCO)，并接着在含有Ca 的HBSS中以10 个细胞
5
/ml进行重悬。用50％或16％的抗Cad-11抗体培养基在冰上将10个细胞/孔染色45分
2+
钟，在含有Ca 的HBSS中洗涤两次，用一种与藻红蛋白(phytoerytherin)相偶联的羊抗鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)以1％的浓度在冰上染色45分钟，并
2+ 2+
接着在含由Ca 的HBSS中再洗涤两次。然后，在含有Ca 和1％甲醛的400μl HBSS中将这些细胞重悬，并且随后在FACScalibur(Becton Dickenson，Franklin Lakes，NJ)上对于PE阳性细胞进行分析。
中洗涤两次，这种HBSS含有Ca (0.137M NaCl、5.4mM、KCl 0.25mM Na2HPO4、0.44mM KH2PO4、
2+ 6
1.3mM CaCl2、1.0mM MgSO4、以及4.2mM NaHCO)，并接着在含有Ca 的HBSS中以10 个细胞
5
/ml进行重悬。用50％或16％的抗Cad-11抗体培养基在冰上将10个细胞/孔染色45分
2+
钟，在含有Ca 的HBSS中洗涤两次，用一种与藻红蛋白(phytoerytherin)相偶联的羊抗鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)以1％的浓度在冰上染色45分钟，并
2+ 2+
接着在含由Ca 的HBSS中再洗涤两次。然后，在含有Ca 和1％甲醛的400μl HBSS中将这些细胞重悬，并且随后在FACScalibur(Becton Dickenson，Franklin Lakes，NJ)上对于PE阳性细胞进行分析。
[0177] 结果
[0178] 来自这些肽4杂交瘤的、包含抗-Cad-11抗体的培养基与Cad-11EC1-2蛋白相结合(图16，HL对比Cad11)，但不结合包含Cad-8和MN-Cad的EC1-2结构域的蛋白(图16，对应地为HL对比Cad8以及HL对比MNCAD)。对照杂交瘤培养基不与所测试的钙黏着蛋白中的任何相结合(图16，Media对比CAD11、Media对比CAD8、以及Media对比MNCAD)。这些数据证明了在这些杂交瘤中存在针对肽4的Cad-11特异性抗体。
[0179] 两种肽4杂交瘤(在此被称为H1M1和H14)与表达人类Cad-11蛋白的细胞相结合(图17A至C和17G至I)，但不与非Cad-11对照431-D细胞相结合(图17D至17F)。被称为H1M1的杂交瘤细胞系具有A.T.C.C.命名号PTA-9699，已经于2009年1月8日保存。被称为H14的杂交瘤细胞系具有A.T.C.C.命名号PTA-9701，已经于2009年1月9日保存。
这些杂交瘤包含体外识别肽4以及表达Cad-11的细胞的抗Cad-11抗体。这些抗体与表达Cad-11-的细胞的结合是用所使用的肽4抗体的量进行滴定来显示的，正如在H1M1的滴定(图18A)和H14的滴定(图18B)对比来自平均荧光强度(MFI)的细胞染色强度的曲线图所示。
这些杂交瘤包含体外识别肽4以及表达Cad-11的细胞的抗Cad-11抗体。这些抗体与表达Cad-11-的细胞的结合是用所使用的肽4抗体的量进行滴定来显示的，正如在H1M1的滴定(图18A)和H14的滴定(图18B)对比来自平均荧光强度(MFI)的细胞染色强度的曲线图所示。
[0180] 与所测试的任何其他钙黏着蛋白(它们包括Cad-7、Cad-8、Cad-20、Cad-24、Cad-9、Cad-18、以及MN-Cad)相比，H1M1和H14肽4抗-Cad-11抗体证明了与Cad-11相结合高出超过100倍。在大多数情况下，没有观察到H1M1和H14抗Cad-11抗体与其他钙黏着蛋白的结合。抗Cad-11抗体H14显示出对Cad-11的强结合(图19A)，对Cad-8的结合低468倍(图19A)，并且几乎不结合Cad-7、MN-Cad、Cad-9、Cad-18、Cad-20、或Cad-24(图19B)。类似的，抗Cad-11抗体H1M1显示出对Cad-11的强结合(图20)，对Cad-8的结合低365倍(图20)，并且不结合Cad-7、MN-Cad、Cad-9、Cad-18、Cad-20、或Cad-24(数据未显示)。
[0181] 实例6：这些抗Cad-11EC1结构域抗体H1M1和H14与包括氨基酸序列GPDP的Cad-11EC1结构域中的表位相结合。
[0182] 材料和方法
[0183] 为了确定在肽4Cad-11EC1抗体H1M1和H14所结合的Cad-11EC1结构域内的表位，将跨越EC1区域的前37个氨基酸的4种不同的肽(见图22)以一种ELISA形式进行固定，并且确定了H1M1和H14抗体与这4种肽中的每一种相结合的能力。在4℃下用0.3ng/孔的肽1(Cad-11EC1结构域的氨基酸G1-P18)、0.3ng/孔的肽2(Cad-11EC1结构域的氨基酸G15-N34)、0.3ng/孔的肽3(Cad-11EC1结构域的氨基酸 V19-Y37)、0.3ng/孔的免疫原肽4(Cad-11EC1结构域的氨基酸G1-G33)、20ng的一种融合蛋白(包括整个EC1结构域(EFL))、或20ng的对照人类Ig(Fc-段)将96-孔再反应结合板包被过夜。将这些孔用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次、在22℃下用在dH2O中的酪蛋白封闭3小时，并接着用PBS-Tween(0.05％)再次洗涤两次。将不同稀释的这些不同的肽4CAD-11EC1结构域抗体转移到这些肽或蛋白包被的孔中，在22℃下孵育45分钟，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100μl的羊抗小鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)的
1/1000稀释液加入到每个孔中，在22℃下孵育30分钟，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100μl/孔的室温TMB试剂加入到每个孔，并且允许在22℃下显色5分钟。用
100μl的室温的2N硫酸将该反应终止，并且在Wallac 1420酶标仪上在450nm的波长下读取该板。
1/1000稀释液加入到每个孔中，在22℃下孵育30分钟，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100μl/孔的室温TMB试剂加入到每个孔，并且允许在22℃下显色5分钟。用
100μl的室温的2N硫酸将该反应终止，并且在Wallac 1420酶标仪上在450nm的波长下读取该板。
[0184] 结果
[0185] 在该ELISA中，肽4抗-Cad-11抗体H1M1在1∶11下(图21A)并且H14在1∶23下(图21B)均与肽4(PEP4)免疫原、连同EC1结构域融合蛋白(EFL)相结合，正如通过相对于对照物提高的OD450孔板读数所指示。这些抗体中没有一种与这种人类IgG对照(Fc段)相结合。此外，在该ELISA中这两种抗体均与肽2(PEP2)相结合，但不结合肽1(PEP1)或肽3(PEP3)(图21A和21B)。
[0186] 这些结果提示这些抗Cad-11EC1结构域抗体(H1M1和H14)与一种常见表位(common epitope)相结合，该表位在肽2和4中、但不存在于重叠的肽3中。作为肽3的上游、由肽2和4共有的氨基酸在图22所示的加框区域中被突出显示。从Cad-11EC1结构域的G15开始，这四个氨基酸GPDP(SEQ ID NO：11)可能是由H1M1和H14抗体所识别的表位的一部分。
[0187] 实例7：抗Cad-11EC1结构域抗体H1M1和H14体外抑制了表达Cad-11的细胞的聚集。
[0188] 材料和方法
[0189] 为了评估这些Cad-11抗体抑制Cad-11介导的细胞聚集的能力，将30μg/ml的H1M1肽4抗体与75,000个表达Cad-11的A-431-D表皮样癌细胞在24-孔圆底聚丙烯板中、在0.5ml的DMEM-高葡萄糖、20mMHepes pH 7.4、10％FCS、以及10U/ml DNA酶中培养。将这些24-孔板放置在旋转的平台上(以大约60rpm)，并且在37℃下用5％CO2孵育过夜。
第二天，在100x(对于H1M1实验)或40x(对于H14实验)放大倍数下对这些板拍照之后评定细胞的聚集。
第二天，在100x(对于H1M1实验)或40x(对于H14实验)放大倍数下对这些板拍照之后评定细胞的聚集。
[0190] 结果
[0191] 在对照同种型抗体(30μg/ml)的存在下，这些表达Cad-11的细胞形成了大块(图23A)，而这些亲本的Cad-11阴性细胞保持着单细胞群或双细胞群(图23C)。这些H1M1处理的Cad-11细胞保持为小的细胞簇(图23B)，这些细胞簇没有发展形成使用该对照抗体所获得的大的团块。
[0192] 使用相同的测定，抗Cad-11抗体H14还显示出抑制Cad-11-介导的聚集。尽管这些亲本的表达Cad-11的细胞形成了大的聚集的细胞簇(图24A)，这种H14抗体(图24B)在30μg/ml的浓度下抑制了聚集，因为细胞簇是小的并且稀少的。这些结果表明这些抗Cad-11抗体(H1M1和H14)在体外抑制了Cad-11介导的细胞聚集。
[0193] 实例8：抗Cad-11EC1结构域抗体(H1M1和H14)在类风湿性关节炎的鼠模型中在体内抑制与关节炎相关联的关节肿胀。
[0194] 材料和方法
[0195] 研究1-在第0天和第2天用150μl的KBN血清注射六周龄的雄性C57/B16小鼠。经KBN血清处理的小鼠接受了盐水注射液(图25，空心的三角形)或用不同剂量的H1M1抗-Cad-11EC1抗体进行治疗。治疗方案包括：在第0天用0.5mg的抗体/小鼠进行给药，并且在这之后每隔一天(q2d)用0.1mg的抗体/小鼠(0.5mg+0.1mg)进行给药(图25，实心三角形)；在第0天用0.5mg的抗体/小鼠(0.5mg)进行给药(图25，菱形)；每隔一天(q2d)用0.1mg的抗体/小鼠(0.1mg+0.1mg)进行给药(图25，正方形)；或每隔一天(q2d)用0.3mg的抗体/小鼠(0.3mg+0.3mg)进行给药(图25，圆形)。对照组由5只小鼠组成，并且治疗组由7只小鼠组成。与关节炎相关联的关节肿胀是通过每隔一天采取的卡尺测量来确定的。
[0196] 研究2-在第0天和第2天用150μl的KBN血清注射六周龄的雄性C57/B16小鼠，并接着每隔一天(q2d)用盐水治疗(图26，三角形)、或用抗Cad-11抗体H1M1(图26，正方形)或H14(图26，圆形)之一以0.3mg/剂量q2d治疗。对照组由5只小鼠组成，并且治疗组由7只小鼠组成。与关节炎相关联的关节肿胀是通过每隔一天采取的卡尺测量来确定的。
[0197] 结果
[0198] 研究1-相对于对照小鼠，H1M1抗-Cad-11抗体抑制了关节肿胀。与关节炎相关联的关节肿胀的最大抑制是通过每隔一天用0.3mg的H1M1抗体对经KBN处理的小鼠进行给药来进行观察的(图25，圆形)。
[0199] 研究2-相对于对照，这两种抗-Cad-11抗体均抑制了关节肿胀。在这项研究中，与这些对照动物相比，这种H14抗体显著地延迟了关节炎的发作(图27)。在对照组中所有小鼠都在第3天发展成了关节炎，而在所有这些动物发展成关节炎之前H14治疗的小鼠要求6天。
[0200] 这些研究表明对抗人类Cad-11的EC1结构域的抗体可以在体内抑制关节炎的发展和严重程度。
[0201] 实例9：对抗人类钙黏着蛋白-11的另一种EC1结构域肽的抗体的产生。
[0202] 材料和方法
[0203] 用0.01mg的肽V19-Y37(VL VGRLH SDIDS GDGNI KY(SEQ IDNO：12))在足垫处对Balb/c小鼠进行免疫，一周两次，一个月9次，这种肽与人类Cad-11EC1结构域的19个氨基酸相对应、以共价键与BSA相连接。这种肽在此被称作肽3。从经免疫的小鼠中得到脾，并且将其与一种鼠融合伴侣P3X63-Ag8.653融合，从而生成产生抗体的杂交瘤。将这些杂交瘤扩展，并且对来自这些杂交瘤的、包含抗Cad-11抗体的培养基筛选与一种蛋白相结合的能力，该蛋白对应于在细菌中产生的Cad-11的EC1-2结构域。同时，对来自这些肽3杂交瘤的、包含抗-Cad-11抗体的培养基筛选与涵盖Cad-8和MN--钙黏着蛋白的EC1-2结构域的蛋白相结合的缺失。在4℃下用0.05ml的0至300mg/ml的EC1-2Cad蛋白中每一种蛋白、或CHO细胞产生的EC1-Fc融合蛋白将96-孔EIA板包被过夜，并接着用盐水缓冲液洗涤若干次。然后，用0.25ml的酪蛋白-PBS缓冲液封闭这些板，并且随后用盐水缓冲液洗涤若干次。在22℃下将含有这些肽3抗Cad-11抗体的杂交瘤培养基在每个孔中未稀释地孵育1小时，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100μl的一种羊抗小鼠IgG二抗的1/1000稀释液加入到每个孔中，在22℃下孵育30分钟，并接着用PBS-Tween(0.05％)洗涤两次。将100μl/孔的室温TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)试剂加入到每个孔，并且允许在22℃下显色5分钟。用100μl的室温的2N硫酸将该反应终止，并且在Wallac 1420酶标仪上在450nm下读取该板。
[0204] 还对来自这些肽3杂交瘤的培养基测试了与在细胞上表达的人类Cad-11蛋白相2+
结合的能力。冰冻的表达Cad-11的431D细胞被解冻，并且在含有Ca 的HBSS中洗涤两
6 2+
次，并接着以10个细胞/ml在含有Ca 的HBSS中重悬。用50％或16％抗Cad-11抗体培
5 2+
养基在冰上将10个细胞/孔染色45分钟，在含有Ca 的HBSS中洗涤两次，并接着用一种与藻红蛋白相偶联的羊抗小鼠IgG二抗以1％的浓度在冰上染色45分钟， 并接着在含有
2+ 2+
Ca 的HBSS中再次洗涤两次。然后，在含有Ca 和1％甲醛的400μl HBSS中将这些细胞重悬，并且随后在FACScalibur上对PE阳性细胞进行分析。
结合的能力。冰冻的表达Cad-11的431D细胞被解冻，并且在含有Ca 的HBSS中洗涤两
6 2+
次，并接着以10个细胞/ml在含有Ca 的HBSS中重悬。用50％或16％抗Cad-11抗体培
5 2+
养基在冰上将10个细胞/孔染色45分钟，在含有Ca 的HBSS中洗涤两次，并接着用一种与藻红蛋白相偶联的羊抗小鼠IgG二抗以1％的浓度在冰上染色45分钟， 并接着在含有
2+ 2+
Ca 的HBSS中再次洗涤两次。然后，在含有Ca 和1％甲醛的400μl HBSS中将这些细胞重悬，并且随后在FACScalibur上对PE阳性细胞进行分析。
[0205] 结果
[0206] 来自来自这些肽3杂交瘤的、包含抗-Cad-11抗体的培养基与Cad-11EC1-2蛋白以及EC1-Fc融合蛋白相结合(图28，对应地是HL对比Cad11以及HL对比Cad11-EC1)，但不结合包含Cad-8和MN-Cad的EC1-2结构域的蛋白(图28，对应地是HL对比Cad8、以及HL对比MNCAD)。对照杂交瘤培养基不结合任何钙黏着蛋白蛋白(图28，Media对比CAD11、Media对比CAD8、并且Media对比MNCAD)。
[0207] 来自这些肽3杂交瘤的抗-Cad-11抗体还与表达人类Cad-11蛋白的细胞相结合(图29，见箭头)，但未与不表达Cad-11的对照细胞(表达Neos)相结合。这种结果证实：在这些杂交瘤中存在体外识别肽3和表达Cad-11-的细胞的抗Cad-11抗体。
[0208] 所有专利、公开的申请以及参考文献的有关传授内容都通过引用将其全文进行结合。
[0209] 尽管本发明已经通过参考本发明的示例性实施方案进行了具体地显示和说明，本领域中的普通技术人员应当理解在其中可以在形式和细节方面做出不同的改变，而没有偏离由所附的权利要求所涵盖的本发明的范围。
[0210] WO 2009/089062 PCT/US2009/000162
[0213] (PCT/细则13之二)
[0214]
[0215]
[0216] 基于PCT/RO/134(1998年7月；2004年1月重印)
[0217] 关于保藏的微生物以及其他生物材料的说明
[0218] (附加页)
[0219] C.附加说明(续前页)
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