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一种含磷微 生物胶囊及其制备方法与应用

阅读：272发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种含磷微生物胶囊及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种含磷微生物胶囊及其制备方法及应用。本发明提供的含磷微生物胶囊不仅可以提高微生物活性，而且增加了解磷微生物与含磷材料的接触面积，可以加速 PO43-的溶出，提高修复效率。本发明制备的含磷微生物胶囊充分发挥了解磷微生物和含磷材料对重金属的协同修复作用，表现出对铅良好的钝化效果，可用于稳定土壤和底泥中的铅，具有良好的应用前景。，下面是一种含磷微生物胶囊及其制备方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种含磷微生物胶囊，为由囊壁和液体囊芯组成的液芯胶囊；
构成所述囊壁的材料包括水凝胶；
构成所述液体囊芯的材料包括含磷化合物和解磷微生物。
2.根据权利要求1所述的含磷微生物胶囊，其特征在于：所述水凝胶选自海藻酸钠水凝胶和聚乙烯醇水凝胶中至少一种；
所述含磷化合物选自磷酸钙、羟基磷灰石和磷酸氢钙中至少一种；
所述解磷微生物选自非脱羧勒克菌、苏云金芽孢杆菌和恶臭假单胞杆菌中至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的含磷微生物胶囊，其特征在于：所述水凝胶和含磷化合物的质量比为1：0.005-0.05；
所述水凝胶与解磷微生物的质量比为1：0.1-1。
4.根据权利要求1-3中任一所述的含磷微生物胶囊，其特征在于：构成所述囊壁的材料还包括交联剂；
所述交联剂具体选自CaCl2的水溶液和硼酸水溶液中至少一种；
所述含磷化合物与交联剂的用量比为1g:10-500mL。
5.一种制备权利要求1-4中任一所述含磷微生物胶囊的方法，包括：
将含有所述解磷微生物的菌液与含磷化合物混合后，再在交联剂存在的条件下与凝胶剂进行反应，反应完毕得到所述含磷微生物胶囊。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述交联剂选自CaCl2的水溶液和硼酸水溶液中至少一种；
所述凝胶剂选自海藻酸钠和聚乙烯醇水凝胶中至少一种。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述与凝胶剂进行反应的方式为滴加到所述凝胶剂中；
具体的，所述滴加步骤中，滴加的速率为1-2mL/min。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述含有所述解磷微生物的菌液与含磷化合物的质量比为0.264：0.015～0.031；
所述含有所述解磷微生物的菌液与所述交联剂的用量比为0.264g：2-10mL；
所述凝胶剂与所述含磷化合物的质量比为1：0.005-0.05；
所述含磷化合物与交联剂的用量比为1g:10-500mL。
9.权利要求1-4任一所述含磷微生物胶囊在重金属污染土壤的修复中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述重金属为铅、镉或锌；
所述修复为钝化；
所述含磷微生物胶囊的用量为重金属污染土壤重量的1-10％；具体为2％。

说明书全文

一种含磷微 生物胶囊及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物稳定修复重金属污染土壤和底泥领域，涉及一种含磷微生物胶囊及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 铅对于环境的污染，主要是铅冶炼企业在冶炼过程中产生的含铅废水，废渣随意排放造成的；另外，工业生产和交通运输中产生的含铅废气，会随着大气沉降进入土壤和底泥环境中。由于铅自身难以降解，不断蓄积于土壤和底泥中，因此土壤和底泥铅污染问题日趋严重。

[0003] 目前治理铅污染的途径主要有两种：一是通过客土易土、清淤疏浚等方法，使土壤和底泥中铅的含量降低，从而改善铅污染状况；二是改变铅在土壤和底泥中的存在形式，减少其中有效态铅的含量，降低铅在环境中的迁移性和生物可利用性，减少铅在食物链中的传递和积累。

[0004] 原位钝化修复方法是修复中轻度铅污染土壤和底泥的较好选择，符合我国可持续发展战略要求，受到广泛关注。磷酸盐能够在一定程度上通过化学作用降低环境中重金属的毒性和生物可利用性，国内外很多研究表明，磷酸盐材料，如磷酸三钙(TCP)，磷酸氢二铵(DAP)，羟基磷灰石(HAP)和其他合成的磷酸盐材料等能够与铅生成磷氯铅矿等自然界中几乎最稳定的物质，从而有效地减少土壤和底泥中铅的浸出率。因此，近二十年来，不断有学者尝试用各种磷酸盐材料作为化学稳定剂治理铅污染，并充分研究了磷酸盐材料与铅相互作用的机制。万佳等(湖南大学，2018)制备了改性纳米氯磷灰石并将其用于铅污染底泥的稳定修复，结果表明，其用表面活性剂改性的纳米氯磷灰石处理的底泥在23天左右其毒性淋溶可提取态(TCLP)铅去除率就达到了100％。付煜恒等(环境工程，2017，35(9):177-180)用磷酸二氢钙修复铅污染土壤，结果表明对铅的钝化率可以达到69.81％。

[0005] 解磷微生物能将难溶磷转化为可溶性磷来修复重金属铅，可以很大程度地提高对铅的稳定效率。微生物新陈代谢过程中产生的代谢产物及微生物自身均能络合环境中的重金属，实现不同重金属形态间的转化，从而影响重金属的生物有效性。另外，利用解磷微生物来修复铅污染土壤和底泥不会对生态系统造成巨大扰动，并可节约磷矿资源，是一种经济绿色的修复技术。姚倩等(西北大学，2017)研究了两株解磷菌对铅污染底泥的钝化效应，并初步探讨了解磷菌钝化铅污染的作用机制，实验结果表明，解磷菌能够显著降低底泥中可交换态和碳酸盐结合态的铅。但土壤和底泥中存在大量的污染物，种类复杂，毒性较大，外来微生物在短期内难以适应环境条件，其生长代谢会受到影响甚至可能失活。

[0006] 综上，虽然含磷物料和解磷微生物修复铅污染土壤和底泥均具有一定的效果，但均有各自的弊端，且即使将二者按照常规方法进行叠加、套用，仍然无法克服其原有的缺陷。因此，亟需开发一种协同效果好且施用简便的新型铅钝化剂，以有效地解决土壤和底泥中的铅污染问题。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种含磷微生物胶囊及其制备方法与应用。该含磷微生物胶囊的制备工艺简单，可以节约磷矿资源，且对生态系统的影响较小，可有效降低我国铅污染土壤和底泥对动植物及人类健康的潜在风险，并且可以为微生物修复土壤和底泥重金属污染提供理论支撑。

[0008] 本发明提供的含磷微生物胶囊，为由囊壁和液体囊芯组成的液芯胶囊；

[0009] 构成所述囊壁的材料包括水凝胶；

[0010] 构成所述液体囊芯的材料包括含磷化合物和解磷微生物。

[0011] 上述含磷微生物胶囊中，所述水凝胶选自为海藻酸钠水凝胶和聚乙烯醇水凝胶中至少一种；

[0012] 所述含磷化合物选自磷酸钙、羟基磷灰石和磷酸氢钙中至少一种；

[0013] 所述解磷微生物选自非脱羧勒克菌、苏云金芽孢杆菌和恶臭假单胞杆菌中至少一种；

[0014] 所述水凝胶和含磷化合物的质量比为1:0.005-0.05；具体为1：0.0069、1：0.0083、1：0.00964、1：0.011、1：0.012和1：0.014；

[0015] 所述水凝胶与解磷微生物的质量比为1:0.1-1；具体为1:0.12；上述解磷微生物的质量为菌体湿重。

[0016] 构成所述囊壁的材料还可包括交联剂；

[0017] 所述交联剂具体选自CaCl2的水溶液和硼酸水溶液中至少一种；

[0018] 具体的，所述CaCl2的水溶液中，CaCl2和水的用量比为5～15g：100mL；具体为10g：100mL；

[0019] 所述含磷化合物与交联剂的用量比为1g:10-500mL；具体为1g：230mL。

[0020] 本发明提供的制备所述含磷微生物胶囊的方法，包括：

[0021] 将含有所述解磷微生物的菌液与含磷化合物混合后，再在交联剂存在的条件下与凝胶剂进行反应，反应完毕得到所述含磷微生物胶囊。

[0022] 上述方法中，所述交联剂选自CaCl2的水溶液和硼酸水溶液中至少一种；

[0023] 具体的，所述CaCl2的水溶液中，CaCl2和水的用量比为5～15g：100mL；具体为10g：100mL；

[0024] 所述凝胶剂选自海藻酸钠和聚乙烯醇水凝胶中至少一种；

[0025] 具体的，所述海藻酸钠或聚乙烯醇水凝胶以水溶液的形式加入到反应体系中；所述海藻酸钠或聚乙烯醇水凝胶和水的用量比为0.2～0.5g：100mL；具体为0.3g：100mL；

[0026] 所述与凝胶剂进行反应的方式为滴加到所述凝胶剂中；所述滴加步骤中，滴加的速率为1-2mL/min。

[0027] 所述含有所述解磷微生物的菌液可按照各种常规方法制得，如可按照如下方法制得：

[0028] 1)非脱羧勒克菌的菌悬液的制备：取培养好的非脱羧勒克菌的斜面菌种接种于无菌种子培养基中，于28℃振荡培养10～12h，得到OD600值为0.8～1之间的非脱羧勒克菌的菌悬液；

[0029] 2)将50mL OD600值为0.8～1的所述非脱羧勒克菌的菌悬液离心，弃去上清液，得到下层菌体，即为所述含有所述解磷微生物的菌液。

[0030] 具体的，所述含有所述解磷微生物的菌液与含磷化合物的质量比为0.264：0.015～0.031；具体为0.264：0.0217、0.264：0.0155、0.264：0.0186、0.264：0.0248、0.264：0.0279、0.264：0.031；

[0031] 所述含有所述解磷微生物的菌液与所述交联剂的用量比为0.264：2-10mL；具体为0.264：5mL；

[0032] 所述凝胶剂与所述含磷化合物的质量比为1：0.005-0.05；具体为1:0.01、1：0.0069、1：0.0083、1：0.011、1：0.012或1：0.014；

[0033] 所述含磷化合物与交联剂的用量比为1g:10-500mL；具体为1g：161mL、1g：179mL、1g：202mL、1g：269mL、1g：230mL或1g：322mL。

[0034] 另外，上述本发明提供的含磷微生物胶囊在重金属污染土壤的修复中的应用，也属于本发明的保护范围。具体的，所述重金属为铅、镉或锌；

[0035] 所述修复为钝化；

[0036] 所述含磷微生物胶囊的用量为重金属污染土壤重量的1-10％；具体为2％。

[0037] 本发明提供的含磷微生物胶囊的制备工艺简单，生产成本低，可以节约磷矿资源，易于实现工业化规模生产且对生态系统的影响较小，可有效降低我国铅污染土壤和底泥对动植物及人类健康的潜在风险，并且可以为微生物修复土壤和底泥重金属污染提供理论支撑，具有重要的应用价值。附图说明

[0038] 图1为含磷微生物胶囊的制备过程示意图。

[0039] 图2为所制备的含磷微生物胶囊的外貌图片。

[0040] 图3为含不同Ca3(PO4)2的微生物胶囊对液体培养基中Pb2+的去除效果。

[0041] 图4显示了所制备的含磷微生物胶囊在不同初始Pb2+浓度条件下的作用效果。

[0042] 图5表示含磷微生物胶囊对铅污染底泥的修复效果。

具体实施方式

[0043] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

[0044] 下述实施例所用菌株MRP-1已于2017年08月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.14561，分类命名为非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)；

[0045] 所用菌株MRP-2已于2018年02月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.15337，分类命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；

[0046] 所用菌株MRP-3已于2018年02月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.15338，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)。

[0047] 实施例1、含磷微生物胶囊的制备。

[0048] 具体包括以下步骤：

[0049] (1)非脱羧勒克菌的菌悬液制备：取培养好的非脱羧勒克菌的斜面菌种接种于无菌种子培养基中，于28℃振荡培养10～12h，得到OD600值为0.8～1之间的非脱羧勒克菌的菌悬液。

[0050] (2)将50mL OD600值为0.8～1之间的非脱羧勒克菌的菌悬液离心后，弃去上清液，得到下层菌体，其质量约为0.264g(wt)。

[0051] (3)向步骤(2)得到的菌体中加入0.0217g Ca3(PO4)2，再加入5mL交联剂，混匀。

[0052] (4)将步骤(3)中的混合悬液用10mL注射器逐滴滴入不断搅拌的海藻酸钠的水溶液中，滴加的速率为1ml/min，滴加完毕即可得到含磷微生物胶囊，如图2所示。

[0053] 步骤(3)中，所述交联剂是按照10g：100mL的比例将无水CaCl2溶于纯净水中制备得到的。

[0054] 步骤(4)中所述海藻酸钠的水溶液为0.3g：100mL的比例将海藻酸钠溶于纯净水中，40℃水浴加热溶解而得。海藻酸钠的总质量用量为2.17g；也即海藻酸钠与Ca3(PO4)2的质量比为1:0.01；

[0055] 该实施例所得含磷微生物胶囊的平均粒径为0.5cm。该含磷微生物胶囊中，囊壁为海藻酸钠水凝胶，囊芯为由非脱羧勒克菌菌体和Ca3(PO4)2组成。其中，每个胶囊中，1g海藻酸钠水凝胶对应的Ca3(PO4)2的质量为0.00964g，对应的菌体(湿重)为0.11733g。

[0056] 实施例2、含磷微生物胶囊中磷的含量对Pb2+去除性能的影响。

[0057] 具体包括以下步骤：

[0058] (1)同实施例1中含磷微生物胶囊的制备方法，将实施例1中步骤(3)的Ca3(PO4)2的质量依次替换为0.0155g，0.0186g，0.0248g，0.0279g，0.031g，得到含磷微生物胶囊，平均粒径为0.5cm。上述含磷微生物胶囊中，囊壁均为海藻酸钠水凝胶，囊芯为由非脱羧勒克菌菌体和Ca3(PO4)2组成的液体囊芯。其中，每个胶囊中，1g海藻酸钠水凝胶对应的Ca3(PO4)2的质量依次为0.0069、0.0083、0.011、0.012和0.014g，对应的菌体(湿重)均为0.11733g。

[0059] (2)将所制得的含磷微生物胶囊按2％的投加量，加入无菌的含铅无机盐培养基中。

[0060] (3)然后将步骤(2)中加入含磷微生物胶囊的培养基在28℃，120rpm的震荡培养箱中培养24h。

[0061] (4)对培养基中剩余Pb2+离子进行测定分析，测定方法为ICP-MS(电感耦合等离子质谱)，其测定结果如图3所示。

[0062] 步骤(2)中无机盐培养基主要成分：葡萄糖10.0g/L、NaCl 0.3g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、MnSO4·4H2O 0.03g/L、KCl 0.3g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L。加入1mM Pb2+(由Pb(NO3)2提供)，所述培养基在121℃110kPa下，灭菌30min。

[0063] 图3为不同Ca3(PO4)2含量的微生物胶囊对培养基中Pb2+的去除率。由图3可知，随含磷量的增加，Pb2+去除率不断增大，当Ca3(PO4)2含量为0.07mM时，去除率达到98％，继续增加Ca3(PO4)2的含量，去除率变化不大。因此，当包裹0.07mM Ca3(PO4)2时，可以得到最佳的含磷微生物胶囊。

[0064] 实施例3、含磷微生物胶囊对不同含量铅的去除性能。

[0065] 具体包括以下步骤：

[0066] (1)同实施例1中含磷微生物胶囊的制备方法。

[0067] (2)将步骤(1)中所制得的含磷微生物胶囊按2％的投加量，加入无菌的含不同浓度铅的改进无机盐培养基中。

[0068] (3)然后将步骤(2)中加入含磷微生物胶囊的培养基在28℃，120rpm的震荡培养箱中培养24h。

[0069] (4)对培养基中剩余Pb2+离子进行测定分析，测定方法同实施例2，其测定结果如图4所示。

[0070] 步骤(2)中无机盐培养基主要成分同实施例2，其中Pb2+的含量分别为0.02mM，0.05mM，1mM，2.5mM，3mM。

[0071] 图4显示了在不同初始铅浓度下，含磷微生物胶囊对培养基中Pb2+的去除效果。由2+
图可知，当初始铅浓度在1mM以下时，含磷微生物胶囊对Pb 的去除率可以达到96％左右，当Pb2+浓度超过1mM时，胶囊对Pb2+的去除率大幅降低至40％左右，这可能是由于Pb2+浓度过高，对微生物的毒害作用增加，微生物生长代谢受到抑制，因此对Pb2+的去除率降低。由此我们可以得出，该含磷微生物胶囊适用于1mM及以下Pb2+浓度的环境条件。

[0072] 实施例4、含磷微生物胶囊对铅污染底泥的模拟修复

[0073] 具体包括以下步骤：

[0074] (1)底泥的采集与处理：选取水流缓慢、远离排污口、沉积物稳定的河流采样区域，在河流周围采用棋盘式布点法采样，采样深度为0-20cm，采集10袋样品，装入塑封袋，运回实验室。将所采取各个点的底泥平铺于阴凉处风干3-5天，去除大块石砾、植物碎片等杂物，混匀。将风干的底泥研磨，过1mm尼龙网筛，对其基本理化性质进行测定；剩余风干底泥用含500mg/L Pb2+的硝酸铅溶液进行人为污染，使其稳定，备用。

[0075] (2)称取4g稳定的风干底泥于150mL锥形瓶中，加入40mL无机盐培养基，在121℃，110kPa下，灭菌30min。

[0076] (3)同实施例1中含磷微生物胶囊的制备方法。

[0077] (4)将步骤(3)中所制得的含磷微生物胶囊按2％的投加量，加入步骤(2)中的模拟铅污染底泥中。

[0078] (5)然后将步骤(4)中加入含磷微生物胶囊的泥水混合物在28℃，120rpm的震荡培养箱中培养10天，分别于0d，3d，5d，10d取样，对底泥中铅的存在形态进行分析，其测定结果如图5所示。

[0079] 步骤(2)中无机盐培养基主要成分：葡萄糖10.0g/L、NaCl 0.3g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、MnSO4·4H2O 0.03g/L、KCl 0.3g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L。

[0080] 图5显示了用该含磷微生物胶囊模拟修复铅污染底泥过程中不同形态铅含量的变化情况。由图可知，随着时间的延长，底泥中弱酸态铅含量不断减少，修复10天后，弱酸态铅从最初的28％降低到14％，可还原态、可氧化态、残渣态所占比例则不断增加，说明弱酸态铅不断向其他更加稳定的形态转化，因此该含磷微生物胶囊对铅污染底泥有较好的稳定效果。

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一种含磷微生物胶囊及其制备方法与应用

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