技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，具体涉及一种猪源杂合抗菌肽PP-1及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 传统抗生素提高了动物的生产性能，降低了
疾病发生率，但同时也导致药物残留、耐药性菌株、环境污染等问题的产生。特别是近些年来滥用抗生素以及耐药性问题呈现日益加剧的趋势，由此可见研发高效且安全的新型
饲料对传统抗生素进行替代具有重要意义。抗菌肽是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分,不仅具有抑制、杀灭多种细菌、
真菌、病毒、寄生虫的生物学功能，而且可以提高动物
机体免疫能
力，不存在残留、无任何
副作用。因此，抗菌肽替代抗生素已成为近年来的研究热点。
[0003] 猪源抗菌肽种类较多，其中PR-39研究较为广泛，是一种富含脯
氨酸-精氨酸的由39个氨基酸残基组成的线性内源性抗菌肽。但是，其主要对革兰氏阴性菌具有抗菌作用，对部分
革兰氏阳性菌，比如金黄色葡萄球菌和
铜绿加单孢菌等，没有抑制作用。因此如何拓宽PR-39的抗菌谱具有重要的意义。
发明内容
[0004] 基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种猪源杂合抗菌肽PP-1，其序列如
序列表SEQ ID No.1所示，该多肽由猪源抗菌肽PR-39与猪源骨髓抗菌肽PMAP-23杂合，安全性较好，具有广谱抗菌活性、低毒性和低溶血性。
[0005] 本发明的另外一个目的在于提供一种猪源杂合抗菌肽PP-1的制备方法，该制备方法简单且技术成熟，合成成本低，适合应用于生产，方法步骤如下：
[0006] (1)根据猪源抗菌肽PR-39的氨基酸组成特点，截取其
片段与猪源骨髓抗菌肽PMAP-23或PMAP-36的片段杂合而获得氨基酸长度19至22的3条杂合抗菌PP-1、PP-2和PP-3，其序列分别如序列表SEQ ID No.1-3所示；
[0007] (2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成多肽；
[0008] (3)将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备；
[0009] (4)采用美国临床实验室标准化研究所推荐的测定最小抑菌浓度的方法，发现杂合抗菌PP-1的最小抑菌浓度平均值为3.56μM，且无溶血毒性，综合
治疗指数达到144，从而选取猪源杂合抗菌肽PP-1。
[0010] 本发明的另一目的在于提供如上所述的猪源杂合抗菌肽PP-1的在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
[0011] 本发明的优点及有益效果：该多肽由猪源抗菌肽PR-39与猪源骨髓抗菌肽PMAP-23杂合，安全性较好，具有广谱抗菌活性、低毒性和低溶血性；该多肽由19个氨基酸组成，肽链较短，制备方法简单且技术成熟，合成成本低，适合应用于生产。
附图说明
[0012] 图1为抗菌肽PP-1的质谱图。
[0013] 图2为抗菌肽PP-2的质谱图。
[0014] 图3为抗菌肽PP-3的质谱图。
具体实施方式
[0015] 下面结合
实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0016] 实施例1：猪源杂合抗菌肽的设计
[0017] 通过NCBI获取猪源抗菌肽PR-39、PMAP-23和PMAP-36氨基酸全序列，通过生物信息学分析，获得三者的核心区域。通过杂合方式，获得氨基酸长度19和22的3条抗菌肽序列PP-1，PP-2，PP-3。如表1所示。
[0018] 表1猪源杂合抗菌肽的氨基酸序列和分子量
[0019]
[0020] 实施例2：猪源杂合抗菌肽的合成
[0021] 将表1所示三条多肽使用多肽合成仪合成，选用固相有机合成，采用Fmoc保护合成法，合成方向从C端到N端逐一进行，具体步骤如下：
[0022] (1)选取已经和C端第一个氨基酸连接的Wang
树脂，即Fmoc-A(trt)-Wang(9-芴甲
氧羧基-三甲基-A，其中A为C端第一个氨基酸)，使用二甲基甲酰胺(DMF)浸泡15min左右以除去杂质；用含有20％哌啶的DMF脱除树脂上的Fmoc保护，反应20min，洗涤树脂直至完全。用DMF清洗掉哌啶，剩余的固体悬浮物即是脱保护的A-Wang。用印三
酮检测剂检查A-Wang脱保护的
质量。
[0023] (2)将Fmoc-B(trt)-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-B，B为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)与上述得到的脱保护的Wang树脂进行缩合反应；然后再脱去Fmoc基团。按照这个程序依次从C端到N端逐个延伸，直至将整个肽链合成完毕，当最后一个氨基酸脱保护后，用DMF洗涤8次，再用
乙醇和二氯甲烷(DCM)交叉洗涤8次。将三氟乙酸(TFA)：三异丙基氯
硅烷(TIS)：
水＝95：2.5：2.5(体积比)进行混合，配制成为切割
试剂与上述得到的多肽20℃下反应2h，把多肽从树脂上切割下来。
旋转蒸发仪蒸发TFA，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚沉淀多肽3h，析出白色粉末状固体。
真空干燥，得到粗品多肽。
[0024] (3)将上述粗品多肽使用90％乙腈水溶液溶解，使用制备色谱柱进行纯化，分析型色谱柱检测纯度。半制备型高效液相色谱仪为Waters Delta Prep 4000，制备色谱柱为Waters X-Bridge C18、5μm反相柱。洗脱液A为含有0.1％TFA的水溶液，B为含有0.1％TFA的乙腈水溶液；检测
波长220nm，洗脱方式为30％B～65％B的线性浓度梯度洗脱，流速为30mL/min。收集纯度高于95％的馏分，并
冷冻干燥。分析型高效液相色谱仪为Agilent 1100，分析型色谱柱为SepaxGP-C18反相柱(4.6mm×150mm,5μm)，洗脱液A液为0.1％TFA的水溶液，B液为含0.1％TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。洗脱方式为50％B～75％B的线性浓度梯度洗脱，流速为1.0mL/min。
[0025] (4)多肽的质谱鉴定：将上述得到的多肽经过电喷射质谱法分析，质谱图中显示的分子量与理论分子量一致。如附图所示。使用高效液相色谱进行纯化，使得抗菌肽的纯度大于95％。
[0026] 实施例3：猪源杂合抗菌肽的抑菌活性和细胞毒性测定
[0027] 采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的测定最小抑菌浓度(MIC)的方法，同
时针对抗菌肽的阳离子性的特征，进行了相应的改进。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液50μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含抗菌肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果如表2所示，可以看出，PP-1的最小抑菌浓度为2-8μM，PP-2的为1-4μM，PP-3的为4-16μM。从表3可以看出，PP-1、PP-2、PP-3的最小抑菌浓度分别为3.56、2、7.13μM。
[0028] 表2猪源杂合抗菌肽的抑菌活性
[0029]
[0030] 另外，通过利用人红细胞测定多肽的溶血活性，结果发现PP-1、PP-2、PP-3的最小溶血活性分别为>256、64、>256μM。综合最小抑菌浓度和最小溶血浓度，发现杂合肽PP-1、PP-2、PP-3的TI值依次为143.82、32和71.81，其中PP-1的TI值最大，显示出最高的治疗指数，更适宜于生产应用。
[0031] 表3猪源杂合抗菌肽的溶血活性
[0032]
[0033] 备注：
[0034] GM：代表最小抑菌浓度的几何平均数
[0035] MHC:代表最低溶血浓度
[0036] TI：代表MHC/GM
