通过酶缀合在大肠杆菌中生产重组疫苗
阅读：507发布：2020-05-08
专利汇可以提供通过酶缀合在大肠杆菌中生产重组疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在本文中提供了精通于体内生产糖缀合物的原核细胞，以及用于产生这些细胞的方法和使用这些细胞生产糖缀合物的方法。还包括提及的糖缀合物的组合物以及它们的不同用途。，下面是通过酶缀合在大肠杆菌中生产重组疫苗专利的具体信息内容。
1.用于生产多糖的经工程改造的革兰氏阴性菌，其中所述革兰氏阴性菌包含：
(a) 编码以下肺炎链球菌(S. pneumoniae)的荚膜多糖基因簇的调节基因wzg、wzh、wzd或wze的核酸：肺炎链球菌CPS1、CPS2、CPS3、CPS4、CPS5、CPS6A、CPS6B、CPS7A、CPS7B、CPS7C、CPS8、CPS9A、CPS9L、CPS9N、CPS9V、CPS10A、CPS10B、CPS10C、CPS10F、CPS11A、CPS11B、CPS11C、CPS11D、CPS11F、CPS12A、CPS12B、CPS12F、CPS13、CPS14、CPS15A、CPS15B、CPS15C、CPS15F、CPS16A、CPS16F、CPS17A、CPS17F、CPS18A、CPS18B、CPS18C、CPS18F、CPS19A、CPS19B、CPS19C、CPS19F、CPS20、CPS21、CPS22A、CPS22F、CPS23A、CPS23B、CPS23F、CPS24A、CPS24B、CPS24F、CPS25A、CPS25F、CPS26、CPS27、CPS28A、CPS28F、CPS29、CPS31、CPS32A、CPS32F、CPS33A、CPS33B、CPS33C、CPS33D、CPS33F、CPS34、CPS35A、CPS35B、CPS35C、CPS35D、CPS35F、CPS36、CPS37、CPS38、CPS39、CPS40、CPS41A、CPS41F、CPS42、CPS43、CPS44、CPS45、CPS46、CPS47A、CPS47F或CPS48；或
(b)编码无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)CPSIa、CPSIb、CPSII、CPSIII、CPSIV、CPSV、CPSVI、CPSVII或CPSVIII的荚膜多糖基因簇的调节基因CpsA、CpsB、CpsC或 CpsD的核酸；和
(c) 编码含有糖基化共有序列的载体蛋白的核酸，所述载体蛋白为来自铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的脱毒外毒素A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的脱毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、空肠弯曲杆菌(C. jejuni) AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、肺炎链球菌NOX、肺炎链球菌PspA、肺炎链球菌PcpA、肺炎链球菌PhtD、肺炎链球菌PhtE、肺炎链球菌Ply或肺炎链球菌LytB；
其中所述革兰氏阴性菌进一步包含对于所述革兰氏阴性菌异源的且来自弯曲杆菌（a Campylobacter species）的寡糖转移酶；并且
其中所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌(E. coli)，其中所述革兰氏阴性菌本身的一个或多个基因已缺失或失活，其中所述一个或多个已缺失或失活的基因包括waaL 基因。
2.权利要求1的革兰氏阴性菌，其中所述调节基因是来自1型肺炎链球菌或4型肺炎链球菌的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)调节基因。
3.权利要求1或2的革兰氏阴性菌，其中所述调节基因是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)调节基因。
4.权利要求1或2的革兰氏阴性菌，其中所述一个或多个缺失的基因包括与所述革兰氏阴性菌中O抗原生物合成有关的全部基因。
5.权利要求1或2的革兰氏阴性菌，其中所述调节基因是wzg、wzh、wzd或wze。
6.权利要求1或2的革兰氏阴性菌，其中所述荚膜多糖是肺炎链球菌CPS1、CPS2、CPS3、CPS4、CPS5、CPS6A、CPS6B、CPS7A、CPS7B、CPS7C、CPS8、CPS9A、CPS9L、CPS9N、CPS9V、CPS10A、CPS10B、CPS10C、CPS10F、CPS11A、CPS11B、CPS11C、CPS11D、CPS11F、CPS12A、CPS12B、CPS12F、CPS13、CPS14、CPS15A、CPS15B、CPS15C、CPS15F、CPS16A、CPS16F、CPS17A、CPS17F、CPS18A、CPS18B、CPS18C、CPS18F、CPS19A、CPS19B、CPS19C、CPS19F、CPS20、CPS21、CPS22A、CPS22F、CPS23A、CPS23B、CPS23F、CPS24A、CPS24B、CPS24F、CPS25A、CPS25F、CPS26、CPS27、CPS28A、CPS28F、CPS29、CPS31、CPS32A、CPS32F、CPS33A、CPS33B、CPS33C、CPS33D、CPS33F、CPS34、CPS35A、CPS35B、CPS35C、CPS35D、CPS35F、CPS36、CPS37、CPS38、CPS39、CPS40、CPS41A、CPS41F、CPS42、CPS43、CPS44、CPS45、CPS46、CPS47A、CPS47F或CPS48。
7.重组糖蛋白，其由权利要求1-6中任一项的革兰氏阴性菌生产。
8.生产重组糖蛋白的方法，其包括在适合于蛋白生产的条件下培养权利要求1-6中任一项的革兰氏阴性菌，任选地进一步包括纯化所述重组糖蛋白。
9.权利要求1-6中任一项的经工程改造的革兰氏阴性菌，其进一步包含类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides) O抗原基因簇和编码含有糖基化共有序列的载体蛋白的核酸，其中所述O抗原基因簇的wbgW基因是失活的，并且其中所述大肠杆菌细胞生产Und-PP-D-FucNAc4N。
10.权利要求1-6中任一项的经工程改造的革兰氏阴性菌，其进一步包含索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)或类志贺邻单胞菌O17 O抗原基因簇和编码含有糖基化共有序列的载体蛋白的核酸，其中所述O抗原基因簇的wbgW基因是失活的，并且其中所述大肠杆菌细胞生产Und-PP-D-FucNAc4N。
11.生产包含革兰氏阳性菌的荚膜多糖的重组糖蛋白的方法，其包括在合适蛋白生产的条件下培养权利要求1-6中任一项的革兰氏阴性菌，任选进一步包括纯化所述重组糖蛋白。
12.生产包含肺炎球菌多糖的糖缀合疫苗的方法，其包括通过在合适蛋白生产的条件下培养权利要求1-2或4-6中任一项的革兰氏阴性菌来生产重组糖蛋白，且任选进一步纯化所述重组糖蛋白。
通过酶缀合在大肠杆菌中生产重组疫苗
[0001] 1-前言
[0002] 在本文中提供了在体内熟练生产糖缀合物的原核细胞，以及用于产生这些细胞的方法和使用这些细胞生产糖缀合物的方法。还包括了提及的糖缀合物的组合物以及它们的不同用途。
[0003] 2-背景
[0005] 糖蛋白涉及数个过程诸如，细胞相互作用和细胞信号传导；它们参与分泌蛋白和膜蛋白的蛋白质折叠、寡聚化、稳定性、质量控制、分选和转运。蛋白质糖基化在蛋白质的抗原性、稳定性和半衰期上具有深远的有利影响。
[0006] 存在不同种类的糖蛋白，其取决于碳水化合物分子和蛋白质载体中氨基酸残基之间的键的类型。
[0007] N-连接蛋白质糖基化——将碳水化合物分子添加至靶蛋白的多肽链的天冬酰胺残基——是发生在真核生物内质网中的最常见的翻译后修饰类型。该过程通过酶促的寡糖基转移酶复合体（OST）完成，其在内质网中负责将来自脂质载体（磷酸多萜醇）的预装配寡糖转移至新生蛋白质保守序列Asn-X-Ser/Thr（其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸）内的天冬酰胺残基。随后糖链在高尔基体中经历其他修饰。N-连接糖基化过程出现在真核生物中并广泛出现在古细菌中，但是在细菌中非常罕见（见下文）。
[0009] 已经显示由于其具有其自身的糖基化机器(glycosylation machinery)，细菌食源性病原体空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）也可以使其蛋白质N-糖基化（Wacker 等人, Science. 2002; 298(5599):1790-3）。负责该反应的机器由称为pgl（指蛋白质糖基化）的簇编码。
[0010] 可以将空肠弯曲杆菌的糖基化机器转移至大肠杆菌（E. coli）中，以允许通过大肠杆菌细胞表达的重组蛋白质的糖基化。先前的研究已经证明如何产生可以执行N-糖基化的大肠杆菌菌株（参见，例如，Wacker 等人, Science. 2002; 298 (5599):1790-3; Nita-Lazar 等人, Glycobiology. 2005; 15(4):361-7; Feldman 等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(8):3016-21; Kowarik 等人, EMBO J. 2006; 25(9):1957-66; Wacker 等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(18):7088-93;国际专利申请公开号WO2003/074687、WO2006/119987、WO 2009/104074和WO/2011/06261和WO2011/138361）。
[0011] 可以将细菌分为两类，革兰氏阳性和革兰氏阴性，这取决于它们是否具有通常由荚膜多糖包围的单层或双层鞘细胞膜。这样的细菌的实例包括链球菌属亚种（Streptococcus ssp.）、假单胞菌属亚种（Pseudomonas ssp.）、奈瑟氏菌属亚种（Neisseria ssp.）、沙门氏菌属亚种（Salmonella ssp.）、埃希氏菌属亚种（Escherichia ssp.）、葡萄球菌属亚种（Staphylococcus ssp.）、弯曲杆菌属亚种（Campylobacter ssp.）等。在医学和商业上最相关的感染原之一是肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae），为革兰氏阳性病原体。
[0012] 肺炎链球菌是全世界轻度感染和重度感染两者的主要原因。与肺炎球菌感染有关的主要临床综合征是肺炎、脑膜炎、血流感染和急性中耳炎，按照发病率和死亡率肺炎是这些当中最重要的。由肺炎链球菌导致的感染尤其是在非常年轻的人和老年人中的重大疾病负担的原因（Isaacman DJ, M. E., Reinert RR. 2010. Burden of invasive pneumococcal disease and serotype distribution among Streptococcus pneumoniae isolates in young children in Europe: impact of the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and considerations for future conjugate vaccines. Int J Infect Dis. 14:197-209）。
[0013] 肺炎球菌被分为数个血清型（ 93）（基于它们的化学上和血清学上不同的荚膜多~糖）。某些血清型比其他更丰富，与临床上显性感染相关，导致严重的侵入性感染并且获得对一类或多类抗菌剂的耐药性（Rueda, A. M. M., MSc; Serpa, José A. MD; Matloobi, Mahsa MD; Mushtaq, Mahwish MD; Musher, Daniel M. MD. 2010. The spectrum of invasive pneumococcal disease at an adult tertiary care hospital in the early
21st century. Medicine (Baltimore) 89:331-336）。已经基于多糖荚膜的结构区别鉴定了肺炎链球菌的不同血清型。根据先前的分析，约10或11种血清型占据了世界上全部地区超过70%的侵入性小儿感染（Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, Siber GR: Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2000,
30(1):100-121）。引起疾病的血清型的分布随年龄、疾病综合征、疾病严重度、地理区域和随时间而不同。对青霉素、红霉素、复方增效磺胺（co-trimoxazole）或多种药物有耐药性的肺炎球菌在很多地区是常见的（Evolving trends in Streptococcus pneumoniae resistance: implications for therapy of community-acquired bacterial
pneumonia. Jones RN, Jacobs MR, Sader HS. Int J Antimicrob Agents. 2010 Sep;
36(3):197-204）。
21st century. Medicine (Baltimore) 89:331-336）。已经基于多糖荚膜的结构区别鉴定了肺炎链球菌的不同血清型。根据先前的分析，约10或11种血清型占据了世界上全部地区超过70%的侵入性小儿感染（Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, Siber GR: Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2000,
30(1):100-121）。引起疾病的血清型的分布随年龄、疾病综合征、疾病严重度、地理区域和随时间而不同。对青霉素、红霉素、复方增效磺胺（co-trimoxazole）或多种药物有耐药性的肺炎球菌在很多地区是常见的（Evolving trends in Streptococcus pneumoniae resistance: implications for therapy of community-acquired bacterial
pneumonia. Jones RN, Jacobs MR, Sader HS. Int J Antimicrob Agents. 2010 Sep;
36(3):197-204）。
[0014] 肺炎球菌荚膜是主要的细菌毒力因子之一并且已成功作为抗原在多种疫苗中使用。针对荚膜多糖的抗体已经显示出针对肺炎球菌感染是保护性的（Musher DM PH, Watson DA, Baughn RE: Antibody to capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae at the time of hospital admission for Pneumococcal pneumonia. J Infect Dis 2000, 182(1):158-167、Isaacman DJ ME, Reinert RR: Burden of invasive pneumococcal disease and serotype distribution among Streptococcus pneumoniae isolates in young children in Europe: impact of the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and considerations for future conjugate vaccines. Int J Infect Dis 2010, 14(3):197-209）。
[0015] 肺炎球菌荚膜多糖（CPS）合成途径根据血清型（ 93）而不同。除了类型3和37是通~过合酶途径合成（Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA 等人: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31），肺炎链球菌CPS一般通过O-抗原-翻转酶（Wzx）/聚合酶（Wzy）-依赖途径合成（图1）。
[0016] CPS通过分步方法在载体脂质上从共同前体（例如核苷酸活化的单糖）装配。首先，通过不同的糖基转移酶将重复单元装配在膜的细胞质一侧的载体上。连接脂质的寡糖随后翻转至膜外侧，重复单元在此聚合。完成的CPS从载体脂质释放并且输出至表面。
[0017] 细菌多糖可以在人中引起持久的免疫应答（如果它们与含有T-细胞表位的蛋白质载体偶联）。该概念在几乎100年前被阐述（Avery, O. T.和W. F. Goebel, 1929. Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins. Immunological specificity of synthetic sugar-proteins. J. Exp. Med. 50:521-533），并且随后对偶联至蛋白质载体白喉毒素的乙型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza type B）（HIB）的多糖证实（Anderson, P. 1983. Antibody responses to Haemophilus influenzae type b and diphtheria toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type b capsule with the nontoxic protein CRM197. Infect Immun 39:233-8; Schneerson, R., O. Barrera, A. Sutton, 和J. B. Robbins. 1980. Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates. J Exp Med 152:361-76）。该糖缀合物还是于1987年在美国许可的第一种缀合疫苗，并且不久之后被引入美国婴儿免疫计划表。除了HIB，已经成功地开发了针对有荚膜的人病原体脑膜炎奈瑟氏菌（ Neisseria meningitidis）和肺炎链球菌的缀合疫苗。这些疫苗的常规使用已经导致了减少的鼻咽建群以及感染。目前~
25%的全球疫苗市场包括缀合疫苗。
25%的全球疫苗市场包括缀合疫苗。
[0018] 已经成功使用缀合疫苗针对细菌感染进行保护。由于多糖是T-细胞不依赖性抗原，因此抗原性多糖对蛋白质载体的缀合是保护性记忆应答所必需的。使用多糖中的活化反应基团以及蛋白质载体，多糖已通过不同的化学方法缀合至蛋白质载体（Pawlowski, A., G. Kallenius, 和 S. B. Svenson. 2000. Preparation of pneumococcal capsular polysaccharide-protein conjugates vaccines utilizing new
fragmentation and conjugation technologies. Vaccine 18:1873-1885; Robbins, J. B., J. Kubler-Kielb, E. Vinogradov, C. Mocca, V. Pozsgay, J. Shiloach, 和R. Schneerson. 2009. Synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific oligosaccharide-core-protein conjugates. Proc Natl Acad Sci U S A 106:7974-7978）。
fragmentation and conjugation technologies. Vaccine 18:1873-1885; Robbins, J. B., J. Kubler-Kielb, E. Vinogradov, C. Mocca, V. Pozsgay, J. Shiloach, 和R. Schneerson. 2009. Synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific oligosaccharide-core-protein conjugates. Proc Natl Acad Sci U S A 106:7974-7978）。
[0019] 缀合疫苗可以对儿童施用以保护他们免于细菌感染并且可以对成人提供持久的免疫应答。已发现本发明的构建体在动物中产生IgG应答。相信多糖（即糖残基）引发了糖特异性的短期免疫应答。确实，人免疫系统对细菌的特定多糖表面结构，诸如O-抗原和荚膜多糖产生强烈的应答。然而，由于对多糖的免疫应答是IgM依赖性的，因此免疫系统不发生记忆。然而，携带多糖的蛋白质载体引发了T-细胞依赖性的IgG应答，并且因为免疫系统发生记忆因而所述IgG应答提供持久保护。由于该原因，开发作为蛋白质载体-多糖缀合物的疫苗是有利的。
[0020] 纯肺炎球菌多糖疫苗在幼小儿童中诱导对重要血清型的保护性免疫应答的无能性将其从婴儿免疫的考虑中排除。
[0021] 至今，针对肺炎球菌疾病的疫苗是通过良好建立的化学缀合技术在体外合成的。抗原性荚膜多糖被从病原生物中提取，纯化、化学活化并且缀合至合适的蛋白质载体。目前，存在用于生产糖缀合物的不同的蛋白质载体，例如CRM197（白喉类毒素）、破伤风类毒素和流感嗜血杆菌蛋白D。
[0022] 已经在数年前许可了7价肺炎球菌缀合疫苗（PCV7），并且其已经被WHO的Strategic Advisory Group of Experts (SAGE)推荐在具有高疾病负担的发展中国家使用（Vaccine 2012 Jul 6;30(32):4717-8. Epub 2012 May 20. Pneumococcal vaccines WHO position paper - 2012 - recommendations. WHO Publication）。同样已经在多个国家批准了10价（PCV10）和13价（PCV13）缀合疫苗。另外的缀合疫苗处于开发的不同阶段（Jiang SM, Wang L 和 Reeves PR: Molecular characterization of Streptococcus pneumoniae type 4, 6B, 8, and 18C capsular polysaccharide gene clusters. Infect Immun 2001, 69(3):1244-1255）。
[0023] 在化学缀合疫苗生产的背景下已经鉴定了数个问题。用于缀合的多糖的化学处理已经显示出损害了多糖的天然构象，其影响了抗原的质量，因此影响了最终产品的抗原性和免疫原性（Impact of the conjugation method on the immunogenicity of Streptococcus pneumoniae serotype 19F polysaccharide in conjugate vaccines (Poolman J, Frasch C, Nurkka A, Käyhty H, Biemans R, Schuerman L.Clin Vaccine Immunol. 2011 Feb;18(2):327-36. Epub 2010 Dec 1）。
[0024] 3-发明概述
[0025] 本发明描述了生产含有来自肺炎球菌细胞的多糖的糖缀合疫苗的新方法。该创新性的肺炎球菌疫苗是基于以下发现：涉及革兰氏阳性菌的寡糖或多糖生物合成的调节基因可以用于在革兰氏阴性宿主菌株中有效地合成寡糖和多糖，并且以该方法生产的寡糖或多糖可以用于在革兰氏阴性宿主细胞中制造糖缀合疫苗。本发明的进一步新的和意想不到的特征包括且不限于下文陈述的实施方案。
[0026] 本发明描述了用于基于肺炎球菌多糖的缀合疫苗的生产的原始程序。所述程序基于多个步骤：
[0027] i）在大肠杆菌中使用提高多糖生产效率的调节基因，将肺炎球菌多糖重组生产为十一异戊烯焦磷酸（undecaprenyl-pyrophosphate, Und-PP）连接的O抗原样多糖。
[0028] ii）通过缺失初始菌株的特定功能开发合适的生产菌株以使得多糖生产更有效率。
[0029] iii）设计允许在大肠杆菌中肺炎球菌多糖的有效重组合成的合适DNA构建体。
[0030] iv）通过寡糖基转移酶使多糖和受体蛋白在体内有效缀合的方法。
[0032] 图1描述了肺炎链球菌的荚膜多糖生物合成途径的遗传构成。用于体内缀合的肺炎链球菌的荚膜多糖生物合成途径的一般遗传构成的示意图。
[0033] 图2显示了涉及CPS1生物合成的遗传构成。CPS1遗传构成，wzg至rmlD是涉及荚膜多糖的生物合成的基因。
[0034] 图3说明了CPS1亚基。CPS1亚基的示意图。
[0035] 图4显示来自索氏志贺氏菌(S. sonnei)和类志贺邻单胞菌（P. shigelloides）的O抗原亚基。索氏志贺氏菌和类志贺邻单胞菌重复单元的示意图。
[0036] 图5显示了类志贺邻单胞菌O17抗原簇。类志贺邻单胞菌O17 O抗原簇。
[0037] 图6展示了在大肠杆菌中肺炎链球菌CPS1多糖的生产。在大肠杆菌中肺炎链球菌CPS1多糖的生产。来自使用质粒pGVX767（含有完整的 CPS1生物合成基因，wzg-ugd）转化的不同大肠杆菌菌株的蛋白酶K处理的全细胞提取物的蛋白质印迹分析。泳道1，蛋白质标志物；泳道2，大肠杆菌GVX2174 (W3110 ΔwaaL ΔwecAwzzECA ΔrfbO16::rfb类志贺邻单胞菌O17-clmR)；泳道3，使用pGVX767（pLAFR编码启动子、RBS和CPS 1型的wzg-ugd）转化的大肠杆菌GVX2174；泳道4和5，使用pGVX767转化的大肠杆菌GVX3329（=GVX2174 wbgW::clmR= W3110 ΔwaaL ΔwecAwzzECA ΔrfbO16::( rfb类志贺邻单胞菌O17 ΔwbgW::clmR)）。样品在12% Bis-Tris凝胶 (invitrogen)上使用MES 在200V下电泳35分钟，并且随后在iBlot中进行印迹，并且通过作为一级抗体的抗-CP1抗体（1:250）显色。clmR指示了赋予氯霉素（clm）抗性的DNA区段，即clm抗性盒。
[0038] 图7显示了对在大肠杆菌中生产的CPS1多糖的酸处理的敏感性。使用质粒pGVX767（含有完整的CPS1生物合成基因，wzg-ugd）转化大肠杆菌GVX3329的大肠杆菌蛋白质印迹分析。泳道1、3，蛋白酶K处理的两个不同菌落的全细胞提取物；泳道2和4，TFA处理的对应的提取物；泳道5，蛋白质标志物。将样品在12% Bis-Tris PAGE凝胶(invitrogen)使用MES缓冲液在200V电泳35分钟，并且随后进行电印迹并且通过作为一级抗体的抗CP1抗体（1:250）显色。
[0039] 图8显示了在肺炎链球菌CPS1中转运蛋白基因缺失的效果。荚膜多糖转运蛋白基因wzg、wzh、wzd和wze的缺失对在大肠杆菌中肺炎链球菌CPS1的生物合成上的效果。使用质粒pGVX808（=pGVX767 ∆wzg-wze::clmR，泳道2-5）和pGVX767（完整的CPS1簇，泳道6）转化的大肠杆菌GVX3329的四个不同菌落的全细胞提取物（蛋白酶K消化的）的蛋白质印迹分析。将样品在12% Bis-Tris凝胶(invitrogen)上使用MES以200V电泳35分钟，并且随后在iBlot中印迹并且使用作为一级抗体的抗CP1抗体（1:250）显色。
[0040] 图9 具有来自工程改造的大肠杆菌的肺炎链球菌CPS 1型的N-糖基化EPA的 His-Trap纯化步骤。具有来自工程改造的大肠杆菌的肺炎链球菌荚膜多糖组1的N-糖基化EPA的 His-Trap纯化步骤。小图A和小图B分别显示了来自通过抗His和抗CP1显色的EPA-CP1缀合物的纯化步骤的蛋白质样品的蛋白质印迹。使用4-12% Bis-Tris PAGE-凝胶分析蛋白质样品。使用了由pGVX767、pGVX114和pGVX150转化的大肠杆菌菌株GVX3329 (=GVX2174 wbgW::clmR= W3110 ΔwaaL ΔwecAwzzECA ΔrfbO16::( rfb类志贺邻单胞菌O17 ΔwbgW::
clmR))。
clmR))。
[0041] 图10 CPS4亚基的示意图。
[0042] 图11 CPS4遗传构成。CPS4遗传构成，wzg至fnlC是涉及荚膜多糖生物合成的基因。
[0043] 图12描述了肺炎链球菌CPS4多糖在大肠杆菌中的生产。经蛋白酶K处理的来自不同大肠杆菌菌株的全细胞提取物的蛋白质印迹分析。泳道1，蛋白质标志物；泳道2-4，使用pGVX803（表达完整的CPS4簇）和pGVX238（Z3206，表异构酶）转化的大肠杆菌W3110 ΔwaaL；泳道5-7，使用pGVX803和pGVX207 (galE，表异构酶)转化的大肠杆菌W3110 ΔwaaL；泳道8-
10，使用pGVX753（部分CPS4簇，wcij-fnlc，无调节基因和wciI）和pGVX238 转化的大肠杆菌W3110 ΔwaaL大肠杆菌。使用0.1%的阿拉伯糖用于诱导。将0.1 OD的培养的生物量的等量物在12% Bis-Tris凝胶(invitrogen) 上使用MES以200V电泳35分钟，并且随后在iBlot中印迹并且通过作为一级抗体的抗CPS4抗体（1:100）显色。
10，使用pGVX753（部分CPS4簇，wcij-fnlc，无调节基因和wciI）和pGVX238 转化的大肠杆菌W3110 ΔwaaL大肠杆菌。使用0.1%的阿拉伯糖用于诱导。将0.1 OD的培养的生物量的等量物在12% Bis-Tris凝胶(invitrogen) 上使用MES以200V电泳35分钟，并且随后在iBlot中印迹并且通过作为一级抗体的抗CPS4抗体（1:100）显色。
[0044] 图13显示了来自大肠杆菌SCM6中生产的肺炎链球菌CPS4的分析结果。大肠杆菌中生产的肺炎链球菌CPS4的分析。从大肠杆菌SCM6提取LLO（Schwarz F, Huang W, Li C, Schulz BL, Lizak C, Palumbo A, Numao S, Neri D, Aebi M, Wang LX: A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol 2010），并且如先前（US 2011/0274720 A1）描述的使用
2AB标记。小图A；将2AB标记的从使用pGVX803（表达来自pLAFR的完整的CPS4簇）和galE表异构酶（pGVX207, pMLBAD骨架）转化的大肠杆菌SCM6提取的LLO（虚线）相比于使用空载体pLAFR和pMLBAD转化的背景大肠杆菌菌株（实线）的色谱图。小图B，CPS4峰（在53.9分钟洗脱）的单一重复单元MS/MS分析，（小图A）。
2AB标记。小图A；将2AB标记的从使用pGVX803（表达来自pLAFR的完整的CPS4簇）和galE表异构酶（pGVX207, pMLBAD骨架）转化的大肠杆菌SCM6提取的LLO（虚线）相比于使用空载体pLAFR和pMLBAD转化的背景大肠杆菌菌株（实线）的色谱图。小图B，CPS4峰（在53.9分钟洗脱）的单一重复单元MS/MS分析，（小图A）。
[0045] 图14显示了在大肠杆菌SCM3中生产的肺炎链球菌CPS4的分析结果（Faridmoayer A, Fentabil MA, Mills DC, Klassen JS, Feldman MF: Functional characterization of bacterial oligosaccharyltransferases involved in O-linked protein glycosylation. JOURNAL OF BACTERIOLOGY 2007, 189(22):8088-8098）。在大肠杆菌中生产的肺炎链球菌CPS4的分析。从大肠杆菌SCM3（Sφ874，ΔwaaL）中提取LLO并且如描述的（US 2011/0274720 A1）使用2AB标记。将2AB标记的从使用pGVX771（pLAFR ，其含有启动子、RBS、Z3206 基因和CPS14簇的wciJ-fnlc，无调节基因）转化的大肠杆菌SCM3中提取的LLO（实线）相比与使用空载体pGVX725（只含有启动子和RBS的pLAFR）转化的背景大肠杆菌SCM3菌株（虚线）的HPLC色谱图。与具有或不具有丙酮酸（Pyr）的单一CPS4重复单元（RU）匹配的在50.8、53.6和56.2分钟洗脱的峰的MS分析。
[0046] 图15 描述了来自使用CPS4-LLO在体外N-糖基化的分析的结果。在体外使用CPS4脂质连接的寡糖的N-糖基化。LLO是从使用pGVX771 (在前文图中描述)和pGVX725 (空载体)转化的大肠杆菌SCM3 (Sφ874 ΔwaaL)提取的。在体外的反应通过将纯化的空肠弯曲杆菌PglB、荧光标记的肽受体（Tamra-DANYTK）和LLO提取物在反应缓冲液中混合过夜完成。通过有机相分离将肽从反应混合物中分离并且经历UPLC随后进行MS分析。小图A和小图B，在使用从含有pGVX725的SCM3（阴性对照）和含有pGVX771的SCM3中提取的LLO糖基化之后肽的UPLC色谱图。小图C和小图D，对应在肽上装配的CPS4的一个或两个完整亚基的在15.43和
17.62分钟洗脱的糖肽的MS/MS分析。
17.62分钟洗脱的糖肽的MS/MS分析。
[0047] 图16 具有肺炎链球菌CPS4的N-糖基化EPA的HisTrap纯化步骤。从使用pGVX539、 pGVX114、pGVX207和pGVX803转化并且在TB培养基中生长的经工程改造的大肠杆菌W3110ΔwaaL的具有肺炎链球菌CPS4的N-糖基化EPA的HisTrap纯化步骤。小图A、B和C显示了考马斯亮蓝染色和分别由抗His和抗CP4显色的来自 EPA-CPS4缀合物的纯化步骤的蛋白质样品的蛋白质印迹。使用4-12% Bis-Tris SDS-凝胶分析蛋白质样品。pGVX539 是用于EPA载体蛋白表达的表达质粒，其中EPA是脱毒的并且含有两个N糖基化共有序列。
[0048] 图17显示了通过CPS4-EPA糖缀合物的HPLC RP分析的PMP衍生化分析(derivatization analysis)。通过在大肠杆菌中生产的CPS4-EPA糖缀合物的HPLC RP分析的PMP衍生化分析。实线：从糖缀合物水解和分析获得的迹线，虚线：从CPS4荚膜多糖同样制备的迹线。
[0049] 图18描述了来自使用CPS4-EPA缀合物免疫的兔的血清的斑点印迹分析。来自使用CPS4-EPA缀合物免疫的兔的血清的斑点印迹分析。将从肺炎链球菌组4分离的50ng CPS4荚膜多糖在各点进行印迹。将第二次注射后获得的血清以1至100的稀释度用于分析。分别使用：泳道1，在该研究中使用的兔的免疫前血清合并物；泳道2-7，来自使用EPA-CPS4注射的不同兔的血清；泳道8-9，分别使用含有氢氧化铝和弗氏完全佐剂的缓冲液注射的对照兔的血清；泳道10-11，使用Prevenar-13注射的阳性对照兔的血清；泳道12-13，以1:100和1:200稀释度作为一级抗体的来自Statens血清研究所的肺炎球菌抗血清4型。
[0050] 图19描述了涉及CPS生物合成的基因的CPS14遗传构成。CPS14遗传构成，wzg至wciY是涉及荚膜多糖生物合成的基因。
[0051] 图20 CPS14亚基的示意图。
[0052] 图21 在大肠杆菌中CPS14 LLO的表达。将来自CPS14簇的wchA 至wciY基因克隆至含有O16 O抗原簇（rfbO16）启动子的基因置换载体pDOC-C (pGVX615) 中，并且转化至大肠杆菌GVX1128 (W3110ΔwaaL)。小图A，将2AB标记的从使用 pGVX615wzymut (生产单一亚基的CPS14 聚合酶突变体)转化的大肠杆菌GVX1128提取的LLO（实线）相比于从背景菌株提取的LLO（虚线）的色谱图；插图是由抗CPS14抗体作为一级抗体探测的被蛋白酶K消化的使用pGVX615转化的大肠杆菌GVX1128蛋白质印迹。小图B，在57分钟洗脱的CPS14单一亚基的MS/MS分析（在小图A中通过箭头指示）。
[0053] 图22 在使用CPS14簇将荚膜异多糖酸（CA）置换的大肠杆菌菌株中CPS14多糖的表达。描述了由抗CPS14探测的来自不同整合的大肠杆菌菌株的经蛋白酶K消化的细胞的蛋白质印迹。全部整合的菌株；GVX6126 (GVX1052 CA::CPS14; 泳道 1和2)、GVX6129 (GVX1128 CA::CPS14; 泳道3和4)和GVX6300 (GVX1716; 泳道5和6)显示了当使用pGVX688转化，表达RcsA时对应CPS14聚合酶生产的梯状图案。
[0054] 图23 描述了CPS14转运蛋白基因对在大肠杆菌菌株GVX6126 (大肠杆菌W3110 CA::CPS14)中肺炎链球菌CPS14多糖的生产上的效果。显示了经蛋白酶K处理的来自不同大肠杆菌细胞的全细胞提取物的蛋白质印迹分析。泳道1，蛋白质标志物；泳道2，使用pGVX688 (rcsA) 和 pGVX72 (空载体)转化的大肠杆菌GVX6126 ; 泳道 3, 使用pGVX688 (rcsA)和pGVX1497 (将CPS14 wzg-wze 克隆至pGVX72)转化的大肠杆菌GVX6126。将培养的生物量的0.4 OD的等量物在12% Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上使用MES以200V电泳35分钟，并且随后在iBlot中印迹并且由作为一级抗体的抗CPS4抗体（1:100）显色。
[0055] 图24描述了通过如在0079和0080部分描述的2-AB标记以及MS/MS分析来分析的从使用pGVXN688（表达RcsA）转化的大肠杆菌GVX6129（W3110ΔwaaL CA::CPS14）提取的2AB标记的LLO和糖脂的色谱图。MS/MS分析鉴定了CPS14的2个和3个亚基（通过箭头指示，分别在95.9分钟和115.3分钟处洗脱）。
[0056] 5-发明详述
[0057] 肺炎链球菌的荚膜多糖是通过通常在肺炎链球菌细胞的CPS簇中编码的一组酶的协同，在载体脂质上合成的（Whitfield C, Roberts IS: Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol Microbiol 1999, 31(5):1307-1319）。wzy依赖的CPS的合成从在膜的细胞质一侧将单糖磷酸添加至十一异戊烯磷酸（Und-P）开始。短寡糖通过不同的糖基转移酶从活化的糖核苷酸连续的添加单糖延长，并且连接脂质的多糖通过翻转酶翻转穿过膜。抗原-重复单元（RU）通过由蛋白质wzy执行的酶促反应聚合。随后将多糖转移至最终的受体结构。相信聚合和转运至细胞表面是由位于CPS簇5'端的一组3至4种酶控制的。
[0058] 在大多数情况中，糖基转移酶、聚合酶wzy、翻转酶wzx和单糖磷酸转移酶是在dexB 至aliA簇中编码，而核苷酸活化的单糖的生物合成途径在一般的持家活性情况下是在基因组的别处编码，而当单糖对CPS特异时其特定在CPS簇中编码（Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA等人: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31）。
[0059] 相信在CPS生物合成中的长度控制涉及用于调节的磷酸化事件的循环（Morona JK, Miller DC, Morona R, Paton JC. The effect that mutations in the conserved capsular polysaccharide biosynthesis genes have on virulence of Streptococcus pneumoniae. J Infect Dis. 2004 May 15;189(10):1905-13.Epub 2004 Apr 27. PubMed PMID: 15122528）。生产CPS的大多数生物合成途径使用核苷酸二磷酸（NDP）活化的单糖作为底物，即是UDP-Glc和UDP-GlcNAc。这些NDP糖通过持家基因在革兰氏阴性和革兰氏阳性宿主中提供，并且因此可作为用于特定的糖的合成的起始材料得到。用于特定的NDP-糖的合成或其他修饰的生物合成基因几乎总是在CPS簇中编码。
[0060] O抗原合成和CPS合成在生物合成的最后步骤不同。O抗原通过连接酶WaaL添加至脂质A核心，并且进一步运输至外膜，而CPS以荚膜结构出现在细胞上。平均地，最终的O抗原糖长度比CPS的短得多。
[0061] 将肺炎链球菌CPS分类为组I CPS（由于导致其合成的特定生物化学途径）。革兰氏阴性菌也含有组I CPS途径，其由于存在负责外膜转运的另外的膜转运蛋白基因而与肺炎球菌组I簇不同。例如，这些是荚膜异多糖酸（CA）生物合成机器基因簇wca，（Stevenson G, Andrianopoulos K, Hobbs M, Reeves PR: Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular
polysaccharide colanic acid. J Bacteriol 1996, 178(16):4885-4893）和K30 CPS簇（Whitfield C: Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli. Annu Rev Biochem 2006, 75:39-68）。
polysaccharide colanic acid. J Bacteriol 1996, 178(16):4885-4893）和K30 CPS簇（Whitfield C: Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli. Annu Rev Biochem 2006, 75:39-68）。
[0062] 然而，尽管一些革兰氏阴性和阳性荚膜多糖簇在功能元件上相似这一事实，但是从来没有完整的肺炎球菌CPS簇在大肠杆菌中有功能地表达。普遍认为的是不同细胞被膜结构（envelope architecture）需要用于多糖生产的特定机器，其在当必需穿过外膜时是不同的。因此在本文中描述了肺炎球菌荚膜多糖的改进的生产方法，其使用i）在革兰氏阴性生物中的LPS和荚膜多糖途径的方面和ii）在革兰氏阴性宿主细胞中革兰氏阳性荚膜生物合成调节和转运途径的组合的方面。这样的多糖在革兰氏阴性宿主中通过LPS途径机制生产，这样的多糖的结构与LPS多糖相同。因此，在本发明的革兰氏阴性系统中生产的这样的多糖可以表征为为了本申请目的的“修饰的荚膜多糖”或“LPS荚膜”。此外，该新合成的表达系统和生物合成途径（其将LPS与荚膜生物合成途径组合）可以被表征为为了本申请目的的“修饰的LPS生物合成途径”。
[0063] 因此，另外的实施方案涉及通过使用修饰的LPS途径的糖基化系统制造的肺炎链球菌疫苗，其包括修饰的荚膜多糖或LPS-荚膜的生产。
[0064] 本发明的另一个特定的实施方案涉及为了肺炎球菌CPS的优化表达而进行革兰氏阴性大肠杆菌宿主细胞基因组的优化。大肠杆菌W3110编码称为gtr的原噬菌体基因簇。Gtr酶GtrA、B和S编码了通过向在周质空间生长中的O抗原链添加分枝葡萄糖残基而修饰O抗原的机器（Lehane AM, Korres H, Verma NK: Bacteriophage-encoded glucosyltransferase GtrII of Shigella flexneri: membrane topology and
identification of critical residues. The Biochemical journal 2005, 389(Pt 1):
137-143）。该途径涉及在细胞膜的细胞质一侧的十一异戊烯磷酸（Und-P，不是Und-PP）连接的葡萄糖的产生，翻转至外周胞质，并且不断的将Und-P-连接的葡萄糖转移至生长中的O抗原多糖。
identification of critical residues. The Biochemical journal 2005, 389(Pt 1):
137-143）。该途径涉及在细胞膜的细胞质一侧的十一异戊烯磷酸（Und-P，不是Und-PP）连接的葡萄糖的产生，翻转至外周胞质，并且不断的将Und-P-连接的葡萄糖转移至生长中的O抗原多糖。
[0065] 在某些实施方案中，gtrABS 基因被部分地或完全地功能失活或从革兰氏阴性宿主细胞缺失，例如，gtrABS 在大肠杆菌宿主细胞中缺失。不受理论束缚，这样的缺失引导全部CPS生物合成活性至可进行糖基化的Und-PP途径，并且因此增加了糖蛋白的生产。很多肺炎球菌多糖使用葡萄糖作为起始单糖合成为重复单元（RU）聚合物。因此，当蛋白在Und-P上装配时，这样的重复单元可以干它们的糖基化。
[0066] 另一个特定的实施方案是通过增加UDP-葡萄糖：十一异戊烯磷酸葡萄糖-磷酸转移酶(UDP-glucose:undecaprenyl phosphate glucose-phosphate transferase)活性的表达和活性增强Und-PP连接的CPS的生产，其在细胞中增加Und-PP-Glc量并且因此导致CPS重复单元（RU）和多糖的提高的生产效率。这样的UDP-葡萄糖：十一异戊烯磷酸葡萄糖-磷酸转移酶的实例是肺炎链球菌的WchA（即提供起始功能的天然酶）或在大肠杆菌W3110荚膜异多糖酸wca操纵子中编码的WcaJ。本发明的特定的实施方案是为了优化糖脂生产性能用在wcaJ基因中编码的大肠杆菌功能替换天然肺炎链球菌wchA基因功能。
[0067] 本发明的另一个实施方案是为了稳定且高产量的糖脂生产和为了提高的糖基化活性，使用重组CPS簇替换大肠杆菌W3110 wca 操纵子的基因组整合。
[0068] 调节基因
[0069] 可以在本发明的方法和宿主细胞中使用革兰氏阳性菌的荚膜多糖基因簇的多种调节基因。在特定的实施方案中，调节基因是肺炎链球菌的荚膜多糖基因簇的 wzg、wzh、wzd或wze，或金黄色葡萄球菌（S. aureus）的荚膜多糖基因簇的capA、capB或capC，或无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）（组B链球菌，或GBS）的荚膜多糖基因簇的CpsA、CpsB、CpsC或CpsD。在某些实施方案中，调节基因是在下文“荚膜多糖”部分列举的荚膜多糖基因簇的调节基因。
[0070] 荚膜多糖
[0071] 在某些实施方案中，使用本发明的方法和宿主细胞生产肺炎链球菌的荚膜多糖。这些荚膜多糖包括肺炎链球菌
[0072]
[0073]
[0074] 和在（Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA 等人: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31）中提及的全部另外的荚膜。特别地，这些荚膜多糖包括肺炎链球菌CPS1、CPS4和CPS14。
[0075] 在其他实施方案中，可以使用本发明的方法和宿主细胞产生其他革兰氏阳性菌的荚膜多糖。其他革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌和无乳链球菌（GBS）。这样的荚膜多糖的实例包括金黄色葡萄球菌CPS5、CPS8，无乳链球菌（组B，GBS） CPSIa、CPSIb、CPSII、CPSIII、CPSIV、CPSV、CPSVI、CPSVII、CPSVIII，粪肠球菌（Enterococcus faecalis）CPSA、CPSB、CPSC、CPSD。
[0076] 在某些实施方案中，将糖基转移酶引入至本文中提供的宿主细胞，使得在宿主细胞中合成期望的荚膜多糖。参见，例如，国际专利申请号WO 2011/138361，其通过引用以其整体在此并入。
[0077] 生物缀合物
[0078] 在本发明的某些实施方案中，进一步修饰宿主细胞以产生生物缀合物，即，使用宿主细胞产生的荚膜蛋白糖基化的载体蛋白。通过寡糖基转移酶催化荚膜多糖至载体蛋白上的转移。在某些实施方案中，寡糖基转移酶在宿主细胞中重组表达。在某些实施方案中，将寡糖基转移酶引入至原核宿主中。寡糖基转移酶可以来自任何来源，并且可以包括异源寡糖基转移酶，即，来源于不是原核宿主细胞的不同生物的寡糖基转移酶（例如，来源于不同细菌物种的寡糖基转移酶）。在特定的实施方案中，寡糖基转移酶来自弯曲杆菌属种，例如，空肠弯曲杆菌。
[0079] 载体蛋白可以是重组蛋白。在某些实施方案中，载体蛋白是天然地包含一个或多个N-糖基化共有序列的蛋白质。在其他实施方案中，已将一个或多个N-糖基化共有序列重组地引入载体蛋白中。可以在本文中使用适合在缀合疫苗生产中使用的任何载体蛋白。示例性的载体蛋白包括，但不限于，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）外毒素A（EPA）、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的脱毒溶血素A、金黄色葡萄球菌的凝集因子A、金黄色葡萄球菌的凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基（CTB）、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域（passenger domain）、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白，肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和另外的肺炎链球菌蛋白质抗原，例如，肺炎链球菌NOX、肺炎链球菌PspA、肺炎链球菌PcpA、肺炎链球菌PhtD、肺炎链球菌PhtE、肺炎链球菌Ply和肺炎链球菌LytB。
[0080] 在某些实施方案中，在本文中描述的缀合物产生中使用的载体蛋白是经修饰的，例如，以蛋白质毒性更小或更易受到糖基化影响等的方式修饰。在特定的实施方案中，在本文中描述的缀合疫苗产生中使用的载体蛋白是经修饰的，使得载体蛋白中糖基化位点的数量以允许待施用的蛋白质（例如，在免疫原性组合物中，以其生物缀合物形式）的更低浓度的方式来最大化。因此，在某些实施方案中，在本文中描述的载体蛋白经修饰以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或比通常与载体蛋白有关的更多的糖基化位点（例如，相对于与以其本来的/天然的（例如，“野生型”状态）载体蛋白有关的糖基化位点的数量）。在特定的实施方案中，糖基化位点的引入是通过在蛋白质的一级结构中的任意位置插入糖基化共有序列完成的。这样的糖基化位点的引入可以通过，例如，将新的氨基酸添加至蛋白质的一级结构（即，完整的或部分的添加糖基化位点）或通过突变蛋白质中存在的氨基酸以产生糖基化位点（即，不将氨基酸添加至蛋白质，但是将蛋白质中选择的氨基酸突变从而形成糖基化位点）来完成。本领域技术人员将认识到蛋白质的氨基酸序列可以使用本领域已知的方法容易地修饰，例如，包括编码蛋白质的核酸序列修饰的重组方法。在特定的实施方案中，将糖基化共有序列引入载体蛋白的特定区域，例如，蛋白质的表面结构、在蛋白质的N或C末端和/或在通过二硫键在蛋白质上稳定的环中。在某些实施方案中，为了更有效率的糖基化，经典的5个氨基酸的糖基化共有序列可以通过赖氨酸残基延伸，并且因此插入的共有序列可以编码应当被插入或替换受体蛋白质氨基酸的5、6或7个氨基酸。
[0081] 在某些实施方案中，在本文中描述的缀合疫苗产生中使用的载体蛋白包含“标签（tag）”，即，允许分离和/或鉴定载体蛋白的氨基酸序列。例如，将标签添加至本文中描述的载体蛋白可用于该蛋白质的纯化，和因此，包含标签化的载体蛋白的缀合疫苗的纯化。可以在本文中使用的示例性的标签包括，但不限于，组氨酸（HIS）标签（例如，六组氨酸标签或6XHis标签）、FLAG-标签和HA标签。在某些实施方案中，在本文中使用的标签是可移除的，一旦不再需要它们，例如，在蛋白质已纯化后，例如，通过化学剂或通过酶促方法移除。
[0082] 在某些实施方案中，在本文中描述的细菌宿主细胞和通过在本文中描述这样的细菌宿主细胞生产的缀合物具有有利的特性。例如，在某些实施方案中，在本文中描述的细菌宿主细胞（其包含来源于革兰氏阳性菌的调节基因，其中所述调节基因涉及寡糖或多糖的生物合成）能够生产增加长度的糖抗原（作为存在所述调节基因的结果），例如，寡糖和/或多糖。此外，相比于缺少来源于革兰氏阳性菌的调节基因的革兰氏阴性菌宿主细胞，在本文中描述的细菌宿主细胞能够生产增加量的糖抗原，例如寡糖和/或多糖。在通过细菌细胞生产的缀合物具有更高的糖抗原与蛋白质比例并且因为细菌细胞生产更大量的缀合物中，这些特征的每一个均是有利的。
[0083] 在某些实施方案中，在本文中描述的细菌宿主细胞比具有相同特性但是缺乏来自革兰氏阳性菌的涉及寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞生产多约5%、10%、15%、20%、约25%、约30%、约40%、约50%或大于50%的缀合物。在某些实施方案中，在本文中描述的细菌宿主细胞比具有相同特性但是缺乏来自革兰氏阳性菌的涉及寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞生产多5%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%或40%至50%的缀合物。
[0084] 在某些实施方案中，在本文中描述的细菌宿主细胞比具有相同特性但是缺乏来自革兰氏阳性菌的涉及寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞生产多约5%、10%、15%、20%、约25%、约30%、约40%、约50%或大于50%的糖抗原，例如寡糖和/或多糖。在某些实施方案中，在本文中描述的细菌宿主细胞比具有相同特性但是缺乏来自革兰氏阳性菌的涉及寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞生产多5%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%或40%至50%的糖抗原，例如寡糖和/或多糖。
[0085] 在某些实施方案中，在本文中描述的细菌宿主细胞生产糖抗原，例如寡糖和/或多糖，其比通过具有相同特性但是缺乏来自革兰氏阳性菌的涉及寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞生产的糖抗原，例如寡糖和/或多糖长约5%、10%、15%、20%、约25%、约30%、约40%、约50%或大于50%。在某些实施方案中，在本文中描述的细菌宿主细胞生产糖抗原，例如寡糖和/或多糖，其比通过具有相同特性但是缺乏来自革兰氏阳性菌的涉及寡糖或多糖生物合成的调节基因的细菌宿主细胞生产的糖抗原，例如寡糖和/或多糖长5%至10%、
10%至20%、20%至30%、30%至40%或40%至50%。
10%至20%、20%至30%、30%至40%或40%至50%。
[0086] 多种测定可以用于表征在本文中描述的缀合物（例如，表征载体蛋白、连接的糖抗原（例如，寡糖和/或多糖），或两者），所述测定包括，例如，高效尺寸排阻色谱（high performance size exclusion chromatography）、等电聚焦、SDS-PAGE和蛋白质印记、通过MS的分子量确定、N端测序、氨基酸分析、反相液相色谱、电喷射质谱、串联质谱（MS/MS）和在胰蛋白酶消化后通过质谱的肽作图。
[0087] 实施方案
[0088] 在一个实施方案中，在本文中提供的是用于生产多糖的经工程改造的革兰氏阴性菌，其中革兰氏阴性菌包含革兰氏阳性菌的荚膜多糖基因簇的调节基因。在某些实施方案中，革兰氏阴性菌包含荚膜多糖基因簇的可读框的至少25%、50%、75%、85%、90%或至少95%。在某些实施方案中，革兰氏阴性菌包含完整的荚膜多糖基因簇。在某些实施方案中，多糖包含荚膜多糖的表位。
[0089] 在某些实施方案中，前述段落的革兰氏阴性菌选自埃希氏菌属种、大肠杆菌、志贺氏菌属种、克雷伯氏菌属种、沙门氏菌属种、耶尔森氏菌属种、奈瑟氏球菌属种、弧菌属种和假单胞菌属种。在特定的实施方案中，革兰氏阴性菌是大肠杆菌。
[0090] 在某些实施方案中，经工程改造至前文段落中任一段的革兰氏阴性菌的革兰氏阳性菌的荚膜多糖基因簇的调节基因是肺炎链球菌调节基因。在特定的实施方案中，肺炎链球菌调节基因来自1型肺炎链球菌。在特定的实施方案中，肺炎链球菌调节基因来自4型肺炎链球菌。
[0091] 在某些实施方案中，经工程改造至前文段落中任一段的革兰氏阴性菌的革兰氏阳性菌的荚膜多糖基因簇的调节基因是金黄色葡萄球菌调节基因。在特定的实施方案中，调节基因是无乳葡萄球菌(Staphylococcus agalactiae)调节基因。
[0092] 在某些实施方案中，经工程改造至前文段落中任一段的革兰氏阴性菌的革兰氏阳性菌的荚膜多糖基因簇的调节基因是粪肠球菌调节基因。
[0093] 在某些实施方案中，前文段落中任何段落的革兰氏阴性菌包含寡糖基转移酶。在特定的实施方案中，寡糖基转移酶对革兰氏阴性菌是异源的。
[0094] 在某些实施方案中，前文段落中任何段落的革兰氏阴性菌包含至少一种异源糖基转移酶。在特定的实施方案中，异源糖基转移酶是原核生物的糖基转移酶。在特定的实施方案中，糖基转移酶是如同调节基因从相同的革兰氏阳性菌获得的。
[0095] 在某些实施方案中，前文段落中任何段落的革兰氏阴性菌包含革兰氏阴性菌本身的一个或多个基因的缺失或失活。在特定的实施方案中，一个或多个缺失的基因包括waaL基因。在特定的实施方案中，一个或多个缺失的基因包括与革兰氏阴性菌中O抗原生物合成有关的全部基因。
[0096] 在某些实施方案中，经工程改造进入前文段落中任何段落的革兰氏阴性菌的调节基因是wzg、wzh、wzd、wze、capA、capB或capC。
[0097] 在某些实施方案中，前文段落中任何段落的革兰氏阴性菌包含编码载体蛋白（包含糖基化的共有序列）的核酸。在特定的实施方案中，编码载体蛋白的核酸对革兰氏阴性菌是异源的。在特定的实施方案中，载体蛋白是来自铜绿假单胞菌的脱毒外毒素A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的脱毒溶血素A、凝集因子 A、凝集因子 B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基（CTB）、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域(passenger domain)、空肠弯曲杆菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白和肺炎链球菌肺炎球菌溶血素。在特定的实施方案中，载体蛋白是肺炎链球菌蛋白，例如肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、肺炎链球菌NOX、肺炎链球菌PspA、肺炎链球菌PcpA、肺炎链球菌PhtD、肺炎链球菌PhtE、肺炎链球菌Ply和肺炎链球菌LytB。在特定的实施方案中，载体蛋白通过寡糖基转移酶缀合至多糖。
[0098] 在某些实施方案中，经工程改造至前文段落中任何段落的革兰氏阴性菌的调节基因是对应以下荚膜多糖基因簇中一种的调节基因：肺炎链球菌
[0099]
[0100] 或金黄色葡萄球菌CPS5或CPS8；无乳链球菌（组B，GBS）CPSIa、CPSIb、CPSII、CPSIII、CPSIV、CPSV、CPSVI、CPSVII或CPSVIII；或粪肠球菌CPSA、CPSB、CPSC或CPSD。
[0101] 在一个实施方案中，在本文中提供的是能够在革兰氏阴性菌中复制的载体，其中所述载体包含与在革兰氏阳性菌中荚膜多糖生物合成有关的调节基因。
[0102] 在某些实施方案中，UDP-葡萄糖：十一异戊烯磷酸葡萄糖-磷酸转移酶活性的表达和活性在前文段落中任何段落的革兰氏阴性菌中增加。
[0103] 在某些实施方案中，前文段落中任何段落的革兰氏阴性菌表达由肠道常见细菌（enterocommonbacteriae）（例如大肠杆菌W3110）的荚膜异多糖酸wca操纵子编码的WcaJ。
[0104] 在某些实施方案中，在本文中提供的是用于生产多糖的经工程改造的革兰氏阴性菌，其包括前文段落中任何段落的革兰氏阴性菌，其中使编码革兰氏阴性菌Gtr酶的基因功能失活。在特定的实施方案中，编码Gtr酶的基因的功能失活导致Und-P连接的葡萄糖的消除。在特定的实施方案中，革兰氏阴性菌编码Gtr酶的基因缺失。在特定的实施方案中，编码GtrA、GtrB和/或GtrS的基因功能失活。在特定的实施方案中，编码GtrA、GtrB和/或GtrS的基因缺失。在特定的实施方案中，革兰氏阴性菌选自埃希氏菌属种、大肠杆菌、志贺氏菌属种、克雷伯氏菌属种、沙门氏菌属种、耶尔森氏菌属种和假单胞菌属种。
[0105] 在特定的实施方案中，前述段落的革兰氏阴性菌包含寡糖基转移酶。在特定的实施方案中，寡糖基转移酶对革兰氏阴性菌是异源的。
[0106] 在特定的实施方案中，前文段落的革兰氏阴性菌包含对革兰氏阴性菌异源的至少一种糖基转移酶。在特定的实施方案中，糖基转移酶是原核生物的糖基转移酶。
[0107] 在特定的实施方案中，前文段落的革兰氏阴性菌包含编码载体蛋白（包含糖基化的共有序列）的核酸。在特定的实施方案中，编码载体蛋白的核酸对革兰氏阴性菌是异源的。在特定的实施方案中，载体蛋白是铜绿假单胞菌的脱毒外毒素A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的脱毒溶血素A、凝集因子 A、凝集因子 B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基（CTB）、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。在特定的实施方案中，载体蛋白通过寡糖基转移酶缀合至多糖。
[0108] 在特定的实施方案中，前文段落的革兰氏阴性菌的多糖是肺炎链球菌的荚膜多糖。
[0109] 在特定的实施方案中，前文段落的革兰氏阴性菌的多糖是大肠杆菌O抗原
[0110]
[0111] 沙门氏菌属种 (猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种(S. enterica subsp. Enterica)、猪霍乱沙门氏菌萨拉姆亚种(S. enterica subsp. Salamae)、肠沙门氏菌亚利桑那亚种(S. enterica subsp. arizonae)、猪霍乱沙门氏菌双亚利桑那亚种(S. enterica subsp. Diarizonae)、猪霍乱沙门氏菌豪顿亚种(S. enterica subsp. Houtenae)、邦戈沙门氏菌(S. Bongori)、和猪霍乱沙门氏菌印度亚种(S. enterica subsp. Indica))、和 O型 1-67、假单胞菌属种(铜绿假单胞菌O 血清型 1-20)、克雷伯氏菌属种(特别是肺炎克雷伯氏菌（K. pneumonia）血清型 O1、O2 (和血清亚型)、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12)、不动杆菌O 抗原 (特别是鲍氏不动杆菌（A. baumannii ）O 抗原)、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis )O 抗原 (血清型 A、B、C、D、E、F、G、H、I J、K、L1、L2、L3)、霍乱弧菌（Vibrio cholera ）O 抗原 O1至155、李斯特菌属种，特别是单核细胞增生李斯特菌（L. Monocytogenes）1、2、3、4型和其血清亚型、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）血清型1至15 O 抗原、副百日咳博德特氏菌（Bordetella parapertussis）O 抗原、鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei）和类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei） O 抗原、土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）、弯曲杆菌属种 (空肠弯曲杆菌)；艰难梭状芽胞杆菌（Clostridium difficile）(血清型 A、G、H、K、S1、S4、D、Cd-5、和产气荚膜梭菌（ C. perfringens）血清型 A、B、C、D和E) 的荚膜多糖、金黄色葡萄球菌5和8型、酿脓链球菌（ Streptococcus pyrogenes ）(组 B 链球菌荚膜血清型多糖)、大肠杆菌、无乳链球菌(组 A 链球菌荚膜多糖)、脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis ）(血清型 A、B、C、W、Y、X)、白色念珠菌（Candida albicans）、流感嗜血杆菌、粪肠球菌荚膜多糖类型 I-V；和其他表面多糖结构，例如伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）糖脂)、脑膜炎奈瑟氏菌菌毛蛋白O 聚糖和脂低聚糖 (LOS)、流感嗜血杆菌LOS、利什曼原虫（Leishmania）主要脂磷聚糖、肿瘤相关的碳水化合物抗原、疟疾糖基磷脂酰肌醇或结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)阿拉伯甘露聚糖。
[0112] 在特定的实施方案中，在本文中提供的是通过前文段落中任一段的革兰氏阴性菌生产的重组糖蛋白。
[0113] 在特定的实施方案中，在本文中提供的是生产重组糖蛋白的方法，其包括在对生产蛋白质适合的条件下培养前文段落中任一段的革兰氏阴性菌。在特定的实施方案中，方法进一步包括纯化重组糖蛋白。
[0114] 在特定的实施方案中，在本文中提供的是包含类志贺邻单胞菌O 抗原基因簇的经工程改造的大肠杆菌，其中O抗原基因簇的wbgW基因是失活的，并且其中大肠杆菌细胞生产Und-PP-D-FucNAc4N。
[0115] 在特定的实施方案中，在本文中提供的是包含索氏志贺氏菌或类志贺邻单胞菌 O17 O抗原基因簇的经工程改造的大肠杆菌细胞，其中O抗原基因簇的wbgW基因是失活的，并且其中大肠杆菌细胞生产Und-PP-D-FucNAc4N。
[0116] 6-实施例
[0117] 实施例1：在大肠杆菌中CPS1缀合物的合成：
[0118] 本发明实施方案的目标是在大肠杆菌中生产CPS 1型抗原多糖。如在上文讨论的，本发明人以新的方式利用大肠杆菌表达肺炎链球菌CPS簇的生物合成机器的能力。
[0119] 在图2中描述CPS簇DNA（由dexB和aliA之间的DNA序列定义），并且在图3中显示1型肺炎链球菌的重复单元结构。重复单元以D-FucNAc4N开始，随后是在α1-3糖苷键中连接的两个D-GalA残基（-4-a-D-GalA-1,3-a-D-GalA-1,3-a-D-FucNAc4N-）。此外，RU是非化学计量地O-乙酰化的（Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA 等人: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31）。DNA序列含有编码用于以下的蛋白质的推定的基因：
[0120] i）转运/调节（Wzg、Wzh、Wzd、Wze），
[0121] ii）如从同源性搜索中所推断的，两种最可能负责两个GalA残基（WchBD）的转移的糖基转移酶
[0122] iii）推定的乙酰转移酶WchC，
[0123] iv）聚合酶wzy，其用于重复单元在细胞质膜的外部小叶（outer leaflet）上的聚合
[0124] v）翻转酶wzx，将单一重复单元从内部翻转至细胞质膜的外部小叶
[0125] vi）负责核苷酸活化的D-GalA的合成的两种蛋白质，即Gla和Ugd。显示了通过从持家UDP-Glc的Gla和Ugd 的UDP-D-GalA合成（Munoz R, Lopez R, de Frutos M, Garcia E: First molecular characterization of a uridine diphosphate galacturonate 4-epimerase: an enzyme required for capsular biosynthesis in Streptococcus pneumoniae type 1. Mol Microbiol 1999, 31(2):703-713）
[0126] vii）已知制造TDP-L-鼠李糖的四种蛋白质RmlACBD。这些基因是隐藏的并且可能对CPS生产是可有可无的。
[0127] 总之，这意味着用于制造1型 CPS的全部所需基因在簇中编码，除了：
[0128] a）编码用于起始物糖UDP-D-FucNAc4N合成的蛋白质的生物合成基因；
[0129] b）编码用于将磷酸-D-FucNAc4N添加至脂质载体Und-P的磷酸糖转移酶（phosphorsugar transferase）的基因。为了通过修饰的LPS生物合成途径合成CPS 1型，需要以通过添加CPS 1型簇可以使得肺炎球菌LPS荚膜合成的方式在大肠杆菌宿主菌株中提供a）和b）。大肠杆菌菌株一般不编码这样的酶。引人注意地，已知只有少数微生物合成FucNAc4N并且将其掺入多糖：肺炎链球菌CP1菌株、索氏志贺氏菌、类志贺邻单胞菌 O17和脆弱拟杆菌（Bacterioides fragilis）。
[0130] 因此本发明人推断需要发现提供所述功能性的基因簇。本发明人通过使用用于索氏志贺氏菌或类志贺邻单胞菌 O17 O抗原合成的生物合成机器的基因元件实现这一点。这两种生物均使用同样的结构合成O抗原。该O抗原是由通过二糖重复单元-4-a-L-AltNAcA-1,3-a-D-FucNAc4N-1-构成的直链聚合物构成的真正的革兰氏阴性O抗原，（图4）（Batta G, Liptak A, Schneerson R, Pozsgay V: Conformational stabilization of the altruronic acid residue in the O-specific polysaccharide of Shigella sonnei/Plesiomonas shigelloides. Carbohydr Res 1997, 305(1):93-99）。起始糖显示为D-FucNAc4N（Kubler-Kielb J, Vinogradov E, Ben-Menachem G, Pozsgay V, Robbins JB, Schneerson R: Saccharide/protein conjugate vaccines for Bordetella species: preparation of saccharide, development of new conjugation procedures, and physico-chemical and immunological characterization of the conjugates. Vaccine 2008, 26(29-30):3587-3593）。生物合成所需的基因簇（图5）在类志贺邻单胞菌的基因组中和索氏志贺氏菌毒力质粒上编码（Kopecko DJ, Washington O, Formal SB: Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infection and immunity 1980, 29(1):207-214）。基因功能通过同源性分析推定已知（Xu DQ, Cisar JO, Ambulos Jr N, Jr., Burr DH, Kopecko DJ: Molecular cloning and characterization of genes for Shigella sonnei form I O polysaccharide: proposed biosynthetic pathway and stable expression in a live salmonella vaccine vector. Infect Immun 2002, 70(8):4414-4423）。
[0131] 因此，在大肠杆菌中装配用于CPS 1型生产的生物合成机器的策略如下：
[0132] 首先，本发明人以重组Und-PP-D-FucNAc4N生产途径为目标。为了实现该目标，本发明人在大肠杆菌中重组表达了类志贺邻单胞菌O抗原。
[0133] 第二，本发明人从类志贺邻单胞菌O17簇缺失了L-AltNAcA糖基转移酶，导致了Und-PP-D-FucNAc4N截短的脂质前体。
[0134] 第三，本发明人将CPS 1型簇添加在质粒上。相信在该质粒中编码的酶延伸通过类志贺邻单胞菌系统制造的Und-PP-D-FucNAc4N前体以完成CPS 1型 RU并且聚合RU以制造修饰的LPS。
[0135] 技术上，这如下完成：
[0136] 在第一个步骤中，本发明人将类志贺邻单胞菌O抗原基因簇（rfb类志贺邻单胞菌O17）克隆至供体质粒 pDOC-C中（Lee DJ, Bingle LE, Heurlier K, Pallen MJ, Penn CW, Busby SJ, Hobman JL: Gene doctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiol 2009, 9:252）。通过使用该供体质粒和编码重组酶和核酸内切酶的辅助质粒（Kuhlman TE, Cox EC: Site-specific chromosomal integration of large synthetic constructs. Nucleic acids research 2010, 38(6):e92），本发明人通过同源重组将W3110 ΔwecAwzzECA ΔwaaL大肠杆菌菌株的rfb簇交换为来自质粒的类志贺邻单胞菌簇（wzz至wbgZ，图5）。参见，例如，国际申请号PCT/EP2013/071328，其通过引用以其整体并入本文。产生的染色体整合的菌株制造重组O抗原，其在蛋白质印迹中对抗索氏志贺氏菌分型血清是反应性的。
[0137] 根据Datsenko和Wanner的方法，通过同源重组将在该整合的类志贺邻单胞菌簇中编码的wbgW基因从染色体缺失（Datsenko KA, Wanner BL: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97(12):6640-6645）。产生的菌株不再生产任何抗索氏志贺氏菌特异的连接脂质的多糖，最可能是由于菌株制造完整的二糖重复单元的无能性。
[0138] 接下来，将从wzg至ugd的CPS1簇（图2）克隆至大肠杆菌中有活性的人工启动子（J23103, http://partsregistry.org/Part:BBa_J23103）和优化核糖体结合位点之后。
[0139] 在用于脂质连接的寡糖生物合成分析的摇瓶培养物中的描述的遗传系统的表达在使用抗CPS 1型特异抗血清的蛋白质印迹中产生了梯状带型图案（图6）。这显示修饰的LPS生物合成途径在1型肺炎链球菌的CPS的重组表达中协作。
[0140] 为了进一步提供生产的反应性蛋白酶抗性物质确实是连接至十一异戊烯焦磷酸的CPS 1型的证据；对来自图6的样品实施酸敏感性测试。通过TFA的温和酸处理消除了抗CPS 1型信号，指示连接多糖和十一异戊烯的焦磷酸键的存在（图7）。本发明人发现可能在转运蛋白基因wzg-wzd的存在下制造修饰的O抗原。为了检查这些基因是否具有直接的效果，本发明人通过同源重组从CPS 1型质粒缺失了四个转运蛋白基因（Bloor AE, Cranenburgh RM: An efficient method of selectable marker gene excision by Xer recombination for gene replacement in bacterial chromosomes. Applied and environmental microbiology 2006, 72(4):2520-2525）。修饰的质粒的共表达令人惊讶地导致了抗CPS 1型信号的失去（图8）。这表明转运蛋白基因对修饰的O抗原的有效生产是必需的。
[0141] 为显示重组CPS 1型可以用于蛋白质的糖基化并且因此形成蛋白质-碳水化合物缀合物，本发明人对在合适的重组大肠杆菌菌株中缀合物生产的能力测试了细菌蛋白质糖基化机器（Wacker M, Linton D, Hitchen PG, Nita-Lazar M, Haslam SM, North SJ, Panico M, Morris HR, Dell A, Wren BW 等人: N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science 2002,
298(5599):1790-1793）。
298(5599):1790-1793）。
[0142] 使用在（Feldman MF, Wacker M, Hernandez M, Hitchen PG, Marolda CL, Kowarik M, Morris HR, Dell A, Valvano MA, Aebi M: Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102(8):3016-3021; Kowarik M, Young NM, Numao S, Schulz BL, Hug I, Callewaert N, Mills DC, Watson DC, Hernandez M, Kelly JF 等人: Definition of the bacterial N-glycosylation site consensus sequence. The EMBO journal 2006, 25(9):1957-1966; Wacker M, Linton D, Hitchen PG, Nita-Lazar M, Haslam SM, North SJ, Panico M, Morris HR, Dell A, Wren BW 等人: N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science 2002, 298(5599):1790-1793; Ihssen J, Kowarik M, Dilettoso S, Tanner C, Wacker M, Thony-Meyer L: Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli. Microbial cell factories 2010, 9:61.）中记录的N-糖基化系统进行实验。使用两种可诱导质粒转化表达CPS 1型脂质连接的寡糖的重组大肠杆菌。一种质粒编码PglB酶，其重复地显示使受体蛋白质通常地N糖基化（所述蛋白编码–D/E-x-N-x-S/T-类型的共有氨基酸序列，其中x不能是脯氨酸）。在第二种质粒上，编码载体蛋白EPA，其含有两种插入的N糖基化共有序列和用于Ni亲和色谱纯化的His-标签。在糖基化实验后，将EPA蛋白纯化并且使用抗his标签抗血清（图9，小图A）和抗CPS 1型抗血清（图9，小图B）探测并且清楚地在洗脱级分中检测到。这证明PglB系统连同重组CPS 1型表达系统允许蛋白质缀合物的有效生产，所述蛋白质缀合物可以作为抗肺炎球菌疫苗候选使用。
[0143] 实施例2：在大肠杆菌中CPS4缀合物的合成
[0144] 为进一步显示蛋白质糖基化可以用于生产活性缀合疫苗，本发明人以在关于CPS1的转运蛋白基因的存在下生产CPS 4型缀合物为目标。
[0145] CPS4在还原端具有含GalNAc的重复单元结构（图10）。完整结构为：
[0146] -1,4-(2,3 S pyr)-a-D-Gal-1,3-a-D-ManNAc-1,3-a-L-FucNAc-1,3-a-D-GalNAc[0147] 不像CPS1的基因簇，编码来自肺炎链球菌CPS 4型的簇编码合成CPS4的全部所需酶（图11）。通过蛋白质MnaA、FnlA、B和C制造UDP-D-FucNAc和UDP-D-ManNAc。不同糖基转移酶的功能根据它们对其他具有已知特异性的糖基转移酶的同源性进行预测。WciI是预测的糖基化-磷酸转移酶并且因此负责Und-PP-D-GalNAc合成，WciJ、K和L是D-ManNAc、L-FucNAc和D-Gal转移酶，并且WciM是丙酮酸转移酶的同源物（Jiang SM, Wang L, Reeves PR: Molecular characterization of Streptococcus pneumoniae type 4, 6B, 8, and 18C capsular polysaccharide gene clusters. Infect Immun 2001, 69(3):1244-1255）。
[0148] 为了在大肠杆菌中重构CPS4修饰的途径，本发明人首先将CPS4基因簇（aliA和dexB之间的基因）克隆至在大肠杆菌中表达的质粒，产生pGVXN803。在第二个设置中，本发明人只包括了转运蛋白基因下游的基因（产生了pGVXN753），即 wciJ-fnlC，以明确地分析wzg、wzh、wzd和wze的效果，以及wciI 缺失的效果。WciI 是根据生物信息学分析的磷酸糖转移酶同源物。相似活性在大肠杆菌中存在，特别是在肠道细菌共同抗原（ECA）簇中编码的wecA 基因。在pGVXN753中，本发明人包括了多克隆位点上游的人工启动子序列，以确认插入基因的转录。
[0149] 为分析上文提及的质粒在大肠杆菌中表达时的效果，本发明人使用pGVXN753和pGVXN803转化W3110 ΔwaaL细胞。W3110 ΔwaaL编码WecA蛋白质，其负责Und-PP-D-GlcNAc的合成但是不能制造Und-PP-D-GalNAc。后一脂质连接的单糖是CPS4簇的酶的期望的底物，所述CPS4簇应当完成CPS4 RU。因此，除了CPS4簇质粒以外，本发明人提供了两种不同的D-GlcNAc至D-GalNAc的差向异构酶， Z3206 (Rush JS, Alaimo C, Robbiani R, Wacker M, Waechter CJ: A novel epimerase that converts GlcNAc-P-P-undecaprenyl to GalNAc-P-P-undecaprenyl in Escherichia coli O157. J Biol Chem 2010, 285(3):1671-1680)和GalE (Linton D, Dorrell N, Hitchen PG, Amber S, Karlyshev AV, Morris HR, Dell A, Valvano MA, Aebi M, Wren BW: Functional analysis of the Campylobacter jejuni N-linked protein glycosylation pathway. Mol Microbiol
2005, 55(6):1695-1703)。两种基因编码允许体内合成D-GalNAc的蛋白质，前者通过脂质连接的D-GlcNAc的差向异构化作用 (Und-PP-D-GlcNAc<-> Und-PP-D-GalNAc)，和后者通过使用核苷酸活化的糖作为底物（UDP-D-GlcNAc<->UDP-D-GalNAc）。
2005, 55(6):1695-1703)。两种基因编码允许体内合成D-GalNAc的蛋白质，前者通过脂质连接的D-GlcNAc的差向异构化作用 (Und-PP-D-GlcNAc<-> Und-PP-D-GalNAc)，和后者通过使用核苷酸活化的糖作为底物（UDP-D-GlcNAc<->UDP-D-GalNAc）。
[0150] 图12显示了分析的结果。细胞生长并且诱导差向异构酶表达，并且通过SDS-PAGE将蛋白酶抗性生物量分离，并且在将糖脂转移至硝酸纤维素膜后通过免疫检测分析。结果显示每当pGVXN803存在于细胞中时，可通过抗CPS4抗血清检测到梯状信号。pGVXN753也诱导了信号，尽管比含有转运蛋白基因和wciI的构建体更弱。差向异构酶的诱导和性质轻微地影响了信号强度。最强反应性用pGVXN803和对核苷酸活化的糖特异性的差向异构酶获得，表明WciI 是D-GalNAc-磷酸转移酶。因此，关于CPS1令人惊讶地，转运蛋白基因对在大肠杆菌中CPS4修饰的LPS的有效生产是重要的。为仔细分析转运蛋白基因相比于wciI的影响，可以进行在pGVX753存在下wciI的共表达。最可能地，单独的wciI 不能将CPS4表达提高至存在转运蛋白基因时观察到的水平（即，在含有pGVX803的 W3110 ΔwaaL 中）。
[0151] 为进一步表征在大肠杆菌中生产的CPS4，本发明人在大肠杆菌SCM6中表达pGVXN803（Schwarz F, Huang W, Li C, Schulz BL, Lizak C, Palumbo A, Numao S, Neri D, Aebi M, Wang LX: A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol 2010; SCM6 is deleted in wecA, ECA, waaL）并且通过2-AB标记和MS/MS分析进行分析糖脂。2-AB标记是开发以分离、水解、修饰多糖和单糖并且通过HPLC和MS/MS对它们分析的方法。将细胞生长过夜并且根据已建立的程序制备和处理（US2011/0274720）。
[0152] 简而言之，通过有机溶剂（氯仿：甲醇：水 10:10:3）将糖脂从生物量中提取，并且经过C18盒(cartridge)纯化；使用TFA在水/异丙醇中处理洗脱物以水解焦磷酸键并且从 Und-PP-聚糖释放聚糖部分。将产生的溶液经过另一个C18盒以移除脂质。将流通物(flow through)干燥并且使用2氨基苯甲酰胺在还原端标记聚糖。通过HPLC使用gylcosepN 正相柱将产生的标记的聚糖分离并且通过荧光检测（US2011/0274720 A1）。
[0153] 产生的色谱图在图13（小图A）中显示。从含有或缺乏pGVXN803的SCM6细胞获得的色谱图的比较显示前者中存在而后者中缺乏的数个峰。它们中的一些通过MS/MS分析，以鉴定聚糖同一性和序列。对于数个峰，可以鉴定与预期的CPS4 RU和聚合物结构一致的MS/MS模式（通过箭头指示）。图13的小图B显示了在53.8分钟洗脱的峰的MALDI-MS/MS谱。碎片离子系列与在非还原己糖处用丙酮酸修饰的CPS4 RU一致。
[0154] 本发明人观察到由于丙酮酸的非化学计量的存在的异质性，指示了具有丙酮酸的CPS4重复单元的非定量修饰或在样品制备期间的水解。本发明人从数据总结本发明人能够产生在Und-PP上生产CPS4聚糖的修饰的LPS生物合成途径。
[0155] 为进一步分析CPS4糖脂，本发明人从大肠杆菌SCM3菌株提取糖脂（Faridmoayer A, Fentabil MA, Mills DC, Klassen JS, Feldman MF: Functional characterization of bacterial oligosaccharyltransferases involved in O-linked protein glycosylation. JOURNAL OF BACTERIOLOGY 2007, 189(22):8088-8098），所述菌株表达CPS4，并且如上文描述的分析它们（图14），或直接地使用糖脂用于体外糖基化。在该实验中，将糖脂、含有N糖基化共有序列的受体肽和寡糖基转移酶PglB的纯化制备物混合（Jervis AJ, Butler JA, Lawson AJ, Langdon R, Wren BW, Linton D:
Characterization of the structurally diverse N-linked glycans of
Campylobacter species. JOURNAL OF BACTERIOLOGY 2012, 194(9):2355-2362）。形成糖肽，其可以通过HILIC色谱（图15，小图A和B）随后通过ESI-MS/MS用于聚糖测序来分析。当分析来自这样的实验的产物时，鉴定到连接至肽的唯一的丙酮酸化聚糖（图15，小图C和D）。因此，在图13和14中观察到的非化学计量的丙酮酸化最可能来源于在样品制备期间从聚糖的丙酮酸水解而不是CPS4 RU的非定量修饰(non-quantitative decoration)。因此，本发明人断言通过修饰的LPS生物合成途径，其可能在允许有活性的并且可能相比化学缀合更好的缀合物合成的天然环境下生产CPS。
Characterization of the structurally diverse N-linked glycans of
Campylobacter species. JOURNAL OF BACTERIOLOGY 2012, 194(9):2355-2362）。形成糖肽，其可以通过HILIC色谱（图15，小图A和B）随后通过ESI-MS/MS用于聚糖测序来分析。当分析来自这样的实验的产物时，鉴定到连接至肽的唯一的丙酮酸化聚糖（图15，小图C和D）。因此，在图13和14中观察到的非化学计量的丙酮酸化最可能来源于在样品制备期间从聚糖的丙酮酸水解而不是CPS4 RU的非定量修饰(non-quantitative decoration)。因此，本发明人断言通过修饰的LPS生物合成途径，其可能在允许有活性的并且可能相比化学缀合更好的缀合物合成的天然环境下生产CPS。
[0156] 为测试该假设，本发明人以在临床前测定中测试糖缀合物为目标。在第一个步骤中，本发明人使用微生物发酵以生产缀合至一般载体蛋白（铜绿假单胞菌的遗传脱毒的外毒素A（EPA，US2011/0274720 A1））的CPS4。使用pGVXN539 （表达编码2N糖基化共有序列的EPA载体蛋白（US2011/0274720 A1和dyx），在pACT3（GenBank: U51556.1）中克隆，其中clmR 盒由卡那霉素抗性盒（kanR）替换）；pGVXN114 （可诱导表达PglB，US2011/0274720 A1）、pGVXN207 （可诱导表达GalE，（Rush JS, Alaimo C, Robbiani R, Wacker M, Waechter CJ: A novel epimerase that converts GlcNAc-P-P-undecaprenyl to GalNAc-P-P-undecaprenyl in Escherichia coli O157. J Biol Chem 2010, 285(3):1671-1680））和pGVXN803 （编码CPS4簇）转化大肠杆菌W3110 ΔwaaL。细胞在TB培养基中生长并且在合适的OD诱导并且过夜进行生产。从通过使用溶菌酶随后IMAC的周质提取制备的周质提取物中纯化His标签化的EPA。洗脱级分的分析测定在图16中显示。SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色显示在70和大于70kDa处的非糖基化的和糖基化的EPA，后者以指示由RU构成的（修饰的）O抗原聚糖的梯状图案存在（图16，小图A）。在相同级分电转移至硝酸纤维素膜后通过抗His（图16，小图B）和抗CPS4（图16，小图C）的免疫检测确认了材料中CPS4和EPA的存在。
[0157] 糖缀合物通过用于分离非糖基化和糖基化的EPA的阴离子交换色谱进一步纯化；糖蛋白随后通过尺寸排阻色谱进一步纯化。分析产生的糖蛋白制备物的单糖组成，其使用通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生化作用（PMP, Lv L, Yang X, Zhao Y, Ruan Y, Yang Y, Wang Z: Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum by HPLC with indirect UV detection. Food Chemistry 2009, 112:742–746），其证明重组糖缀合物的聚糖组成与从肺炎链球菌分离的CPS4是相同的（图17）。
[0158] 为测试糖缀合物的疫苗活性，进行了免疫研究和调理吞噬测定（OPA）。OPA是公认的针对用于消除肺炎链球菌细胞的抗体的功能性的测定并且是用于保护的替代品。本发明人使用不同剂量的EPA-CPS4缀合物免疫兔。作为对照，本发明人使用Prevenar 13，其是广泛用于小儿肺炎球菌疾病预防的许可的和销售的产品。根据标准方案通过用于免疫原性的斑点印迹（图18）和用于功能性的OPA将产生的抗血清进行分析（Romero-Steiner S, Frasch CE, Carlone G, Fleck RA, Goldblatt D, Nahm MH: Use of opsonophagocytosis for serological evaluation of pneumococcal vaccines. Clin Vaccine Immunol 2006, 13(2):165-169）。
[0159] 表1显示了获得的相关调理素滴度。结果显示在调理吞噬测定中提升抗血清活性的能力方面，在大肠杆菌中重组制备的糖缀合物同样好并且在一些情况下甚至优于许可的疫苗比较物。
[0160] 实施例3：在大肠杆菌中CPS14缀合物的合成
[0161] 为进一步显示大肠杆菌可以用于CPS缀合物的生产，本发明人以生产CPS14缀合物为目标。CPS14多糖由如CPS1和CPS4相似的结构的CPS14簇（图19）编码。CPS14由聚合的RU和以下结构（图20）组成：-1,6-(b-D-Gal-1,4)-b-D-GlcNAc-1,3-b-D-Gal-1,4-b-D-Glc-。
[0162] CPS14的生物合成从通过WchA活性将磷酸-D-Glc添加至十一异戊烯磷酸（Und-P）开始。WchA生物化学上显示为磷酸-葡萄糖转移酶，具有如由荚膜异多糖酸簇中基因编码的大肠杆菌WcaJ蛋白同样的活性。D-Glc进一步的延长通过在簇中存在的其他糖基转移酶的酶促作用实现（Kolkman MA, van der Zeijst BA, Nuijten PJ: Functional analysis of glycosyltransferases encoded by the capsular polysaccharide biosynthesis locus of Streptococcus pneumoniae serotype 14. J Biol Chem 1997, 272(31):19502-19508）。将CPS14簇中不同ORF的详细功能预测为wzg、wzh、wzd、wze (调节子和3个转运相关基因)、WchJK (D-Gal转移酶)、WchL (D-GlcNAc转移酶)、 WchM (D-Gal 转移酶)、Wzy (聚合酶)、Wzx (翻转酶)。WciY对CPS14形成是非必要的，而wchN缺失负面影响了CPS14产量（Kolkman MA, Wakarchuk W, Nuijten PJ, van der Zeijst BA: Capsular polysaccharide synthesis in Streptococcus pneumoniae serotype 14: molecular analysis of the complete cps locus and identification of genes encoding glycosyltransferases required for the biosynthesis of the tetrasaccharide subunit. Mol Microbiol 1997, 26(1):197-208）。CPS14簇在这一意义上是特别的：存在比CPS14生物合成最少所需更多的编码的功能。最有可能地，一些具有未分配功能的蛋白质是支持荚膜生物合成的辅助酶。
[0163] 为测试在大肠杆菌中CPS14多糖的生产，将由wchA至wciY的一段序列组成的CPS14基因簇克隆至pDOC供体质粒（Lee DJ, Bingle LE, Heurlier K, Pallen MJ, Penn CW, Busby SJ, Hobman JL: Gene doctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiol 2009, 9:
252）（所述质粒指定将CPS14整合至O16抗原簇（pGVXN615））中，并且转化至大肠杆菌菌株GVXN1128 (W3110 ΔwaaL)。经蛋白酶K消化的携带pGVXN615的大肠杆菌细胞的免疫印迹分析显示了梯状图案，其使用用于临床CPS14分离物的荚膜血清分型的CPS14抗血清检测（图
21插图，小图A）。此外，为积累单一的重复单元，通过转座子突变将在pGVXN615中的CPS14簇的聚合酶wzy缺失，产生pGVXN643。将糖脂从使用pGVXN643转化的大肠杆菌细胞中提取，并且在如上文描述的水解和荧光标记后通过NP-HPLC分析。特异的峰从glycosepN柱在57.4分钟洗脱（图21，小图A）。对该峰的MS和MS/MS分析与CPS14的单一重复单元的预期质量和碎裂图形相匹配（图21，小图B）。这确认了在O抗原启动子的控制下部分CPS14基因簇的表达可以导致在共同的大肠杆菌宿主细胞中的重组LPS生物合成的CPS14寡糖生产。
252）（所述质粒指定将CPS14整合至O16抗原簇（pGVXN615））中，并且转化至大肠杆菌菌株GVXN1128 (W3110 ΔwaaL)。经蛋白酶K消化的携带pGVXN615的大肠杆菌细胞的免疫印迹分析显示了梯状图案，其使用用于临床CPS14分离物的荚膜血清分型的CPS14抗血清检测（图
21插图，小图A）。此外，为积累单一的重复单元，通过转座子突变将在pGVXN615中的CPS14簇的聚合酶wzy缺失，产生pGVXN643。将糖脂从使用pGVXN643转化的大肠杆菌细胞中提取，并且在如上文描述的水解和荧光标记后通过NP-HPLC分析。特异的峰从glycosepN柱在57.4分钟洗脱（图21，小图A）。对该峰的MS和MS/MS分析与CPS14的单一重复单元的预期质量和碎裂图形相匹配（图21，小图B）。这确认了在O抗原启动子的控制下部分CPS14基因簇的表达可以导致在共同的大肠杆菌宿主细胞中的重组LPS生物合成的CPS14寡糖生产。
[0164] 为了改善和稳定CPS14多糖在大肠杆菌中的生物合成，将含有从wchA至wciY的一段序列的部分CPS14簇克隆至pDOC-C替换质粒中（Lee DJ, Bingle LE, Heurlier K, Pallen MJ, Penn CW, Busby SJ, Hobman JL: Gene doctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiol 2009, 9:252），其被指定将CPS14整合入大肠杆菌荚膜异多糖酸簇（pGVXN710）。
CPS14的整合在数个大肠杆菌菌株中完成，其包括如上文描述的GVXN1052 (W3110)、GVXN1128 (W3110 ΔwaaL)和GVXN1716 (W3110 ΔwaaLΔwecA-wzzE)。已经显示在正常条件下荚膜异多糖酸基因不在大肠杆菌中表达，并且它们的表达通过调节子的复杂网络控制。鉴定了荚膜异多糖酸的转录需要正调节子RcsA（Ebel W, Trempy JE. J Bacteriol.
1999;181(2):577-84）。经蛋白酶K消化的携带用于RcsA表达的质粒（pGVX688）的大肠杆菌菌株的免疫印迹分析显示了由CPS14抗血清（其用于临床CPS14分离物的血清分型）检测的梯状图案，在所述大肠杆菌菌株中由CPS14簇替换荚膜异多糖酸簇；该图案在不存在RcsA下是不可检测的（参见图22）。该结果证明荚膜异多糖酸是整合多糖生物合成途径的合适靶位置，并且异源多糖的表达通过大肠杆菌RcsA蛋白质严格控制。
CPS14的整合在数个大肠杆菌菌株中完成，其包括如上文描述的GVXN1052 (W3110)、GVXN1128 (W3110 ΔwaaL)和GVXN1716 (W3110 ΔwaaLΔwecA-wzzE)。已经显示在正常条件下荚膜异多糖酸基因不在大肠杆菌中表达，并且它们的表达通过调节子的复杂网络控制。鉴定了荚膜异多糖酸的转录需要正调节子RcsA（Ebel W, Trempy JE. J Bacteriol.
1999;181(2):577-84）。经蛋白酶K消化的携带用于RcsA表达的质粒（pGVX688）的大肠杆菌菌株的免疫印迹分析显示了由CPS14抗血清（其用于临床CPS14分离物的血清分型）检测的梯状图案，在所述大肠杆菌菌株中由CPS14簇替换荚膜异多糖酸簇；该图案在不存在RcsA下是不可检测的（参见图22）。该结果证明荚膜异多糖酸是整合多糖生物合成途径的合适靶位置，并且异源多糖的表达通过大肠杆菌RcsA蛋白质严格控制。
[0165] 为了进一步表征在大肠杆菌中产生的CPS14，将GVX6129 (W3110ΔwaaL CA::CPS14)与pGVXN688 (rcsA)一同转化至大肠杆菌。通过如上文描述的2-AB标记和MS/MS分析对糖脂进行分析。MS/MS分析鉴定了CPS14的2个和3个亚基，分别在95.9分钟和115.3分钟洗脱（参见图24）。
[0166] 为测试在大肠杆菌中转运蛋白基因的表达对生产CPS14多糖的效果，将含有转运蛋白基因的肺炎链球菌CPS14簇的wzg 至wze克隆至具有IPTG可诱导启动子的低拷贝数质粒（pGVX 72）中以形成pGVX1497。将质粒转化至大肠杆菌菌株GVX6126（大肠杆菌W3110 CA::CPS14），从中CPS14簇的wchA至wciY部分已整合至荚膜异多糖酸大肠杆菌中。使用pGVX72或pGVX1497转化GVX6126 并且培养，并使用0.01 mM IPTG诱导转运蛋白基因表达。在过夜孵育后收获大肠杆菌细胞并且使用蛋白酶K消化，并且通过SDS-PAGE将蛋白酶抗性生物量分离并且在糖脂转移至硝酸纤维素膜后通过免疫检测分析。结果显示在pGVXN1497（表达wzg-wzh-wzd-wze）存在下，通过抗CPS14抗血清检测到高分子量梯状信号（参见图23，泳道3），并且当使用空载体（pGVX72）替换pGVXN1497 时，梯状物大小显著地降低（参见图
23，泳道2）。这证明了转运蛋白基因对CPS生产的支持性需要。
23，泳道2）。这证明了转运蛋白基因对CPS生产的支持性需要。
[0167] gtrABS 操纵子涉及Und-P（与CPS14 的天然起始物步骤（通过wchA合成）Und-PP非常相似的细胞复合物）上的葡萄糖合成。gtrABS 操纵子含有编码涉及在细胞质中Und-P上的葡萄糖的组装、将糖脂翻转至周质的酶，和将Und-P-葡萄糖用作供体来将葡萄糖残基转移至大肠杆菌W3110中O16亚基的还原端GlcNAc上的糖基转移酶的基因。
[0168] 为避免具有D-Glc的两种脂质前体的生产和单独生产Und-PP-CPS14而非Und-P-CPS14，可以使用只将Und-PP-葡萄糖作为起始物葡萄糖的酶。此外，可以缺失Und-P-葡萄糖生产途径。这样，全部CPS通过焦磷酸键连接至Und并且因此可以用于糖基化。
[0169] 为了进一步说明和优化在大肠杆菌中的CPS14生物合成途径，可以提高CPS14途径的起始物糖基转移酶的活性。这通过以下探究：通过wchA和wcaJ的缺失，并且通过携带质粒的过表达策略使用相同的基因互补它们，并且分析在糖脂生产上的效果。
[0170] 含有wcaJ 基因的质粒可以良好地转化至含有CPS14但是缺乏 WchA和WcaJ的大肠杆菌菌株（例如W3110 ΔwaaL ΔrfbO16::CPS14-clmR ΔwchA ΔgtrABS）中。使用建立的方法，可以在这些菌株中分析糖生产。基于这些结果，可以测定用于连接Und-PP的CPS14的最大量生产的最优基因组合，并且用于转化大肠杆菌产生最优生产菌株。当然，具有优秀的糖生产的该新型大肠杆菌菌株可以对富集糖基化蛋白质（N和O糖基化两者）的生产是理想的。此外，如果另外地，该新工程改造的菌株可以用于产生不同的糖缀合物；不同的蛋白载体被包括在任何在还原端含有Glc的糖缀合物的生产菌株中。
[0171]
[0172] 表1：在第0天、第21天和第42天用指明的糖缀合疫苗（注，以μg 计的规定量指的是多糖/注射的量）通过皮下途径对‘新西兰白’兔免疫。糖缀合疫苗或者对于三次免疫用0.12% Al3+ 佐剂化，或者对于引发免疫（第0天）用弗氏完全佐剂(FCA)佐剂化且对于两次加强免疫（第21天和第42天）用弗氏不完全佐剂(FIA)佐剂化。根据生产商说明书使用Prevnar-13并且每次免疫注射一人剂量（对应2.2 μg CPS4多糖）。将动物在第56天处死并且将获得的血清在调理吞噬杀灭测定（opsonophagocytosis killing assay）（OPK）中对中和活性进行分析。将“调理素指数”定义为杀灭50%细菌（肺炎球菌血清型4）的血清的稀释度。
[0173] 等同方案：
[0174] 在本文中公开的方法、宿主细胞和组合物不限制于由本文中描述的具体实施方案的范围。实际上，除了描述的那些之外的方法、宿主细胞和组合物的多种改变将从前文描述和附图中对于本领域技术人员是显而易见的。此类改变意在落入所附的权利要求的范围中。
[0175] 在本文中引用多个出版物、专利和专利申请，其公开内容以其整体通过引用并入。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种低溶血活性的蜂毒肽及其应用 | 2020-05-08 | 139 |
| 一种抗菌肽ID13及其制备方法和应用 | 2020-05-08 | 331 |
| 色瑞替尼的抗菌新用途 | 2020-05-08 | 190 |
| 一种载益生菌的微胶囊的制备方法及由其制得产品和应用 | 2020-05-12 | 914 |
| 一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法 | 2020-05-08 | 900 |
| 一株抑制植物病原真菌的枯草芽孢杆菌Baisha2C | 2020-05-08 | 965 |
| 一株苯酚降解菌及其应用 | 2020-05-11 | 962 |
| 用于广谱抗菌的壳聚糖季铵盐/纳米铜复合材料的制备方法 | 2020-05-08 | 926 |
| 通过酶缀合在大肠杆菌中生产重组疫苗 | 2020-05-08 | 507 |
| 一种减少解冻过程中微生物变化的解冻方法 | 2020-05-11 | 936 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈