一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法
阅读：900发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且脓毒病是一种危害生命的全身性感染，需要在快速测定病原体的 基础 上进行适当和快速的 治疗 。革兰氏阴性菌(GNB)是内毒素(LPS)作为其特征性替代 生物 标志物的主要致病病原体。在这项研究中，首先探索了一种新的方法，首先通过GNB培养增加LPS，然后通过动态 浊度 测定法(KT-TALA)检测鲎 变形 细胞溶解物(TAL)的LPS。优化了样品制备程序。结果表明，在高GNB浓度下，LPS可在培养后3小时检测到，提前6.5-7.5小时，而BD BACTEC阳性报告在9.5-10.5小时；在低GNB负载下，BD BACTEC系统检测GNB需要22-26小时，但KT-TALA系统仅需9小时来检测GNB的LPS，提前13-17小时。本 发明 的检测GNB感染LPS的新方法比传统的BD BACTEC系统快得多，特别是在细菌负荷较低的脓毒病的早期阶段，这将有助于在更早的时间内做出适当的治疗决策。，下面是一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法专利的具体信息内容。
1.一种检测脓毒病患者血液中革兰氏阴性菌(GNB)产生的内毒素的新方法，其特征在于，所述方法包括血液培养、动态取样、稀释、加热、旋转、进一步稀释，并用动态浊度读数器和鲎变形细胞溶解物(TAL)进行测定，所述动态浊度TAL测定(KT-TALA)系统包括：
(A)用于血液培养、取样、稀释、加热、旋转，进一步稀释和以最佳条件进行测试的技术和装置；
(B)特殊鲎变形细胞溶解物(TAL)试剂；
(C)用于动态浊度TAL测定的读数器(KT-TALA)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受试者是人和动物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测试目标是由革兰氏阴性细菌(GNB)在血液中产生的内毒素脂多糖(LPS)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测试试剂是变形细胞溶解物，包括TAL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动态取样是每1-2小时。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动态浊度读数用于LPS靶向TAL的凝胶化过程。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用于血液培养、取样和测试的整个过程由装置完全自动化。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，可以用于与LPS检测有关的所有领域。
9.一种检测体系，其特征在于，包括：
(a)用于血液培养、取样、稀释、加热、旋转，进一步稀释和以最佳条件进行测试的技术和装置；
(b)特殊鲎变形细胞溶解物(TAL)试剂；
(c)用于动态浊度TAL测定的读数器(KT-TALA)；和
(d)鲎变形细胞溶解物(TAL)。
10.一种权利要求9所述的检测体系的用途，其特征在于，用于制备检测脓毒病患者血液中革兰氏阴性菌(GNB)产生的内毒素的试剂或试剂盒。
一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法
技术领域
背景技术
[0002] 脓毒病是最危险的情况，需要立即进行专用治疗，因为每小时延迟会使死亡率增加5-10％，导致高达～30％的死亡。脓毒病的高发病率主要与创伤、感染、主要器官功能障碍和许多疾病，如癌症、衰老等的末期有关。快速检测系统侵入的病原体对于挽救生命至关重要。
[0003] 目前，血培养仍是脓毒病诊断的金标准，其利用累积到一定水平的代谢产物，用BD BACTEC系统触发阳性报告基因(http：//www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/microbiology-solutions/blood-culture/bd-bactec-fx-blood-culture-system)。对于～50％的脓毒病患者，这需要大约16-24小时，对于其余的患者，大约需要＞24小时，这对于快速制定治疗决策来说所需的时间太长了。此外，并非BD BACTEC系统都能检测到血液中的所有GNB。Thomas等人报道，在培养物中发现12个样品是内毒素阳性而没有相应的GNB。在这12种阳性内毒素检测中的7种中，可以提供这些阳性检测的实验室或临床解释。这组数据表明，非常需要一种新的测定来补偿GNB感染中BD BACTEC系统的“盲点”。
[0004] 众所周知，由鲎(Limulus polyphemus)的阿米巴样细胞制备的TAL是检测GNB的LPS的最敏感的试剂。动态浊度TAL测定(KT-TALA)的作用机制是内毒素激活酶化合物C，然后激活TAL的化合物B，并触发凝结酶的级联并形成凝胶，其可以用比浊读数器进行动力学记录。这种灵敏的检测方法已广泛用于检测不同生物样本中的内毒素，如血液，尿液，腹水，胸腔积液，脑脊液，支气管肺泡灌洗液，空气和水。与传统的GNB培养试验相比，LPS-TAL试验更灵敏，更可靠。
[0005] 然而，在许多脓毒病病例中，特别是在脓毒病发作期间，即使使用最灵敏的KT-TALA方法，血液内毒素的水平也是不可检测的。有人提出，只有当血浆LPS＞0.5EU/ml时，才能确定GNB引起的内毒素仅发生在患有感染性休克或严重脓毒病的患者中，这对于有效治疗来说为时已晚。迫切需要开发更灵敏的用于检测LPS的基于TAL的方法。
[0006] 来自GNB脓毒病的血液样本在37℃富含营养物中进行短时间(几小时)的培养，每20分钟GNB快速加倍，大量产生/释放LPS，其可通过KT-TALA方法容易地检测到并且比BD BACTEC系统血培养报告为LPS+GNB+脓毒病早得多。
[0007] 开发灵敏LPS检测的新方法不仅有助于早期诊断GNB脓毒症，还有助于监测治疗效果，这可能是临床医生和研究人员所欢迎的。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种不仅有助于早期诊断GNB脓毒症，还有助于监测治疗效果的开发灵敏LPS检测的新方法。
[0009] 本发明第一方面提供了一种检测脓毒病患者血液中革兰氏阴性菌(GNB)产生的内毒素的新方法，其特征在于，所述方法包括血液培养、动态取样、稀释、加热、旋转、进一步稀释，并用动态浊度TAL测定(KT-TALA)系统和鲎变形细胞溶解物(TAL)进行测定，所述动态浊度TAL测定(KT-TALA)系统包括：
[0010] (A)用于血液培养、取样、稀释、加热、旋转，进一步稀释和以最佳条件进行测试的技术和装置；
[0011] (B)特殊鲎变形细胞溶解物(TAL)试剂；
[0012] (C)用于动态浊度TAL测定的读数器(KT-TALA)。
[0013] 在另一优选例中，所述受试者是人和动物。
[0014] 在另一优选例中，所述测试目标是由革兰氏阴性细菌(GNB)在血液中产生的内毒素脂多糖(LPS)。
[0015] 在另一优选例中，所述测试试剂是变形细胞溶解物，包括TAL。
[0016] 在另一优选例中，所述动态取样是每1-2小时。
[0017] 在另一优选例中，所述动态浊度读数用于LPS靶向TAL的凝胶化过程。
[0018] 在另一优选例中，用于血液培养、取样和测试的整个过程由装置完全自动化。
[0019] 在另一优选例中，可以用于与LPS检测有关的所有领域。
[0020] 本发明第二方面提供了一种检测体系，包括：
[0021] (a)用于血液培养、取样、稀释、加热、旋转，进一步稀释和以最佳条件进行测试的技术和装置；
[0022] (b)特殊鲎变形细胞溶解物(TAL)试剂；
[0023] (c)用于动态浊度TAL测定的读数器(KT-TALA)；和
[0024] (d)鲎变形细胞溶解物(TAL)。
[0025] 本发明第三方面提供了一种本发明第二方面所述的检测体系的用途，用于制备检测脓毒病患者血液中革兰氏阴性菌(GNB)产生的内毒素的试剂或试剂盒。
[0027] 图1显示了疑似患有GNB感染的血液中LPS检测的新步骤。
[0028] 图2显示了将结果与LPS标准曲线进行比较，以确定LPS在疑似血液中的GNB随时间增长时是否增加。
具体实施方式
[0029] 经过广泛而深入的研究，本发明首次意外的发现了一种在GNB感染的血液中检测LPS的新方法，具体地，本发明采用的KT-TALA系统检测GNB的LPS，与BD BACTEC系统相比，本发明采用的KT-TALA系统可极大缩短检测时间，即检测GNB的LPS仅需9小时，并且本发明的方法具有非常高的灵敏度。在此基础上，本发明人完成了本发明。
[0030] 本发明的主要优点包括：
[0031] (1)本发明的方法可极大缩短检测GNB的LPS的时间。
[0032] (2)本发明的方法具有非常高的灵敏度。
[0033] (3)与BD BACTEC系统相比，本发明采用的KT-TALA系统可极大缩短检测时间，即检测GNB的LPS仅需9小时，检测GNB脓毒病比传统BD BACTEC系统早得多。
[0034] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0035] 实施例中用到的材料和试剂如无特殊说明，均为市售产品。
[0036] 实施例1 快速检测疑似脓毒病患者培养血液中LPS的方法
[0037] 疑似患有GNB感染的血液中LPS检测的新步骤。简言之，将3-5ml血液加入培养瓶中。2小时后，每隔一小时取0.5ml样品用于LPS的动态测试。在用KT-TAL系统进行LPS定量测定之前，将样品稀释、加热、旋转并再次稀释。
[0038] 实施例2 参考标准的制定
[0039] 用无内毒素的水重构冻干的内毒素标准储备液，稀释至50、10、1、0.1、0.01和0EU/ml的终浓度，在微量培养板上进行三次独立实验。向每个孔中加入100μl TAL试剂后，将板置于动态培养读数器(BioTekTM ELx808IULALXH)中，并且该读数器立即开始用动力学测定程序测定内毒素水平。在波长630nm下每30秒记录凝胶形成30-60分钟。对于这组研究，产生的公式是Log(Y)＝A*Log(X)+B，其中Y＝反应时间(起始时间)，A＝Y截距，X＝内毒素浓度，B＝回归曲线的斜率。在这组研究中，A为-0.279，B为5.95，R2(相关效率)为0.994。如果使用相同的批次试剂和相同的程序完成标准曲线，则可以将其存储在读数器中作为以下分析的参考。但是，如果试剂发生变化或程序发生变化，则需要重新创建新标准作为新参考。将未知样品的结果与LPS标准曲线进行比较，以确定疑似血液中的GNB随时间而增加，LPS是否会随其一同增加。
[0040] 实施例3 加热对GNB样品释放的LPS和测定特异性的影响
[0041] 基于以下知识：(1)LPS具有两种形式，游离LPS和与完整细胞壁相关的LPS(Jorgensen等人，1973)；和(2)热不仅可以促进LPS的释放，而且还可以变性/沉淀干扰物质，并有助于更灵敏的定量LPS，采用热量作为样品制备的必要步骤。如表1所示，在4、5、6、7、8和9小时收集一系列培养的大肠杆菌样品，并进行加热或不加热，对同时制备的成对样品比较检测的LPS水平。在第4小时，未加热样品的LPS为0.144EU/ml，而加热样品的LPS为
6.689EU/ml。类似地，在第5、6、7、8小时，未加热的样品相对缓慢地从0.326、0.999、4.237升至10.706EU/ml，并且在第9小时＞14.125EU/ml时，而在第5小时，加热时间达到10.854，相当于第8小时未加热的样品。后来，在第6小时，加热的样品达到＞14.125，相当于第9小时未加热的样品，这表明加热步骤可以将LPS从不可检测的形式显著增加到可检测的形式，并减少测定的干扰因素，从而显著促进早期GNB感染中的LPS的检测。
6.689EU/ml。类似地，在第5、6、7、8小时，未加热的样品相对缓慢地从0.326、0.999、4.237升至10.706EU/ml，并且在第9小时＞14.125EU/ml时，而在第5小时，加热时间达到10.854，相当于第8小时未加热的样品。后来，在第6小时，加热的样品达到＞14.125，相当于第9小时未加热的样品，这表明加热步骤可以将LPS从不可检测的形式显著增加到可检测的形式，并减少测定的干扰因素，从而显著促进早期GNB感染中的LPS的检测。
[0042] 表1 加热对GNB样品释放的LPS和测定特异性的影响#
[0043]
[0044] #用不含LPS的水以1∶4的比例稀释样品，在100℃加热10分钟，在450g下旋转3分钟，然后将上清液以1∶10的比例进一步稀释，用KT-TAL系统进行LPS测定。以相同的趋势重复实验三次，即在GNB大肠杆菌组中，加热的样品的LPS远高于未加热的样品(*P＜0.05)，而在革兰氏阳性金黄色葡萄球菌组中，加热和未加热样品之间的ET没有差异。
[0045] 实施例4 离心对ET恢复的影响
[0046] 由于KT-TALA测定凝胶的形成，而LPS与TAL试剂反应，因此需要样品清洁和透明。然而，在加热和变性后，血液样本变得混浊，不得不旋转混浊的物质。表2显示离心的速度和时间可能影响LPS的恢复。在Allegra 21R离心机中使用1.5ml管旋转混浊物质，发现当以
10,000rpm旋转3min时，LPS丢失率为14.97％，而在3,000rpm下3min时，LPS损失8.75％，类似于不旋转的6.55％。该数据表明LPS可在旋转过程中共沉淀。高速旋转比低速旋转下拉更多的LPS。优化的旋转速度为3,000rpm，持续3分钟。如果样品清洁且透明，则可能不需要旋转。旋转的速度和时间很大程度上取决于样品的透明度。
10,000rpm旋转3min时，LPS丢失率为14.97％，而在3,000rpm下3min时，LPS损失8.75％，类似于不旋转的6.55％。该数据表明LPS可在旋转过程中共沉淀。高速旋转比低速旋转下拉更多的LPS。优化的旋转速度为3,000rpm，持续3分钟。如果样品清洁且透明，则可能不需要旋转。旋转的速度和时间很大程度上取决于样品的透明度。
[0047] 表2 离心对LPS损失的影响＊
[0048]
[0049] *将来自同一BD BACTEC瓶的培养5天的阴性培养基分成几管，每管加入标准的1EU/ml LPS，以不同速度离心，测定LPS并以(1-测定的LPS/1.045)×100％计算LPS损失率。
[0050] 实施例5 样品稀释对LPS测定结果的影响
[0051] 具有3-10ml全血的BD BACTEC培养瓶含有大量可能与TAL结合并阻止其与LPS凝胶化的组分，即使存在大量ET也产生阴性结果。虽然热/旋转过程可去除一些具有大分子量的干扰物质，但在KT-TALA测定之前优化的稀释将有助于减少具有小分子量的干扰物质。为了确定优化的稀释因子，在BD BACTEC瓶中培养了4个样品(1个正常血液，命名为M1；3个患者血液，命名为CN1，2，3)，每个样品分成两个管：一个作为背景，另一个加入标准的1EU的LPS。加热成对样品，以3000rpm旋转3分钟并在KT-TALA测定之前以不同的比例(1∶10，1∶20，1∶40或1∶100)稀释。结果(表3)显示，在1∶10稀释组，所有4对成对样品未检测到LPS(＜0.007EU/ml)，这表明高水平的干扰因子阻断LPS-TAL凝胶化。在1∶20稀释组中，4个加标液也显示出非常低水平的LPS(0.01～0.025EU/ml)。在1∶40和1∶100稀释组中，加入样品中的所有加标液显示其LPS水平接近1EU，高回收率为97.66％-118.99％。数据支持只有在干扰物质被稀释到一定的低水平后，TAL试剂才能开始与LPS反应并形成凝胶。采用这种新方法，最佳稀释倍数为1∶40至1∶100。
[0052] 表3 加标样品回收试验的样品稀释的优化#
[0053]
[0054]
[0055] #：在标有-S的所有试管中加入1EU/ml LPS，检测到的LPS应为～1，＜1EU/ml，这表明存在一些抑制试验系统的强因子。
[0056] M1*：将加3ml血液的培养基作为背景对照。
[0057] M1-S*：向M1*中加入标准的LPS(1EU/ml)以进行不同稀释度下的LPS回收(％)。
[0058] CN1*，CN2*，CN3*：将不添加LPS的来自BD瓶的临床血培养阴性样品作为背景对照。
[0059] CN1-S*，CN2-S*，CN3-S*：在不同稀释度下，向CN1*，CN2*，CN3*中加入标准的LPS(1EU/ml)，用于计算不同稀释度下的LPS回收率(％)。
[0060] 实施例6 KT-TALA系统与BD BACTEC系统之间GNB检测时间的比较
[0061] 本研究的目的是将血培养与KT-TALA测定相结合，检测GNB的LPS比传统的BD BACTEC系统早得多。为了证明是这种情况，将0.5McF的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(作为测试)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(作为阴性对照)以1∶10-8、1∶10-9、1∶10-11、1∶10-12的系列比例进行稀释，将同样数量的细菌注入两个BD BACTEC瓶，一个用于BD BACTEC检测器报告阳性检测时间，另一个用于37℃细菌振荡培养箱(功能类似于BD BACTEC检测器)，每小时进行LPS采样，每小时在培养后3小时开始，以确定LPS检测为阳性的第一个时间点。独立实验的结果(表4)显示，在实验1中，当以1∶10-8接种GNB(从0.5McF开始)时，KT-TALA系统的LPS阳性报告时间为3小时，6.5至7.5小时。
早于BD BACTEC系统的细菌阳性报告时间。在实验2中进一步证实了这种LPS早期检测和对GNB的特异性，这表明LPS报告时间比细菌阳性报告时间早6.5至8.5小时，并且在革兰氏阳性金黄色葡萄球菌培养基中未检测到LPS。当培养瓶中的细菌数量较少时，LPS早期报告时间的优势更为明显，实验3证明，GNB在1∶10-9，1∶10-11，1∶10-12(从0.5McF开始)的浓度下，ET阳性报告时间分别比细菌阳性报告时间早13h，16h或17h。这可能意味着在低负荷细菌感染的脓毒病的早期阶段，BD BACTEC系统检测GNB需要22-26小时，而KT-TALA系统检测GNB的LPS仅需9小时，这将有助于医生在更早的时间做出适当的治疗决定。
早于BD BACTEC系统的细菌阳性报告时间。在实验2中进一步证实了这种LPS早期检测和对GNB的特异性，这表明LPS报告时间比细菌阳性报告时间早6.5至8.5小时，并且在革兰氏阳性金黄色葡萄球菌培养基中未检测到LPS。当培养瓶中的细菌数量较少时，LPS早期报告时间的优势更为明显，实验3证明，GNB在1∶10-9，1∶10-11，1∶10-12(从0.5McF开始)的浓度下，ET阳性报告时间分别比细菌阳性报告时间早13h，16h或17h。这可能意味着在低负荷细菌感染的脓毒病的早期阶段，BD BACTEC系统检测GNB需要22-26小时，而KT-TALA系统检测GNB的LPS仅需9小时，这将有助于医生在更早的时间做出适当的治疗决定。
[0062] 表4 KT-TAL比BD BACTEC系统更快地检测培养瓶中的GNB*
[0063]
[0064]
[0065] *将大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(测试)和金黄色葡萄球菌(阴性对照)调节至0.5McF，并以1∶108，1∶109，1∶1011或1∶1012的系列比例进一步稀释。将两个等量的细菌注入两个BD BACTEC瓶中，一个瓶置于BD BACTEC检测器中用于GNB阳性检测报告的时间，另一个置于实验室37℃细菌振荡器用于每小时LPS取样，在培养后3小时开始。进行KT-TAL测定以在不同时间点检测GNB的LPS。通过减去两个报告时间来确定两次测定之间的阳性检测时间的差异。
[0066] 实施例7 新方法检测GNB脓毒病比传统BD BACTEC系统早得多
[0067] 为了证明我们的新方法可以比传统的BD BACTEC系统更早地检测到GNB感染的脓毒病，将来自疑似脓毒病的患者的10ml血液分别注射到两个BD BACTEC瓶中，每个注射5ml，其中一个用于BD BACTEC系统以报告病原体，另一个用于LPS测定，作为培养后不同时间的取样。BD BACTEC系统在28.5小时报告GNB病原阳性，而KT-TALA系统检测到LPS在培养后12小时呈阳性，这表明本发明的新方法比传统BD BACTEC系统早16.5小时检测到GNB。感染的病原体被鉴定为鲍氏不动杆菌(acinetobacter baumannii)。
[0068] 表5 鲍氏不动杆菌脓毒病患者培养样品中LPS的动态测试*
[0069]
[0070]
[0071] *将疑似脓毒病的患者的10ml血液分别注入2个BD BACTEC瓶中，各5ml，一个用于BD BACTEC系统报告病原体，另一个用于在指定时间点进行LPS的测定取样。在28.5小时，BD BACTEC系统报告病原体阳性，并且在培养后12小时检测到LPS，差异为16.5小时。感染的病原体被鉴定为鲍氏不动杆菌(acinetobacter baumannii)。
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