一种油橄榄叶中羟基酪醇乙酸酯在制备杀菌剂中的应用
阅读：341发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种油橄榄叶中羟基酪醇乙酸酯在制备杀菌剂中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种油橄榄叶中羟基酪醇乙酸酯在制备 杀菌剂 中的应用。细菌生长抑制试验表明，羟基酪醇乙酸酯对弧菌具有抗菌活性，对副溶血性弧菌的最小抑制浓度和最小杀菌浓度分别为39和78μg/mL，羟基酪醇乙酸酯的抗菌活性是有浓度依赖性的。膜通透性评估测定表明，羟基酪醇乙酸酯增加了副溶血弧菌的膜通透性。DNA相互作用测定和琼脂糖凝胶 电泳 显示羟基酪醇乙酸酯能与DNA相互作用。羟基酪醇乙酸酯增强了DNA结合分子的 荧光 强度并介导了超螺旋DNA的解螺旋。羟基酪醇乙酸酯最终抑制细菌生长并诱导细菌死亡，羟基酪醇乙酸酯具有抗菌性，是一种潜在的 抗菌剂 。，下面是一种油橄榄叶中羟基酪醇乙酸酯在制备杀菌剂中的应用专利的具体信息内容。
一种油橄榄叶中羟基酪醇乙酸酯在制备杀菌剂中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种羟基酪醇乙酸酯的应用，具体涉及一种来自油橄榄叶中的羟基酪醇乙酸酯的应用，特别涉及一种来自油橄榄叶中的羟基酪醇乙酸酯在制备杀菌剂或杀菌组合物中的应用。
背景技术
[0002] 弧菌属于革兰氏阴性细菌，是多种海洋动物的致病菌，在海洋水产养殖中引起了严重的疾病，造成了重大经济损失。目前，常用抗生素来治疗海水养殖动物中的弧菌感染。尽管抗生素治疗已部分解决了弧菌感染问题，但它同时也带来了耐药性、环境污染和食品安全等一系列新问题。为了克服这些问题，亟待发现对人类和环境健康风险最小的更安全，更有效的抗菌药物。
[0003] 在过去的十年中，中草药制剂替代抗生素治疗的策略取得了很大的发展。研究表明许多植物具有抗菌活性，活性物质包括丁醇、不饱和长链醛、肽、香精油、生物碱和酚等化合物。这些化合物对弧菌病具有潜在的治疗应用。历史记载橄榄树(油橄榄(Olea europeaea)，油菜科)为地中海盆地提供了可观的经济和饮食效益。此外，橄榄叶提取物还用于地中海地区的民间医学中，以治疗发烧和其他疾病。橄榄叶含有烯醚萜，类黄酮和酚类化合物。这些化合物具有抗氧化，降血糖，抗高血压，抗微生物，抗肿瘤，抗动脉粥样硬化和抗病毒(包括抗HIV)等活性。橄榄苦苷及其衍生物，例如羟基酪醇和酪醇，可能是橄榄叶的主要酚类成分，这些化合物可能具有抗菌作用。Brahmi等报道，橄榄叶的抗菌活性与其萜烯含量有关，萜烯通过破坏细胞膜起作用。Sudjana等发现橄榄叶提取物可选择性降低空肠弯曲杆菌和幽门螺杆菌的水平，从而调节胃菌群的组成。尽管最近有越来越多的研究人员关注橄榄叶的抗菌活性，但对该活性的物质基础和作用机理尚未完全了解。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种油橄榄叶中羟基酪醇乙酸酯在制备杀菌剂中的应用。本发明在从橄榄叶中识别潜在抗菌剂的筛选过程中，发现来源于橄榄的羟基酪醇乙酸盐是潜在的具有抗弧菌活性的天然化合物，羟基酪醇乙酸酯具有显著的抗菌活性，可以作为抗菌剂或抗菌剂的成分使用。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供一种羟基酪醇乙酸酯在制备杀菌剂中的应用。
[0007] 优选的，羟基酪醇乙酸酯作为唯一活性成分在制备杀菌剂中的应用。
[0008] 优选的，所述的杀菌剂用来杀灭弧菌。
[0009] 优选的，所述的杀菌剂用来杀灭溶藻弧菌，鳗弧菌，灿烂弧菌、副溶血弧菌。
[0010] 优选的，所述的杀菌剂可以制成常规的剂型。
[0011] 优选的，所述的杀菌剂为水剂、粉剂、颗粒剂。
[0012] 本发明中所述的羟基酪醇乙酸酯，是从橄榄叶中分离得到(>98％)，结构式如下所示：
[0013]
[0014] 本发明的有益效果通过下列试验证明：
[0015] 所述试验中材料为：羟基酪醇乙酸酯是从橄榄叶中分离得到(>98％)；碘化丙啶(PI)，吖啶橙(AO)，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)和Hoechst33258购自Beyond；小牛胸腺DNA(ctDNA)和pBR322质粒DNA购自TAKARA。
[0016] 所述试验中菌株为：溶藻弧菌，鳗弧菌，灿烂弧菌和副溶血弧菌由申请人实验室提供，在2216E培养基中26℃培养。
[0017] 所述试验中数据分析：所有实验至少重复三次，并且数据用平均值±SD表示。t检验确定对照组和处理组之间是否存在显著差异。P<0.05被认为具有显著差异。
[0018] 试验例1、羟基酪醇乙酸酯的抗菌活性测定
[0019] 通过琼脂扩散测定法检测羟基酪醇乙酸酯的抗菌活性：使用玻璃涂布棒将100μL的细菌稀释液均匀地涂布在2216E平板上。然后，将5μL 100mg/mL羟基酪醇乙酸酯溶液在无菌条件下加入到直径为6mm的无菌滤纸片上。将滤纸片轻轻放置在接种的2216E平板表面。然后将平板置于26℃恒温培养箱中过夜培养。最后，在培养结束时测量抑菌圈的直径。
[0020] 图1a-图1d分别为羟基酪醇乙酸酯抑制溶藻弧菌，鳗弧菌，灿烂弧菌和副溶血弧菌的抑菌圈照片，对溶藻弧菌，鳗弧菌，灿烂弧菌和副溶血弧菌的有效抑制区直径分别为14.4±2.3、21.2±1.7、16.7±2.1和27.3±3.6mm(如表1所示)；副溶血弧菌对羟基酪醇乙酸酯相对更敏感。由此可知，羟基酪醇乙酸酯对弧菌属具有抗菌活性。
[0021] 表1：羟基酪醇乙酸酯对弧菌的有效抑制圈直径。
[0022]
[0023] 结果是直径的平均值±标准偏差。
[0024] 试验例2、羟基酪醇乙酸酯的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)
[0025] 羟基酪醇乙酸酯对弧菌的抑菌和杀菌活性参考MIC和MBC方法进行检测。将细菌在26℃下过夜培养，并将菌悬液在600nm处的OD值调整为0.5。然后，将1μL菌悬液添加到198μL的2216E肉汤培养基中，该培养基中补充了1μL三苯基四唑氯化物(TTC)。将羟基酪醇乙酸酯的浓度调节为10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04和0.02mg/mL。将经过处理和未经处理的菌悬液在96孔板中于26℃孵育24小时。MIC定义为没有粉红色出现的化合物的最低浓度。MBC被定义为在琼脂培养基上继代培养后阻止细菌生长的最低化合物浓度。如表2所示，羟基酪醇乙酸酯对溶藻弧菌，鳗弧菌，灿烂弧菌和副溶血弧菌的MIC分别为156、78、
156和39μg/mL。羟基酪醇乙酸酯对溶藻弧菌，鳗弧菌，灿烂弧菌和副溶血弧菌的MBC分别为
312、156、312和78μg/mL。由于副溶血弧菌对羟基酪醇乙酸酯的敏感性更高，因此选择其进行进一步分析。
156和39μg/mL。羟基酪醇乙酸酯对溶藻弧菌，鳗弧菌，灿烂弧菌和副溶血弧菌的MBC分别为
312、156、312和78μg/mL。由于副溶血弧菌对羟基酪醇乙酸酯的敏感性更高，因此选择其进行进一步分析。
[0026] 表2羟基酪醇乙酸酯对弧菌的MIC和MBC。
[0027]
[0028]
[0029] 试验例3、羟基酪醇乙酸酯对副溶血性弧菌生长曲线的确定
[0030] 将细菌在26℃下过夜培养，并将副溶血性弧菌悬液在600nm的OD值调整为0.5。将羟基酪醇乙酸酯的终浓度在25mL 2216E肉汤培养基中，分别调节为10、20、40和80μg/mL，再添加1％(v/v)的菌悬液。通过在孵育过程中每两小时测量600nm的OD值来检测细菌存活率。根据副溶血弧菌在600nm的OD值建立细菌生长曲线。如图2所示，所有浓度的羟基酪醇乙酸酯均能抑制副溶血性弧菌的生长；用80μg/mL羟基酪醇乙酸酯处理，几乎完全抑制了培养过程中细菌的生长。因此，在孵育24小时后，羟基酪醇乙酸酯对于抑制副溶血弧菌的生长具有浓度依赖性。
[0031] 试验例4、羟基酪醇乙酸酯对副溶血性弧菌的细菌膜通透性的评估
[0032] 使用碘化丙啶(PI)染色来检测副溶血弧菌的膜通透性：用羟基酪醇乙酸酯(0-80μg/mL)的PBS溶液处理菌悬液(5×107CFU/mL)。收集细菌，与PI在室温黑暗环境下孵育10分钟。随后，细菌细胞用PBS洗涤两次，并铺在玻片上。在荧光显微镜(Zeiss，德国)下最少计数100个细菌细胞。使用以下公式计算PI染色细胞的百分比：
[0033] PI染色细胞百分比(％)＝(PI染色细胞数/细胞总数)×100％。
[0034] 如表3所示，与对照组相比，在处理组中PI染色的细菌细胞更多。此外，染色细胞的百分比随着羟基酪醇乙酸酯浓度的增加而增大。对照组中PI染色细胞的百分比仅为7.22％。用20、40、60和100μg/mL羟基酪醇乙酸酯处理后，PI染色细胞的百分比分别为
7.59％，13.22％，19.05％和27.61％。这些结果表明，羟基酪醇乙酸酯增加了副溶血弧菌的膜通透性。
7.59％，13.22％，19.05％和27.61％。这些结果表明，羟基酪醇乙酸酯增加了副溶血弧菌的膜通透性。
[0035] 表3分别用0、20、40、60和80μg/mL羟基酪醇乙酸酯处理的PI染色细胞的百分比[0036]
[0037]
[0038] 试验例5、羟基酪醇乙酸酯与DNA相互作用的测定
[0039] 用吖啶橙(AO)，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst33258染色和琼脂糖凝胶电泳来确定羟基酪醇乙酸酯与DNA的相互作用：将小牛胸腺DNA(ctDNA)(50μM)溶于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，并分别与DAPI(1.5μM)，AO(0.5μM)和Hoechst33258(1.5μM)孵育。然后加入羟基酪醇乙酸酯。将反应混合物在37℃下孵育30分钟。DAPI，AO和Hoechst33258的荧光发射光谱通过F96PRO荧光分光光度计(中国上海京科)测定。如图3所示，ctDNA的UV-VIS光谱在260nm处显示最大吸收；而单独的羟基酪醇乙酸酯吸收率较低。然而，当将羟基酪醇乙酸酯加入ctDNA溶液中时，UV-VIS光谱发生变化，这表明羟基酪醇乙酸酯和ctDNA彼此相互作用。
[0040] 为了进一步研究羟基酪醇乙酸酯和DNA之间的相互作用，进行了DAPI染色测定。测定结果表明，没有经羟基酪醇乙酸酯作用的ctDNA和DAPI的荧光强度为234.94±21.38。但是，当分别向溶液中添加15和30μM羟基酪醇乙酸酯时，荧光强度增加到306.65±35.44和377.76±27.92。如图4所示，荧光光谱证实羟基酪醇乙酸酯处理增强了ctDNA荧光强度。该结果表明羟基酪醇乙酸酯和DNA在体外相互作用，并且羟基酪醇乙酸酯增强了DAPI和DNA之间的相互作用。
[0041] 为了进一步研究羟基酪醇乙酸酯与DNA之间的相互作用，进行了AO和Hoechst33258染色测定。测定结果表明，羟基酪醇乙酸酯增强了AO-DNA复合物和Hoechst33258-DNA复合物的荧光强度；如图5所示，羟基酪醇乙酸酯影响AO和DNA之间的相互作用；如图6所示，羟基酪醇乙酸酯影响Hoechst33258和DNA之间的相互作用。
[0042] 由DNA相互作用测定和琼脂糖凝胶电泳可知，羟基酪醇乙酸酯能与DNA相互作用。
[0043] 试验例6、超螺旋DNA结构的确定
[0044] 使用琼脂糖凝胶电泳确定DNA超螺旋结构：将超螺旋质粒pBR322 DNA(0.25μg)溶解在反应缓冲液(35mM tris-HCl，72mM KCl，5mM MgCl2、5mM DTT，5mM亚精胺和0.1％BSA)中。将羟基酪醇乙酸酯加入到DNA溶液中。将反应混合物在37℃下孵育30分钟。通过在-80℃下冷冻终止反应。将DNA样品溶解在1％琼脂糖内，用溴化乙锭(1μg/mL)染色，并用凝胶成像系统拍照(图7)。通过Gel-Pro Analyzer软件分析解螺旋的DNA的相对量(图8，*P<0.05)，检测是否产生了解螺旋的DNA分子。
[0045] 如图7所示：不添加羟基酪醇乙酸酯(泳道1)的情况下，pBR322 DNA(0.25μg)保持超螺旋(SC)结构，而存在羟基酪醇乙酸酯(泳道2-5)的情况下，解螺旋DNA(RLX)的量增加。如图8所示，相对于对照组，用100、200、400和800μg/mL羟基酪醇乙酸酯处理后解螺旋DNA量分别为1.83、3.95、7.16和13.54。这些结果表明，羟基酪醇乙酸酯介导了超螺旋DNA的解螺旋。
[0046] 本发明通过细菌生长抑制，膜通透性评估和DNA相互作用测定以及琼脂糖凝胶电泳来研究醋酸羟基酪醇的抗菌活性，结果表明，羟基酪醇乙酸酯对弧菌具有抗菌活性；羟基酪醇乙酸酯对副溶血性弧菌的最小抑制浓度和最小杀菌浓度分别为39和78μg/mL；细菌生长抑制测定表明羟基酪醇乙酸酯的抗菌活性是有浓度依赖性的；膜通透性评估测定表明，羟基酪醇乙酸酯增加了副溶血弧菌的膜通透性；DNA相互作用测定和琼脂糖凝胶电泳显示羟基酪醇乙酸酯能与DNA相互作用；羟基酪醇乙酸酯增强了DNA结合分子的荧光强度并介导了超螺旋DNA的解螺旋。由研究结果可知，羟基酪醇乙酸酯最终抑制细菌生长并诱导细菌死亡，羟基酪醇乙酸酯对弧菌具有抗菌活性，是一种潜在的抗菌剂。附图说明
[0047] 图1a-图1d分别为羟基酪醇乙酸酯抑制溶藻弧菌，鳗弧菌，灿烂弧菌和副溶血弧菌的抑菌圈。
[0048] 图2为20-80μg/mL羟基酪醇乙酸酯处理的副溶血性弧菌的生长曲线；其中：▲代表0μg/ml，◆代表20μg/ml，●代表40μg/ml， 代表60μg/ml，▇代表80μg/ml。
[0049] 图3为羟基酪醇乙酸酯与DNA相互作用的UV-VIS光谱；其中：---代表ctDNA，—代表hydroxytyrosol acetate 100μM，……代表ctDNA and hydroxyty rosol acetate 100μm，—.—代表sum。
[0050] 图4为DAPI染色测定羟基酪醇乙酸酯和DNA之间的相互作用的结果；其中：---代表ctDNA and DAPI，……代表hydroxytyrosol acetate 15μM，—代表hydroxytyrosol acetate 30μM，—.—代表DAPI。
[0051] 图5为AO染色测定羟基酪醇乙酸酯和DNA之间的相互作用的结果；其中：---代表ctDNA and AO，……代表hydroxytyrosol acetate 15μM，—代表hydroxytyrosol acetate 30μM，—.—代表AO。
[0052] 图6为Hoechst33258染色测定羟基酪醇乙酸酯和DNA之间的相互作用的结果；其中：---代表ctDNA and Hoechst33258；—.—代表hydroxytyrosol acetate7.5μM，—代表hydroxytyrosol acetate 15μM，……代表Hoechst33258。
[0053] 图7为1％琼脂糖凝胶电泳分离所有DNA样品后的电泳图。
[0054] 图8为Gel-Pro Analyzer软件分析解螺旋DNA的相对量。
具体实施方式
[0055] 以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：
[0056] 实施例1
[0057] 取羟基酪醇乙酸酯，分别加水配制成活性成分浓度为0.039g/L、0.078g/L、0.1569g/L、0.132g/L、0.2g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、8g/L、16g/L、32g/L、64g/L、100g/L的水剂。使用时根据水体中弧菌的密度酌情选用不用浓度的水剂泼洒于养殖水体中。
[0058] 实施例2
[0059] 取羟基酪醇乙酸酯，分别加糊精混配成活性成分浓度为0.039g/L、0.078g/L、0.1569g/L、0.132g/L、0.2g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、8g/L、16g/L、32g/L、64g/L、100g/L的粉剂。使用时根据水体中弧菌的密度酌情选用不用浓度的粉剂撒于养殖水体中。
[0060] 上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
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