宽裂解谱溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
阅读：1024发布：2020-06-10
专利汇可以提供宽裂解谱溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于溶藻弧菌 噬菌体 的研发技术领域，具体涉及宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体及其组合物和 试剂 盒 。所述溶藻弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体VAP7（Vibrio alginolyticus phage VAP7），保藏编号为CCTCC NO:M 2018767。还公开了该溶藻弧菌噬菌体、或者溶藻弧菌噬菌体组合物、或含有溶藻弧菌噬菌体或溶藻弧菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒在杀灭和/或 预防 弧菌属 微 生物 中的应用。本发明具有宿主范围较广，低浓度下依然对宿主菌具有高毒性；而且在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可实现大规模工业生产。本发明能为 噬菌体疗法 的应用提供优良的菌株资源。，下面是宽裂解谱溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用专利的具体信息内容。
1.一种宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体，其特征在于，所述溶藻弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体VAP7（Vibrio alginolyticus phage VAP7），保藏编号为CCTCC NO: M 2018767。
2.根据权利要求1所述裂宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体，其特征在于，所述溶藻弧菌噬菌体VAP7（Vibrio alginolyticus phage VAP7）为烈性噬菌体，有一呈对称的头部和较长的尾部，头部为二十面体对称，长径L为60～70nm,横径W为60～70nm，L/W≈1；尾部包括可收缩的肌鞘和尾丝，肌鞘长度为30～40nm，宽5～10nm,尾丝具有3～6根；最适pH为pH6～pH8， 4℃～65℃条件下具有耐性，MOI=0.001条件下培养8～10h，其效价为1.8×1010 pfu/ mL。
3.根据权利要求1所述宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体，其特征在于，所述溶藻弧菌噬菌体VAP7（Vibrio alginolyticus phage VAP7）具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
4.一种含有权利要求1～3任一项所述宽宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物含有所述溶藻弧菌噬菌体VAP7（Vibrio alginolyticus phage VAP7）以及其它弧菌噬菌体中的至少一种。
5.一种含有权利要求4所述宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物含有溶藻弧菌噬菌体VAP7（Vibrio alginolyticus phage VAP7），溶藻弧菌噬菌体VAP9（Vibrio alginolyticus phage VAP9）保藏号为CCTCC NO: M 2018766；和溶藻弧菌噬菌体VAP21（Vibrio alginolyticus phage VAP21）保藏号为CCTCC NO: M 2018768中的两种或两种以上；
以上噬菌体均于2018年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名均为Vibrio alginolyticus phage。
6.根据权利要求4所述宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物包括溶藻弧菌噬菌体VAP7（Vibrio alginolyticus phage VAP7），还包括各噬菌体突变体中的一种或多种；优选的，所述突变体至少90％与对应的弧菌噬菌体的天然序列相同。
7.一种含有权利要求5所述宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体或溶藻弧菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。
8.权利要求1～3任一项所述宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体、或者权利要求4所述的溶藻弧菌噬菌体组合物、或权利要求7所述的含有溶藻弧菌噬菌体或溶藻弧菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒在杀灭和/或预防弧菌属微生物中的应用：
所述弧菌属微生物包括溶藻弧菌V.alginolyticus、鳗弧菌V.anguillarum、霍乱弧菌V.cholerae、非O1群霍乱弧菌non-O1V.cholerae、费氏弧菌V.fischeri、河流弧菌V.fluvialis、哈维氏弧菌V.harveyi、病海鱼弧菌V.ordalii、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、杀鲑弧菌V.salmonicida、拟态弧菌V.mimicus、灿烂弧菌V.splendidus、金黄色弧菌V.azureus、产气弧菌V.gazogenes、创伤弧菌V.vulnificus、竹荚鱼弧菌V.trachuri、雀鲷弧菌V.damsela、漂浮弧菌V.natriegen、沙蚕弧菌V.nereis、鱼肠道弧菌V.ichthyoenteri、鲨鱼弧菌V.carchariae、坎氏弧菌V.campbellii以及杀对虾弧菌V.penaeicida中的一种或多种。
宽裂解谱溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
技术领域
[0001] 本发明属于溶藻弧菌噬菌体的研发技术领域，具体涉及宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用。
背景技术
[0002] 溶藻弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌，无芽孢、荚膜，隶属于弧菌科、弧菌属，是一种常见的海洋致病菌，其数量居海水类弧菌之首。可对人引起伤口感染、食物中毒、中耳炎等疾病。同时，它也是鱼、虾、贝等海洋水养殖动物的一种条件致病菌，当环境恶化时机体免疫机能下降，溶藻弧菌病容易爆发。
[0003] 噬菌体是专门裂解细菌的一类病毒，主要化学成分由蛋白质和核酸组成，广泛存在于土壤、空气、水及生物体中，具有较强的专一性。由于其具备强大的杀菌能力，噬菌体可作为一种抗细菌感染制剂使用，自20世纪初以来一直受到国内外许多学者关注。
[0004] 关于溶藻弧菌噬菌体，付汉清等人(《微生物学通报》2018年6月25日期)分离得到一株溶藻弧菌噬菌体ФV170,该噬菌体ФV170可裂解15株溶藻弧菌中的7株,属于种内宽谱；最佳感染复数为0.01；一步生长曲线显示潜伏期为 10min,裂解量为101.3；对65℃以上温度敏感。该噬菌体具有治疗海水养殖过程中溶藻弧菌病的潜力。
[0006] 发明专利CN107904213A公开了一种溶藻弧菌噬菌体及包含该噬菌体的杀菌组合物，噬菌体可在短时间内快速抑制弧菌的生长，且抑制作用维持时间长。此外，该噬菌体的杀菌组合物安全、有效，且特异性强，生产成本低，在致病菌的控制过程中弥补了单一噬菌体疗法的不足。
[0007] 目前，关于溶藻弧菌噬菌体的研究主要集中在杀菌抑菌性方面，针对更多病原的溶藻弧菌噬菌体及其裂解特性的研究鲜见报道。综上，急需开发宽裂解谱的溶藻弧菌新型噬菌体。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用，具有宽裂解谱的特点。
[0009] 具体方案如下:一种宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体，所述溶藻弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)，保藏编号为CCTCC NO: M 2018767。
[0010] 进一步的，所述溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7) 为烈性噬菌体，有一呈对称的头部和较长的尾部，头部为二十面体对称，长径L 为60～70nm,横径W为60～70nm，L/W≈1；尾部包括可收缩的肌鞘和尾丝，肌鞘长度为30～40nm，宽5～10nm,尾丝具有3～6根；且在pH3～pH11、在4℃～ 65℃条件下具有耐性，MOI＝0.001条件下培养8～10h，其效价为1.8×1010pfu/mL。
[0011] 进一步的，所述溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7) 具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0012] 一种含有宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体的组合物，所述组合物含有所述溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)以及其它弧菌噬菌体中的至少一种。
[0013] 进一步的，所述组合物含有溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)，溶藻弧菌噬菌体VAP9(Vibrio alginolyticus phage VAP9)和溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticus phage VAP21)中的两种或两种以上。
[0014] 进一步的，所述组合物包括溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)，还包括各噬菌体突变体中的一种或多种；所述突变体至少90％与对应的弧菌噬菌体的天然序列相同。
[0015] 一种宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体或溶藻弧菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。
[0016] 一种宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体、或者溶藻弧菌噬菌体组合物、或含有溶藻弧菌噬菌体或溶藻弧菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒在杀灭和/或预防弧菌属微生物中的应用：所述弧菌属微生物包括溶藻弧菌V.alginolyticus、鳗弧菌V.anguillarum、霍乱弧菌 V.cholerae、非O1群霍乱弧菌non-O1V.cholerae、费氏弧菌V.fischeri、河流弧菌 V.fluvialis、哈维氏弧菌V.harveyi、病海鱼弧菌V.ordalii、副溶血弧菌 V.parahaemolyticus、杀鲑弧菌V.salmonicida、拟态弧菌V.mimicus、灿烂弧菌V.splendidus、金黄色弧菌V.azureus、产气弧菌V.gazogenes、创伤弧菌V.vulnificus、竹荚鱼弧菌V.trachuri、雀鲷弧菌V.damsela、漂浮弧菌V.natriegen、沙蚕弧菌 V.nereis、鱼肠道弧菌V.ichthyoenteri、鲨鱼弧菌V.carchariae、坎氏弧菌V.campbellii 以及杀对虾弧菌V.penaeicida中的一种或多种。
[0017] 本发明所述溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)在噬菌体效价、裂解溶藻弧菌的最佳感染复数(MOI)、pH稳定性、温度对噬菌体存活稳定性的影响等方面具有如下的生理特性和有益效果：(1)具有较高的效价(参见表1)，其中溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)感染溶藻弧菌的最佳MOI分别为1:1000；并具有高度亲和性及裂解能力的烈性噬菌体，可迅速裂解溶藻弧菌(表2)；所述溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)在pH为8时生长活性所受影响最小；对温度的热稳定性均相对较好；适宜4℃低温存放。
[0018] (2)溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)无毒力基因或不良基因；供试噬菌体具有较宽的宿主范围，对180株溶藻弧菌的识别率达95％。三株的裂解率可以达到96.7％。
[0019] (3)溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)对非致病性细菌的裂解：仅可识别10株副溶血性弧菌菌株中的3株、5株漂浮弧菌中的1株及3株金黄色弧菌中的1株。更进一步地、本发明所述溶藻弧菌噬菌体 VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)、或其组合物无法识别包括7株金黄色葡萄球菌、2株嗜水气单胞菌及6株大肠杆菌在内的非致病性细菌。
[0020] (4)溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)与非宿主性致病性细菌的互作，无法识别62株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株。
[0021] (5)溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)具有如下的优势：其为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性；具有较广的宿主范围；在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可进行大规模发酵培养；其培养液可于室温下稳定存活，于4℃下可保存
12个月。本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明的溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)能为开发噬菌体疗法提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。本发明中所述溶藻弧菌噬菌体的鸡尾酒组合可裂解更多溶藻弧菌，裂解率达96％以上，具有更强的裂解性。
12个月。本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明的溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)能为开发噬菌体疗法提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。本发明中所述溶藻弧菌噬菌体的鸡尾酒组合可裂解更多溶藻弧菌，裂解率达96％以上，具有更强的裂解性。
[0022] (6)本发明所述溶藻弧菌噬菌体VAP7、VAP9及VAP21或其组合物可以由本领域技术人员根据本发明的记载和本领域常识制备成应用于治疗或预防溶藻弧菌引起的病害的药剂或试剂。
[0023] (7)本发明所述溶藻弧菌噬菌体VAP7或其组合物的产品形式包括但不限于以载体携带、浓缩喷洒或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、生活水体等范围；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于含水性载体；浓缩喷洒形式包括但不限于虾苗喷洒等；药剂浸泡形式包括但不限于漂洗剂等。
[0024] (8)本发明所述溶藻弧菌噬菌体VAP7被制备成作为有效成分应用于溶藻弧菌的快速检测试剂或试剂盒。其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的溶藻弧菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，可有效确保检测的灵敏度。
[0025] (9)本发明所述溶藻弧菌噬菌体VAP7或其组合物被制备常作为有效成分应用于环境消毒的各种产品，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于消毒剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、海水等。
具体实施方式
[0027] 以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
[0028] 以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号。
[0029] 溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)，保藏编号为 CCTCC NO:M 2018767，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018 年11月09日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学；溶藻弧菌噬菌体VAP9(Vibrio alginolyticus phageVAP9)，保藏编号为CCTCC NO:M
2018766，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年11 月09日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学；
溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticus phageVAP21)，保藏编号为CCTCC NO:M
2018768，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年11 月09日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
2018766，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年11 月09日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学；
溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticus phageVAP21)，保藏编号为CCTCC NO:M
2018768，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年11 月09日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
[0031] 所述TSB(2％NaCl)培养液的配方为：胰蛋白胨17g，大豆木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠20g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
[0032] 所述TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆木瓜蛋白酶消化物 5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
[0033] 半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨17g，大豆木瓜蛋白酶消化物3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂7g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
[0034] SM液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L Tris-HCl 50ml，明胶0.25g，蒸馏水1000ml。
[0035] 溶藻弧菌噬菌体VAP7(Vibrio alginolyticus phage VAP7)、溶藻弧菌噬菌体 VAP9(Vibrio alginolyticus phage phage VAP9)和溶藻弧菌噬菌体VAP21(Vibrio alginolyticus phage VAP21)的组合物(1：1：1)均为按照实施例8的方法制备。
[0036] 实施例1溶藻弧菌噬菌体VAP7分离纯化分别采集福建海产品样本及海南海水样本各50ml，5000rpm离心10min后取20ml 上清液并除菌，将其与20ml 2倍TSB液体培养基及2ml处于对数期的溶藻弧菌 VAHN1菌液(108cfu/ml)均匀混合，于30℃下150rpm过夜摇培，富集噬菌体。将样本富集液5000rpm离心
10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。取滤液50μl与其宿主溶藻弧菌菌液300μl均匀混合，静置15min 使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的TSA平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h，观察噬菌斑生长情况。在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1ml SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5ml TSB液体培养基中，加入0.1ml溶藻弧菌菌液并混匀，30℃下150rpm过夜摇培，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。自福建海产品样本中分离得到溶藻弧菌噬菌体VAP7。溶藻弧菌噬菌体VAP7在溶藻弧菌菌苔上均产生单一的圆形噬菌斑，中心透亮，边缘具晕圈，直径为5-6mm；溶藻弧菌噬菌体VAP7透射电子显微镜照片参见图1。
10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。取滤液50μl与其宿主溶藻弧菌菌液300μl均匀混合，静置15min 使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的TSA平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h，观察噬菌斑生长情况。在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1ml SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5ml TSB液体培养基中，加入0.1ml溶藻弧菌菌液并混匀，30℃下150rpm过夜摇培，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。自福建海产品样本中分离得到溶藻弧菌噬菌体VAP7。溶藻弧菌噬菌体VAP7在溶藻弧菌菌苔上均产生单一的圆形噬菌斑，中心透亮，边缘具晕圈，直径为5-6mm；溶藻弧菌噬菌体VAP7透射电子显微镜照片参见图1。
[0037] 溶藻弧菌噬菌体VAP7的保藏编号为CCTCC NO:M 2018767。经过核苷酸测序，溶藻弧菌噬菌体VAP7具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
[0038] 实施例2溶藻弧菌噬菌体VAP7效价的测定用SM液做稀释液，将溶藻弧菌噬菌体VAP7(由实施例1制得)的原液10倍梯度逐级稀释至l08倍。分别取l05、l06、l07及l08稀释度的噬菌体培养液l000μl与其宿主菌溶藻弧菌VAHN1菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数
10
从表1可以得出，溶藻弧菌噬菌体VAP7培养12h后具有10 PFU/ml以上的效价。
10
从表1可以得出，溶藻弧菌噬菌体VAP7培养12h后具有10 PFU/ml以上的效价。
[0039] 表1培养12h后溶藻弧菌噬菌体VAP7的效价实施例3溶藻弧菌噬菌体VAP7对溶藻弧菌最佳感染复数(MOI)的测定
挑取溶藻弧菌单个菌落，接种到盛有3mlTSB(2％NaCl)培养液的试管中，30℃摇床中
150rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到 l0ml TSB(2％NaCl)培养液，30℃150rpm振荡培养至对数前期。按照感染复数比例加入噬菌体VAP7的纯培养液(由实施例1制得)和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/ 细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。在30℃摇床中150rpm过夜摇培。培养完毕后5000g离心l0min并收集上清液，测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。
挑取溶藻弧菌单个菌落，接种到盛有3mlTSB(2％NaCl)培养液的试管中，30℃摇床中
150rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到 l0ml TSB(2％NaCl)培养液，30℃150rpm振荡培养至对数前期。按照感染复数比例加入噬菌体VAP7的纯培养液(由实施例1制得)和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/ 细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。在30℃摇床中150rpm过夜摇培。培养完毕后5000g离心l0min并收集上清液，测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。
[0040] 结果如表2所示，溶藻弧菌噬菌体VAP7效价达到最高(1.8x1010PFU/ml) 时，其MOI为1:1000。
[0041] 表2不同感染复数下溶藻弧菌噬菌体VAP7的效价实施例4溶藻弧菌噬菌体VAP7的pH稳定性试验
取无菌EP管分别加入不同pH(1-14)的TSB培养基900μl后将上述EP管置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入l00μl菌体纯培养液，室温下静置1h。待反应时间结束后将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。之后分别于4h、8h、24h及96h后重复上述过程，重复实验3次。
取无菌EP管分别加入不同pH(1-14)的TSB培养基900μl后将上述EP管置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入l00μl菌体纯培养液，室温下静置1h。待反应时间结束后将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。之后分别于4h、8h、24h及96h后重复上述过程，重复实验3次。
[0042] 结果如表3所示，溶藻弧菌噬菌体VAP7在pH为6-8范围内处理96h后其效价无明显变化。
[0043] 表3反应不同时间后溶藻弧菌噬菌体VAP7pH值稳定性a.溶藻弧菌噬菌体VAP7的pH值稳定性(起始效价：5x109PFU/ml)
实施例5溶藻弧菌噬菌体VAP7的热稳定性试验
各取l00μl噬菌体纯培养液装于无菌EP管中，分别于55℃、65℃、75℃水浴中作用2h、
24h、48h。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。
实施例5溶藻弧菌噬菌体VAP7的热稳定性试验
各取l00μl噬菌体纯培养液装于无菌EP管中，分别于55℃、65℃、75℃水浴中作用2h、
24h、48h。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。
[0044] 结果如表4所示，实验组中溶藻弧菌噬菌体VAP7在55℃下较易存活。溶藻弧菌噬菌体VAP7具有良好的热稳定性，在65℃水浴2h后仍有较高的效价。
[0045] 表4溶藻弧菌噬菌体VAP7于不同温度下的效价实施例6溶藻弧菌噬菌体VAP7的存活稳定性试验
取5m溶藻弧菌噬菌体VAP7纯培养液分装于无菌试管中，分别于4℃、25℃、 30℃下放置，定期经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。
取5m溶藻弧菌噬菌体VAP7纯培养液分装于无菌试管中，分别于4℃、25℃、 30℃下放置，定期经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。
[0046] 结果如表5所示，4℃条件下溶藻弧菌噬菌体VAP7存放50周效价仍具 109PFU/ml；25℃下VAP7存放12周内效价数量级未降低(109PFU/ml)；30℃下噬菌体VAP7可在12周内维持108PFU/ml及以上效价；各保存温度下噬菌体均对宿主菌具有较强裂解能力。噬菌体适宜
4℃下存放。
4℃下存放。
[0047] 表5溶藻弧菌噬菌体VAP7于不同保存温度下的存活稳定性实施例7溶藻弧菌噬菌体VAP7毒力基因或不良基因缺失检测试验
选取65种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表6)，通过测定副溶血性弧菌噬菌体VAP7全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。
选取65种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表6)，通过测定副溶血性弧菌噬菌体VAP7全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。
[0048] 结果显示，供试噬菌体不含有下列毒力基因。供试噬菌体无不良基因。
[0049] 表6病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因实施例8溶藻弧菌噬菌体VAP7对溶藻弧菌裂解范围试验及溶藻弧菌噬菌体 VAP7、VAP9及VAP21组合物的制备和裂解范围试验
采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别取效价为1x108PFU/ml溶藻弧菌噬菌体 VAP7、VAP9及VAP21的原液，将3株噬菌体等体积均匀混合于SM液中，制成溶藻弧菌噬菌体VAP7、VAP9及VAP21的1:1:1的鸡尾酒组合。
采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别取效价为1x108PFU/ml溶藻弧菌噬菌体 VAP7、VAP9及VAP21的原液，将3株噬菌体等体积均匀混合于SM液中，制成溶藻弧菌噬菌体VAP7、VAP9及VAP21的1:1:1的鸡尾酒组合。
[0050] 挑取180株溶藻弧菌的单菌落分别接种于盛有3ml TSB(2％NaCl)的试管中，150rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取10μl噬菌体培养液及VAP7、VAP9及VAP21 的鸡尾酒组合液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后30℃培养6-
8h，观察结果。试验重复三次。
8h，观察结果。试验重复三次。
[0051] 结果如表7所示，溶藻弧菌噬菌体VAP7具有较宽的宿主范围。VAP7 可裂解171株溶藻弧菌，裂解率为95％。而VAP7、VAP9及VAP21(比例为1:1:1) 的鸡尾酒组合液可识别174株溶藻弧菌，裂解率为96.7％。说明溶藻弧菌噬菌体VAP7具有较宽的宿主谱，同时噬菌体鸡尾酒组合可弥补噬菌体单一应用时宿主谱的局限性，在噬菌体治疗方面具有极大的应用潜力。
[0052] 表7溶藻弧菌噬菌体VAP7、VAP9及VAP21的裂解谱测定结果注：++：完全裂解，噬菌斑非常透亮；+：完全裂解，噬菌斑透亮；-：未裂解实施例9溶藻弧菌噬菌体VAP7对非致病性细菌的裂解试验
挑取包括副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌等在内的33株非致病性细菌单菌落分别接种于盛有3ml TSB的试管中，150rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液及含有VAP7、VAP9及VAP21(比例为
1:1:1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后30℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
挑取包括副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌等在内的33株非致病性细菌单菌落分别接种于盛有3ml TSB的试管中，150rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液及含有VAP7、VAP9及VAP21(比例为
1:1:1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后30℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
[0053] 结果如表8所示，在本研究中，溶藻弧菌噬菌体VAP7可裂解10株副溶血性弧菌菌株中的3株；其鸡尾酒组合可识别副溶血性弧菌中的5株。VAP7同时可识别5株漂浮弧菌中的1株及3株金黄色弧菌中的1株。所有噬菌体均无法识别金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及嗜水气单胞菌。
[0054] 表8溶藻弧菌噬菌体及鸡尾酒与33株非致病性细菌的交互反应注：++：完全裂解，噬菌斑非常透亮；+：完全裂解，噬菌斑透亮；-：未裂解。
[0055] 实施例10溶藻弧菌噬菌体VAP7与非宿主性致病性细菌的互作试验挑取62株非宿主性致病性细菌单菌落分别接种于盛有3ml TSB的试管中， 150rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取10μl噬菌体培养液及含有溶藻弧菌噬菌体VAP7、 VAP9及VAP21(比例为1:1:1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养 6-8h，观察结果。试验重复三次。
[0056] 将噬菌体与非宿主性致病性细菌进行交互反应，结果显示，VAP7及鸡尾酒组合无法识别62株供试非宿主性致病性细菌(表9)。
[0057] 表9溶藻弧菌噬菌体及鸡尾酒组合与62株致病性细菌的交互反应注：-：未裂解。
[0058] 实施例11溶藻弧菌噬菌体VAP7的发酵制备挑取溶藻弧菌VAHN1单菌落，接种到盛有3mlTSB(2％NaCl)培养液的试管中， 30℃摇床中150rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到500ml TSB(2％NaCl)培养液，30℃150rpm振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度。溶藻弧菌噬菌体VAP7发酵制备的体系为8L，发酵培养基为TSB培养基。发酵培养基的初始pH值均为7。采用火焰接种法接种，以其相应的最佳感染复数比例向发酵培养基中分别接入50ml的噬菌体(106PFU/
9
ml)和对数期宿主菌液(10CFU/ml)。发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml噬菌体与宿主菌的混合液于无菌容器中，
5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。
9
ml)和对数期宿主菌液(10CFU/ml)。发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml噬菌体与宿主菌的混合液于无菌容器中，
5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。
[0059] 由表10可知，溶藻弧菌噬菌体VAP7于发酵12h时效价达最高，为 3.2x1010PFU/ml。12h发酵结束后噬菌体效价由初始的104PFU/ml升高至1010 PFU/ml及以上，提高了6个数量级。因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种农药增效助剂及其降低农药使用剂量的方法 | 2020-05-08 | 586 |
| 养殖池专用选择性氧化二氧化氯缓释片剂 | 2020-05-08 | 210 |
| 一种东北苏打盐碱地用土壤调理剂、其制备方法以及使用该土壤调理剂种植春小麦的方法 | 2020-05-08 | 840 |
| 一种池底杀灭弧菌的底质改良颗粒制剂 | 2020-05-08 | 973 |
| 一种犬细小病毒精制卵黄抗体冻干剂的制备方法 | 2020-05-08 | 767 |
| 药物组合物 | 2020-05-08 | 601 |
| 一种微生物荧光染色液及其应用 | 2020-05-08 | 127 |
| 纺喷结合半融合高韧性纳米级颈膜及其材料的制备方法 | 2020-05-08 | 485 |
| 一种循环水用杀菌灭藻剂及其制备方法 | 2020-05-11 | 339 |
| 一种溴酚化合物及其应用 | 2020-05-08 | 544 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈