本発明は、昆虫における殺虫剤抵抗性を容易に識別するための検出キットに関する。本キットは、数匹の昆虫を含む検体サイズを使用した抵抗性マーカーの素早くかつ簡単な識別を可能にすることから、圃場における抵抗性の検出にとりわけ適している。さらに、本発明は、ある種の殺虫剤に抵抗性である昆虫において抵抗性を管理する方法に関する。本方法およびキットは、とりわけワタコナジラミ、ベミシア・タバキ(Bemisia tabaci)(半翅目(Hemiptera):コナジラミ科(Aleyrodidae))に適している。

ワタコナジラミ(ベミシア・タバキ)におけるネオニコチノイド殺虫剤のイミダクロプリドに対する抵抗性は、チトクロムP450モノオキシゲナーゼCYP6CM1の高い発現レベルと関連していることが公知である(Insect Biochemistry and Molecular Biology 38,(2008),634−644)。

問題 農業において重要性が高まっている問題は、経済的な関連のある種々の有害昆虫において広く用いられるある種の殺虫剤に対する抵抗性の発達である(Pest Manag Sci 2009;65:313−322)。殺虫剤に対するある一定のレベルの抵抗性を発達させた有害昆虫へのこれらの殺虫剤の施用は、作物の損失をもたらし、これらの害虫集団における付加的な抵抗性の増進に対するさらなる選択圧を加える。

コナジラミ害虫を防除するのに好ましい殺虫剤の1つは、ネオニコチノイド殺虫剤である。ネオニコチノイド殺虫剤は、以下の商業化された活性成分:イミダクロプリド、チアクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ニテンピラムおよびジノテフランを含む。それらはまた、殺虫剤抵抗性対策委員会(Insecticide Resistance Action Committee)(IRAC;www.irac−online.org)によるIRAC作用機構分類(MoA分類)4Aとも呼ばれる。

農業者はコナジラミ害虫をネオニコチノイド化学で好ましく処理するであろうが、彼らは、これらの活性成分に対して少なくとも何らかの抵抗性を発達させたますます多くの昆虫集団に直面する。異なる化学または異なるIRAC MoA分類からの他の殺虫剤への完全な切り替えは、おそらく、同様にこれらの殺虫剤に抵抗性である害虫集団の発達をもたらすであろう。加えて、他の化学は、その殺虫活性が劣っている可能性がある。

特異的な殺虫剤に対する害虫の抵抗性を標準的に決定するには、現在、実験室環境を必要とする。圃場または温室条件下では、農業者は殺虫剤を試用し、次いでそれが目的の特定害虫を防除できるかを観察しなければならないであろう。しかしながら、抵抗性の昆虫は作物の少なくとも一部をとうに破壊してしまうため、結果が得られるのは遅すぎるであろう。加えて、抵抗性管理を既に必要とする弱い抵抗性は、これらの条件下で視認できない。

Insect Biochemistry and Molecular Biology 38,(2008),634−644

Pest Manag Sci 2009;65:313−322

したがって、農業者が圃場においてすぐに作業することができる使いやすい系を持つことは実用上大いに重要であって、これはさらに高い感度および信頼性を達成し、農業者に結果を数分で提供するであろうから、農業者は抵抗性メカニズムに影響されない異なる作用機構分類を輪番で使用することに基づいて、適切な抵抗性管理戦略を実行することができる。

原理 驚くべきことに、チトクロムP450モノオキシゲナーゼ、とりわけCYP6CM1のレベルは、使いやすい抗体検出系との組み合わせで、ネオニコチノイドおよびピメトロジン化学に対する昆虫、とりわけベミシア・タバキの抵抗性を速く、信頼でき、かつ非常に感度良く検出することを可能にする。

図1は、ELISAアッセイを通じた、P450モノオキシゲナーゼ、好ましくはCYP6CM1の免疫学的検出を示す図である。

図2は、検出キットの利用により、一組のベミシア・タバキ系統を試験し、感受性/抵抗性を実験室内で検出した図である。

図3は、ELISAに基づくストリップ(ラテラルフロー)による検出系のデザインを示す図である。

図4は、ELISAに基づくストリップ(ラテラルフロー)による検出系のデザインを示す図である。

図5は、ストリップ上でELISAに基づいて抵抗性マーカーを検出するための3つの異なる構成を示す図である。

テストキット(図1もまた参照のこと) 試験の原理は、好ましくはELISAアッセイを通じた、P450モノオキシゲナーゼ、好ましくはCYP6CM1の免疫学的検出である。P450モノオキシゲナーゼタンパク質は、1の、または好ましくは2の異なるポリクローナル抗体(溶液A1およびA2)により認識される。とりわけ好ましいのは、ビオチンで標識された抗体およびジゴキシゲニンで標識された追加の抗体の組み合わせである。P450抗原の存在下で、ビオチン化抗体は、ストレプトアビジン−金溶液(溶液B)に付加的に結合して複合体を形成し、これが今度はテストストリップ上にラインとしてスポットされた抗ジゴキシゲニン抗体により検出される。

キットは、典型的に、3つの溶液(A1、A2およびB)、使い捨てのホモジナイゼーションバイアル、使い捨てのホモジナイゼーションペッスルおよび密封されたテストストリップを伴って届けられる。

ネオニコチノイドまたはピメトロジン抵抗性の存在は、典型的に、以下の試験手順中に記載される1回のコナジラミ試験において1〜20匹のコナジラミを処理することにより観察することができる。最適なのは、4匹前後のコナジラミであり;20匹を超える虫はシグナルの消失をもたらすであろうから、それ故により好ましくない。

コナジラミは、水および1〜10滴の洗剤(商用の食器洗い用洗剤またはキットが供給する10% Tween20のいずれかを用いる)を満たした水ボウル、例として植物の受け皿(理想的には濃い色のもの)の中に収集され得る。寄生した植物からボウル内へとコナジラミを軽くたたいて落とすことでコナジラミが収集され、液体の表面上に浮く。ホモジナイゼーションペッスルをボウル内に浸すと、コナジラミはその表面にくっつく。

一般的な試験手順は、1〜2滴の各溶液A1およびA2(各々、十分な量の対応するビオチンまたはジゴキシゲニン化された標識抗体をリン酸バッファーおよび洗剤中に有する)をホモジナイゼーションバイアル内に加えることを含む(図1、絵1)。次に、コナジラミをボウルの水面から上記のように「釣る」。1〜20匹のコナジラミがその先端にくっついたペッスルを、液体(前もって滴下した溶液A1およびA2)が入ったホモジナイゼーションバイアル内に挿入し、コナジラミをホモジナイズするために慎重に回転させる(図1、絵2)。溶液が黄色がかって濁ってきたら、ホモジナイゼーションが完了する。溶液は、最終的な結果を変えることなく次のステップのためにすぐに用いることができる;しかしながら、1〜5分のインキュベーション時間は最終的なシグナルを増加させる。

ホモジナイゼーション後、2滴の溶液B(リン酸バッファーおよび洗剤中のストレプトアビジン−金の液体を含有する)をバイアルに加え、バイアルを3〜4回反転させることにより、結果として得られた溶液を穏やかに混合する(図1、絵3)。再び、次のステップに進む前に1〜5分待機することでシグナルは増加するが、全体的な結果は変わらない。

抵抗性検出のため、全溶液をバイアルからテストストリップ(コナジラミキットと共に届けられるテストストリップは密封されており、初めに包装を取り除かなくてはならない)のサンプルキャビティ内に注ぐ(図1、絵4)。液体がストリップの上の方に流れると、遅くとも5分後に、(ハウジング上にマークされた「C」の位置に)赤色のコントロールラインが現れる。このラインが存在する場合のみ、ストリップは適切に動作した。

コントロールラインが存在するが(ハウジング上にマークされた「T」の位置に)追加のテストラインがない場合、試験されたベミシア・タバキ集団は、CYP6CM1の過剰発現に基づくネオニコチノイドまたはピメトロジンに対する抵抗性はない。

「T」(図1)において明瞭なラインが視認できる場合、集団はネオニコチノイド(およびピメトロジン)抵抗性であり、それらの集団を防除するために異なる作用機構分類の別の活性成分を施用しなければならない。

抵抗性マーカーの検出は、典型的に、任意の抗体または抗体から派生する検出系を使用して行うことができる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体もしくは1より多いモノクローナル抗体の組み合わせのいずれかであることができる。あるいは、例としてアプタマーといった任意の他の分子の高アフィニティー系を、本発明を行うのに用いることができる。好ましくは、ポリクローナル抗体が用いられる。好ましくは、1より多い抗体の組み合わせが検出のために用いられる。

抵抗性マーカー−抗体複合体の検出は、典型的に、例としてジゴキシゲニン検出系またはビオチン−ストレプトアビジン系といった、適度に簡便かつ素早いシグナル生成を可能にする任意の抗体検出系を使用して行うことができる。他の好適な検出系は、プラズモン共鳴原理に基づくものである。好ましくは、ジゴキシゲニンおよびビオチン化された抗体の組み合わせが好ましい。ELISAに基づくストリップ(ラテラルフロー)による検出系のデザインが図3および4中に例示される。

説明の目的のため、ストリップ上でELISAに基づいて抵抗性マーカーを検出するための3つの異なる構成が図5中に表示される。好ましくは抗体−抵抗性マーカーコンジュゲートの検出は、ラテラルフロー分析により行われる。

害虫防除の方法 本発明のさらなる実施形態は、有害昆虫、好ましくは抵抗性系統を防除する方法であり、これは、以下のステップ: a.有害昆虫の検体を得ること、 b.CYPファミリーから選択される抵抗性マーカーの抗体に基づく検出を、好ましくはELISAアッセイによって行うこと、 c.抵抗性マーカーが検出された場合、カルバメート系、有機リン酸エステル系、シクロジエン有機塩素系、ピレスロイド系、スルホキシイミン系、ピリプロキシフェン、ジアフェンチウロン、ベンゾイル尿素系、ブプロフェジン、METI、テトロン酸およびテトラミン酸系、ブテノリド系、ジアミド系、ピリフルキナゾンよりなるリストA)から殺虫剤を選択すること、 d.抵抗性マーカーが存在しない場合、リストA)またはイミダクロプリド、チアクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ニテンピラムおよびジノテフラン、ピメトロジンよりなるリストB)のいずれかから殺虫剤を選択すること を含む。

カルバメート系、有機リン酸エステル系、シクロジエン有機塩素系、ピレスロイド系、スルホキシイミン系、ピリプロキシフェン、ジアフェンチウロン、ベンゾイル尿素系、ブプロフェジン、METI、テトロン酸およびテトラミン酸系、ジアミド系の分類に属する、本発明を実施するためのリストA)の好ましい殺虫剤は: カルバメート系:アラニカルブ(I1)、アルジカルブ(I2)、ベンジオカルブ(I3)、ベンフラカルブ(I4)、ブトカルボキシム(I5)、ブトキシカルボキシム(I6)、カルバリル(I7)、カルボフラン(I8)、カルボスルファン(I9)、エチオフェンカルブ(I10)、フェノブカルブ(I11)、ホルメタネート(I12)、フラチオカルブ(I13)、イソプロカルブ(I14)、メチオカルブ(I15)、メソミル(I16)、メトルカルブ(I17)、オキサミル(I18)、ピリミカルブ(I19)、プロポキスル(I20)、チオジカルブ(I21)、チオファノックス(I22)、トリアザメート(I23)、トリメタカルブ(I24)、XMC(I25)およびキシリルカルブ(I26); 有機リン酸エステル系:アセフェート(I27)、アザメチホス(I28)、アジンホス−エチル(I29)、アジンホス−メチル(I30)、カズサホス(I31)、クロルエトキシホス(I32)、クロルフェンビンホス(I33)、クロルメホス(I34)、クロルピリホス(I35)、クロルピリホス−メチル(I36)、クマホス(I37)、シアノホス(I38)、デメトン−S−メチル(I39)、ダイアジノン(I40)、ジクロルボス/DDVP(I41)、ジクロトホス(I42)、ジメトエート(I43)、ジメチルビンホス(I44)、ジスルホトン(I45)、EPN(I46)、エチオン(I47)、エトプロホス(I48)、ファムフール(I49)、フェナミホス(I50)、フェニトロチオン(I51)、フェンチオン(I52)、ホスチアゼート(I53)、ヘプテノホス(I54)、イミシアホス(I55)、イソフェンホス(I56)、イソプロピル O−(メトキシアミノチオ−ホスホリル)サリチレート(I57)、イソキサチオン(I58)、マラチオン(I59)、メカルバム(I60)、メタミドホス(I61)、メチダチオン(I62)、メビンホス(I63)、モノクロトホス(I64)、ナレド(I65)、オメトエート(I66)、オキシデメトン−メチル(I67)、パラチオン(I68)、パラチオン−メチル(I69)、フェントエート(I70)、ホレート(I71)、ホサロン(I72)、ホスメット(I73)、ホスファミドン(I74)、ホキシム(I75)、ピリミホス−メチル(I76)、プロフェノホス(I77)、プロペタムホス(I78)、プロチオホス(I79)、ピラクロホス(I80)、ピリダフェンチオン(I81)、キナルホス(I82)、スルホテップ(I83)、テブピリムホス(I84)、テメホス(I85)、テルブホス(I86)、テトラクロルビンホス(I87)、チオメトン(I88)、トリアゾホス(I89)、トリクロルホン(I90)およびバミドチオン(I91); シクロジエン有機塩素系:クロルデン(I92)およびエンドスルファン(I93); ピレスロイド系:アクリナトリン(I96)、アレトリン(I97)、d−cis−transアレトリン(I98)、d−transアレトリン(I99)、ビフェントリン(I100)、ビオアレトリン(I101)、ビオアレトリン S−シクロペンテニル異性体(I102)、ビオレスメトリン(I103)、シクロプロトリン(I104)、シフルトリン(I105)、ベータ−シフルトリン(I106)、シハロトリン(I107)、ラムダ−シハロトリン(I108)、ガンマ−シハロトリン(I109)、シペルメトリン(I110)、アルファ−シペルメトリン(I111)、ベータ−シぺルメトリン(I112)、シータ−シペルメトリン(I113)、ゼータ−シペルメトリン(I114)、シフェノトリン[(1R)−trans異性体](I115)、デルタメトリン(I116)、エムペントリン[(EZ)−(1R)異性体)(I117)、エスフェンバレレート(I118)、エトフェンプロックス(I119)、フェンプロパトリン(I120)、フェンバレレート(I121)、フルシトリネート(I122)、フルメトリン(I123)、タウ−フルバリネート(I124)、ハルフェンプロックス(I125)、イミプロトリン(I126)、カデトリン(I127)、ペルメトリン(I128)、フェノトリン[(1R)−trans異性体)(I129)、プラレトリン(I130)、ピレトリン(除虫菊)(I131)、レスメトリン(I132)、シラフルオフェン(I133)、テフルトリン(I134)、テトラメトリン(I135)、テトラメトリン[(1R)異性体)](I136)、トラロメトリン(I137)およびトランスフルトリン(I138);またはDDT(I139);またはメトキシクロル(I140); ベンゾイル尿素系:ビストリフルロン(I191)、クロルフルアズロン(I192)、ジフルベンズロン(I193)、フルシクロクスロン(I194)、フルフェノクスロン(I195)、ヘキサフルムロン(I196)、ルフェヌロン(I197)、ノバルロン(I198)、ノビフルムロン(I199)、テフルベンズロン(I200)およびトリフルムロン(I201); METI:フェナザキン(I212)、フェンピロキシメート(I213)、ピリミジフェン(I214)、ピリダベン(I215)、テブフェンピラド(I216)およびトルフェンピラド(I217);またはロテノン(デリス)(I218); テトロン酸およびテトラミン酸系:例としてスピロジクロフェン(I221)、スピロメシフェン(I222)およびスピロテトラマト(I223); (25)ミトコンドリア複合体II電子伝達阻害剤、例えばベータ−ケトニトリル誘導体、例としてシエノピラフェン(I229)およびシフルメトフェン(I230); ジアミド系:クロラントラニリプロール(I231)、シアントラニリプロール(I232)およびフルベンジアミド(I233); ブテノリド系:4−{[(6−ブロモピリジン−3−イル)メチル](2−フルオロエチル)アミノ}フラン−2(5H)−オン(I258)(WO2007/115644から公知)、4−{[(6−フルオロピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオロエチル)アミノ}フラン−2(5H)−オン(I259)(WO2007/115644から公知)、4−{[(2−クロロ−1,3−チアゾール−5−イル)メチル](2−フルオロエチル)アミノ}フラン−2(5H)−オン(I260)(WO2007/115644から公知)、4−{[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](2−フルオロエチル)アミノ}フラン−2(5H)−オン(I261)(WO2007/115644から公知)、フルピラジフロン(I262)、4−{[(6−クロル−5−フルオロピリジン−3−イル)メチル](メチル)アミノ}フラン−2(5H)−オン(I263)(WO2007/115643から公知)、4−{[(5,6−ジクロロピリジン−3−イル)メチル](2−フルオロエチル)アミノ}フラン−2(5H)−オン(I264)(WO2007/115646から公知)、4−{[(6−クロロ−5−フルオロピリジン−3−イル)メチル](シクロプロピル)アミノ}フラン−2(5H)−オン(I265)(WO2007/115643から公知)、4−{[(6−クロロピリジン−3−イル)メチル](シクロプロピル)アミノ}フラン−2(5H)−オン(I266)(EP−A−0539588から公知)、4−{[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](メチル)アミノ}フラン−2(5H)−オン(I267)(EP−A−0539588から公知)、 スルホキシミン系:{[1−(6−クロロピリジン−3−イル)エチル](メチル)オキシド−λ4−スルファニリデン}シアナミド(I268)(WO2007/149134から公知)ならびにそのジアステレオマー{[(1R)−1−(6−クロロピリジン−3−イル)エチル](メチル)オキシド−λ4−スルファニリデン}シアナミド(A)(I269)および{[(1S)−1−(6−クロロピリジン−3−イル)エチル](メチル)オキシド−λ4−スルファニリデン}シアナミド(B)(I270)(これらもまたWO2007/149134から公知)、同様にジアステレオマーAの群と呼ばれるジアステレオマー[(R)−メチル(オキシド){(1R)−1−[6−(トリフルオロメチル)ピリジン−3−イル]エチル}−λ4−スルファニリデン]シアナミド(A1)(I271)および[(S)−メチル(オキシド){(1S)−1−[6−(トリフルオロメチル)ピリジン−3−イル]エチル}−λ4−スルファニリデン]シアナミド[スルホキサフロルとしても公知](A2)(I272)(WO2010/074747、WO2010/074751から公知)、[(R)−メチル(オキシド){(1S)−1−[6−(トリフルオロメチル)ピリジン−3−イル]エチル}−λ4−スルファニリデン]シアナミド(B1)(I273)および[(S)−メチル(オキシド){(1R)−1−[6−(トリフルオロメチル)ピリジン−3−イル]エチル}−λ4−スルファニリデン]シアナミド である。

より好ましくは、リストA)は、スピロテトラマト、スピロメシフェンおよびフルピラジフロンからなる。非常に好ましくは、リストA)は、スピロテトラマトおよびスピロメシフェンからなる。

好ましくは、リストB)は、イミダクロプリドまたはピメトロジンからなる。

好ましい抵抗性マーカーは、CYP6CM1である。

好ましい有害昆虫は、ベミシア属に属する。非常に好ましい有害昆虫は、ワタコナジラミ(ベミシア・タバキ)である。

本明細書中でその「一般名」により特定される活性成分は公知であり、例えば、駆除剤マニュアル(”The Pesticide Manual”,14th Ed.,British Crop Protection Council 2006)中に記載されているか、またはインターネット(例としてhttp://www.alanwood.net/pesticides)上で検索することができる。

試薬の調製および組成: ウサギの免疫: 4羽のウサギにPBS中のHis6−CYP6CM1(注射1回あたり500μg)を免疫した。

SPFウサギ(SPF=特定病原体不在(Specific Pathogen Free);系統:New Zealand White)の免疫は、以下を包含する: ・免疫の標準プロトコール(0、28、42、56日目に4回注射)、2回の対照(40および54日後) ・採血前(pre−bleed)(最初の注射前)の血清 ・免疫は、アジュバント(最初の注射はCFA、2回目以降の注射はIFA)と組み合わせて皮下注射により実施する ・血清の供出(1.および2.は各々3〜5mLを採血、70日目に各々約20mlを採血、その後は毎月各ウサギの約20mlを採血) 抗体の精製: 抗体は、正の免疫吸着によって血清から精製した。カラムマトリックスを調製するため、製造業者の説明書に従って抗原のMBP−CYP6CM1をNHS活性化セファロース4FF(GE Healthcare)にカップリングした。精製は、MBP−CYP6CM1−セファロースを充填したカラムにポンプで血清を通すことによりCYP6CM1に特異的な抗体の一部を結合させることによって行った。(1)0.5M NaCl、0.05% Tween 20および(2)30mM NaClを使用した2回の洗浄ステップの後、特異的な抗体を、酸性条件下、100mMグリシン、0,5M NaClを含有するpH2.7のバッファーを使用して溶出した。抗体はPBSに対して透析し、限外濾過により濃縮した。

抗体の修飾: 抗体は、第一級アミノ基(−NH2)と効率的に反応して安定なアミド結合を形成するNHS活性化された標識試薬をカップリングすることにより標識した。抗体は、リジン(K)残基の側鎖および各ポリペプチドのN−末端中に、NHS活性化試薬を使用した標識のための標的として利用可能な数個の第一級アミンを持つ。これらの利用可能なアミノ基から、いくつかの残基が反応中にランダムにカップリングされる。標識の程度は、コンジュゲーション反応中に用いられるモル比に依存する。

ビオチン化は、100mMリン酸バッファー pH8.5中で、2から8倍のモル過剰量のビオチン化試薬(スクシンイミジル−6−(ビオチンアミド)ヘキサノエート)を使用して、25℃で2時間行った。10mMリジンを加えることにより反応を停止した。PBSに対する透析により過剰なビオチン化試薬および副産物からコンジュゲートを精製した。標識の程度は、HABAアッセイにより決定した。

ジゴキシゲニンとのコンジュゲーションは、100mMリン酸バッファー pH8.5中で、8倍のモル過剰量の標識試薬(ジゴキシゲニン−3−O−メチルカルボニル−e−アミノカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)を使用して、25℃で2時間行った。10mMリジンを加えることにより反応を停止した。PBSに対する透析により過剰な標識試薬および副産物からコンジュゲートを精製した。

ホモジナイゼーションバッファー:

ランニングバッファー:

抗体:50ng〜500ng、好ましくは各々150ng(抗体ビオチンおよび抗体ジゴキシゲニンのコンジュゲート) ストレプトアビジン−金(40nm):100mOD 50〜300mOD ラテラルフロー用途のためのテストストリップ(図3および4も参照のこと): メンブレンカード:例としてHF120 Plus(Millipore) 排液パッド(waste pad):C083(Millipore)または任意の他の類似のセルロースパッド。

サンプルパッド:以下を含む溶液で処理されたC083(Millipore) a)100〜400mMホウ酸含有バッファー、pH8.0〜10.0、好ましくは250mMホウ酸ナトリウム、pH9.0; b)0.1〜3重量% BSA、好ましくは1重量% BSA; c)0.01〜0.2重量% Triton X−100、好ましくは0.05% Triton X−100 例: 検出キットの利用により、一組のベミシア・タバキ系統を試験し、感受性/抵抗性を実験室内で検出した: 1)ESP−07M:抵抗性、Q型、スペイン 2)ESP−00:抵抗性、1)より弱い抵抗性、Q型、スペイン 3)SuS:感受性、B型でもQ型でもない、スーダン 4)B−Ref:感受性、B型、イスラエル 5)Crete:抵抗性、1)および2)より弱い抵抗性、Q型、ギリシャ 6)EAE:抵抗性、B型、ブラジル この試験系統中、1、2、5および6は、キットを用いることにより抵抗性マーカーについて陽性と試験された(図2)。全ての場合において、抵抗性マーカーの検出はイミダクロプリドに対する抵抗性と相関した。