무름병 저항성을 가지는 ＡｔＷＲＫＹ５５ 유전자 과발현 형질전환 식물체 및 이의 제조방법 {Transgenic plant overexpressing AtWRKY55 gene with resistance for soft rot and method for producing the same}

본 발명은 무름병 저항성을 증진시키는 AtWRKY55 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 이를 이용한 무름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 식물체의 무름병 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

식물의 병 또는 해충에 의한 피해는 자연재해와 더불어 인류의 안정적 식량 확보의 가장 큰 장애가 되어 왔다. 일반적인 통계에 의하면 식물의 병 또는 해충에 의한 손실은 각각 전체 생산량의 10% 정도에 이르는 것으로 나타나고 있으며 생산된 작물의 병해충에 의한 질 저하까지 고려한다면 훨씬 높은 수치를 보일 것이다. 또한 기상이변이나 특수한 환경 변화에 의한 일정 병해충의 대발생은 커다란 사회문제를 일으키는 경우도 있다.

이와 같은 병해충 방제를 위한 노력의 일환으로 인공 합성된 농약을 개발하여 방제에 이용하는 방법이 농업에 주로 이용되어 왔다. 그러나 인구의 끊임없는 증가로 인해 더 많은 양의 식량 확보가 필요하게 되면서, 이를 위한 양질의 동일품종의 대량재배는 병해충의 대량발생으로 이어지고 이들의 방제를 위한 합성 농약의 남용으로 인해 자연 생태계의 파괴는 물론 잔류독성, 인축에 대한 독성, 및 약제 내성인 새로운 병해충의 출현 등의 문제가 최근 들어 크게 야기되어 왔다. 이를 대체하기 위하여 신농약(저독성농약, 천연물농약 또는 생물농약)의 개발을 위한 연구가 진행되고 있으나, 그 개발속도가 수요를 충족시키지 못하고 있다. 또한 근래에 크게 일고 있는 환경보호운동과 오염되지 않은 청정농산물을 취하려는 인류의 성향은 인축에 해가 없고 잔류독성이나 자연생태계 파괴의 우려가 없는 새로운 방법을 절실히 요구하고 있다.

최근에 들어 유전공학기술이 발달되면서 병 저항성 형질전환 식물이 농약을 적게 사용하면서도 안정적인 식량작물을 생산할 수 있는 대안으로 제시되고 있으며, 식물의 병 저항성 기작을 연구하여 인축 및 환경에 독성이 없는 새로운 개념의 식물보호제를 개발하려는 시도가 선진국을 중심으로 이루어지고 있다.

한편 무름병(bacterial soft rot)은 식물, 특히 배추의 잎 줄기 뿌리에 수침상(水浸狀)의 반점이 생기기 시작하여 빠른 속도로 확대되어 포기 전체가 썩게 되는 병해이며, 흰빛썩음병이라고도 한다. 재배기간과 저장 수송 중에도 나타나는 병으로, 특히 줄기의 아래쪽 토양과 인접한 부분에서 발병하기 쉽다. 무에서는 근두부(根頭部)에 발병하여 수침상으로 물렁하게 되고, 무의 중심부가 연부(軟腐)하여 속이 비게 된다. 세균에 의해서 발병하며 종자, 병든잎 뿌리, 토양곤충의 번데기에서 월동하고 다음해에 전염원이 된다. 병 발생은 온도와 밀접한 관계가 있으며 여름에 뿌린 배추에 특히 피해가 많다.

그람-음성 네크로트로픽(necrotrophic) 박테리아인 펙토박테리움 속( Pectobacterium spp.)은 상추, 감자, 담배, 관상용 식물 같은 잎이 있는 숙주를 감염시킨다(Ma et al., 2007). Pectobacterium carotovorum ssp. carotovorum ( Pcc )는 펙티나아제, 셀룰라아제, 프로테아제와 같은 식물 세포 벽-분해 효소를 가지고 있다. 배추는 국내에서 재배되는 가장 중요한 작물 중 하나이며, Pcc 에 의해 발병하는 배추 무름병은 Brassica 종에 영향을 미치는 가장 심각한 병이다(Ren et al., 2001).

그러나, 이러한 무름병은 지금까지 방제가 어려워 그 손실을 막을 방법이 현실적으로 없었다. 따라서 이러한 무름병에 저항성인 품종을 육성할 필요성이 끊임없이 대두되어왔다.

이에, 본 발명자들은 무름병 저항성 증진방법에 관해 연구를 하던 중, 애기장대 유래 AtWRKY55 유전자가 식물체의 무름병에 대해 저항성을 증진시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 무름병 저항성을 증진시키는 AtWRKY55 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 이용한 무름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 이용하여 식물체에서 무름병 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예는 식물체의 무름병 저항성을 증진시키는 재조합 벡터를 제공하며, 구체적으로 식물체의 무름병 저항성을 증진시키는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 AtWRKY55 (Arabidopsis thaliana WRKY transcription factor 55) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "무름병"이란 독특한 냄새가 나면서 흐물흐물해져서 썩는 식물 병해를 말하며, 특히 배추의 잎 줄기 뿌리에 수침상(水浸狀)의 반점이 생기기 시작하여 빠른 속도로 확대되어 포기 전체가 썩게 되는 병해를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어, "배추무름병"이란 배추무름병 병원균인 펙토박테리움 카로토보럼 ( Pectobacterium carotovorum spp. carotovorum , Pcc )에 의해 발병하는 병해를 의미한다. 상기 Pcc 는 죽은 유기체에서만 양분을 얻는 생물인 사물영양체(necrotroph)이다. 따라서 본 발명에서 "식물체의 무름병 저항성을 증진"시킨다는 것은 식물체의 Pcc 감염에 대한 저항성을 증진시키는 것을 의미할 수 있다.

상기 구체예에 따라 무름병 저항성을 증진시킬 수 있는 식물체는 무름병 병원균에 의해 감염될 수 있는 모든 식물체를 포함할 수 있고, 구체적으로 배추, 애기장대, 무, 상추, 가지, 국화 또는 백합일 수 있으며, 예를 들어 무름병의 대표적인 피해 채소인 배추, 상추일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

애기장대 ( Arabidopsis thaliana )와 배추 ( Brassica rapa )는 유전자 배열 등이 거의 동일한 것으로 알려져 있다. 이에 따라 애기장대 유래 유전자가 애기장대에서 특정 기능을 하는 경우, 이 유전자를 배추에 도입하였을 때에도 같은 기능을 하는 것을 확인한 실험이 다수 보고되어 있다. 반대로 배추 유래 유전자가 배추에서 특정 기능을 하는 경우, 이 유전자를 애기장대에 도입하였을 때에도 같은 기능을 하는 것을 확인한 실험이 다수 보고되어 있다 (Kim et al., "Overexpression of the Brassica rapa transcription factor WRKY12 results in reduced soft rot symptoms caused by Pectobacterium carotovorum in Arabidopsis and Chinese cabbage", Plant Biology, Vol.16, Issue.5, pp.973-981, 2014; Ko et al., "Heterologous expression of the Brassica rapa transcription factor BrWRKY7 enhances resistance against bacterial soft rot caused by Pectobacterium carotovorum in Arabidopsis ", Plant biotechnology reports (2015) 9:179-186 등). 따라서, 본 발명의 상기 구체예에 따른 AtWRKY55 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 무름병 저항성을 증진시킬 수 있는 식물체가 애기장대에만 한정되는 것은 아니며, 애기장대 이외에도 배추 등의 타 식물이 본 발명의 적용 범위에 포함될 수 있음은 통상의 기술자에게 자명한 사항이다.

상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 AtWRKY55 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로 발현될 수 있다.

상기 AtWRKY55 유전자는 애기장대 ( Arabidopsis thaliana ) 유래의 WRKY55 유전자로서, NCBI Accession number NM_129636에 공지된 유전자일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 바(Bar), 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시발현(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시발현 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시발현 프로모터는 선택 가능성을 한정하지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 p35S 프로모터가 포함된 벡터 pB2GW7에 AtWRKY55 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터 AtWRKY55-OE를 도 3에 예시하고 있고, 상기 AtWRKY55-OE 벡터는 업스트림(upstream)에서 다운스트림(downstream) 방향으로 제조체 저항성 유전자 Bar, p35S 프로모터, AtWRKY55 유전자를 포함하고 있으나, 본 발명은 이러한 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 무름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 식물체는 무름병 병원균에 의해 감염될 수 있는 모든 식물체를 포함할 수 있고, 구체적으로 배추, 애기장대, 무, 상추, 가지, 국화 또는 백합일 수 있으며, 예를 들어 무름병의 대표적인 피해 채소인 배추, 상추일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito RD et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein TM et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 벡터가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 및 캘러스(callus)를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조되고 조직 배양을 통해 재분화시킨 무름병 저항성 식물체를 제공한다.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 무름병 저항성 식물체는 AtWRKY55 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다. 즉, AtWRKY55 유전자가 포함된 재조합 발현벡터로 아그로박테리움에 도입시키고 상기 도입된 아그로박테리움을 이용하여 애기장대 꽃에 분사시켜 형질전환시켰다. 그 다음, 제초제에 살아남는 개체를 선발하여 무름병 저항성 식물체를 수득할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 과발현시켜 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 AtWRKY55 단백질의 세포 내 수준(level)을 높이는 단계를 포함하는 식물체의 무름병 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

상기 유전자를 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 세포 내 수준이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 AtWRKY55 유전자 또는 이들에 대한 상동 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 AtWRKY55 유전자 또는 이들에 대한 상동유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1 또는 이의 기능적 동등물의 AtWRKY55 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이와 동등물의 세포 내 수준을 증가시키는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 과발현시키는 방법은 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이와 동등물을 암호화하는 유전자, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자를 작동 가능하게 연결한재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시킬 수 있다.

상기 단백질 동등물에는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상동성을 갖는 상동 단백질이 포함된다.

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질은 292개의 아미노산으로 이루어진다.

상기 "상동 단백질"이란 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질로서 본 발명의 AtWRKY55 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 상기 유전자 동등물에는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자와 상동성을 갖는 상동 유전자를 포함한다.

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 AtWRKY55 유전자 또는 이의 상동 유전자는 단백질로 암호화된다. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 AtWRKY55 유전자는 879개의 핵산으로 이루어진다.

상기 "상동 유전자"란 서열번호 1의 염기서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 유전자로서 본 발명의 AtWRKY55 유전자와 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 유전자를 말한다. 서열 상동성은 당업계에 공지된 방법으로 분석될 수 있다.

상기 "실질적으로 동질의 기능"이란 무름병에 대한 저항성에 관여하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 AtWRKY55의 활성에 직접관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 AtWRKY55의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 단백질과의 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 AtWRKY55 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하여 식물 세포를 형질전환시킴으로써 애기장대 유래 AtWRKY55 단백질의 세포 내 발현 수준을 증가시켰다.

또한, 상기 본 발명에 따른 형질전환 유전자로는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 유전자뿐만 아니라, 서열번호 1의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열로부터 발현되는 단백질의 활성, 즉, 무름병에 대한 저항성과 동등한 정도의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기서열이 사용될 수 있다.

본 발명은 AtWRKY55 유전자를 이용한 식물체에서 무름병 저항성을 증진시키는 방법을 제공할 수 있으며, 종국에는 무름병 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다. 이러한 형질전환 식물체를 공급함으로써 농약사용 절감이 가능하고 그로 인해 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 될 것이다.

도 1은 애기장대에 배추무름병(soft rot) 병원균 펙토박테리움 카로토보럼 ( Pectobacterium carotovorum spp. carotovorum , Pcc ) 처리 후 시간(0, 12, 24, 48)에 따른 AtWRKY55 유전자의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 애기장대에 배추무름병(soft rot) 병원균 펙토박테리움 카로토보럼 ( Pectobacterium carotovorum spp. carotovorum , Pcc ) 또는 배추 검은썩은병(balck rot) 병원균 잔토모나스 캠페스트리스 ( Xanthomonas campestris pathovar campestris , Xcc )를 처리한 후, AtWRKY55 유전자의 발현여부를 확인한 도이다.
도 3은 AtWRKY55 유전자를 포함하는 재조합 벡터 AtWRKY55-OE의 모식도를 나타낸 도이다.
도 4는 AtWRKY55-OE 벡터로 형질전환된 애기장대와 비형질전환체(Col-0)의 AtWRKY55 과발현 검정 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 비형질전환체(Col-0)와 AtWRKY55 과발현 형질전환체(AtWRKY55-OE #1, #2, #3)에서 무름병 병징을 발병도(Disease severity; 레벨 0, 1 및 2)로 나타낸 그래프이다.
도 6은 비형질전환체(Col-0)와 AtWRKY55 과발현 애기장대 형질전환체(AtWRKY55-OE #2, #3)에서 AtPDF1.2 및 LOX2 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> 애기장대 유래 AtWRKY55 유전자 분리 및 과발현 벡터의 제작

<1-1> 애기장대 유래 AtWRKY55 유전자의 분리

애기장대( Arabidopsis thaliana )에서 배추무름병에 의해 특이하게 유도되는 유전자를 선발하였다.

구체적으로, 애기장대에 배추무름병(soft rot) 병원균인 펙토박테리움 카로토보럼 ( Pectobacterium carotovorum spp. carotovorum , Pcc )과 배추 검은썩은병(balck rot) 병원균인 잔토모나스 캠페스트리스 ( Xanthomonas campestris pathovar campestris , Xcc )를 각각 처리한 후, 잎 샘플을 액체 질소에서 간 다음, RT-PCR을 위한 전체 RNA를 Trizol reagent (Invitrogen)를 이용하여 추출하였다. 전체 RNA의 1 ㎍을 Promega(Madison, WI)로부터 구입한 M-MLV RTase(Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA로 만든 후, PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 94℃ 30초, 53℃ 1분, 72℃ 1분으로 30 사이클 수행 후 72℃에서 10분간 연장하였다. 상기 PCR을 수행하기 위한 프라이머로는 하기 표 1의 프라이머를 사용하였으며, 액틴 유전자인 AtActin을 대조군으로 사용하여 AtWRKY55 유전자 발현 정도를 분석하였다.

그 결과, 배추무름병원균 ( Pcc )의 처리에 의해서만 애기장대 WRKY55 (Arabidopsis thaliana WRKY transcription factor 55, AtWRKY55) 유전자의 발현이 매우 증가함을 확인하였다. 특히 배추무름병원균 처리 후 24시간에 AtWRKY55 유전자가 가장 많이 발현되었다 (도 1). 즉, AtWRKY55 유전자는 검은썩은병 병원균 ( Xcc )을 처리하였을 때는 발현이 증가하지 않았으며, 배추무름병 병원균 ( Pcc )이 처리에 의해 특이적으로 발현이 증가함을 확인하였다 (도 2).

따라서, AtWRKY55 유전자 (Locus tag: At2g40740.1, NCBI Accession number: NM_129636)가 배추무름병 저항성 기능과 관련이 있을 것으로 예상하고, 애기장대로부터 AtWRKY55 유전자의 전장 cDNA를 분리하였다. 분리한 애기장대 유래 AtWRKY55 유전자는 서열번호 1로 기재하고, 이에 상응하는 아미노산 서열을 서열번호 2로 기재하였다.

<1-2> 애기장대 AtWRKY55 유전자 과발현 벡터의 제작

애기장대 유래 AtWRKY55 유전자를 과발현하는 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 애기장대 시료로부터 AtWRKY55-F 프라이머(서열번호 3)와 AtWRKY55-R 프라이머(서열번호 4)를 이용하여 PCR을 수행해 cDNA를 증폭하였으며, 상기 프라이머는 AttB1 및 AttB2 재조합 사이트를 각각 포함하였다(표 2). PCR은 94℃ 30초 - 58℃ 1분 - 72℃ 1분을 30 사이클 수행 후, 72℃에서 10분간 연장하였다. 증폭된 cDNA는 pDONR221 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 BP clonase 반응(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 클로닝하여 엔트리 클론(entry clone)을 제작했다. AtWRKY55 유전자가 도입된 AtWRKY55 엔트리 클론 및 pB2GW7 (Gateway™, Belgium) 벡터 사이에 LR clonase 반응을 통해 형질전환용 벡터 AtWRKY55-OE를 제작하였다(도 3).

< 실시예 2> 애기장대 AtWRKY55 유전자 과발현 형질전환체 제작 및 과발현 검정

상기 실시예 1-2에서 제작한 AtWRKY55-OE 벡터를 애기장대에 형질전환하고, 형질전환된 식물에서 AtWRKY55 유전자의 과발현을 확인하는 실험을 하였다.

구체적으로, AtWRKY55의 형질전환용 벡터 AtWRKY55-OE를 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101에 도입시켰으며, 상기 균 현탁액을 개화하지 않은 Col-0 애기장대 꽃에 분사시켰다(Hwang et al., 2011). 형질전환 식물체는 제초제 (0.3% 바스타)를 이용하여 살아남는 개체를 선별하였다. 선별된 형질전환체로부터 총 RNA를 분리한 후 RTase를 이용해 cDNA를 만든 후, AtWRKY55 유전자-특이적 프라이머(서열번호 9 및 10)로 RT-PCR을 수행하여 AtWRKY55 유전자의 과발현을 검정하였다 (표 3).

그 결과, 비형질전환체 Col-0에서는 AtWRKY55가 발현되지 않는 반면에, 형질전환체에서는 AtWRKY55가 과발현되었음을 확인할 수 있었다(도 4).

< 실시예 3> AtWRKY55 과발현 형질전환체의 무름병 저항성 검정

상기 실시예 2에서 제작한 AtWRKY55 유전자 과발현 애기장대의 배추 무름병에 대한 저항성을 확인하였다.

구체적으로, 배추무름병 병원균 ( Pectobacterium carotovorum spp. carotovorum, Pcc )을 5 ml의 Luria Bertani (LB) 배지에서 30 ℃의 쉐이킹(shaking) 인큐베이터에서 1일 동안 배양하였다. 다음날, 배양한 배지를 5 ml의 새로운 LB 배지에 10 ^-2 희석하여 다시 접종하고, 6 시간 동안 배양하였다. 균 현탁액은 스핀 다운(spin down)하고, 1 mM NaCl에 재현탁하여 OD ₆₀₀ =0.1로 조정하여 5 ㎕를 이쑤시개로 상처낸 애기장대 형질전환체에 접종하였다. 발병도(disease severity)는 3가지 수준으로 나타내었으며, 레벨 0은 무름병 증상이 없는 잎, 레벨 1은 0.5 mm 이하의 병 증상이 발견된 잎, 레벨 2는 0.5 mm 이상의 병 증상을 가지는 잎을 의미한다.

발병도 검정 결과, 비형질전환 애기장대에서는 50 개체 중 26 개체(53%)가 3 dpi 접종 부분에서 레벨 2의 증상을 보였고, 24 개체(47%)는 레벨 1의 덜 심각한 증상을 보였다. 그러나, AtWRKY55 형질전환 애기장대 (#1)에서는 50 개체 중 12 개체(25%)만이 레벨 2의 증상을 보였고, 22 개체(45%)는 레벨 0의 미약한 증상을 보였다. 그러므로, AtWRKY55 과발현 애기장대에서 병의 증상이 감소된 걸로 보아, AtWRKY55 유전자는 무름병균( Pcc )에 대한 저항성에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다(도 5).

따라서, 비형질전환체에서 보다 AtWRKY55 형질전환 애기장대에서 무름병 병징이 완화되었음을 알 수 있었다.

< 실시예 4> AtWRKY 유전자 과발현 애기장대의 방어 경로(defense pathway)

AtWRKY55가 병 방어를 유도하는지 여부를 조사하기 위하여, AtWRKY55 과발현 애기장대 식물체로 병 방어 유전자에 대해 RT-PCR을 수행하였고, 병 방어 유전자의 발현 패턴에 대한 AtWRKY55 과발현의 효과를 검정하였다.

구체적으로, 병 방어-특이적 저항성 관련 마커 유전자인 AtPDF1.2(Arabiodopsis plant defensin) 및 LOX2(lipooxygenase)의 발현 패턴을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다(Manners et al., 1998; Penninckx et al., 1998). 먼저 잎 샘플을 액체 질소에서 간 후, RT-PCR을 위한 전체 RNA를 Trizol reagent (Invitrogen)을 이용하여 추출하였다. 전체 RNA의 1 ㎍ 을 Promega(Madison, WI)로부터 구입한 M-MLV RTase(Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행하였으며, 94℃ 30초 - 58℃ 1분 - 72℃ 1분으로 30 사이클 수행 후 72℃에서 10분간 연장하였다. 상기 PCR을 수행하기 위한 프라이머로는 하기 표 4의 프라이머를 이용하였으며, 액틴 유전자인 AtActin이 대조군으로 사용되었다.

그 결과, AtPDF1.2의 전사는 비 형질전환체에서 거의 유도되지 않는 반면, AtWRKY55 과발현 개체에서 강력하게 유도되었다. 이것은 애기장대에서 AtWRKY55의 발현이 JA(Jasmonic acid)-반응성 유전자인 AtPDF1.2 발현의 활성화에 관련이 있음을 의미한다. 또한 LOX2의 전사도 비형질전환체에서 거의 유도되지 않는 반면, AtWRKY55 과발현 개체에서 강력하게 유도되었는데, 이는 AtWRKY55가 JA 특이적 병 방어를 유도한다는 것을 의미한다(도 6).

이러한 결과로부터 AtWRKY55는 JA(Jasmonic acid)에 반응하는 저항성 마커 유전자의 발현을 유도시키는 전사인자임을 알 수 있었다.

SEQUENCE LISTING <110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Transgenic plant overexpressing AtWRKY55 gene with resistance for soft rot and method for producing the same <130> P16R12D0889 <160> 14 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 879 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgtactcgt acaaaaaaat aagttaccag atggaagagg taatgtcaat gatcttccac 60 ggaatgaaac tagttaaatc gctcgagtcc agcttaccgg aaaagccacc ggaatctcta 120 ttgacatctc ttgacgagat cgtaaagaca ttcagtgatg caaacgagcg gctgaagatg 180 ttactagaga ttaagaactc cgagactgcg ttaaacaaaa ccaaaccggt gattgtgtcc 240 gttgcaaacc agatgttgat gcagatggaa ccgggtctga tgcaagagta ttggttaagg 300 tatggcgggt ccacgtcgtc tcaaggaacg gaggccatgt tccagacgca gctcatggcc 360 gttgatggtg gtggagaaag gaatttgacg gctgcagtag aaagatccgg cgctagcggt 420 tcctccacgc caaggcagcg gagaaggaag gacgaaggag aagaacaaac ggtgttggtg 480 gcggcgctaa ggacggggaa cacagatctg ccacccgacg ataaccatac ttggcgtaaa 540 tacggtcaaa aagaaattct tggctctagg tttcctaggg cgtacta tag gtgcacccac 600 caaaagctat acaattgccc ggccaagaaa caagtccaac gccttaacga cgatcccttc 660 accttccggg tcacataccg tggctcacac acttgctaca actcaaccgc tccaaccgca 720 tcctctgcca ctccaagtac cattccaatc tcatccgtca ccactggtca ttctgttgac 780 tacggtcttg ctgtcgttga catggctgat gttatgtttg gtagcggcgg ggtcggaacc 840 aacatggatt tcatatttcc taaaaacgat ccatcttaa 879 <210> 2 <211> 292 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Tyr Ser Tyr Lys Lys Ile Ser Tyr Gln Met Glu Glu Val Met Ser 1 5 10 15 Met Ile Phe His Gly Met Lys Leu Val Lys Ser Leu Glu Ser Ser Leu 20 25 30 Pro Glu Lys Pro Pro Glu Ser Leu Leu Thr Ser Leu Asp Glu Ile Val 35 40 45 Lys Thr Phe Ser Asp Ala Asn Glu Arg Leu Lys Met Leu Leu Glu Ile 50 55 60 Lys Asn Ser Glu Thr Ala Leu Asn Lys Thr Lys Pro Val Ile Val Ser 65 70 75 80 Val Ala Asn Gln Met Leu Met Gln Met Glu Pro Gly Leu Met Gln Glu 85 90 95 Tyr Trp Leu Arg Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Ser Gln Gly Thr Glu Ala 100 105 110 Met Phe Gln Thr Gln Leu Met Ala Val Asp Gly Gly Gly Glu Arg Asn 115 120 1 25 Leu Thr Ala Ala Val Glu Arg Ser Gly Ala Ser Gly Ser Ser Thr Pro 130 135 140 Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp Glu Gly Glu Glu Gln Thr Val Leu Val 145 150 155 160 Ala Ala Leu Arg Thr Gly Asn Thr Asp Leu Pro Pro Asp Asp Asn His 165 170 175 Thr Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Glu Ile Leu Gly Ser Arg Phe Pro 180 185 190 Arg Ala Tyr Tyr Arg Cys Thr His Gln Lys Leu Tyr Asn Cys Pro Ala 195 200 205 Lys Lys Gln Val Gln Arg Leu Asn Asp Asp Pro Phe Thr Phe Arg Val 210 215 220 Thr Tyr Arg Gly Ser His Thr Cys Tyr Asn Ser Thr Ala Pro Thr Ala 225 230 235 240 Ser Ser Ala Thr Pro Ser Thr Ile Pro Ile Ser Ser Val Thr Thr Gly 245 250 255 His Ser Val Asp Tyr Gly Leu Ala Val Val Asp Met Ala Asp Val Met 260 265 270 Phe Gly Ser Gly Gly Val Gly Thr Asn Met Asp Phe Ile Phe Pro Lys 275 280 285 Asn Asp Pro Ser 290 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtWRKY55-F <400> 3 aaaaagcagg ctcgatgtac tcgtacaaaa aaataagtta ccag 44 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtWRKY55-R <400> 4 agaaagc tgg gtattaagat ggatcgtttt taggaaatat gaa 43 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtWRKY55 RT-F <400> 5 agcggagaag gaaggacgaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtWRKY55 RT-R <400> 6 tgtgagccac ggtatgtgac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtActin-F <400> 7 catcaggaag gacttgtacg 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtActin-R <400> 8 gatggacctg actcgtcata c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtWRKY55-specific primer-F <400> 9 agcggagaag gaaggacgaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtWRKY55-specific primer-R <400> 10 tgtgagccac ggtatgtgac 20 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtPDF1.2-F <400> 11 agaaatatgc atgtcataaa gttactcat 29 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AtPDF1.2-R <400> 12 caatggtgga agcacagaag 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LOX2-F <400> 13 gtccaaacct cagaagacga t 21 <2 10> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LOX2-R <400> 14 cacccatgac tcacatgtaa 20