一株贝莱斯芽胞杆菌及其在制备成水稻抗病剂中的应用
阅读：141发布：2020-05-11
专利汇可以提供一株贝莱斯芽胞杆菌及其在制备成水稻抗病剂中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株贝莱斯芽胞杆菌及其在制备成 水 稻抗病剂中的应用。该制剂具有诱导水稻秧苗免疫反应，且该菌能在水稻根或叶面组织定殖占居生态位，从而较好的抵御病原菌入侵；该 生物 菌剂可与 种子 一起拌匀、 播种 ，也可采用叶面喷雾方式进行施用， 预防 水稻纹枯病和稻瘟病，并显著减少化学 农药 用量，具有较高的市场价值。，下面是一株贝莱斯芽胞杆菌及其在制备成水稻抗病剂中的应用专利的具体信息内容。
一株贝莱斯芽胞杆菌及其在制备成水稻抗病剂中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 水稻是我国第一大粮食作物，而水稻病害包括纹枯病、稻瘟病、恶苗病等是水稻主要病害，这些病害在全国各稻区生产中普遍发生，可导致水稻根、茎或叶染病坏死，轻者秧苗发育停滞，重者死亡，由于秧苗发育不良，导致机械插秧困难，容易发生漂秧、死秧或者缓苗迟缓等现象，严重影响水稻产量和稻米品质。生产中，主要依靠化学农药进行防治，例如噁霉灵、甲霜灵、咪鲜胺等，而化学杀菌剂的长期使用不仅易产生农药抗性，而且易导致农药残留，带来环境安全风险。
[0003] 植物诱导抗病性分为两类：1)系统获得性抗病性(systematic acquired resistance,SAR)，由病原菌局部侵染诱导植物系统抗病性；2)诱导系统抗病性(induced systemic resistance,I SR)，是通过外界非致病微生物诱导植物产生的系统抗病性。ISR具有非特异性、持久性和传导性等特点，对多种病原菌均有较好的效果而成为目前研究的热点和重点。尽管尚不完全清楚ISR抗性产生机制，但发现ISR能诱导植物合成和积累植保素及植物防卫反应机制分子的合成，从而诱导植物抗病性，目前已发现许多生物分子能诱导ISR的产生，包括寡糖、水杨酸、茉莉酸、乙烯、蛋白质等。过氧化物酶是植物细胞内的重要保护酶类之一，病原菌的侵染能诱导过氧化物酶的表达，抑制病原菌孢子的萌发，而抗病品种过氧化物酶活性显著高于感病品种。多酚氧化酶广泛存在于植物体各种器官，机械损伤、病原菌感染、信号分子(水杨酸、乙烯等)能诱导多酚氧化酶的表达、产生醌类物质，帮助植物提高抗病性。苯丙氨酸解氨酶是植物抗病反应次生代谢中，苯丙烷类代谢的重要酶类之一，可促进植保素、木质素和酚类化合物等抗病次生物质的形成，与植物抗病性息息相关。通过分析植物过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶等酶活性的变化，能有效对植物诱导抗病性效果进行评估，为开发植物诱导抗病性制剂奠定基础。
[0004] 贝莱斯芽胞杆菌是一种芽胞杆菌属细菌，由Ruiz-García等2005年新命名的芽胞杆菌种，目前研究发现该菌产生β-葡聚糖酶，该酶能有效降解真菌细胞壁，从而抑制病原真菌的生长，已发现该菌对多种病原真菌生长具有抑制作用，包括棉花黄萎菌、番茄灰霉菌等。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽胞杆菌H68，该菌株于2019年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)H68，保藏编号为CCTCC NO：M2019963。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了贝莱斯芽胞杆菌H68在制备成植物抗病剂中的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0007] 本发明涉及的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)H68是申请人从湖北武穴水稻田土壤中分离得到，并于2019年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)H68，保藏编号为CCTCC NO：M2019963。
[0008] 该菌生理生化鉴定结果为：菌体杆状、芽胞椭圆中生、鞭毛侧生，菌落奶白色、边缘整齐，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阳性、马尿酸盐水解阴性、VP试验阳性、VP反应最终pH 4.4，淀粉水解反应阳性、硝酸盐还原反应阳性、柠檬酸盐利用反应阳性、厌氧生长阴性、D-麦芽糖利用阳性、D-麦海藻糖利用阳性、D-纤维二塘利用阳性、蔗糖利用阳性、D-松二糖利用阴性、水苏糖利用阴性、蜜三糖和蜜二糖利用阴性、明胶利用阴性、D-半乳糖利用阴性、L-乳酸利用阳性、D-苹果酸利用阴性、L-苹果酸利用阳性、D-葡糖-6-磷酸利用阴性、可在pH 5.7条件下生长、4％和8％NaCl中能生长，参照伯杰氏细菌手册(第九版)该菌符合芽胞杆菌生理生化特征。同时采用PCR技术对其16SrDNA基因进行扩增并测序，扩增正向引物为1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，反向引物为27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)，测序结果在NCBI数据中进行序列比对，发现与贝莱斯芽胞杆菌同源比例达到97.99％。综合该菌生理生化特征以及16SrDNA序列同源性，鉴定该菌株为贝莱斯芽胞杆菌。
[0009] 贝莱斯芽胞杆菌H68在制备成植物抗病剂中的应用，包括利用该菌株作为有效成分或是有效成分之一制备成植物抗病剂；或是用于制备成诱导植物产生抗病性的诱导剂。
[0010] 所述的植物优选水稻。
[0012] 以上所述的应用，当制备成抑菌剂时，优先对纹枯菌，稻瘟菌，尖孢镰刀菌，轮枝镰刀菌，草莓灰霉菌起作用。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0014] 申请人自湖北武穴水稻田土壤中分离到的贝莱斯芽胞杆菌H68，能有效抑制水稻纹枯菌、稻瘟菌等植物真菌，同时能诱导水稻免疫反应，提高水稻参与抗病反应相关酶(过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶)活性，并能定向的在水稻根或叶组织内定殖，同时，该菌剂能提高水稻出苗率和促进根茎发育，显示该菌株具有较好的开发潜力和市场价值。
具体实施方式
[0015] 本发明技术方案中，所述试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述技术方案如未特别说明，均为本领域的常规技术。
[0016] 实施例1：
[0017] 贝莱斯芽胞杆菌H68的分离鉴定：
[0018] 申请人从湖北武穴水稻田土壤分离得到，并于2019年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensisH68，保藏号为CCTCC NO：M2019963。
[0019] 该菌生理生化鉴定结果为：菌体杆状、芽胞椭圆中生、鞭毛侧生，菌落奶白色、边缘整齐，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阳性、马尿酸盐水解阴性、VP试验阳性、VP反应最终pH 4.4，淀粉水解反应阳性、厌氧生长阴性、D-麦芽糖利用阳性、D-麦海藻糖利用阳性、D-纤维二塘利用阳性、蔗糖利用阳性、D-松二糖利用阴性、水苏糖利用阴性、蜜三糖和蜜二糖利用阴性、明胶利用阴性、D-半乳糖利用阴性、L-乳酸利用阳性、D-苹果酸利用阴性、L-苹果酸利用阳性、D-葡糖-6-磷酸利用阴性、可在pH 5.7条件下生长、4％和8％NaCl中能生长，参照伯杰氏细菌手册(第九版)该菌符合芽胞杆菌生理生化特征。同时采用PCR技术对其16SrDNA基因进行扩增并测序，扩增正向引物为1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，反向引物为27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)，测序结果在NCBI数据中进行序列比对，发现与贝莱斯芽胞杆菌同源比例达到97.99％。综合该菌生理生化特征以及16Sr DNA序列同源性，鉴定该菌株为贝莱斯芽胞杆菌。
[0020] 实施例2：
[0021] 贝莱斯芽胞杆菌H68的制备：
[0022] 超低温甘油保存贝莱斯芽胞杆菌H68菌种，首先在NA固体培养基上活化，挑取单菌落接种于NA液体培养基中，于28℃、200r/min摇床震荡培养12h，将其作为种子液，种子液按照5％的装瓶量接种于发酵培养基中，装液量50L，转速200r/min，空气流量1L/min，发酵24h，发酵液有效菌浓度为1╳109cfu/mL，本发明或称为菌液，用于以下实施例；
[0023] NA培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水1000ml，pH 7.0；NA固体培养基每1000mL培养基另加20g琼脂粉。
[0025] 灭菌后的硅藻土置于混合器中，将贝莱斯芽胞杆菌发酵液加入硅藻土中，混匀，成品为松散的颗粒状，加了硅藻土后的贝莱斯芽胞杆菌H68菌剂的有效菌含量是1.5╳108cfu/g，本发明或称为菌粉、用于以下实施例。
[0026] 实施例3：
[0027] 贝莱斯芽胞杆菌H68的抑菌谱：
[0028] 可以有效抑制5种常见植物病原真菌生长，包括：纹枯菌，稻瘟菌，尖孢镰刀菌，轮枝镰刀菌，草莓灰霉菌，但对油菜核盘菌、辣椒疫霉菌抑菌效果差或基本无效。
[0029] 计算抑制率的实验过程具体如下：
[0030] 病原真菌于28℃培养3～5d后，采用5mm直径消毒打孔器沿菌落边缘打孔，然后将菌丝块置于新的PDA平板(直径9cm)中央，在距平板中心5cm处对称放置4张消毒小滤纸圆片(直径5mm)，每张滤纸片上滴加15uL贝莱斯芽胞杆菌H68菌液，重复2个平皿；对照为PDA琼脂平板小滤纸圆片上滴加15uL无菌水。平板置于28℃培养箱培养3～5d，待对照组真菌长满平板时取出，测量真菌菌落直径，并按照下列公式计算病原真菌生长抑制率(％)：
[0031]
[0032]病原真菌 抑菌率(％)
水稻纹枯菌(Rhizoctonia solani) 37.6
稻瘟菌(Magnaportheoryzae) 49.7
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) 69.2
轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides) 71.5
草莓灰霉菌(Botrytis cinerea) 58.4
油菜核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum) 3.4
辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici) 1.8
水稻纹枯菌(Rhizoctonia solani) 37.6
稻瘟菌(Magnaportheoryzae) 49.7
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) 69.2
轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides) 71.5
草莓灰霉菌(Botrytis cinerea) 58.4
油菜核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum) 3.4
辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici) 1.8
[0033] 实施例4：
[0034] 贝莱斯芽胞杆菌H68在制备成水稻抗病剂/拌种剂中的应用：
[0035] 水稻种子(鄂香2号)经剔除秠粒后常温浸泡8h，沥干水分后用于拌种处理。共4个处理，分别如下：
[0036] 处理1：贝莱斯芽胞杆菌按药种比1：50(重量比)与水稻种子一起拌匀。
[0037] 处理2：贝莱斯芽胞杆菌按药种比1：100(重量比)与水稻种子一起拌匀。
[0038] 处理3：贝莱斯芽胞杆菌按药种比1：150(重量比)与水稻种子一起拌匀。
[0039] 处理4：空白对照，不进行药剂拌种。
[0040] 同时，为验证贝莱斯芽胞杆菌能否在其它作物定殖，设立处理5：将贝莱斯芽胞杆菌按药种比1：50(重量比)与油菜种子一起拌匀。
[0041] 以上所用的贝莱斯芽胞杆菌为实施例2制备的菌粉。
[0042] 各处理完毕后，按照每穴1粒种子分别播种于200孔穴盘(20孔╳10孔，长宽高分别为535mm、280mm和40mm)，每处理3个穴盘，重复3次，置于人工气候箱中(光照12h，黑暗12h，28℃)。穴盘土为市售水稻育秧基质经高温消毒处理，每处理3个穴盘，重复3次。播种后10d，统计出苗率，并分别取各处理秧苗的根测量过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性。酶活性测试采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒，测试方法严格按照厂家说明书进行。播种后30d，调查水稻根长等生物学指标，并采用IMBMSPSS22.0进行数据统计分析。
[0043] 在调查水稻生物学指标同时，采集水稻苗根组织，首先用无菌水将根表面基质冲洗干净，然后将根组织浸泡于75％酒精消毒5min，倒掉酒精后，再加入浓度为5％的次氯酸钠浸泡20min，以彻底杀灭根表面微生物，然后用无菌水反复清洗3～5遍，最后用无菌滤纸将水吸干。经消毒后的根组织加入定量无菌水进行研磨，然后采用梯度稀释法对组织液进行稀释，最后分别取不同梯度稀释液100μL在NA平板上涂布，涂布完毕后至于28℃恒温培养箱进行培养，24h后检查菌落数量。
[0044] 贝莱斯芽胞杆菌拌种诱导水稻免疫反应结果如下：
[0045]
[0046] *：表中括号中相同字母代表在0.05水平无显著性差异，不同字母代表有显著性差异。
[0047] 水稻苗株高以处理1最高，为15.4cm，显著高于其它处理(P<0.05)。水稻苗根长以处理1最(5.4cm)，显著高于其它处理(P<0.05)。处理1能显著诱导根部过氧化物酶活性(597.5U/给鲜重)，显著高于其它处理(P<0.05)，而处理2显著高于处理3和处理4(P<0.05)，处理3和处理4则无显著性差异(P>0.05)。以处理1多酚氧化酶活性最高(66U/g鲜重)，显著高于其它3处理(P<0.05)，而其它3处理则无显著性差异。处理1苯丙氨酸解氨酶活性最高(48.8U/g鲜重)，显著高于其它处理(P<0.05)，其次为处理2和处理3，这两处理均显著高于处理4(P<0.05)。在处理30d后，处理1水稻苗根组织中贝莱斯芽胞杆菌数量为1251.5CFU/g根组织，与处理2(1044.9CFU/g根组织)，显著高于处理3(915.3CFU/g根组织)，而处理4(对照)没有检测出贝莱斯芽胞杆菌。采用贝莱斯芽胞杆菌处理油菜种子(处理5)也能诱导油菜过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸酶解氨酶的活性增加，但该菌不能在油菜根内定殖。
[0048] 贝莱斯芽胞杆菌拌种促进水稻生长结果如下：
[0049]
[0050] *：表中括号中相同字母代表在0.05水平无显著性差异，不同字母代表有显著性差异。
[0051] 水稻苗株高以处理1最高，为15.4cm，显著高于其它处理(P<0.05)。水稻苗根长以处理1最长(5.4cm)，显著高于其它处理(P<0.05)。水稻苗白根数以处理1最多，为5.9根/株，显著高于其它处理(P<0.05)。地上鲜重以处理1最重，为3.9g/20株，显著高于其它处理(P<0.05)。地下鲜重也以处理1最重，为2.0g/20株，显著高于其它处理。综合以上结果，贝莱斯芽胞杆菌按照药种比1:50，能有效诱导水稻根部免疫反应，同时能有效促进水稻出苗率、根和茎的发育。
[0052] 实施例5：
[0053] 贝莱斯芽胞杆菌制备成叶面喷雾防治水稻苗期病害的应用：
[0054] 试验在湖北咸宁市崇阳县试验基地行，试验水稻品种为中9优288，为水稻感病品种。水稻采用常规方法催芽并播种于育秧穴盘(20孔╳10孔，长宽高分别为535mm、280mm和40mm)，播种后至于育秧棚，待出苗率达到80％左右时，进行药剂处理。共3个处理，分别如下：(以下所用的菌的初始有效菌浓度是1.5╳108cfu/g，即实施例2制备的菌粉)[0055] 处理1：贝莱斯芽胞杆菌1g：50ml水进行稀释，采用背负式喷雾器进行叶面喷雾，以叶面湿润为宜。
[0056] 处理2：贝莱斯芽胞杆菌1g：100ml水进行稀释，采用背负式喷雾器进行叶面喷雾，以叶面湿润为宜。
[0057] 处理3：25％咪鲜胺乳油稀释4500倍，采用背负式喷雾器进行叶面喷雾，以叶面湿润为宜。
[0058] 处理4：空白对照，采用清水喷雾。
[0059] 移栽前，调查水稻纹枯病和稻瘟病的病情指数，并计算校正防效，数据采用IMBMSPSS22.0进行方差分析。同时，采集各处理叶组织1.0g，首先用无菌水将叶表面冲洗3遍，然后将根组织浸泡于75％酒精消毒5min，倒掉酒精后，再加入浓度为5％的次氯酸钠浸泡20min，以彻底杀灭叶表面微生物，然后用无菌水反复清洗3～5遍，最后用无菌滤纸将水吸干。经消毒后的叶组织加入定量无菌水进行研磨，然后采用梯度稀释法对组织液进行稀释，最后取不同梯度稀释液100μL在NA平板上涂布，涂布完毕后至于28℃恒温培养箱进行培养，24h后检查菌落数量。
[0060] 贝莱斯芽胞杆菌喷雾防治水稻苗期病害结果如下：
[0061]
[0062] *：表中括号中相同字母代表在0.05水平无显著性差异，不同字母代表有显著性差异。
[0063] 处理1【贝莱斯芽胞杆菌稀释50倍】对水稻纹枯病防效与处理3【25％咪鲜胺稀释4500倍】无显著差异(P>0.05)，但显著高于处理2【贝莱斯芽胞杆菌稀释100倍】。处理1对稻瘟病的防效与处理3无显著性差异(P>0.05)，但显著高于处理2。处理1叶组织贝莱斯芽胞杆菌含量为642.3CFU/g叶组织，显著高于处理2(479.2CFU/g叶组织)，以处理3叶组织贝莱斯芽胞杆菌含量最低(273.5CFU/g叶组织)，而处理4(对照)无贝莱斯芽胞杆菌检出。综合以上结果，贝莱斯芽胞杆菌50倍稀释液，能有效防控苗期纹枯病和稻瘟病，同时能在水稻叶组织定殖。
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