一株海洋来源的枯草芽孢杆菌2713、抗菌物质及其制备方法和应用
阅读：744发布：2020-05-11
专利汇可以提供一株海洋来源的枯草芽孢杆菌2713、抗菌物质及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株海洋来源的枯草芽孢杆菌2713、抗菌物质及其制备方法和应用。本发明证明枯草芽孢杆菌2713及其抗菌物质具有广泛的抑菌谱，对多种细菌和 真菌 都有显著的抑制作用，其中对耐甲 氧 西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作用效果最显著。产自枯草芽孢杆菌2713的该抗菌物质，可以作为新型抗MRSA药物的储备，同时该抗菌物质及其产生菌株也可以制备成 益生菌 菌剂，作为优质的 饲料 添加剂，应用到养殖业中替代抗生素的使用。，下面是一株海洋来源的枯草芽孢杆菌2713、抗菌物质及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一株海洋来源的枯草芽孢杆菌菌株2713，其特征在于：其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），菌株于2019年10月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18732。
2.权利要求1所述的海洋来源的枯草芽孢杆菌菌株2713发酵获得的抗菌物质。
3.根据权利要求2所述的抗菌物质，其特征在于，所述抗菌物质的分子量为1463Da。
4.根据权利要求2所述的抗菌物质，其特征在于，所述抗菌物质按如下方法制备，将枯草芽孢杆菌菌株2713接种至培养基中发酵获得发酵液，然后提取并纯化获得抗菌物质。
5.根据权利要求4所述的抗菌物质，其特征在于，
所述的发酵液的发酵过程如下：发酵温度为温度30 37℃，发酵时间为36 48 h；
~ ~
所述提取抗菌物质的方法如下：吸附：将发酵液离心，取上清液加入经预处理的大孔树脂，在室温条件下吸附18 24 h；洗脱：先用2 5倍体积的水洗，依次用2 5倍体积的乙醇进行~ ~ ~
梯度洗脱，并收集洗脱液；浓缩：将洗脱液在50 55℃的条件下浓缩获得；
~
所述纯化抗菌物质的方法如下：液相色谱系统采用C18柱进一步分离纯化，流动相A为乙腈，流动相B为超纯水，然后梯度洗脱；进样量20 μL，流速1 mL·min-1，214 nm波长检测。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株2713和/或权利要求2所述的抗菌物质在制备抑制细菌和真菌的抑菌剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述细菌为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌，所述革兰氏阳性菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌；所述真菌为尖孢镰刀菌。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株2713或权利要求2所述的抗菌物质在制备饲料添加剂、益生菌菌剂中的应用。
9.根据权利要求9的应用，其特征在于，所述的饲料添加剂、益生菌菌剂中的菌体密度大于等于107CFU/g。
10.权利要求2的抗菌物质在制备抗菌药物中的应用。
一株海洋来源的枯草芽孢杆菌2713、抗菌物质及其制备方法
和应用
技术领域
背景技术
[0002] 自从上世纪40年代青霉素问世以来，抗生素一直是治疗细菌性感染的主要药物。随着抗生素的长期应用，特别是在养殖业中的超量滥用，耐药性病原细菌的滋生及传播已成为当今威胁人类生存的严峻挑战。目前，主要的耐药性病原细菌中MRSA分布广泛，威胁较大，传播迅速，极易在医院内扩散，且具有较高的病死率，一直是临床治疗的难题。除此之外，金黄色葡萄球菌是导致奶牛的乳腺炎主要致病菌之一，MRSA的出现也给养殖业带来巨大冲击。
[0003] 在过去的几十年里，人类不断地寻找新型的抗生素以抵抗MRSA蔓延，然而发现的新型抗生素却少之又少，仅有屈指可数的几个药物问世，包括人工合成恶唑烷酮类抗生素利奈唑胺；脂肽类抗生素达托霉素(daptomycin)；头孢吡普第五代头孢菌素类抗生素；以及第五代头孢类注射用抗生素头孢洛林。迄今为止，达托霉素仍然是自2003年以来唯一一个天然产生的新型抗生素，被认为是治疗MRSA引起的菌血症的一线药物。可见天然代谢产物的挖掘，是药物开发的重要途经。
[0004] 益生菌枯草芽孢杆菌产生的脂肽抗菌物质可以作为新型药物的储备，同时益生菌剂可以在动物养殖中添加，提高其日生长速度、相对增重率、饲料系数、成活率、免疫力、抗病力，还可以防霉抑菌，在动物养殖业具有广阔的应用前景。2020年农业部规定饲料中抗生素添加将被全面取缔，饲用抗生素替代品寻找迫在眉睫。随着替抗趋势的发展，益生菌芽孢杆菌及其代谢产物的将受到越来越多的关注。可以预见，活性代谢产物在益生菌中的不断发现和应用，必将有力地促进养殖行业中饲料添加抗生素的替代的早日实现。
发明内容
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一株海洋来源的枯草芽孢杆菌2713、抗菌物质及其制备方法和应用，所述枯草芽孢杆菌2713具有显著的抗菌作用，能有效替换抗生素类产品，防止耐药性病原细菌的滋生，能应用于饲料添加剂、益生菌菌剂中，同时为以后抗菌药物开发提供储备。
[0006] 本发明在研究枯草芽孢杆菌2713代谢产物及其抗菌活性的过程中，通过大孔树脂吸附法、高效液相色谱层析等分离纯化方法，得到了抗菌物质，该抗菌物质对金黄色葡萄球菌及MRSA等有显著的抑制作用，从而实现了本发明的目的。
[0007] 本发明从海水样品中发现了一株具有抗菌活性的菌株2713，经16S rRNA鉴定和全基因组测序属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年10月24日，保藏号为CGMCC No.18732。通过抑菌实验验证，该菌可以产生拮抗MRSA的抗菌活性物质。且该菌抑菌范围较广，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有拮抗效果。
[0009] 本发明还提供了所述的枯草芽孢杆菌菌株2713发酵获得的抗菌物质。使用HPLC对粗提物进行了纯化，并通过ESI-MS/MS分析得知其分子量为1463Da。
[0010] 进一步的，该抗菌物质的制备方法如下：将枯草芽孢杆菌菌株2713接种至培养基中发酵获得发酵液，后用大孔树脂提取获得抗菌物质。
[0011] 进一步的，所述抗菌物质的制备方法为：所述的发酵液的发酵过程如下，发酵温度为温度30～37℃，发酵时间为36～48h。
[0012] 所述大孔树脂提取抗菌物质提取方法如下：吸附：将发酵液离心，取上清液加入经预处理的大孔树脂，在室温条件下吸附18～24h；洗脱：先用2～5倍体积的水洗，依次用2～5倍体积的乙醇进行梯度洗脱，并收集洗脱液；浓缩：将洗脱液在50～55℃的条件下浓缩获得。
[0013] 本发明通过采用大孔树脂对发酵物中的抗菌物质进行粗提取，发现粗提物可以耐受30min的100℃高温处理，且在pH 2-12的范围内有着稳定的抑菌能力。
[0014] 本发明提供了所述枯草芽孢杆菌菌株2713及其抗菌物质具有抑制细菌和真菌的用途。
[0015] 进一步的，所述细菌为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌，所述革兰氏阳性菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌。所述真菌为尖孢镰刀菌。
[0017] 进一步的，所述的饲料添加剂、益生菌菌剂中的菌体密度大于等于107CFU/g。
[0018] 本发明还提供了所述的抗菌物质在制备抗菌药物中的应用。
[0019] 通过以上技术方案，本发明首次从海洋来源的枯草芽孢杆菌中分离纯化出分子量为1463Da的抗菌物质，通过抑菌试验证明，该菌株和抗菌物质对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有较强的拮抗作用，尤其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有抑制作用。同时本发明提供了一种抗菌物质的制备方法，由枯草芽孢杆菌发酵获得，经抑菌实验证明，该抗菌物质对真菌和细菌有强的抑菌能力，本发明所述的枯草芽孢杆菌2713和抗菌物质可以被应用到饲料添加剂、益生菌制剂中，具有益生菌枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质作为新型药物的储备，同时益生菌剂可以在动物养殖中添加，能够提高养殖的日生长速度、动物相对增重率、饲料系数、成活率、免疫力、抗病力，还可以防霉抑菌。附图说明
[0020] 图1为实施例3中基于16S rRNA序列的菌株2713系统进化树。
[0021] 图2为实施例4中菌株2713生长曲线以及代谢产物产生曲线。
[0022] 图3为实施例5中两种提取方法对MRSA的抑制作用。
[0023] 图4为实施例6中抗菌物质进行HPLC分离纯化。
[0024] 图5为实施例7中ESI-MS图谱。
[0025] 具体的实施方式
[0026] 实施例1、抗菌活性芽孢杆菌的筛选
[0027] (1)透明圈法进行初筛
[0028] 将样品进行梯度稀释涂布，置于37℃培养过夜。待菌落长出后，选取平板上菌落分布均匀、且平板菌落数在10-30个的平板，将含有100μL浓度0.1％TTC和100μL指示菌的10mL软琼脂倾倒于选取的平板上，培养过夜。第二天记录透明圈直径，选取透明圈直径较大的菌株进行复筛。
[0029] (2)发酵液进行复筛
[0030] 将初筛菌株接种到5mL的Landy液体培养基中培养48h后，采用spot-on-lawn的方法测定先将100μL的指示菌菌液均匀的涂布于LB平板上，然后用移液枪吸取10μL去除菌体的发酵液，滴到涂布有指示菌的平板上，37℃培养过夜，待指示菌长出后观察抑菌圈。
[0031] 实施例2、菌株2713的抑菌特性
[0032] 指示菌：革兰氏阴性菌(大肠杆菌Escherichia coli K88、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、副溶血弧菌Bibrio Parahemolyticus、沙门氏菌Salmonella bongori)；革兰氏阳性菌(MRSA、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、无乳链球菌Streptococcus agalactiae、粪肠球菌Enterococcus faecium)；真菌(尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、热带假丝酵母Candida tropicalis)
[0033] 其抑菌效果如下表1所示：该菌对多种革兰氏阳性菌，包括金黄色葡萄球菌、MRSA、无乳链球菌、粪肠球菌均有拮抗作用，对革兰氏阴性菌大肠杆菌K88，嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等具有抑制效果，对酿酒酵母和热带假丝酵母没有抑制作用。
[0034] 表1菌株2713的抑菌特性
[0035]
[0036] 实施例3、16S rRNA基因扩增及测序
[0037] 将复筛菌株接种到LB肉汤中37℃过夜培养，以菌液作为模板，利用细菌通用引物27F和1492R对细菌的16S rRNA基因序列进行扩增。PCR扩增体系为50μL，1μL菌液作为模板，上下游引物各1μL，2×Mix 25μL，ddH2O 22μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性
30s；55℃退火30s和72℃延伸90s，34次循环后，72℃后延伸10min。将PCR未纯化的产物交给生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
30s；55℃退火30s和72℃延伸90s，34次循环后，72℃后延伸10min。将PCR未纯化的产物交给生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
[0038] 经过16S rRNA扩增，PCR产物由生工进行测序，NCBI进行序列比对，最终使用Mega7进行系统进化树的构建(图1)。菌株2713被鉴定为Bacillus subtilis。
[0039] 16S rRNA序列如下(SEQ ID No：1)：
[0040] CGCTTGCGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGATCT。
[0041] 实施例4、枯草芽孢杆菌2713代谢产物的发酵
[0042] 选用Landy培养基作为发酵培养基，发酵液装量为20L，发酵温度为37℃，初始pH为7，接种量为1％，搅拌速率分别为200r·min-1，发酵时间为48h。发酵罐操作严格按照发酵罐的说明进行，发酵过程中产生大量的气泡时，可以添加适量灭菌的消泡剂。整个发酵过程不通过补加酸碱调节pH，为自然发酵pH，根据发酵过程中溶氧变化调控通气量和转速。
[0043] 如图2所示。使用发酵罐进行液体深层发酵的发酵液，对MRSA具有抑菌活性，且对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有抑菌作用。以肉眼观察不到抑菌圈出现的最高稀释度定义为一个活力单位(IAU)，其倒数表示抑菌活性物质的抑菌活性，以AU表示。
[0044] 表2枯草芽孢杆菌2713的抗菌物质的抑菌活性
[0045]
[0046] 实施例5、大孔树脂静态吸附提取抗菌物质
[0047] (1)吸附：发酵液12000r·min-1离心15min，弃菌体沉淀，取500mL上清液液加入50g预处理过的大孔树脂，放入25℃，转速为180r·min-1摇床中进行吸附24h。
[0048] (2)洗脱：先用2倍体积的水洗，依次用2倍体积浓度为30％，40％，50％，60％，70％，80％的乙醇洗脱，并收集洗脱液。
[0050] 如图3所示，大孔树脂提取的发酵液仍具有抑菌作用，且抑菌效果优于未提取的发酵液。
[0051] 实施例6、抗菌物质的纯化
[0052] 液相色谱系统采用C18柱进一步分离纯化。100％乙腈平衡C18柱，流动相A为乙腈(含0.1％TFA)，流动相B为超纯水(含0.1％TFA)。采用梯度洗脱，洗脱条件为：①0-5min，A：0-30％；②5-10min，A：30％；③10-12min，A：30％-50％；④12-45min，A：50％；⑤45-47min，A：50-100％；⑥47-60min，A：100％；⑦60-62min，A：100-30％。进样量为20μL，流速为1mL·min-1，214nm波长检测。多次累积收集不同保留时间的洗脱峰，用于下一步LC-MS鉴定。
[0053] 分离纯化的抗菌物质如图4所示，在17min处的洗脱峰，有明显的抗MRSA活性。
[0054] 实施例7、抗菌活性物质分子量的确定
[0055] LC-MS系统为Agilent，1290Infinity II UHPLC/6460QqQ MS C18色谱柱(2.1×100mm，3.51μm)。洗脱条件同上，溶剂A为水(0.1％甲酸)，溶剂B为乙腈(0.01％甲酸)。流速n-1
0.3mL·mi ，214nm波长检测。电离方式采用电喷雾，正离子模式，质量检测器为四级质量分析器，质谱扫描范围为5-3000Da。
0.3mL·mi ，214nm波长检测。电离方式采用电喷雾，正离子模式，质量检测器为四级质量分析器，质谱扫描范围为5-3000Da。
[0056] 其质谱图如图5所示，分子量为1463Da。
[0057] 实验结果表明：B.subtilis 2713对细菌具有广谱抗菌性，对MRSA有较好的抑菌活性，且经过液体深层发酵证实2713所产抗菌代谢产物为次生代谢产物类型，菌株2713适于工程化和规模化工艺放大，ES-MS/MS分析，其分子量为1463Da。
[0058] 实施例8、枯草芽孢杆菌2713发酵制备益生菌制剂
[0059] 取枯草芽孢杆菌2713于LB液体培养基中活化，30～37℃，180～200rpm条件下摇床培养18～24h，以占培养基总体积1％的接种量接种于30L发酵罐，通气条件下培养18h，作为种子液。种子液按以培养基总体积1％的接种量接种于1000L发酵罐中，搅拌速度为200r/min，发酵过程中产生大量气泡时，适量加入灭菌消泡剂，37℃条件下培养48h后获得枯草芽孢杆菌2713菌液及代谢产物，菌体密度大于等于107CFU/g。
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