TNF-α结合蛋白
阅读：1019发布：2020-09-12
专利汇可以提供TNF-α结合蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了分离的结合蛋白，例如，结合 肿瘤 坏死 因子-α(TNF-α)例如人TNF-α的 抗体 或其 抗原 结合部分，并公开了基于相关抗体的组合物和分子。亦公开了包含所述抗体的药物组合物，以及使用所述抗体的 治疗 和诊断方法。，下面是TNF-α结合蛋白专利的具体信息内容。
1.人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其包含能够结合人肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含3个重链互补决定区（CDRs）和3个轻链CDRs，
其中所述3个重链CDRs由下述组成：
由SEQ ID NO:22的氨基酸残基31-35组成的CDR-H1；
由SEQ ID NO:22的氨基酸残基50-65组成的CDR-H2；
由SEQ ID NO:22的氨基酸残基98-106组成的CDR-H3；
其中所述3个轻链CDRs由下述组成：
由SEQ ID NO:23的氨基酸残基24-34组成的CDR-L1；
由SEQ ID NO:23的氨基酸残基50-56组成的CDR-L2；
由SEQ ID NO:23的氨基酸残基89-97组成的CDR-L3；
其中所述人源化结合蛋白或其抗原结合片段包含人接纳体构架；且
-10
其中所述人源化结合蛋白或其抗原结合片段以最多1.56 × 10 M的解离常数(KD)
结合人TNF-α，所述解离常数通过表面等离振子共振来测量。
2.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗原结合结构域包含重链可变（VH）区。
3.权利要求2的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述VH区由选自SEQ ID NO:
24、25、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列组成。
4.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗原结合结构域包含轻链可变（VL）区。
5.权利要求4的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述VL区由选自SEQ ID NO:
26、27、34、35和36的氨基酸序列组成。
6.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗原结合结构域包含重链可变（VH）区和轻链可变（VL）区。
7.权利要求6的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述VH区由选自SEQ ID NO:
24、25、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列组成，所述VL区由选自SEQ ID NO: 26、27、34、
35和36的氨基酸序列组成。
8.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述人接纳体构架由选自SEQ ID NO: 6-21的至少一种氨基酸序列组成。
9.权利要求8的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述人接纳体构架由选自SEQ ID NO: 9、10、11、12、15、16、17和21的氨基酸序列组成。
10.权利要求8或9的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述人接纳体构架包含至少一个氨基酸取代。
11.权利要求10的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述氨基酸取代在选自下述的关键残基处：毗邻CDR的残基、糖基化位点残基、能够与人TNF-α相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、游标区中的残基、在Chothia-定义的可变重链CDR1和Kabat-定义的第一重链构架之间重叠的区域中的残基。
12.权利要求11的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述关键残基选自H1、H12、H24、H27、H29、H37、H48、H49、H67、H71、H73、H76、H78、L13、L43、L58、L70和L80。
13.权利要求12的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述VH氨基酸取代选自Q1E、I12V、A24V、G27F、I29L、V29F、F29L、I37V、I48L、V48L、S49G、V67L、F67L、V71K、R71K、T73N、N76S、L78I和F78I。
14.权利要求12的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述VL氨基酸取代选自V13L、A43S、I58V、E70D和S80P。
15.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白包含具有以下氨基酸序列的两个可变结构域：SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、或SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。
16.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段抑制TNF-α的生物学功能。
17.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段中和TNF-α。
18.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段减弱TNF-α结合其受体的能力。
19.权利要求18的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段减弱原-人TNF-α、成熟-人TNF-α或截短的-人TNF-α结合其受体的能力。
20.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段降低以下一种或多种：TNF-依赖的细胞因子产生、TNF-依赖的细胞杀伤、TNF-依赖的炎症、TNF-依赖的骨质侵蚀和TNF-依赖的软骨损伤。
21.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结
6 -1 -1
合片段具有至少 10M s 的结合速率常数(Kon)，所述速率常数通过表面等离振子共振来测量。
22.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结-3 -1
合片段具有最多10 s 的解离速率常数(Koff)，所述速率常数通过表面等离振子共振来测量。
-9
23.权利要求1的人源化结合蛋白，其中所述结合蛋白具有最多10 M的解离常数
(KD)，所述解离常数通过表面等离振子共振来测量。
24.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG4恒定结构域、人IgA恒定结构域或人IgE恒定结构域的重链免疫球蛋白恒定结构域。
25.权利要求24的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述重链免疫球蛋白恒定结构域为人IgG1恒定结构域。
26.权利要求1或24的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段进一步包含轻链免疫球蛋白恒定结构域，所述轻链免疫球蛋白恒定结构域由人Ig κ恒定结构域或人Ig λ恒定结构域组成。
27.权利要求25的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述人IgG1恒定结构域由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
28.权利要求26的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述人Ig κ恒定结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成或所述人Ig λ恒定结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成。
29.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其进一步包含：
免疫球蛋白（Ig）恒定重区，其由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 3的氨基酸序列组成；
Ig恒定轻区，其由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 5的氨基酸序列组成；
Ig可变重区，其由选自SEQ ID NO: 24、25、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列组成；
和
Ig可变轻区，其由选自SEQ ID NO: 26、27、34、35和36的氨基酸序列组成。
30.权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段选自免疫球蛋白分子、Fv、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR-移植的抗体、双抗体、人源化抗体、多特异抗体、Fab、双重特异抗体、Fab’片段、TM
双特异抗体、F(ab’)2片段，DVD-Ig 、包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段和单链抗体。
31.包含权利要求1的结合蛋白或其抗原结合片段的结晶的结合蛋白，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段为晶体形式。
32.权利要求31的结晶的结合蛋白，其中所述晶体为无载体的药用控制释放晶体。
33.权利要求31的结晶的结合蛋白，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段比所述结合蛋白或其抗原结合片段的可溶性对应物具有更长的体内半衰期。
34.释放TNF-α结合蛋白的组合物，其包含：(a)制剂，其中所述制剂包含权利要求1或31的结合蛋白或其抗原结合片段和成分；和(b)至少一种聚合载体。
35.权利要求34的组合物，其中所述成分选自：白蛋白、蔗糖、海藻糖、拉克替醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
36.权利要求34的组合物，其中所述聚合载体为选自以下的聚合物：聚丙烯酸、聚腈基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酸酐、聚缩酚酸肽、聚酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二醇、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酸酐-烷基乙烯醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化的多糖及其共混物和共聚物。
37.包含权利要求1的人源化结合蛋白或其抗原结合片段和接头或免疫球蛋白恒定结构域的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）结合蛋白构建体。
38.权利要求37的TNF-α结合蛋白构建体，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段是糖基化的。
39.权利要求37的TNF-α结合蛋白构建体，其中所述结合蛋白构建体为结晶的
TNF-α结合蛋白构建体。
40.权利要求39的TNF-α结合蛋白构建体，其中所述结晶的TNF-α结合蛋白构建体为无载体的药用控制释放结晶的TNF-α结合蛋白构建体。
41.权利要求37的TNF-α结合蛋白构建体，其中所述结合蛋白构建体比所述结合蛋白构建体的可溶性对应物具有更长的体内半衰期。
42.肿瘤坏死因子-α（TNF-α）结合蛋白缀合物，其包含权利要求37的TNF-α结合蛋白构建体，以及免疫粘附分子、成像剂、治疗剂或细胞毒素剂。
43.权利要求42的TNF-α结合蛋白缀合物，其中所述成像剂为放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。
3 14 35 90
44.权利要求43的TNF-α结合蛋白缀合物，其中所述放射性标记选自 H、C、S、Y、
99 111 125 131 177 166 153
Tc、In、 I、I、 Lu、Ho和 Sm。
45.权利要求42的TNF-α结合蛋白缀合物，其中所述治疗剂或细胞毒性剂为抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类抗生素、毒素或细胞凋亡剂。
46.分离的核酸，其编码由权利要求1的氨基酸序列组成的结合蛋白。
47.分离的核酸，其编码由权利要求37的氨基酸序列组成的TNF-α结合蛋白构建体。
48.载体，其包含权利要求46或47的分离的核酸。
49.权利要求48的载体，其中所述载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。
50.宿主细胞，其包含权利要求48的载体。
51.权利要求50的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞。
52.权利要求50的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真核细胞。
53.权利要求52的宿主细胞，其中所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞。
54.权利要求52的宿主细胞，其中所述真核细胞选自CHO细胞、COS细胞和酿酒酵母细胞。
55.产生结合TNF-α的蛋白质的方法，所述方法包括在足以产生结合TNF-α的结合蛋白的条件下在培养基中培养权利要求50的宿主细胞的步骤。
56.用权利要求55的方法产生的TNF-α结合蛋白。
57.药物组合物，其包含权利要求1的结合蛋白或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
58.权利要求57的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体充当辅助剂。
59.权利要求58的药物组合物，其中所述辅助剂为透明质酸酶。
60.权利要求57的药物组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种另外的试剂，所述另外的试剂用于治疗其中TNF-α活性有害的病症。
61.权利要求60的药物组合物，其中所述另外的试剂为：治疗剂、成像剂、细胞毒素剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、共刺激分子阻滞剂、粘附分子阻滞剂、抗-细胞因子抗体或其功能性片段、甲氨蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素、FK506、可检测的标记、可检测的报告物、TNF-α拮抗剂、抗风湿药；肌肉松弛药、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉药、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、红细胞生成素、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药品、抗抑郁剂、抗紧张剂、刺激剂、哮喘药剂、β-激动剂、吸入式类固醇、口服类固醇、肾上腺素或其类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
62.权利要求1的结合蛋白在制备用于治疗罹患其中TNF-α活性有害的病症的哺乳动物的药物中的用途。
63.权利要求1的结合蛋白在制备用于降低罹患其中TNF-α活性有害的病症的人受试者中的人TNF-α活性的药物中的用途。
64.权利要求1的结合蛋白在制备用于治疗罹患其中TNF-α有害的病症的患者的药物中的用途，其中所述药物在给予第二种剂之前、同时或之后给予，其中所述第二种剂为：能够结合人IL-12的抗体或其片段；PGE2；LPA；NGF；CGRP；SubP；RAGE；组胺；组胺受体阻滞剂；缓激肽；IL-1α；IL-1β；VEGF；PLGF；甲氨蝶呤；皮质类固醇、糖皮质激素受体调节剂；
环孢菌素、雷帕霉素、FK506或非甾体类抗炎药。
65.权利要求1的结合蛋白在制备用于通过免疫测定在受试样品中测定TNF-α或其片段的存在情况的试剂盒中的用途，其中所述免疫测定包含让所述受试样品与权利要求1的至少一种结合蛋白或其片段及至少一种可检测的标记接触。
66.权利要求65的用途，其中所述用途进一步包括下列步骤：
(i)让所述受试样品与至少一种结合蛋白或其片段接触，其中所述结合蛋白与TNF-α或其片段上的表位结合，以形成第一复合物；
(ii)让所述复合物与至少一种可检测的标记接触，其中所述可检测的标记与所述第一复合物上或TNF-α或其片段上的表位结合，以形成第二复合物，所述表位未与所述结合蛋白或其片段结合；和
(iii)基于由第二复合物中的可检测的标记所产生的信号来检测所述受试样品中
TNF-α或其片段的存在情况，其中所述TNF-α或其片段的存在情况与由所述可检测的标记所产生的信号直接相关。
67.权利要求65的用途，其中所述用途进一步包括下列步骤：
(i)让所述受试样品与至少一种结合蛋白或其片段接触，其中所述结合蛋白或其片段与TNF-α或其片段上的表位结合，以形成第一复合物；
(ii)让所述复合物与至少一种可检测的标记接触，其中所述可检测的标记与TNF-α或其片段竞争性结合所述结合蛋白或其片段，以形成第二复合物；和
(iii)基于由所述第二复合物中的可检测的标记所产生的信号来检测所述受试样品中TNF-α或其片段的存在情况，其中所述TNF-α或其片段的存在情况与由可检测的标记所产生的信号间接相关。
68.权利要求65的用途，其中所述用途任选进一步包括诊断、预测或评估对所述患者的治疗性/预防性治疗的效率。
TNF-α结合蛋白
[0001] 相关申请的交叉引用
[0004] 发明背景
[0005] 本领域需要能够结合TNF-α (亦称作肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子-阿尔法、肿瘤坏死因子-α、TNF和恶液质素)的改良抗体。在实施方案中，所述抗体能够中和TNF-α。本发明提供结合蛋白的新家族、移植CDR的抗体、人源化抗体及其片段，其能够结合TNF-α、以高亲和力结合TNF-α和结合并中和TNF-α。
[0006] 发明简述
[0007] 本发明涉及TNF-α结合蛋白，尤其是抗-TNF-α抗体或其结合TNF-α的抗原-结合部分。在实施方案中，能够结合TNF-α的抗体或其抗原结合部分，包含选自SEQ ID NO:22-36的氨基酸序列。
[0008] 在一个方面，本发明提供人源化结合蛋白，其包含能够结合人TNF-α的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含至少一个CDR，所述CDR包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:22的残基31-35、SEQ ID NO:22的残基50-65、SEQ ID NO:22的残基98-106、SEQ ID NO:23的残基24-34、SEQ ID NO:23的残基50-56和SEQ ID NO:23的残基89-97，其中结合蛋白包含人接纳体构架。在实施方案中，结合蛋白包含至少3个CDR，例如，包含选自以下的可变结构域CDR集合：(a) SEQ ID NO:22的残基31-35、SEQ ID NO:22的残基50-65和SEQ ID NO:22的残基98-106；和(b) SEQ ID NO:23的残基24-34、SEQ ID NO:23的残基50-56和SEQ ID NO:23的残基89-97。在特定实施方案中，抗原结合结构域包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含SEQ ID NO:22的残基31-35、SEQ ID NO:22的残基50-65、SEQ ID NO:22的残基98-106、SEQ ID NO:23的残基24-34、SEQ ID NO:23的残基50-56和SEQ ID NO:23的残基89-97。
[0009] 在实施方案中，抗原结合结构域包含VH区，例如，包含选自SEQ ID NO: 24、25、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗原结合结构域包含VL区，例如，包含选自SEQ ID NO: 26、27、34、35和36的氨基酸序列。在特定实施方案中，抗原结合结构域包含VH区和VL区，例如，其中VH区包含选自SEQ ID NO: 24、25、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列，VL区包含选自SEQ ID NO: 26、27、34、35和36的氨基酸序列。
[0010] 在实施方案中，人接纳体构架包含至少一种选自SEQ ID NO: 6-21的氨基酸序列。在特定实施方案中，人接纳体构架包含选自SEQ ID NO: 9、10、11、12、15、16、17和21的氨基酸序列。在另一实施方案中，人接纳体构架包含至少一个构架区氨基酸取代，其中所述构架的氨基酸序列与人接纳体构架的序列至少65%相同，并包含至少70个与人接纳体构架相同的氨基酸残基。在另一实施方案中，人接纳体构架包含至少一个在关键残基上的构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：毗邻CDR的残基、糖基化位点残基、稀有残基、能够与人TNF-α相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、规范残基(canonical residue)、重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、游标区(Vernier zone)中的残基和在Chothia-定义的可变重链CDR1及Kabat-定义的第一重链构架之间重叠的区域中的残基。在实施方案中，关键残基选自：H1、H12、H24、H27、H29、H37、H48、H49、H67、H71、H73、H76、H78、L13、L43、L58、L70和L80。在实施方案中，VH突变选自：Q1E、I12V、A24V、G27F、I29L、V29F F29L I37V、I48L、V48L、S49G、V67L、F67L、V71K、R71K、T73N、N76S、L78I和F78I。在另一实施方案中，VL突变选自V13L、A43S、I58V、E70D和S80P。在实施方案中，结合蛋白包含两个可变结构域，其中所述两个可变结构域具有选自SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
[0011] 在实施方案中，结合蛋白结合TNF-α。在另一实施方案中，结合蛋白调节TNF-α的生物学功能。在另一实施方案中，结合蛋白中和TNF-α。在又一实施方案中，结合蛋白减弱TNF-α结合其受体的能力，例如，结合蛋白减弱原-人TNF-α、成熟-人TNF-α或截短的-人TNF-α结合其受体的能力。在又一实施方案中，结合蛋白降低TNF-α的选自以下的一种或多种生物学活性：TNF-依赖的细胞因子产生、TNF-依赖的细胞杀伤、TNF-依赖的炎症、TNF-依赖的骨质侵蚀和TNF-依赖的软骨损伤。
[0012] 在实施方案中，结合蛋白具有选自以下的结合速率常数(on rate constant,2 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1
Kon)：至少约10M s 、至少约10M s 、至少约10M s 、至少约10M s 和至少约10 M s ，该速率常数可通过表面等离振子共振来测量。在另一实施方案中，结合蛋白具有选自以下-3 -1 -4 -1 -5 -1
的解离速率常数(off rate constant, Koff)：最多约10 s 、最多约10 s 、最多约10 s-6 -1
和最多约10 s ，该速率常数可通过表面等离振子共振来测量。在又一实施方案中，结合蛋-7 -8 -9 -10
白具有选自以下的解离常数(KD)：最多约10 M、最多约10 M、最多约10 M、最多约10 -11 -12 -13
M、最多约10 M、最多约10 M和最多10 M。
Kon)：至少约10M s 、至少约10M s 、至少约10M s 、至少约10M s 和至少约10 M s ，该速率常数可通过表面等离振子共振来测量。在另一实施方案中，结合蛋白具有选自以下-3 -1 -4 -1 -5 -1
的解离速率常数(off rate constant, Koff)：最多约10 s 、最多约10 s 、最多约10 s-6 -1
和最多约10 s ，该速率常数可通过表面等离振子共振来测量。在又一实施方案中，结合蛋-7 -8 -9 -10
白具有选自以下的解离常数(KD)：最多约10 M、最多约10 M、最多约10 M、最多约10 -11 -12 -13
M、最多约10 M、最多约10 M和最多10 M。
[0013] 在实施方案中，结合蛋白包含选自以下的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG4恒定结构域、人IgA恒定结构域和人IgE恒定结构域。在特定实施方案中，重链免疫球蛋白恒定区结构域为人IgG1恒定结构域。在另一实施方案中，结合蛋白进一步包含选自以下的轻链免疫球蛋白恒定结构域：人Ig κ恒定结构域和人Ig λ恒定结构域。例如，在实施方案中，结合结构域包含免疫球蛋白恒定结构域，该恒定结构域具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在特定实施方案中，人IgG1恒定结构域包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在另一实施方案中，轻链免疫球蛋白恒定区结构域为包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的人Ig κ恒定结构域。在又一实施方案中，轻链免疫球蛋白恒定区结构域为包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的人Ig λ恒定结构域。
[0014] 在特定实施方案中，本发明提供能够结合人TNF-α的结合蛋白，该结合蛋白包含：具有选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的Ig恒定重区；具有选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的Ig恒定轻区；具有选自SEQ ID NO: 24、25、28、29、30、31、32和33的氨基酸序列的Ig可变重区；和具有选自SEQ ID NO: 26、27、34、35和
36的氨基酸序列的Ig可变轻区。在特定实施方案中，本发明的结合蛋白选自：免疫球蛋白分子、Fv、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR-移植的抗体、双抗体、人源化抗体、多特异抗体、Fab、双重特异抗体、Fab’片段、双特异抗体、F(ab’)2片TM
段，DVD-Ig 、包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段、分离的互补决定区(CDR)和单链抗体。
36的氨基酸序列的Ig可变轻区。在特定实施方案中，本发明的结合蛋白选自：免疫球蛋白分子、Fv、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR-移植的抗体、双抗体、人源化抗体、多特异抗体、Fab、双重特异抗体、Fab’片段、双特异抗体、F(ab’)2片TM
段，DVD-Ig 、包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段、分离的互补决定区(CDR)和单链抗体。
[0015] 在另一方面，本发明提供包含本发明的结合蛋白的结晶的结合蛋白，其中结合蛋白为晶体形式。在实施方案中，晶体为无载体的药用控制释放晶体。在另一实施方案中，所述结合蛋白比结合蛋白的可溶性对应物具有更长的体内半衰期。在另一实施方案中，结合蛋白保留生物学活性。
[0016] 在另一方面，本发明提供释放TNF-α结合蛋白的组合物，该组合物包含：(a)制剂，其中所述制剂包含本发明的结晶的结合蛋白和成分；和(b)至少一种聚合载体。在实施方案中，聚合载体为选自以下的一种或多种的聚合物：聚丙烯酸、聚腈基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酸酐、聚缩酚酸肽、聚酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二醇、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酸酐-烷基乙烯醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycan)、硫酸化的多糖；及其共混物和共聚物。在另一实施方案中，所述成分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
[0017] 在另一方面，本发明提供TNF-α结合蛋白构建体，所述构建体包含本发明的TNF-α结合蛋白和选自接头和免疫球蛋白恒定结构域的多肽。在实施方案中，结合蛋白具有人糖基化方式。在另一实施方案中，结合蛋白构建体为结晶的TNF-α结合蛋白构建体。在又一实施方案中，结晶的TNF-α结合蛋白构建体为无载体的药用控制释放结晶的TNF-α结合蛋白构建体。在特定实施方案中，TNF-α结合蛋白构建体比结合蛋白构建体的可溶性对应物具有更长的体内半衰期。在另一实施方案中，结合蛋白构建体保留生物学活性。
[0018] 在另一方面，本发明提供TNF-α结合蛋白缀合物，所述缀合物包含本发明的TNF-α结合蛋白构建体和进一步包含选自以下的剂(agent)：免疫粘附分子、成像剂、治疗剂和细胞毒素剂。在实施方案中，所述剂为选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素的成像剂。在实施方案中，成像剂为选自以下的放射性标记：3 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153
H、C、S、Y、Tc、 In、I、 I、Lu、 Ho和 Sm。在另一实施方案中，所述剂为选自以下的治疗剂或细胞毒性剂：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类抗生素、毒素和细胞凋亡剂。
H、C、S、Y、Tc、 In、I、 I、Lu、 Ho和 Sm。在另一实施方案中，所述剂为选自以下的治疗剂或细胞毒性剂：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类抗生素、毒素和细胞凋亡剂。
[0019] 在另一方面，本发明提供编码本发明结合蛋白的分离的核酸。在另一方面，本发明提供包含本发明分离的核酸的载体。在实施方案中，载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。在实施方案中，本发明提供包含本发明载体的宿主细胞。在另一实施方案中，宿主细胞为原核细胞，例如，大肠杆菌(E. coli)。在另一实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如，原生生物细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞。在另一实施方案中，真核细胞为选自哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞的动物细胞。例如，宿主细胞为CHO细胞、COS细胞、酵母细胞例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或昆虫Sf9细胞。
[0020] 在另一方面，本发明提供产生结合TNF-α的蛋白质的方法以及通过所述方法产生的TNF-α结合蛋白，所述方法包括在足以产生结合TNF-α的结合蛋白的条件下在培养基中培养本发明宿主细胞的步骤。
[0021] 在另一方面，本发明提供包含本发明的结合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在实施方案中，药学上可接受的载体充当对增加结合蛋白的吸收和分散有用的辅助剂。在另一实施方案中，辅助剂为透明质酸酶。在另一实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种用于治疗其中TNF-α活性有害的病症的另外的治疗剂，例如，治疗剂、成像剂、细胞毒素剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、共刺激分子阻滞剂、粘附分子阻滞剂、抗-细胞因子抗体或其功能性片段、甲氨蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素(rapamycin)、FK506、可检测的标记、可检测的报告物、TNF-α拮抗剂、抗风湿药；肌肉松弛药、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉药、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、红细胞生成素、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药品、抗抑郁剂、抗精神病药、刺激剂、哮喘药、β-激动剂、吸入式类固醇、口服类固醇、肾上腺素或其类似物、细胞因子和细胞因子拮抗剂。
[0022] 在另一方面，本发明提供治疗哺乳动物的方法，所述方法包括将有效量的本发明的药物组合物给予哺乳动物的步骤。在另一实施方案中，本发明提供用于降低人TNF-α活性的方法，所述方法包括让人TNF-α与本发明的结合蛋白接触以降低人TNF-α活性的步骤。在另一实施方案中，本发明提供用于降低罹患其中TNF-α活性有害的病症的人受试者的人TNF-α活性的方法，该方法包括将本发明的结合蛋白给予人受试者以降低人受试者的人TNF-α活性的步骤。在另一实施方案中，本发明提供用于治疗具有其中TNF-α活性有害的疾病或病症的受试者的方法，该方法包括将本发明的结合蛋白给予受试者以实现治疗的步骤。
[0023] 在另一实施方案中，本发明提供治疗罹患其中TNF-α有害的病症的患者的方法，所述方法包括在给予第二种剂之前、同时或之后给予本发明的结合蛋白的步骤，其中第二种剂选自：能够结合人IL-12的抗体或其片段；PGE2；LPA；NGF；CGRP；SubP；RAGE；组胺；组胺受体阻滞剂；缓激肽；IL-1α；IL-1β；VEGF；PLGF；甲氨蝶呤；皮质类固醇、糖皮质激素受体调节剂；环孢菌素、雷帕霉素、FK506、非甾体类抗炎药和硬骨素(sclerostin)。在实施方案中，所述病症选自：呼吸病症；哮喘；变应性哮喘和非变应性哮喘；因感染所致的哮喘；因感染呼吸道合胞体病毒(RSV)所致的哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及气道炎症的病况；嗜酸性粒细胞增多症；纤维化和过多粘液产生；囊性纤维化；肺纤维化；特应性病症；特应性皮炎；荨麻疹；湿疹；变应性鼻炎；变应性肠胃炎；皮肤的炎症和/或自身免疫病况；胃肠器官的炎症和/或自身免疫病况；炎性肠病(IBD)；溃疡性结肠炎；克罗恩氏(Crohn's)病；肝脏的炎症和/或自身免疫病况；肝硬化；肝纤维化；乙型和/或丙型肝炎病毒引起的肝纤维化；硬皮病；肿瘤或癌症；肝细胞癌；胶质母细胞瘤；淋巴瘤；何杰金氏(Hodgkin's)淋巴瘤；病毒感染；细菌感染；寄生虫感染；HTLV-1感染；1型保护性免疫应答的表达抑制和疫苗接种中1型保护性免疫应答的表达抑制。在实施方案中，所述病症选自：类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、银屑病、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森病、阿尔茨海默病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter氏病、银屑病性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷疾病综合征、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjögren氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型银屑病、2型银屑病、特发性白细胞减少(leucopaenia)、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sjörgren氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性(goitrous)自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性(phacogenic)葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积(choleostasis)、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、以及癌症例如肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房(aerial)异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、角质细胞(horn cell)变性、抗CD3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆(Dementia pugilistica)、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学病况、多尿症(diabetes)、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性噬血细胞性(hemophagocytic)淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallervorden-Spatz病、Hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、A型流感、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Menzel Dejerine-Thomas Shy-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、OKT3®治疗、睾丸炎/附睾炎(epidydimitis)、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的类肿瘤性综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上(supranucleo)麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynaud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、休克、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬血细胞性综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合征(clinically isolated syndrome)(CIS)、结膜炎、儿童期发病性精神病(childhood onset psychiatric disorder)、慢性阻塞性肺病(COPD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病、椎间盘突出(disk herniation)、盘脱垂(disk prolapse)、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barré综合征(GBS)、枯草热、Hughes综合征、特发性帕金森病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎(keratojunctivitis sicca)、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯(Langerhan’s)细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌痛(PMR)、泵后综合征(post-pump syndrome)、原发性帕金森综合征、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、Sneddon-Wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合征(SJS)、全身性炎症应答综合征、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体相关的周期性综合征)，I型变态反应，II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)、湿黄斑变性、伤口愈合、耶尔森氏菌(yersinia)和沙门氏菌(salmonella)相关的关节病。
[0024] 在另一实施方案中，本发明提供治疗罹患其中TNF-α有害的病症的患者的方法，该方法包括在给予第二种剂之前、同时或之后给予本发明的结合蛋白的步骤，其中所述第二种剂选自：吸入式类固醇；β-激动剂；短效或长效β-激动剂；白三烯或白三烯受体的拮抗剂；ADVAIR；IgE抑制剂；抗-IgE抗体；XOLAIR；磷酸二酯酶抑制剂；PDE4抑制剂；黄嘌呤；抗胆碱药；肥大细胞-稳定剂；色甘酸；IL-4抑制剂；IL-5抑制剂；嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)/CCR3抑制剂；包括H1、H2、H3和H4在内的组胺或其受体的拮抗剂；前列腺素D或其受体DP1和CRTH2的拮抗剂；TNF拮抗剂；TNF受体的可溶性片段；ENBREL；TNF酶拮抗剂；TNF转换酶(TACE)抑制剂；毒蕈碱性受体拮抗剂；TGF-β拮抗剂；干扰素γ；吡非尼酮(perfenidone)；化疗剂，甲氨蝶呤；来氟米特(leflunomide)；西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素)或其类似物、CCI-779；COX2或cPLA2抑制剂；NSAID；免疫调节剂；p38抑制剂；TPL-2、MK-2和NFkB抑制剂；布地奈德(budenoside)；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素；柳氮磺胺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉秦(mesalamine)；奥沙拉秦(olsalazine)；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β抗体；抗-IL-6抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF的抗体或激动剂；CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体；
FK506；雷帕霉素；麦考酚酸吗乙酯；布洛芬(ibuprofen)；泼尼松龙；磷酸二酯酶抑制剂；
腺苷激动剂；抗血栓剂；补体抑制剂；肾上腺素能药物；IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂；IL-1β转换酶抑制剂；TNF-α转换酶抑制剂；T-细胞信号转导抑制剂；金属蛋白酶抑制剂；6-巯基嘌呤；血管紧张素转换酶抑制剂；可溶性细胞因子受体；可溶性p55 TNF受体；可溶性p75 TNF受体；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；抗炎细胞因子；IL-4；IL-10；IL-11；
和TGF-β。
FK506；雷帕霉素；麦考酚酸吗乙酯；布洛芬(ibuprofen)；泼尼松龙；磷酸二酯酶抑制剂；
腺苷激动剂；抗血栓剂；补体抑制剂；肾上腺素能药物；IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂；IL-1β转换酶抑制剂；TNF-α转换酶抑制剂；T-细胞信号转导抑制剂；金属蛋白酶抑制剂；6-巯基嘌呤；血管紧张素转换酶抑制剂；可溶性细胞因子受体；可溶性p55 TNF受体；可溶性p75 TNF受体；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；抗炎细胞因子；IL-4；IL-10；IL-11；
和TGF-β。
[0025] 在实施方案中，通过选自以下的至少一种方式来将本发明的结合蛋白给予受试者：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜的、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内和经皮。
[0026] 发明详述
[0027] 本发明涉及TNF-α结合蛋白，尤其是抗-TNF-α抗体或其结合TNF-α (即肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子-阿尔法、肿瘤坏死因子-α、TNF和恶病质素)的抗原-结合部分。本发明的不同方面涉及抗体和抗体片段及其药物组合物，以及用于制备所述抗体和片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明亦包括使用本发明抗体检测人TNF-α、在体外或体内抑制人TNF-α和调控基因表达或TNF-α相关功能的方法。亦阐述了包含本发明抗体的组合物以及使用所述抗体的方法。
[0028] 除非本文另外定义，否则与本发明一起使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的意思。术语的意思和范围应该很清楚，然而，在有任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优先于任何词典或外部的定义。而且，除非上下文需要，否则单数的术语应包括复数，复数的术语应包括单数。在本申请中，除非另外指出，否则使用"或"意为"和/或"。此外，使用术语"包括"以及该术语的其它形式例如"包含"和"包涵"，是无限制的。同样，除非另外明确指出，否则术语例如"元件"或"组分"包括：包含一个单位的元件或组分和包含多于一个亚单元的元件或组分。
[0029] 连同本文描述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质和核酸化学和杂交使用的术语及其技术，通常为本领域所熟知和常用的术语和技术。除非另外指出，否则通常根据本领域熟知的常规方法并如本说明书通篇所引用和论述的各种一般和更具体的参考文献中所述，来实施本发明的方法和技术。如本领域通常所完成或如本文所述，根据厂家说明书来实施酶促反应和纯化技术。与本文所述的分析化学、有机合成化学和医学和药物化学一起使用的术语及实验程序和技术，为本领域所熟知并通常使用的那些。将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送及治疗患者。
[0030] 将精选的术语定义如下，本发明可更加容易了解。
[0031] 术语"多肽”指氨基酸的任何多聚链。术语"肽"和“蛋白质”可与术语多肽互换使用，亦指氨基酸的多聚链。术语"多肽"包括天然和人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可为单体或多聚体。
[0032] 术语"分离的蛋白质"或"分离的多肽"为这样的蛋白质或多肽：由于其衍生起源或来源而不与在其天然状态中与其相伴的天然缔合组分缔合；基本上没有来自同一物种的其它蛋白质；由来自不同物种的细胞来表达；或不是天然存在的。因此，化学合成的或在不同于其天然产生的细胞的细胞系统中合成的多肽，将是与其天然缔合组分"分离的"。通过使用本领域熟知的蛋白纯化技术分离亦可使蛋白质基本上没有天然缔合组分。
[0033] 术语“回收”指通过分离(例如使用本领域熟知的蛋白纯化技术)使化学物质例如多肽基本上没有天然缔合组分的过程。
[0034] 术语“人TNF-α” (本文缩写为hTNF-α)，包括三聚体细胞因子蛋白质。该术语包括包含三个17.5 kD TNF-α蛋白质的同源三聚体蛋白质。同源三聚体蛋白质称作"TNF-α蛋白"。术语人“TNF-α”意欲包括可通过标准重组表达方法来制备的重组人TNF-α (rhTNF-α)。表1显示了人TNF-α的序列。
[0035] 表1：人TNFα的序列
[0036]
[0037] “生物学活性”指细胞因子的所有固有生物学性质。TNF-α的生物学性质包括但不限于结合TNF受体。
[0038] 关于抗体、蛋白质或多肽与第二种化学物质的相互作用，术语"特异性结合"或"特异性地结合"意为该相互作用依赖于化学物质的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在情况；例如，抗体识别并结合特异的蛋白质结构而不是广泛的蛋白质。如果抗体对表位"A"是特异的，则在含有标记的"A"和所述抗体的反应中，含有表位A (或游离的未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
[0039] 术语"抗体”概括地指任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原结合部分，其包含四条多肽链即两条重(H)链和两条轻(L)链或其任何功能性片段、突变体、变异体或衍生物，它们保留了Ig分子的必要的表位结合特征。所述突变体、变异体或衍生的抗体形式为本领域所知。其非限制性实施方案论述如下。
[0040] 在全长抗体中，每一重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为：超可变区域，称作互补决定区(CDR)，其间散布有更加保守的区域，称作构架区(FR)。每一VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基端到羧基端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG 1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
[0041] 术语抗体的"抗原-结合部分"或“抗原-结合区”(或仅“抗体部分”)，指保留与抗原(例如hTNF-α)特异性结合能力的一种或多种抗体的片段。可通过全长抗体的片段来实施抗体的抗原-结合功能。所述抗体实施方案亦可具有双特异性、双重特异性或多特异性形式；与两种或多种不同抗原特异地结合。包含在术语抗体的"抗原-结合部分"中的结合片段的实例包括：(i) Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab')2片段，其为在铰链区包含通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；
(v) dAb片段(Ward等(1989) Nature 341:544-546；Winter等，PCT公开号WO 90/05144 A1)，其包含单一可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但使用重组方法，通过合成的接头可将它们结合在一起使其作为单链蛋白来制备，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv (scFv)；参见例如：Bird等(1988) Science 242:423-426；和Huston等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。所述单链抗体亦意欲包括在术语抗体的"抗原-结合部分"内。单链抗体的其它形式，例如双体亦包括在内。双体为二价双特异抗体，其中VH和VL结构域表达在单条多肽链上，但是使用接头，所述接头太短以致不允许同一条链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如：Holliger等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等(1994) Structure 2:1121-1123)。所述抗体结合部分为本领域所知(Kontermann和Dubel编辑的Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 第790页(ISBN
3-540-41354-5)。
(v) dAb片段(Ward等(1989) Nature 341:544-546；Winter等，PCT公开号WO 90/05144 A1)，其包含单一可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但使用重组方法，通过合成的接头可将它们结合在一起使其作为单链蛋白来制备，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv (scFv)；参见例如：Bird等(1988) Science 242:423-426；和Huston等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。所述单链抗体亦意欲包括在术语抗体的"抗原-结合部分"内。单链抗体的其它形式，例如双体亦包括在内。双体为二价双特异抗体，其中VH和VL结构域表达在单条多肽链上，但是使用接头，所述接头太短以致不允许同一条链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如：Holliger等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等(1994) Structure 2:1121-1123)。所述抗体结合部分为本领域所知(Kontermann和Dubel编辑的Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 第790页(ISBN
3-540-41354-5)。
[0042] 术语“抗体构建体”指包含连接到接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域上的一个或多个本发明抗原-结合部分的多肽。接头多肽包含通过肽键连接的两个或多个氨基酸残基，用于连接一个或多个抗原结合部分。所述接头多肽为本领域熟知(参见例如：Holliger等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等(1994) Structure2:1121-1123)。免疫球蛋白恒定结构域指重链或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域的氨基酸序列为本领域所知，见表2所示。
[0043] 表2：人IgG重链恒定结构域和轻链恒定结构域的序列
[0044]
[0045] 抗体或其抗原-结合部分可为较大免疫粘附分子的部分，其由抗体或抗体部分与一种或多种其它的蛋白质或肽通过共价或非共价缔合形成。所述免疫粘附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区来制造四聚体的scFv分子(Kipriyanov等(1995) Hum. Antibod. Hybridomas 6:93-101)，和使用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端多聚组氨酸标签来制造二价的和生物素化的scFv分子(Kipriyanov等(1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)。可使用常规技术从整个抗体来制备抗体部分，例如Fab和F(ab')2片段，所述常规技术例如分别用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶消化整个抗体。此外，可使用本文所述的标准重组DNA技术来获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。
[0046] "分离的抗体"指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体或其抗原-结合部分(例如特异地结合hTNF-α的分离的抗体为基本上不含特异地结合非hTNF-α的抗原的抗体)。然而，特异地结合hTNF-α的分离的抗体可与其它抗原例如来自其它物种的TNF-α分子有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。
[0047] 术语"人抗体"包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体或其抗原-结合部分。本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或位点特异性诱变或体内的体细胞突变而引入的突变)，其例如在CDR中，尤其是在CDR3中。然而，术语"人抗体"并非意欲包括其中源自另一哺乳动物物种种系例如小鼠的CDR序列被移植到人构架序列的抗体。
[0048] 术语"重组人抗体"意欲包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体或其抗原-结合部分，例如，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体而表达的抗体；从重组的组合人抗体文库中分离的抗体(Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol.15:62-70；Azzazy 和 Highsmith (2002) Clin. Biochem. 35:425-445；Gavilondo 和Larrick (2000) BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom 和 Chames (2000) Immunol. Today 21:371-378)；从转入人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如Taylor等(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295；Kellermann和Green (2002) Current Opin. Biotechnol. 13:593-597；Little 等 (2000) Immunol. Today
21:364-370)；或通过任何其它方式(其涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列)制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，将所述重组人抗体进行体外诱变(或当使用转入人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管源自人种系VH和VL序列并与其相关但可能天然上不存在于体内人抗体种系的谱系(repertoire)中的序列。
21:364-370)；或通过任何其它方式(其涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列)制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，将所述重组人抗体进行体外诱变(或当使用转入人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管源自人种系VH和VL序列并与其相关但可能天然上不存在于体内人抗体种系的谱系(repertoire)中的序列。
[0049] 术语“嵌合抗体”指这样的抗体或其抗原-结合部分，其包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一物种的恒定区序列，例如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。
[0050] 术语“CDR-移植的抗体”指这样的抗体或其抗原-结合部分，其包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区序列被另一物种的CDR序列替代，例如具有其中一个或多个人CDR (例如CDR3)已被鼠的CDR序列替代的人重链和轻链可变区的抗体。
[0051] 术语“人源化抗体”指这样的抗体或其抗原-结合部分，其包含来自非-人物种(例如小鼠)的重链和轻链可变区序列，但其中已将至少部分VH和/或VL序列改变为更加“人样”，即与人种系的可变序列更加类似。一类人源化抗体为CDR-移植的抗体，其中将非-人CDR序列引入到人VH和VL构架中。
[0052] 术语"Kabat编号"、"Kabat定义"和"Kabat标记"在本文中可互换使用。本领域公认这些术语指抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中比其它氨基酸残基更加可变(即超变的)的氨基酸残基的编号系统(Kabat等(1971) Ann. NY Acad. Sci.190:382-391和Kabat等(1991)免疫学感兴趣的蛋白质序列 (Sequence of Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生及公共服务部，NIH公开号91-3242)。亦参见Kontermann和Dübel编辑的抗体工程 (Antibody Engineering) (Springer-Verlag, Berlin, 2001)一书中Martin所著的第31章“抗体可变区域的蛋白质序列和结构分析”("Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains")，具体为第432-433页。对于重链可变区，CDR1的超变区范围为氨基酸位点31至35，CDR2为氨基酸位点50至65，CDR3为氨基酸位点95至106。对于轻链可变区，CDR1的超变区范围为氨基酸位点24至34，CDR2为氨基酸位点50至56，CDR3为氨基酸位点89至97。
[0053] 术语"接纳体(acceptor)"和"接纳体抗体"指提供或编码一个或多个构架区中至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%氨基酸序列的抗体或核酸序列。在一些实施方案中，术语"接纳体"指提供或编码恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在又一实施方案中，术语"接纳体"指提供或编码一个或多个构架区和恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在具体实施方案中，术语"接纳体"指提供或编码一个或多个构架区中至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%氨基酸序列的人抗体氨基酸或核酸序列。依照该实施方案，接纳体可含有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少10个在人抗体的一个或多个具体位点中不存在的氨基酸残基。接纳体构架区和/或接纳体恒定区可为例如源自或获得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能性抗体(例如本领域熟知的抗体、开发中的抗体或可市购的抗体)。
[0054] 术语"CDR"指抗体可变序列中的互补决定区。重链和轻链的每一可变区有三个CDR，对每一个可变区，将其命名为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR集合”指存在于能够结合抗原的单个可变区中的三个CDR组群。根据不同系统这些CDR的确切范围的界定也不同。Kabat所述的系统(Kabat等，免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest) (国立卫生研究院, Bethesda, Md. (1987)和(1991))不仅提供适用于任何抗体可变区的明确的残基编号系统，而且提供界定三个CDR的精确的残基范围。这些CDR可称为Kabat CDR。Chothia及其同事(Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)和Chothia等(1989) Nature 342:877-883)发现Kabat CDR中某些亚-部分采用几乎相同的肽主链构象，尽管其在氨基酸序列水平上具有巨大的多样性。将这些亚-部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中"L"和"H"分别指明轻链和重链区域。可将这些区域称为Chothia CDR，其范围与Kabat CDR具有重叠。Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139和MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-745阐述了与Kabat CDR重叠的界定CDR的其它范围。还有其它的CDR范围界限可不严格遵从上述系统之一，但仍与Kabat CDR重叠，虽然根据预测或实验发现(即具体的残基或残基组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合)，可将它们缩短或延长。本文所使用的方法可利用根据任何这些系统界定的CDR，但特定的实施方案使用Kabat或Chothia界定的CDR。
[0055] 术语"规范的"残基指限定特定规范CDR结构的CDR或构架中的残基，所述特定规范CDR结构由Chothia等(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia 等(1992) J. Mol. Bio. 227:799-817定义。根据Chothia等，很多抗体的CDR的关键部分具有几乎相同的肽主链构象，尽管其在氨基酸序列水平上具有巨大的多样性。每一规范结构主要为形成环的氨基酸残基的邻接区段确定一组肽主链扭转角。
[0056] 术语"供体"和"供体抗体"指提供一个或多个CDR的抗体。在特定实施方案中，供体抗体为来自与由其获得或衍生构架区的抗体不同的物种的抗体。在人源化抗体情况下，术语"供体抗体"指提供一个或多个CDR的非-人抗体。
[0057] 术语"构架"或"构架序列"指减去CDR的可变区的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可由不同系统来确定，所以对构架序列的含义进行相应不同的解释。六个CDR (轻链的CDR-L1、-L2和-L3；和重链的CDR-H1、-H2和-H3)亦将轻链和重链上的构架区分成在每条链上的四个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，CDR3位于FR3和FR4之间。不将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如其它人提及的，构架区代表单个天然存在的免疫球蛋白链可变区内的组合FR's。FR代表4个亚区之一，且FRs代表构成构架区的4个亚区中的2个或更多。
[0058] 人重链和轻链接纳体序列为本领域所知。在本发明的一个实施方案中，人重链和轻链接纳体序列选自来自V-base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或来自IMGT®，IMGT®(http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/)中所列的序列。在本发明的另一个实施方案中，人重链和轻链接纳体序列选自表3和表4中所述的序列。
[0059] 表3：重链受体序列
[0060]
[0061] 表4：轻链受体序列
[0062]
[0063] 术语"种系抗体基因"或"基因片段"指由非淋巴细胞编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴细胞没有经历可导致特定免疫球蛋白的表达出现基因重排或突变的成熟过程(参见例如Shapiro等(2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3):183-200；Marchalonis等(2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30)。本发明的各种实施方案所提供的优势之一来源于这种认知：种系抗体基因比成熟的抗体基因更可能保留物种个体特有的必要氨基酸序列结构，因此当在该物种中治疗性使用时，其被认为来自外源的可能性较小。
[0064] 术语"关键的"残基指可变区中的某些残基，其对抗体特别是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更大的影响。关键残基包括但不限于以下的一种或多种：毗邻CDR的残基；潜在的糖基化位点(例如N-或O-糖基化位点)；稀有残基；能够与抗原相互作用的残基；能够与CDR相互作用的残基；规范残基；重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；游标区内的残基；和在可变重链CDR1的Chothia定义和第一个重链构架的Kabat定义之间重叠的区域中的残基。
[0065] 术语"人源化抗体"为这样的抗体或其变异体、衍生物、类似物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，并且其包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架(FR)区和基本上具有非-人抗体氨基酸序列的互补决定区(CDR)。在CDR背景下，术语"基本上"指与非-人抗体CDR氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体基本上包含所有至少一个和通常两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有的或基本上所有的CDR区对应非-人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区，所有的或基本上所有的构架区为人免疫球蛋白共有序列的构架区。在特定实施方案中，人源化抗体亦包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的Fc。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域二者。抗体亦可包括重链的CH1区、铰链区、CH2区、CH3区和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链可变结构域和/或人源化重链。
[0066] 人源化抗体可选自任何种类的免疫球蛋白，包括例如IgM、IgG、IgD、IgA和IgE；和任何同种型，包括但不限于例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可包含来自多于一个种类或同种型的序列，并且可使用本领域熟知的技术来选择特定的恒定结构域以优化所需的效应功能。
[0067] 人源化抗体的构架和CDR区不需要精确对应亲本序列，例如，可通过至少一个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失来诱变供体抗体CDR或共有构架，以使在此位点的CDR或构架残基不对应于供体抗体或不对应于共有序列。在特定实施方案中，所述突变不是广泛的。通常至少80%、至少85%、至少90%和至少 95%的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的残基。术语"共有构架"指共有免疫球蛋白序列中的构架区。术语"共有免疫球蛋白序列"指自相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker，从基因到克隆(From Genes to Clones) (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)。在免疫球蛋白家族中，共有序列的每一个位点被该家族中该位点最常出现的氨基酸占据。如果两种氨基酸出现的频率相等，则其任何一种都可包括在共有序列之中。
[0068] 术语"游标"区指可调节CDR结构和微调与抗原的配合(fit)的构架残基亚组，其如Foote和Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499所阐述。游标区残基形成作为CDR基础的层，并且可影响CDR的结构和抗体的亲和力。
[0069] 本说明书中使用术语"多价结合蛋白"来表示包含两个或多个抗原结合位点的结合蛋白。可将多价结合蛋白工程改造成具有三个或多个抗原结合位点，其通常不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指能够结合两种或多种相关或不相关靶标的结合蛋白。本文所用的双可变结构域(DVD)结合蛋白或免疫球蛋白(DVD-Ig)，为包含两个或多个抗原结合位点的结合蛋白，并且为四价或多价结合蛋白。所述DVD-Ig可为单特异性的，即能够结合一种抗原；或可为多特异性的，即能够结合两种或多种抗原。将包含两条重链DVD-Ig多肽和两条轻链DVD-Ig多肽的DVD-Ig结合蛋白称作DVD-Ig。DVD-Ig的每一半包含一条重链DVD-Ig多肽和一条轻链DVD-Ig多肽及两个抗原结合位点。每一结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，且每一抗原结合位点共有6个涉及抗原结合的CDR。美国专利号7,612,181公开了DVD结合蛋白和制备DVD结合蛋白的方法。
[0070] 本发明的一个方面涉及包含能够结合TNF-α的结合蛋白的DVD结合蛋白。在特定实施方案中，DVD结合蛋白能够结合TNF-α和第二靶标。
[0071] 术语“中和”指当结合蛋白特异地结合细胞因子时中和细胞因子的生物学活性。在特定实施方案中，中和结合蛋白为中和抗体，其与hTNF-α的结合导致抑制hTNF-α生物学活性，例如，中和结合蛋白结合hTNF-α并使hTNF-α的生物学活性降低至少约20%、40%、60%、80%、85%或更多。可通过测量本领域熟知的hTNF-α生物学活性的一种或多种指示物来评估中和结合蛋白对hTNF-α生物学活性的抑制。例如，TNF-α对L929细胞的细胞毒性的中和。
[0072] 在另一实施方案中，术语“激动(agonizing)”指当结合蛋白特异地结合TNF-α例如hTNF-α时增加TNF-α生物学活性。在特定实施方案中，激动结合蛋白为激动性抗体，其与TNF-α的结合导致TNF-α生物学活性的增加。在特定实施方案中，激动结合蛋白结合TNF-α并使TNF-α的生物学活性增加至少约20%、40%、60%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%和100%。可通过测量本领域熟知的TNF-α生物学活性的一种或多种指示物来评估激动结合蛋白对TNF-α生物学活性的抑制。
[0073] 术语"活性"包括诸如抗体(例如结合TNF-α抗原的抗-hTNF-α抗体)对抗原的结合特异性/亲和力和/或抗体的中和效能(或激动效能)等活性，该抗体例如抗-hTNF-α抗体，其与hTNF-α的结合抑制hTNF-α的生物学活性，例如中和TNF-α对L929细胞的细胞毒性。
[0074] 术语"表位"或“抗原决定簇”指抗原上结合免疫球蛋白例如抗体、T-细胞受体的位点。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团(grouping)，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可具有特异性的三维结构特征和/或特异性的电荷特征。表位为由抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复合混合物中优先识别其靶抗原时，可认为该抗体特异地结合抗原。可自邻接氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并列的非邻接氨基酸两种来形成表位。自邻接氨基酸形成的表位通常在暴露到变性溶剂中时仍可保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时消失。表位通常在独特的空间构象中包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。用于确定给定抗体所结合的表位的方法(即表位作图)为本领域熟知，包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试TNF-α中重叠的或邻接的肽与给定的抗-TNF-α抗体的反应性。测定表位的空间构象的方法包括本领域技术和本文所述的技术，例如，x-射线晶体学和2-维核磁共振(参见例如G. E. Morris于1996年编辑的分子生物学方法中的表位作图方案(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology)的第66卷)。
[0075] 本发明亦包括结合TNF-α上的表位的抗体，其中TNF-α包含由本文所述的特定抗体识别的所有或部分表位(例如相同或重叠区域，或区域之间或跨区域的区域)。
[0076] 本发明亦包括结合相同表位的抗体和/或与本文所述的抗体竞争结合TNF-α例如人TNF-α的抗体。可使用常规技术来鉴定识别相同表位或竞争结合的抗体。所述技术包括例如免疫测定，其显示一种抗体阻断另一种抗体结合靶抗原的能力，即竞争性结合测定。在其中受试免疫球蛋白抑制参照抗体与共有抗原例如hTNF-α的特异性结合的测定中，测定竞争性结合。已知众多类型的竞争结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli等(1983) Methods in Enzymol. 9:242)；固相直接生物素-亲和素EIA (参见Kirkland等(1986) J. Immunol. 137:3614)；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane，抗体：实验室手册(Antibodies: A Laboratory Manual)，冷泉港出版社(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA (参见Morel等(1988) Mol. Immunol. 25(1):7)；
固相直接生物素-亲和素EIA (Cheung等(1990) Virol. 176:546)；和直接标记的RIA (Moldenhauer等(1990) Scand. J. Immunol. 32:77)。所述测定通常涉及使用与固体表面或细胞结合的纯化抗原，所述固体表面或细胞含有未标记的受试免疫球蛋白和标记的参照免疫球蛋白二者之一。通过测定在受试免疫球蛋白存在时结合到固体表面或细胞上的标记的量来测量竞争性抑制。通常受试免疫球蛋白过量存在。通常当竞争性抗体过量存在时，其将对参照抗体与共有抗原的特异性结合产生至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更多的抑制。
固相直接生物素-亲和素EIA (Cheung等(1990) Virol. 176:546)；和直接标记的RIA (Moldenhauer等(1990) Scand. J. Immunol. 32:77)。所述测定通常涉及使用与固体表面或细胞结合的纯化抗原，所述固体表面或细胞含有未标记的受试免疫球蛋白和标记的参照免疫球蛋白二者之一。通过测定在受试免疫球蛋白存在时结合到固体表面或细胞上的标记的量来测量竞争性抑制。通常受试免疫球蛋白过量存在。通常当竞争性抗体过量存在时，其将对参照抗体与共有抗原的特异性结合产生至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更多的抑制。
[0077] 其它的技术包括例如表位作图法，例如，对抗原:抗体复合物晶体的x-射线分析，其可提供表位的原子级分辨率。其它的方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变异体的结合，其中通常认为因修饰抗原序列中的氨基酸残基而导致的结合丧失是表位组分的指示。另外，在表位作图中亦可使用计算组合法。这些方法依赖于目的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特异短肽的能力。然后将所述肽视作用于限定对应于筛选肽文库中所用抗体的表位的先导(lead)。对于表位作图，亦开发出组合算法，已经证明其可对构象上不连续表位作图。
[0078] 术语"表面等离振子共振"指允许通过检测生物传感器基质中蛋白质浓度的变化来实时分析生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)。更一步的阐述见Jönsson等(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26；Jönsson等(1991) Biotechniques 11:620-627；Johnsson 等 (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131；和 Johnsson 等 (1991) Anal. Biochem. 198:268-277。
[0079] 术语"Kon"指结合蛋白(例如抗体)与抗原缔合以形成例如本领域所知的抗体/抗原复合物的结合速率常数。“Kon”亦可称为术语“缔合速率常数”或“ka”，其在本文中可互换使用。指示抗体与其靶标抗原的结合速率或抗体与抗原之间复合物形成的速率的该数值，亦通过以下反应式来表示：
[0080] 抗体(“Ab”) + 抗原(“Ag”)→Ab-Ag
[0081] 术语"Koff"指结合蛋白(例如抗体)从例如抗体/抗原复合物解离的解离常数或“解离速率常数”，其为本领域所知。该值表明抗体从其靶抗原的解离速率或Ab-Ag复合物随时间分离为游离抗体和抗原的解离速率，其通过以下反应式表示：
[0082] Ab + Ag ←Ab-Ag
[0083] 术语"KD"指“平衡解离常数”，并且指在平衡时滴定测量所获得的数值，或通过用解离速率常数(koff)除以缔合速率常数(kon)所获得的值。使用缔合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数来表示抗体对抗原的结合亲和力。用于测定缔合和解离速率常数的方法为本领域熟知。使用基于荧光的技术提供高灵敏度和在平衡状态下于生理缓冲液中检查样品的能力。可使用其它的实验方法和仪器例如BIAcore® (生物分子相互作用分析)测定(例如，可市购自BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden的仪器)。另外，亦可使用可购自Sapidyne Instruments (Boise, Idaho)的KinExA® (动力学排阻测定(Kinetic Exclusion Assay) )测定。
[0084] 术语“标记的结合蛋白”指已掺入标记的蛋白质，所述标记提供对结合蛋白的识别。在特定实施方案中，标记为可检测的标志物，例如，掺入放射性标记的氨基酸，或将可通过标记的亲和素(例如，含有可通过光学或比色方法来检测的荧光标志物或酶活性的链霉亲和素)来检测的生物素部分连接到多肽上。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：3 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153
放射性同位素或放射性核素(例如 H、C、S、Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho或 Sm)；荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体)；酶标记(例如辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标志物；生物素基；通过第二报告物识别的预设多肽表位(例如亮氨酸拉链配对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；和磁性剂，例如钆螯合物。
放射性同位素或放射性核素(例如 H、C、S、Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho或 Sm)；荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体)；酶标记(例如辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标志物；生物素基；通过第二报告物识别的预设多肽表位(例如亮氨酸拉链配对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；和磁性剂，例如钆螯合物。
[0085] 术语“抗体缀合物”指化学连接到第二化学部分例如治疗剂或细胞毒素剂上的结合蛋白，例如抗体。术语"剂(agent)"表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或从生物学材料制备的提取物。在特定实施方案中，治疗剂或细胞毒素剂包括但不限于：百日咳毒素、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊甙(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同源物。
[0086] 术语“晶体”和“结晶的”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是固态物质的一种形式，其明显不同于其它形式例如无定形固态或液体晶体态。晶体由规则、重复、三维阵列的原子、离子、分子(例如，蛋白例如抗体)、或分子组合(assembly)(例如，抗原/抗体复合物)组成。这些三维阵列按照本领域完全了解的特定数学关系排列。将在晶体内重复的基本单位或构件称作不对称单位。在符合给定的完全确定的晶体学对称的排列中，不对称单位的重复提供了晶体的"晶胞"。通过在所有3个维度中规则平移而重复的晶胞提供晶体。参见核酸和蛋白质的结晶，实用方法(Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach)第二版(编辑：Ducruix和Giegé) (牛津大学出版社，New York，1999)中Giegé等的第1章，第1-16页。
[0087] 术语"多核苷酸"意为两个或多个核苷酸的多聚形式，所述核苷酸可为核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)或为任何一种核苷酸的修饰形式。术语包括单链和双链形式的DNA，但在特定实施方案中，为双链DNA。
[0088] 术语"分离的多核苷酸"意为这样的多核苷酸(例如基因组、cDNA或合成来源或其一些组合的多核苷酸)：由于其来源，“分离的多核苷酸”不与在自然界中发现“分离的多核苷酸”与之缔合的全部或部分多核苷酸缔合；与在自然界中它不与之连接的多核苷酸可操作地连接；或在自然界中不作为较大序列的部分存在。
[0089] 术语"载体"指能够运输它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组一起进行复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。此种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明预期包括此种其它形式的表达载体，例如提供等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
[0090] 术语“可操作地连接的”指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这样的方式连接，从而使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下完成。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，和反式或在远处起作用以控制目的基因的表达控制序列。术语“表达控制序列”指实现它们与之连接的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和需要时，增强蛋白分泌的序列。此种控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此种控制序列一般包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，此种控制序列一般包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期包括其存在是表达和加工必需的组分，且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
[0091] “转化”指外源DNA通过其进入宿主细胞的任何过程。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞内的任何已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，且可以包括但不限于，病毒感染、电穿孔、脂质转染、和粒子轰击。此种“转化的”细胞包括其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体部分复制的稳定转化的细胞。它们还包括在有限时间段内瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。
[0092] 术语"重组宿主细胞" (或简称"宿主细胞")指其中有外源DNA引入的细胞。应该理解，所述术语意欲不仅指特定的受试细胞，而且指所述细胞的后代。因为在随后的世代中可因突变或环境影响发生某些修饰，所以事实上所述后代可能不等同于亲代细胞，但是仍包括在术语"宿主细胞"的范围之内。在特定实施方案中，宿主细胞包括选自生物界的任何原核和真核细胞。真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在特定实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293和COS；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母。
[0093] 标准技术可用于DNA重组、寡核苷酸合成和组织培养及转化(例如电穿孔、脂质转染)。可根据厂家说明书或如本领域通常所实施或本文所述来进行酶促反应和纯化技术。通常可根据本领域熟知的常规方法和如本说明书中通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述来实施前述技术和程序。参见例如Sambrook等分子克隆：实验室指南(Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (第2版，冷泉港出版社，冷泉港，N.Y. (1989))。
[0094] “转基因生物”指具有含有转基因的细胞的生物，其中引入到生物体(或生物体的祖先)中的转基因表达该生物体中不会天然表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，其被稳定和可操作地整合进入细胞的基因组中，该细胞发育成转基因生物，所述转基因指导在转基因生物的一种或多种细胞类型或组织中表达所编码的基因产物。
[0095] 术语"调控"和"调节"可互换使用，其指目的分子的活性(例如hTNF-α的生物学活性)的变化或改变。调节可为目的分子的某种活性或功能在量级的增加或减少。分子的例示性活性和功能包括但不限于结合特性、酶活性、细胞受体激活和信号传导。
[0096] 术语"调节剂"相应地为能够改造或改变目的分子的活性或功能(例如hTNF-α的生物学活性)的化合物。例如，与没有调节剂存在时观测到的活性或功能的量级相比，所述调节剂可导致分子的某种活性或功能在量级上的增加或减少。在某些实施方案中，调节剂为抑制剂，其减少分子的至少一种活性或功能的量级。例示性的抑制剂包括但不限于蛋白质、多肽、抗体、肽体(peptibodies)、碳水化合物或有机小分子。在例如国际PCT公布WO01/83525中阐述了肽体。
[0097] 术语"激动剂"指当与目的分子接触时，与没有激动剂存在时观测到的活性或功能的量级相比，导致分子的某种活性或功能量级增加的调节剂。具体目的激动剂可包括但不限于TNF-α多肽或多肽、核酸、碳水化合物或结合hTNF-α的任何其它分子。
[0098] 术语"拮抗剂"或"抑制剂"指当与目的分子接触时，与没有拮抗剂存在时观测到的活性或功能的量级相比，导致分子的某种活性或功能量级减少的调节剂。具体目的拮抗剂可包括阻断或调节TNF-α例如hTNF-α的生物学或免疫学活性的那些。hTNF-α的拮抗剂和抑制剂可包括但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物或结合hTNF-α的任何其它分子。
[0099] 术语"有效量"指这样的治疗量：其足以降低或改善病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间；防止病症发展；导致病症消退；防止与病症相关的一种或多种症状的复发、发展、发作或进展；检测病症；或增强或改进另一治疗(例如预防性或治疗性药剂)的预防或治疗效果。
[0100] 术语“样品”以其最广泛的含义使用。“生物学样品”包括但不限于，来自生物(living thing)或从前生物的任何量的物质。所述生物包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其它动物。所述物质包括但不限于血液、血清、尿液、滑液、细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。
[0101] I. 结合人TNF-α的抗体
[0102] 本发明的一个方面提供分离的鼠单克隆抗体或其抗原-结合部分，其以高亲和力、缓慢的解离速率和高中和能力结合TNF-α。本发明的第二个方面提供结合TNF-α的嵌合抗体。本发明的第三个方面提供结合TNF-α的移植CDR的抗体或其抗原-结合部分。本发明的第四方面提供结合TNF-α的人源化抗体或其抗原-结合部分。在特定实施方案中，抗体或其部分为分离的抗体。在实施方案中，本发明的抗体中和人抗-TNF-α或调节TNF-α功能。
[0103] A. 制备抗-TNF-α抗体的方法
[0104] 可通过任何本领域已知的多种技术中的任何一种来制备本发明的抗体。
[0105] 1. 使用杂交瘤技术的抗-TNF-α单克隆抗体
[0106] 可使用本领域所知的各种各样技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，可使用包括本领域所知的和在以下文献中教导在内的杂交瘤技术来制备单克隆抗体：Harlow等的抗体：实验指南(Antibodies: A Laboratory Manual)，(冷泉港实验室出版社，第2版，1988)；免疫学研究专著(Research Monographs in Immunology) (总编辑：J.L. Turk) (Elsevier，New York，1981)第3卷中Hammerling等编辑的"单克隆抗体和T-细胞杂交瘤"第563-587页。术语"单克隆抗体"不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语"单克隆抗体"指源自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是指其产生的方法。
[0107] 使用杂交瘤技术来产生和筛选特异性抗体的方法是常规技术，为本领域所熟知。在一个实施方案中，本发明提供产生单克隆抗体的方法以及通过所述方法产生的抗体，该方法包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中通过让分离自用本发明抗原免疫的小鼠的脾细胞和杂交瘤细胞融合来产生杂交瘤，然后在因融合而产生的杂交瘤中筛选分泌能够与本发明多肽结合的抗体的杂交瘤克隆。简言之，可用TNF-α抗原免疫小鼠。在特定实施方案中，将TNF-α抗原与佐剂一起给予以刺激免疫应答。所述佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI (胞壁酰二肽)或ISCOM (免疫刺激复合物)。所述佐剂可通过将多肽隔绝在局部储存区来保护多肽免于快速分散，或它们可能含有刺激宿主分泌因子(其对巨噬细胞和免疫系统的其它组分有趋化性)的物质。在特定实施方案中，如果要给予多肽，则免疫方案应涉及分散于数周之内的两次或更多次多肽给予。
[0108] 在用TNF-α抗原免疫接种动物后，可以从动物获得抗体和/或抗体产生细胞。通过使动物放血或处死动物，从动物获得含抗TNF-α抗体的血清。血清可以如其得自动物那样使用，可以从血清中获得免疫球蛋白级分，或可以从血清中纯化抗TNF-α抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，从而具有特性的异质阵列。
[0109] 一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对于抗原TNF-α特异性的抗体，就收获小鼠脾且分离脾细胞。脾细胞随后通过众所周知的技术与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如来自可从ATCC获得的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择且克隆杂交瘤。随后通过本领域已知的方法就分泌能够结合TNF-α的抗体的细胞测定杂交瘤克隆。一般包含高水平抗体的腹水可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫接种小鼠生成。
[0110] 在另一个实施方案中，可以由免疫接种的动物制备抗体产生性永生杂交瘤。如本领域众所周知的，在免疫接种后，处死动物且使脾B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合。参见例如，Harlow和Lane，同上。在特定实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性细胞系)。在融合和抗生素选择后，使用TNF-α或其部分或表达TNF-α的细胞筛选杂交瘤。在特定实施方案中，使用酶联免疫测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)或ELISA实施最初筛选。在国际PCT申请WO 00/37504中提供了ELISA筛选的实例。
[0111] 如下文进一步讨论的，抗TNF-α抗体产生性杂交瘤被选择、克隆和进一步筛选所需特征，包括稳健杂交瘤生长、高抗体产生和所需抗体特征。杂交瘤可以在同系动物体内、在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠、或在体外细胞培养中培养和扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。
[0112] 在特定实施方案中，如上所述，杂交瘤是小鼠杂交瘤。在另一个特定实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种，例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗TNF-α抗体的人细胞融合。
[0113] 识别特异性表位的抗体片段可以通过已知技术生成。例如，本发明的Fab和F(ab')2片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白酶剪切产生，其中使用酶例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)。F(ab')2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。
[0114] 2. 使用SLAM的抗-TNF-α单克隆抗体
[0115] 在本发明的另一个方面，重组抗体使用本领域中称为选择淋巴细胞抗体法(SLAM)的程序从单个、分离的淋巴细胞中产生，所述SLAM如美国专利号5,627,052；PCT公布WO92/02551和Babcock等人(1996)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，93：7843-7848中所述。
在这种方法中，使用抗原特异性溶血噬斑测定筛选分泌目的抗体的单个细胞，例如衍生自在章节1中所述的任何一种免疫接种的动物的淋巴细胞，其中使用接头例如生物素使抗原TNF-α、TNF-α的亚单位或其片段与绵羊红细胞偶联，且用于鉴定分泌对于TNF-α具有特异性的抗体的单个细胞。在鉴定目的抗体分泌性细胞后，通过逆转录酶PCR从细胞中拯救重和轻链可变区cDNA，随后可以在合适的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)背景中，在哺乳动物宿主细胞例如COS或CHO细胞中表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的、来源于体内选择的淋巴细胞的宿主细胞，随后可以经历进一步的体外分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对TNF-α的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列还可进行体外处理，例如通过体外亲和力成熟法，例如PCT公布WO 97/29131和PCT公布WO
00/56772中描述的那些。
在这种方法中，使用抗原特异性溶血噬斑测定筛选分泌目的抗体的单个细胞，例如衍生自在章节1中所述的任何一种免疫接种的动物的淋巴细胞，其中使用接头例如生物素使抗原TNF-α、TNF-α的亚单位或其片段与绵羊红细胞偶联，且用于鉴定分泌对于TNF-α具有特异性的抗体的单个细胞。在鉴定目的抗体分泌性细胞后，通过逆转录酶PCR从细胞中拯救重和轻链可变区cDNA，随后可以在合适的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)背景中，在哺乳动物宿主细胞例如COS或CHO细胞中表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的、来源于体内选择的淋巴细胞的宿主细胞，随后可以经历进一步的体外分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对TNF-α的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列还可进行体外处理，例如通过体外亲和力成熟法，例如PCT公布WO 97/29131和PCT公布WO
00/56772中描述的那些。
[0116] 3. 使用转基因动物的抗-TNF-α单克隆抗体
[0117] 在本发明的另一实施方案中，通过用TNF-α抗原免疫包含一些或所有人免疫球蛋白基因座的非-人动物来产生抗体。在特定实施方案中，非-人动物为XENOMOUSE转基因小鼠，这是一种包含人免疫球蛋白基因座的大片段且在小鼠抗体产生方面有缺陷的经工程改造小鼠品系。参见例如Green等(1994) Nature Genet. 7:13-21和美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。亦参见以下文献：1991年7月25日公布的PCT公开号WO 91/10741、1994年2月3日公布的WO 94/02602、1996年10月31日公布的WO 96/34096和WO 96/33735、1998年4月23日公布的WO 98/16654、1998年6月11日公布的WO 98/24893、1998年11月12日公布的WO
98/50433、1999年9月10日公布的WO 99/45031、1999年10月21日公布的WO 99/53049、
2000年2月24日公布的WO 00/09560和2000年6月29日公布的WO 00/37504。XENOMOUSE转基因小鼠产生全人抗体的成体-样人谱，产生抗原-特异性的人Mab。通过引入巨碱基大小的、人重链基因座和轻链基因座的种系构型YAC片段，XENOMOUSE转基因小鼠含有大约
80%的人抗体谱。参见Mendez等(1997) Nature Genet. 15:146-156；Green和Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495。
98/50433、1999年9月10日公布的WO 99/45031、1999年10月21日公布的WO 99/53049、
2000年2月24日公布的WO 00/09560和2000年6月29日公布的WO 00/37504。XENOMOUSE转基因小鼠产生全人抗体的成体-样人谱，产生抗原-特异性的人Mab。通过引入巨碱基大小的、人重链基因座和轻链基因座的种系构型YAC片段，XENOMOUSE转基因小鼠含有大约
80%的人抗体谱。参见Mendez等(1997) Nature Genet. 15:146-156；Green和Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495。
[0118] 4. 使用重组抗体文库的抗-TNF-α单克隆抗体
[0119] 亦可使用体外方法来制造本发明的抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所期需的结合特异性的抗体。这样筛选重组抗体文库的方法为本领域熟知，包括例如以下文献中所述方法：美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679； WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；和 WO 97/29131；Fuchs 等(1991) Bio/Technology 9:1369-1372；Hay 等 (1992) Hum. Antibod. Hybridomas
3:81-85；Huse 等 (1989) Science 246:1275-1281；McCafferty 等 (1990) Nature
348:552-554；Griffiths 等 (1993) EMBO J. 12:725-734；Hawkins 等 (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896；Clackson 等 (1991) Nature 352:624-628；Gram 等 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580；Garrard等(1991) Bio/Technology 9:1373-1377；
Hoogenboom等(1991) Nucl. Acid Res. 19:4133-4137；和Barbas等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982；和美国专利公开号2003.0186374。
3:81-85；Huse 等 (1989) Science 246:1275-1281；McCafferty 等 (1990) Nature
348:552-554；Griffiths 等 (1993) EMBO J. 12:725-734；Hawkins 等 (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896；Clackson 等 (1991) Nature 352:624-628；Gram 等 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580；Garrard等(1991) Bio/Technology 9:1373-1377；
Hoogenboom等(1991) Nucl. Acid Res. 19:4133-4137；和Barbas等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982；和美国专利公开号2003.0186374。
[0120] 重组抗体文库可来自用TNF-α或TNF-α的部分免疫的受试者。或者，重组抗体文库可来自首次用于实验的受试者，即尚未用TNF-α免疫过的受试者，例如来自未用人TNF-α免疫过的人受试者的人抗体文库。通过用包含人TNF-α的肽筛选重组抗体文库来选择本发明的抗体，从而选择出识别TNF-α的抗体。用于实施所述筛选和选择的方法为本领域熟知，例如前一段中的参考文献中所述。为了选择对hTNF-α具有特定结合亲和力的本发明抗体，例如以特定koff速率常数从人TNF-α中解离的那些抗体，可使用本领域所知表面等离振子共振方法来选择具有所期需的koff速率常数的抗体。为选择对hTNF-α具有特定中和活性的本发明抗体，例如具有特定IC50的那些抗体，可使用本领域所知的用于评估hTNF-α活性抑制的标准方法。
[0121] 在一个方面，本发明涉及结合TNF-α例如人TNF-α的分离的抗体或其抗原-结合部分。在特定实施方案中，抗体为中和抗体。在多个实施方案中，抗体为重组抗体或单克隆抗体。
[0122] 例如，亦可使用本领域所知的各种噬菌体展示法来产生本发明的抗体。在噬菌体展示法中，将功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。具体而言，可利用所述噬菌体来展示由谱或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原-结合结构域。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原进行选择或鉴定，例如使用标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原。这些方法中使用的噬菌体一般是包括fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述结合结构域由具有Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域的噬菌体表达，所述抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括下述参考文献中公开的那些：Brinkmann等(1995) J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames等(1995) J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough等(1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persic等(1997) Gene 187 9-18；Burton等(1994) Adv. Immunol. 57:191-280；PCT公开号WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047 (PCT申请号PCT/GB91/01134)；WO 92/18619；
WO 93/11236；WO 95/15982；和WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；
5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；
5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。
WO 93/11236；WO 95/15982；和WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；
5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；
5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。
[0123] 如上述参考文献中所述，选择噬菌体后，可自噬菌体分离抗体编码区，并用于产生包括人抗体或任何其它所期需的抗原结合片段在内的全抗体，其在任何所期需的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如以下所详述。例如，使用本领域所知的方法，亦可采用重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术，所述方法为例如在以下文献中公开的方法：PCT公开号WO 92/22324；Mullinax等(1992) BioTechniques12(6):864-869；和Sawai等(1995) Am. J. Reprod. Immunol. 34:26-34；和Better等(1998) Science 240:1041-1043。可用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括以下文献中所述的技术：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等(1991) Methods Enzymol.
203:46-88；Shu 等(1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:7995-7999；和Skerra 等(1998) Science 240:1038-1041。
203:46-88；Shu 等(1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:7995-7999；和Skerra 等(1998) Science 240:1038-1041。
[0124] 作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，本领域已知的用于筛选大组合文库的其他方法可以应用于本发明的双重特异性抗体的鉴定。如PCT公开号WO 98/31700，以及Roberts和Szostak(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA，94：12297-12302中描述的，一类可替代的表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白融合物表达的表达系统。在这种系统中，通过在其3’末端上携带嘌呤霉素－肽基接纳体抗生素的合成mRNA的体外翻译，在mRNA及其编码的肽或蛋白之间产生共价融合。因此，基于编码的肽或蛋白例如抗体或其部分的性质，例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，特定mRNA可以从mRNA的复杂混合物(例如，组合文库)中富集。由此种文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列，可以通过上文所述的重组方法(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达，且此外可以通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环，或通过上文所述用于重组抗体体外亲和力成熟的其他方法实施进一步的亲和力成熟，在所述mRNA-肽融合物中已将突变引入最初选择的序列内。
[0125] 在另一种方法中，本发明的抗体也可以使用本领域已知的酵母展示方法来产生。在酵母展示方法中，使用遗传方法以使抗体结构域束缚于酵母细胞壁，且将它们展示在酵母表面上。具体地，此种酵母可以用于展示由谱或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可用于制备本发明抗体的酵母展示法的实例包括Wittrup等，美国专利号
6,699,658和Frenken等，美国专利号6,114,147中所公开的那些。
6,699,658和Frenken等，美国专利号6,114,147中所公开的那些。
[0126] B. 重组TNF-α抗体的产生
[0127] 可通过本领域所知的很多技术中的任何一种来产生本发明的抗体。例如，从宿主细胞表达，其中通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染进入宿主细胞。术语"转染"的各种形式意欲包括常用于将外源DNA引入到原核或真核宿主细胞的多种多样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是考虑在真核细胞例如在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为所述真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能聚集和分泌正确折叠的和具有免疫学活性的抗体。
[0128] 用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞) (包括dhfr-CHO细胞，其在Urlaub和Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216-4220中阐述，与DHFR可选择的标志物一起使用，例如，如Kaufman和Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621中所述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过在足以允许抗体在宿主细胞中表达的时间内，特别是足以将抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的时间内培养宿主细胞来产生抗体。可使用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。
[0129] 亦可使用宿主细胞来产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应该理解，上述程序的变化在本发明的范围之内。例如，可希望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能性片段的DNA来转染宿主细胞。重组DNA技术还可以用于去除对于与目的抗原的结合不是必需的编码轻链和重链中任一个或两者的一些或全部DNA。本发明抗体亦包括由此种截短的DNA分子表达的分子。此外，通过经由标准化学交联法使本发明抗体与第二种抗体交联可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明抗体，并且另一条重链和轻链对于非目的抗原的抗原是特异性的。
[0130] 在重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的例示性系统中，编码抗体重链和抗-体轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfrCHO细胞内。在重组表达载体内，抗体重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用甲氨蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达抗体重和轻链，且从培养基中回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术以制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。更进一步地，本发明提供了合成本发明的重组抗体的方法，其如下进行：在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至本发明的重组抗体被合成。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
[0131] 1. 抗hTNF-α抗体
[0132] 表5为本发明的抗-hTNF-α抗体的VH和VL区的氨基酸序列列表(CDR序列为粗体)。
[0133] 表5：鼠抗-hTNF-α抗体VH和VL区的氨基酸序列列表
[0134]
[0135] 2. 抗-hTNF-α嵌合抗体
[0136] 嵌合抗体为其中抗体的不同部分源自不同动物物种的分子，例如具有源自鼠单克隆抗体和人免疫球蛋白恒定区的可变区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法为本领域所知，其在实施例2.1中详细讨论。参见例如Morrison (1985) Science 229:1202；Oi等(1986) BioTechniques 4:214-221；Gillies等(1989) J. Immunol. Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397。另外，可使用为产生"嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855；Neuberger等(1984)，Nature 312:604-608；Takeda等(1985) Nature 314:452-454)，其将来自适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自适当生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起。
[0137] 在一个实施方案中，通过用人IgG1恒定区替换第1节中所述的鼠单克隆抗人TNF-α抗体的重链恒定区来产生本发明的嵌合抗体。
[0138] 3. 抗-TNF-α CDR-移植的抗体
[0139] 本发明的CDR-移植的抗体包含来自人抗体的重链和轻链可变区序列，其中用本发明的鼠抗体的CDR序列替换VH和/或VL的一个或多个CDR区域。来自任何人抗体的构架序列可充当CDR移植的模板。然而，在所述构架上的直链替换通常导致与抗原的结合亲和力的一些丧失。人抗体与原始鼠抗体的同源性越高，鼠CDR与人构架结合而引入可降低亲和力的CDR变形的可能性越低。因此，在实施方案中，被选择用来替换除CDR外的鼠可变构架的人可变构架与鼠抗体可变区构架具有至少65%的序列同一性。在特定实施方案中，除CDR外的人和鼠可变区具有至少70%的序列同一性。在特定实施方案中，除CDR外的人和鼠可变区具有至少75%的序列同一性。在特定实施方案中，除CDR外的人和鼠可变区具有至少80%的序列同一性。用于产生嵌合抗体的方法为本领域所知，在实施例2.2中详细讨论(亦参见欧洲专利号EP 0 239 400；PCT公开号WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)；镶面(veneering)或表面重修(EP 0 592 106；EP 0 519 596；
Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498；Studnicka等(1994) Protein Eng.
7(6):805-814；Roguska等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973)；和链改组(美国专利号5,565,352)。
Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498；Studnicka等(1994) Protein Eng.
7(6):805-814；Roguska等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973)；和链改组(美国专利号5,565,352)。
[0140] 在特定实施方案中，本发明提供如表6所述的具VH和/或VL的移植CDR的抗体。
[0141] 表6：移植CDR的抗体
[0142]
[0143]
[0144] 4. 抗-hTNF-α人源化抗体
[0145] 人源化抗体为结合所期需的抗原的来自非人物种抗体的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。公开了已知的人Ig序列，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi；
[0146]
[0147] 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生部(1983)。如本领域所知，可用这些输入的序列来降低免疫原性，或降低、增加或修饰结合性、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其它合适的特性。
[0148] 可用来自CDR供体抗体的相应残基取代人构架区中的构架残基，以改变、提高抗原结合性。通过本领域熟知的方法来鉴定这些构架取代，例如，通过对CDR和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的构架残基，和序列比较以鉴定在特定位置上的罕见构架残基。(参见例如美国专利号5,585,089；Riechmann等(1988) Nature 332:323-327)。通常可获得三维免疫球蛋白模型，其为本领域技术人员所熟悉。可获得阐明和展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些展示，使得我们可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。以这种方式，可从共有和输入序列中选择和组合FR残基，以便获得所期需的抗体特征，例如增加对靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接且最重要地与影响原结合有关。抗体可以使用本领域已知的多种技术进行人源化，例如但不限于下述参考文献中描述的那些：Jones等(1986) Nature 321:522-525；Verhoeyen等(1988) Science 239:1534-1536；Sims等(1993) J. Immunol. 151: 2296-2308；Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Carter等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:4285-4289；Presta 等 (1993) J. Immunol. 151:2623-2632；Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498；Studnicka等(1994) Protein Engineering 7(6):805-814；
Roguska等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973；PCT公开号WO 91/09967，WO 99/06834 (国际申请号PCT/US98/16280)，WO 97/20032 (申请号PCT/US96/18978)，WO 92/11272 (申请 号PCT/US91/09630)，WO 92/03461 (申请号 PCT/US91/05939)，WO 94/18219 (申请号PCT/US94/01234)，WO 92/01047 (申请号PCT/GB91/01134)，WO
93/06213 (申请号 PCT/GB92/01755)，WO 90/14443，WO 90/14424，和WO 90/14430；欧洲公开号EP 0 592 106，EP 0 519 596，和EP 0 239 400，美国专利号5,565,332；5,723,323；
5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；
5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；和
4,816,567。
89:4285-4289；Presta 等 (1993) J. Immunol. 151:2623-2632；Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498；Studnicka等(1994) Protein Engineering 7(6):805-814；
Roguska等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973；PCT公开号WO 91/09967，WO 99/06834 (国际申请号PCT/US98/16280)，WO 97/20032 (申请号PCT/US96/18978)，WO 92/11272 (申请 号PCT/US91/09630)，WO 92/03461 (申请号 PCT/US91/05939)，WO 94/18219 (申请号PCT/US94/01234)，WO 92/01047 (申请号PCT/GB91/01134)，WO
93/06213 (申请号 PCT/GB92/01755)，WO 90/14443，WO 90/14424，和WO 90/14430；欧洲公开号EP 0 592 106，EP 0 519 596，和EP 0 239 400，美国专利号5,565,332；5,723,323；
5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；
5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；和
4,816,567。
[0149] C. 抗体的产生和产生抗体的细胞系
[0150] 在实施方案中，本发明的抗-TNF-α抗体展现出降低或中和TNF-α活性的高能力，例如，其如本领域已知的若干种体外和体内测定中任何一种所评估。或者，本发明的抗-TNF-α抗体亦展现出增加或提升(agonize) TNF-α活性的高能力。
[0151] 在特定实施方案中，分离的抗体或其抗原-结合部分结合人TNF-α，其中抗体或-1其抗原-结合部分以如表面等离振子共振所测定的约0. 1s 或更小的koff速率常数从人-6
TNF-α中解离，或以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。或者，抗体或其抗-2 -1
原-结合部分可以如表面等离振子共振所测定的约1 × 10 s 或更小的koff速率常数从-7
人TNF-α中解离，或可以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。或者，抗体或其-3 -1
抗原-结合部分可以如表面等离振子共振所测定的约1 × 10 s 或更小的koff速率常数-8
从人TNF-α中解离，或可以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。或者，抗体或-4 -1
其抗原-结合部分可以如表面等离振子共振所测定的约1 × 10 s 或更小的koff速率常-9
数从人TNF-α中解离，或可以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。或者，抗体-5 -1
或其抗原-结合部分可以如表面等离振子共振所测定的约1 × 10 s 或更小的koff速率-10
常数从人TNF-α中解离，或可以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。或者，-5 -1
抗体或其抗原-结合部分可以如表面等离振子共振所测定的约1 × 10 s 或更小的koff-11
速率常数从人TNF-α中解离，或可以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。
TNF-α中解离，或以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。或者，抗体或其抗-2 -1
原-结合部分可以如表面等离振子共振所测定的约1 × 10 s 或更小的koff速率常数从-7
人TNF-α中解离，或可以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。或者，抗体或其-3 -1
抗原-结合部分可以如表面等离振子共振所测定的约1 × 10 s 或更小的koff速率常数-8
从人TNF-α中解离，或可以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。或者，抗体或-4 -1
其抗原-结合部分可以如表面等离振子共振所测定的约1 × 10 s 或更小的koff速率常-9
数从人TNF-α中解离，或可以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。或者，抗体-5 -1
或其抗原-结合部分可以如表面等离振子共振所测定的约1 × 10 s 或更小的koff速率-10
常数从人TNF-α中解离，或可以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。或者，-5 -1
抗体或其抗原-结合部分可以如表面等离振子共振所测定的约1 × 10 s 或更小的koff-11
速率常数从人TNF-α中解离，或可以约1 × 10 M或更小的IC50抑制人TNF-α活性。
[0152] 在某些实施方案中，抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。在实施方案中，重链恒定区为IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可包含轻链恒定区，其为κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。在另一实施方案中，抗体包含κ轻链恒定区。或者，抗体部分可为例如Fab片段或单链Fv片段。
[0153] 替换Fc部分中的氨基酸残基以改变抗体效应子功能为本领域所知(参见美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分介导若干重要的效应子功能，例如，细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体及抗原-抗体复合物的半衰期/清除速率。在一些情况下，这些效应子功能为治疗性抗体所期需，但在其它的情况下，可能是不必要的或甚至是有害的，这视治疗的目的而定。某些人IgG同种型尤其是IgG1和IgG3，分别通过结合FcγR和补体C1q来介导ADCC和CDC。新生儿Fc受体(FcRn)是决定抗体循环半衰期的关键组分。在又一实施方案中，抗体的恒定区例如抗体的Fc区域中至少一个氨基酸残基被替换，以便改变抗体的效应子功能。
[0154] 一个实施方案提供标记的结合蛋白，其中本发明的抗体或抗体部分用另外的功能分子(例如另一种肽或蛋白质)衍生化或与其连接。例如，可通过让本发明的抗体或抗体部分与一种或多种其它的分子实体功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)来衍生，所述其他分子实体例如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测的剂、细胞毒素剂、药用剂、和/或可以介导抗体或抗体部分与另一种分子(例如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)结合的蛋白或肽。
[0155] 本发明的抗体或抗体部分可以由之衍生化的有用的可检测的剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测的剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体也可以用可检测酶衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当抗体用可检测酶衍生化时，它通过添加另外的试剂(酶用其生产可检测的反应产物)进行检测。例如，当可检测的剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺导致可检测的有色反应产物。抗体也可以用生物素衍生化，且通过间接测量亲和素和链霉亲和素的结合来检测。
[0156] 本发明的另一实施方案提供结晶的结合蛋白。在实施方案中，本发明涉及本文所公开的全抗-TNF-α抗体或其片段的晶体，和包含所述晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶的结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性对应物更长的体内半衰期。在另一实施方案中，结合蛋白在结晶后保留生物学活性。
[0157] 可根据本领域所知的和PCT公布WO 02/72636中所公开的方法来产生本发明的结晶的结合蛋白。
[0158] 本发明的另一实施方案提供糖基化的结合蛋白，其中抗体或其抗原-结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白生产可经历进一步的加工，叫做翻译后修饰。具体而言，可用酶促法加入糖(糖基)残基，这一过程叫做糖基化。将所得到的含有共价连接的寡糖侧链的蛋白质称作糖基化蛋白质或糖蛋白。蛋白质糖基化视目的蛋白质的氨基酸序列以及在其中表达所述蛋白质的宿主细胞而定。不同的生物体可产生不同糖基化酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，具有不同的可用底物(核苷酸糖)。由于这些因素，蛋白质糖基化的方式和糖基残基的组成可取决于其中表达具体蛋白质的宿主系统而不同。本发明中有用的糖基残基可包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。在实施方案中，糖基化的结合蛋白包含糖基残基以便糖基化方式为人方式。
[0159] 如本领域的技术人员所知，不同的蛋白质糖基化可导致不同的蛋白质特性。例如，与在哺乳动物细胞例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质相比，在微生物宿主例如酵母中产生并利用酵母内源途径糖基化的治疗性蛋白质的功效可能降低。所述糖蛋白在人中亦有免疫原性，给予后显示出降低的体内半衰期。人和其它动物中的特异性受体可识别特异的糖基残基，并促进血流中蛋白质的迅速清除。其它的副作用可包括蛋白质折叠、溶解性、对蛋白酶的敏感性、运输、转运、区室化、分泌、被其它蛋白质或因子识别、抗原性或变应原性的变化。因此，从业者可能优选带有特异组成和糖基化方式的治疗性蛋白，例如与在人细胞中或在预期的受试动物的物种特异性细胞中所产生的一样或至少类似的糖基化组成和方式。
[0160] 可通过基因改造宿主细胞使其表达异源的糖基化酶来获得与宿主细胞不同的糖基化蛋白的表达。使用本领域已知的技术，从业者可产生表现出人蛋白质糖基化的抗体或其抗原-结合部分。例如，业已将酵母菌株遗传改造以表达非天然存在的糖基化酶，以便在这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白(糖蛋白)表现出与动物细胞特别是人细胞一样的蛋白质糖基化(美国专利号7,449,308和7,029,872)。
[0161] 而且，本领域的技术人员应该理解，可使用经遗传工程改造以表达各种糖基化酶的宿主细胞文库，使得宿主细胞文库的成员产生具有差别糖基化方式的目的蛋白，来表达目的蛋白。然后从业者可选择和分离具有特定新型糖基化方式的目的蛋白。在实施方案中，具有特定所选择的新型糖基化方式的蛋白质表现出增加的或改变的生物学特性。
[0162] D. 抗-TNF-α抗体的用途
[0163] 鉴于其结合人TNF-α的能力，可使用例如本发明的抗-人TNF-α抗体或其部分来检测TNF-α (例如，在生物学样品例如血清和血浆中)，所述检测可使用常规的免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。本发明提供用于在生物学样品中检测TNF-α的方法，所述方法包括让生物学样品与本发明的抗体或抗体部分接触，和检测与TNF-α结合的抗体(或抗体部分)或未结合的抗体(或抗体部分)，藉此检测生物学样品中的TNF-α。用可检测的物质直接或间接地标记抗体以促进结合或未结合抗体的检测。适宜的可检测的物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。适宜的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适宜的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适宜的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺3 14 35 90 99 111 125 131 177 166
(luminol)；适宜的放射性材料的实例包括 H、C、S、Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho或
153
Sm。
(luminol)；适宜的放射性材料的实例包括 H、C、S、Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho或
153
Sm。
[0164] 作为标记抗体的备选，可通过竞争性免疫测定来测定生物学流体中的人TNF-α，所述测定利用经可检测的物质标记的rhTNF-α标准和未标记的抗-人TNF-α抗体。在该测定中，联合生物学样品、标记的rhTNF-α标准品和抗-人TNF-α抗体，测定与未标记的抗体结合的rhTNF-α标准品的量。生物学样品中人TNF-α的量与抗-TNF-α抗体上结合的rhTNF-α标准品的量成反比。同样地，亦可通过竞争性免疫测定来测定生物学流体中的人TNF-α，所述测定利用经可检测的物质标记的rhTNF-α标准品和未标记的抗-人TNF-α抗体。
[0165] 在实施方案中，本发明的抗体和抗体部分在体外和体内都能够中和TNF-α的活性，例如人TNF-α的活性。在另一实施方案中，本发明的抗体和抗体部分能够增加或提升人TNF-α的活性，例如人TNF-α的活性。因此，例如在含有hTNF-α的细胞培养物中、在具有与本发明抗体交叉反应的TNF-α的人受试者和其它哺乳动物受试者中，可使用本发明的这些抗体和抗体部分来抑制或增加hTNF-α的活性。在一个实施方案中，本发明提供用于抑制或增加hTNF-α活性的方法，所述方法包括让hTNF-α与本发明的抗体或抗体部分接触，以便抑制或增加hTNF-α的活性。例如，在含有或疑似含有hTNF-α的细胞培养物中，可将本发明的抗体或抗体部分加入到培养基中来抑制或增加培养物中的hTNF-α活性。
[0166] 在另一实施方案中，本发明提供用于降低或增加受试者中hTNF-α活性的方法，所述受试者有利地为来自罹患其中TNF-α活性为有害或有益的疾病或病症的受试者。本发明提供用于降低或增加罹患所述疾病或病症的受试者中TNF-α活性的方法，所述方法包括将本发明的抗体或抗体部分给予受试者以便降低或增加受试者中的TNF-α活性。在特定实施方案中，TNF-α为人TNF-α，受试者为人受试者。或者，受试者可为表达能够被本发明抗体结合的TNF-α的哺乳动物。另外的受试者可为其体内已引入TNF-α的哺乳动物(例如，通过给予TNF-α或通过表达TNF-α转基因)。可为了治疗目的而将本发明的抗体给予人受试者。此外，可为了兽医目的或作为人疾病的动物模型而将本发明的抗体给予表达能够被本发明抗体结合的TNF-α的非-人动物。关于后者，所述动物模型可用于评估本发明抗体的治疗功效(例如，测试剂量和给药时程)。
[0167] 术语"其中TNF-α活性有害的病症"包括这样的疾病和其它病症：其中罹患所述病症的受试者中TNF-α活性的存在，显示出或怀疑其是所述病症的病理生理学的原因或是促成病症恶化的因子。因此，其中TNF-α活性有害的病症为其中希望降低TNF-α活性以减轻病症的症状和/或进展的病症。例如，可通过罹患病症的受试者的生物学流体中TNF-α浓度的增加(例如，受试者血清、血浆、滑液等的TNF-α浓度增加)来证明所述病症，所述浓度的增加可例如使用如上所述的抗-TNF-α抗体来检测。可用本发明抗体治疗的病症的非限制性实例包括以下关于本发明抗体的药物组合物的章节中所论述的那些病症。
[0168] 或者，术语"其中TNF-α活性有益的病症"包括这样的疾病和其它病症：其中罹患所述病症的受试者中TNF-α活性的存在，显示出或怀疑其对治疗所述病症的病理生理学有益或为促成病症治疗的因子。因此，其中TNF-α活性有益的病症为其中希望增加TNF-α活性以减轻病症的症状和/或进展的病症。可用本发明抗体治疗的病症的非限制性实例包括以下关于本发明抗体的药物组合物的章节中所论述的那些病症。
[0169] E. 药物组合物
[0170] 本发明亦提供包含本发明抗体或其抗原-结合部分和药学上可接受的载体的药物组合物。包含本发明抗体的药物组合物用于但不限于以下：诊断、检测或监测病症；防止、治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状；和/或研究。在具体实施方案中，组合物包含本发明的一种或多种抗体。在另一实施方案中，药物组合物包含本发明的一种或多种抗体和除本发明抗体外用于治疗其中TNF-α活性有害的病症的一种或多种预防剂或治疗剂。在特定实施方案中，已知可用于或业已用于或目前正用于预防、治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状的预防剂或治疗剂。按照这些实施方案，组合物可进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。
[0171] 可将本发明的抗体和抗体-部分掺入到适于给予受试者的药物组合物中。药物组合物通常包含本发明的抗体或抗体部分和药学上可接受的载体。术语"药学上可接受的载体"包括任何和所有在生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。药学上可接受的载体的实例包括以下一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及其组合。在很多情况下，组合物中可包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。药学上可接受的载体可进一步包含提高抗体或抗体部分的保存期或有效性的少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
[0172] 已知有各种递送系统，并且可使用这些递送系统来给予本发明的一种或多种抗体或本发明的一种或多种抗体与可用于预防、控制、治疗或改善病症或其一种或多种症状的预防剂或治疗剂的组合，所述递送系统例如脂质体包封、微粒、微囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu和Wu (1987) J. Biol. Chem.262:4429-4432)、作为反转录病毒或其它载体的部分的核酸构建体等。给予本发明的预防剂或治疗剂的方法包括但不限于：胃肠外给予(例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外给予、瘤内给予和粘膜给予(例如鼻内和口腔途径)。另外，可采用肺给予，例如，通过使用吸入器或雾化器和带有雾化剂的制剂。参见例如美国专利号6,019,968；
5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；和5,290,540；和PCT公开号WO 92/19244，WO 97/32572，WO 97/44013，WO 98/31346和WO 99/66903。在一个实施方案中，使用Alkermes AIR®肺药物递送技术(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)来给予本发明的抗体、联合治疗或本发明的组合物。在具体实施方案中，本发明的预防剂或治疗剂经肌内、静脉内、瘤内、口服、鼻内、肺或皮下给予。可通过任何方便的途径来给予预防剂或治疗剂，例如通过输注或推注、过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起给予。给予可以是全身或局部的。
5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；和5,290,540；和PCT公开号WO 92/19244，WO 97/32572，WO 97/44013，WO 98/31346和WO 99/66903。在一个实施方案中，使用Alkermes AIR®肺药物递送技术(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)来给予本发明的抗体、联合治疗或本发明的组合物。在具体实施方案中，本发明的预防剂或治疗剂经肌内、静脉内、瘤内、口服、鼻内、肺或皮下给予。可通过任何方便的途径来给予预防剂或治疗剂，例如通过输注或推注、过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起给予。给予可以是全身或局部的。
[0173] 在具体实施方案中，可能期需将本发明的预防剂或治疗剂局部给予至需要治疗的区域；这可通过例如(但非限制性的)以下方式来实现：局部输注、注射或借助植入物，所述植入物为多孔的或无孔的材料，包括膜和基质，例如硅橡胶膜(sialastic membrane)、聚合物、纤维基质(例如Tissuel®)或胶原基质。在一个实施方案中，将有效量的本发明一种或多种抗体的拮抗剂局部给予至受试者的受影响区域，来预防、治疗、控制和/或改善病症或其症状。在另一实施方案中，将有效量的本发明的一种或多种抗体与有效量的非本发明抗体的一种或多种治疗(例如一种或多种预防剂或治疗剂)一起局部给予至受试者的受影响区域，来预防、治疗、控制和/或改善病症或其一种或多种症状。
[0174] 在另一实施方案中，可在控制释放或持续释放系统中递送预防剂或治疗剂。在一个实施方案中，可使用泵来获得控制或持续释放(参见Langer，见上；Sefton (1987) CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240；Buchwald等(1980) Surgery 88:507-516；Saudek等(1989) N. Engl. J. Med. 321:574-579)。在另一实施方案中，可使用聚合物材料来获得本发明治疗的控制或持续释放(参见例如控制释放的医药应用第II卷：应用和评估(Medical Applications of Controlled Release, Vol. II, Applications and Evaluation) (编辑：Langer和Wise) (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984)一书中Goodson, J.M.所著的第6章，第115-138页；控制的药物的生物利用度，药物产品设计和性能(Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance) (编 辑：Smolen and Ball) (Wiley, New York, 1984)；Langer 和 Peppas (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys. C23(1):61-126；亦见Levy等(1985) Science 228:190-192；During等(1989) Ann. Neurol. 25:351-356；Howard等(1989) J. Neurosurg. 71:105-112)；美国专利号5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463；和
5,128,326；和PCT公开号WO 99/15154和WO 99/20253。持续释放型制剂中使用的聚合物的实例包括但不限于：聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙醇酸交酯共聚物(PLGA)和聚原酸酯。在特定实施方案中，在持续释放型制剂中使用的聚合物为惰性的、不含可沥滤杂质、储存稳定、无菌的和生物可降解的。在又一实施方案中，可将控制或持续释放系统置于预防或治疗靶标的附近，因此仅需全身剂量的部分(参见例如Goodson，控制释放的医药应用(Medical Applications of Controlled Release)，第II卷，同上，第
115-138页(1984)。
5,128,326；和PCT公开号WO 99/15154和WO 99/20253。持续释放型制剂中使用的聚合物的实例包括但不限于：聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙醇酸交酯共聚物(PLGA)和聚原酸酯。在特定实施方案中，在持续释放型制剂中使用的聚合物为惰性的、不含可沥滤杂质、储存稳定、无菌的和生物可降解的。在又一实施方案中，可将控制或持续释放系统置于预防或治疗靶标的附近，因此仅需全身剂量的部分(参见例如Goodson，控制释放的医药应用(Medical Applications of Controlled Release)，第II卷，同上，第
115-138页(1984)。
[0175] 在Langer的综述(1990, Science 249:1527-1533)中讨论了控制释放系统。可用本领域技术人员所知的任何技术来产生包含一种或多种本发明的治疗剂的持续释放制剂。参见例如美国专利号4,526,938；PCT公开号WO 91/05548；PCT公开号WO 96/20698，Ning 等(1996) Radiotherapy Oncol. 39:179-189；Song等(1996) PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50:372-377；Cleek等(1997) Proceed. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854，和Lam等(1997) Proceed. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:759-760。
[0176] 在具体实施方案中，当本发明的组合物为编码预防剂或治疗剂的核酸时，核酸可以体内给予以促进其编码的预防或治疗剂的表达，这通过下述实现，将其构建为合适的核酸表达载体的部分且给予，从而使得其成为细胞内的，例如利用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或直接注射，或使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，DuPont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或与已知进入核的同源异型框样肽连接给予(参见，例如，Joliot等(1991)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88：1864-1868)。或者，核酸可以细胞内引入且通过同源重组掺入到宿主细胞DNA内用于表达。
[0177] 本发明的药物组合物配制为与其预期给予途径相容。给予途径的例子包括但不限于，胃肠外，例如，静脉内、皮内、皮下、经口、鼻内(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、跨粘膜、和直肠给予。在具体实施方案中，组合物依照常规程序配制为药物组合物，所述药物组合物适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部给予人。一般地，用于静脉内给予的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因(lignocamne)，以减轻注射部位处的疼痛。
[0178] 如果本发明的组合物将局部给予，那么组合物可以配制为软膏、乳膏、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、洗发剂、喷雾剂、气溶胶、溶液剂、乳剂形式或本领域技术人员众所周知的其他形式。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub. Co.，Easton，Pa.(1995)。对于不可喷雾的局部剂型，一般采用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂，且具有大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于，溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、油膏等，需要时进行灭菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲剂或盐)混合用于影响各种性质，例如，渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分，任选与固体或液体惰性载体组合，与加压挥发物(例如，气体推进剂，例如FREON®)在混合物中包装或包装在挤压瓶中。需要时保湿剂或湿润剂也可以加到药物组合物和剂型中。此种另外成分的例子是本领域众所周知的。
[0179] 如果本发明的方法包括组合物的鼻内给予，那么组合物可以配制为气溶胶形式、喷雾剂、雾或滴剂形式。特别地，用于根据本发明使用的预防或治疗剂可以以从加压包或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂形式方便地递送，使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀来确定，以递送计量的量。可将在吸入器或吹入器中使的用胶囊和药液筒(由例如明胶组成)配制成包含化合物和合适粉末基例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0180] 如果本发明的方法包括经口给予，那么组合物可以配制为片剂、胶囊、扁囊剂、软胶囊(gelcaps)、溶液剂、混悬剂等经口形式。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学可接受的赋形剂制备，所述赋形剂例如粘合剂(例如，预凝胶玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例如，乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口给予的液体制剂可呈下述形式，但不限于下述形式，溶液剂、糖浆或混悬剂，或它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的溶媒构建。此种液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性溶媒(例如，杏仁油、油酯、乙醇、或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当时制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口给予的制剂可以适当地配制，用于缓慢释放、控释、或持续释放一种或多种预防或治疗剂。
[0181] 本发明的方法可以包括用气溶胶化剂(aerosolizing agent)配制的组合物的肺给予，例如利用吸入器或喷雾器。参见，例如，美国专利号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913和5,290,540；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903。在具体实施方案中，本发明的抗体、组合治疗、和/或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass. US)来给予。
[0182] 本发明的方法可以包括配制用于通过注射(例如通过推注或连续输注)胃肠外给予的组合物的给予。用于注射的制剂可以与添加的防腐剂一起以单位剂型(例如，在安瓿或多剂容器中)呈现。组合物可以呈诸如在油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂等形式，且可以包含配制剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。或者，活性成分可以为粉末形式用于在使用前用合适的溶媒(例如，无菌无热原水)构建。
[0183] 本发明的方法可以另外包括配制为贮库(depot)制剂的组合物的给予。此种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来给予。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
[0184] 本发明的方法包括配制为中性或盐形式的组合物的给予。药学可接受的盐包括由阴离子形成的那些，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由阳离子形成的那些，例如来源于钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。
[0185] 一般地，组合物的成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在密封容器中的干燥的冻干粉末或无水浓缩剂，所述密封容器例如安瓿或小药囊(Sachette)，其指示活性剂的量。当给予方式是输注时，组合物可以用包含无菌药物级别的水或盐水的输注瓶分配。当给予方式是注射时，可以提供无菌注射用水或盐水安瓿，从而使得各成分可以在给予前进行混合。
[0186] 特别地，本发明还提供了包装在密封容器中的本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，所述密封容器例如安瓿或小药囊，其指示药剂的量。在一个实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封容器中的干燥的无菌冻干粉末或无水浓缩剂提供，且可以重构(例如，用水或盐水)至合适浓度以便给予受试者。在实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封容器中的干燥的无菌冻干粉末提供，其单位剂量为至少5 mg、至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、至少75 mg、或至少100 mg。冻干的本发明的预防或治疗剂或药物组合物应在其原容器中贮存于2℃－8℃，并且本发明的预防或治疗剂或药物组合物应在重构后1周内，5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内给予。在备选的实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，以液体形式在指示药剂的量和浓度的密封容器中提供。在实施方案中，液体形式的给予的组合物在密封容器中提供，其量为至少0.25 mg/ml，至少0.5 mg/ml、至少1 mg/ml、至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/kg、至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少100 mg/ml。液体形式应在其原容器中贮存于2℃－8℃。
[0187] 本发明的抗体和抗体部分可以掺入适用于胃肠外给予的药物组合物中。在实施方案中，抗体或抗体部分将制备为包含0.1－250 mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可以由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预装注射器中的液体或冻干剂型组成。缓冲剂可以是L-组氨酸(1－50 mM)，最佳5－10 mM，pH 5.0－7.0(最佳pH 6.0)。其他合适的缓冲剂包括但不限于，琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可以用于修饰浓度0－300 mM(对于液体剂型最佳150 mM)的溶液的毒性。对于冻干剂型可以包括冷冻保护剂，主要为0－10％蔗糖(最佳0.5－1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂型可以包括膨胀剂，主要为1－10％甘露醇(最佳2－4％)。稳定剂可以在液体和冻干剂型中使用，主要为1－50 mM L-甲硫氨酸(最佳5－10 mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以作为0－0.05％聚山梨醇酯80(最佳0.005－0.01％)包括。另外的表面活性剂包括但不限于，聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。
[0188] 本发明的组合物可以为多种形式。这些包括例如，液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液剂(例如，可注射和可输注溶液剂)、分散体或混悬剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。具体形式取决于预期给予方式和治疗应用。一般的组合物呈可注射或可输注溶液剂形式，例如类似于用其他抗体被动免疫接种人所使用的那些组合物。给予方式包括胃肠外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在特定实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射来给予。在另一个特定实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射来给予。
[0189] 治疗组合物一般必须是无菌且在制备和贮存条件下是稳定的。组合物可以配制为溶液剂、微乳剂、分散体、脂质体、或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过下述制备：将需要量的活性化合物(即，抗体或抗体部分)与上文列举的一种成分或成分组合一起掺入合适的溶剂中，必要时随后进行过滤灭菌。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌溶媒内来制备，所述无菌溶媒包含基本分散介质和来自上文列举那些的必需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冻干粉末的情况下，制备方法包括由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外所需成分的粉末的真空干燥和喷雾干燥。溶液的正确流动性可以通过下述来维持，例如利用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需颗粒大小和利用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的剂来引起，所述剂例如单硬脂酸盐和明胶。
[0190] 本发明的抗体和抗体部分可以通过本领域已知的多种方法来给予，尽管对于许多治疗应用，例如给予途径/模式是皮下注射、静脉内注射或输注。如技术人员将认识到的，给予途径和/或模式将依所需结果而变。在某些实施方案中，活性化合物可以与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的许多方法是获得专利保护的或是本领域技术人员一般已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R. Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
[0191] 在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可以例如，与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口给予。化合物(和若需要，其他成分)也可以装入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。对于经口治疗给予，化合物可以与赋形剂掺合，且以可摄食片剂、含服片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等的形式使用。为了通过非胃肠外给药来给予本发明的化合物，可能必需用材料包被化合物、或将化合物与材料共给予，以防止其失活。
[0192] 补充性活性化合物也可以掺入组合物内。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共给予，所述治疗剂可用于治疗其中TNF-α活性是有害的病症。例如，本发明的抗hTNF-α抗体或抗体部分可以与结合其他靶的一种或多种另外的抗体(例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共配制和/或共给予。此外，本发明的一种或多种抗体可以与2种或更多前述治疗剂组合使用。此种组合疗法可以有利地利用较低剂量的给予的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
[0193] 在某些实施方案中，针对TNF-α的抗体或其片段与本领域已知的半衰期延长溶媒连接。此种溶媒包括但不限于，Fc结构域、聚乙二醇、和葡聚糖。此种溶媒在例如美国专利号6,660,843中描述。
[0194] 在具体实施方案中，给予包括编码本发明的抗体或本发明的另一种预防或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列，以经由基因疗法治疗、预防、控制、或改善病症或其一种或多种症状。基因疗法指通过给受试者给予表达的或可表达核酸来进行的疗法。在本发明的这个实施方案中，核酸生产其编码的抗体或介导预防或治疗作用的本发明预防或治疗剂。
[0195] 本领域可用的任何关于基因治疗的方法可以根据本发明使用。关于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等(1993) Clin. Pharm. 12:488-505；Wu和Wu (1991) Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan (1993) Science 260:926- 932；和Morgan和 Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；Robinson (1993) Trends Biotechnol.11(5):155。可 使用 的重组DNA技术领域通常已知的方法，阐述于Ausubel等(编辑)，分子生物学的通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley &Sons，NY (1993)；和Kriegler，基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual)，Stockton Press，NY (1990)中。在美国专利公开号2009/0297514公开了各种基因治疗方法的详细描述。
[0196] TNF-α在与涉及免疫和炎症要素的多种疾病有关的病理学中具有关键作用。这些疾病包括但不限于：获得性免疫缺陷疾病综合征；获得性免疫缺陷相关病；获得性恶性贫血；急性冠状动脉综合征；急性和慢性痛(不同形式的疼痛)；急性特发性多神经炎；与器官移植相关的急性免疫性疾病；与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病；急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病；急性缺血；急性肝病；急性风湿热；急性横贯性脊髓炎；Addison氏病；成人(急性)呼吸窘迫综合征；成人Still氏病；酒精性肝硬变；酒精诱导的肝损伤；变应性疾病；变态反应；秃头；斑秃；阿尔茨海默病；过敏反应；强直性脊柱炎；
强直性脊柱炎相关性肺病；抗磷脂抗体综合征；再生障碍性贫血；动脉硬化；关节病；哮喘；
动脉粥样化疾病/动脉硬化；动脉粥样硬化；特应性变态反应；特应性湿疹；特应性皮炎；
萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退；自身免疫性大疱性疾病；自身免疫性皮炎；自身免疫性糖尿病；与链球菌感染相关的自身免疫性病症；自身免疫性肠病；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性肝炎；自身免疫性听力丧失；自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)；自身免疫介导的低血糖；自身免疫性心肌炎；自身免疫性嗜中性白细胞减少症；自身免疫性过早卵巢衰竭；自身免疫性血小板减少症(AITP)；自身免疫性甲状腺病；自身免疫性葡萄膜炎；闭塞性细支气管炎；Behcet氏病；睑炎；支气管扩张；大疱性类天疱疮；恶病质；心血管病；灾变性抗磷脂综合征；乳糜泻；颈椎关节强硬；衣原体；胆汁郁积(choleostasis)；慢性活动性肝炎；慢性嗜酸性肺炎；慢性疲乏综合征；与器官移植相关的慢性免疫性疾病；慢性缺血；慢性肝病；慢性粘膜皮肤念珠菌病；疤痕性类天疱疮；具有多发性硬化风险的临床孤立综合征(CIS)；常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)；结缔组织病相关性间质性肺病；结膜炎；Coombs阳性溶血性贫血；儿童期发病性精神病；慢性阻塞性肺病(COPD)；克罗恩氏病；隐原性自身免疫性肝炎；隐原性纤维化肺泡炎；泪囊炎；抑郁；皮炎硬皮病；皮肌炎；皮肌炎/多肌炎相关性肺病；糖尿病性视网膜病；糖尿病；扩张型心肌病；盘状红斑狼疮；椎间盘突出；盘脱垂；弥散性血管内凝血；药物诱导的肝炎；药物诱导的间质性肺病；药物诱导的免疫性溶血性贫血；心内膜炎；子宫内膜异位；眼内炎；肠病性滑膜炎；巩膜外层炎；多形性红斑；重型多形性红斑；女性不育；纤维化；纤维化肺疾病；妊娠期类天疱疮；巨细胞性动脉炎(GCA)；肾小球肾炎；甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)；Goodpasture氏综合征；痛风性关节炎；移植物抗宿主病(GVHD)；
Grave氏病；B群链球菌(GBS)感染；Guillain-Barré综合征(GBS)；含铁血黄素沉着病相关性肺病；枯草热；心力衰竭；溶血性贫血；过敏性紫癜；乙型肝炎；丙型肝炎；Hughes综合征；亨廷顿氏舞蹈病；甲状腺机能亢进；甲状旁腺机能减退；特发性白细胞减少；特发性血小板减少症；特发性帕金森病；特发性间质性肺炎；特应性肝病；IgE介导的变态反应；免疫性溶血性贫血；内含体肌炎；传染病；传染性眼炎性疾病；炎性肠病；炎性脱髓鞘疾病；
炎性心脏病；炎性肾病；胰岛素依赖性糖尿病；间质性肺炎；IPF/UIP；虹膜炎；青少年慢性关节炎；青少年性恶性贫血；青少年类风湿性关节炎；Kawasaki氏病；角膜炎；干燥性角膜结膜炎；Kussmaul病或Kussmaul-Meier病；Landry氏麻痹；朗格汉斯细胞组织细胞增多症；线性IgA疾病；网状青斑；莱姆关节炎；淋巴细胞性浸润性肺病；黄斑变性；特发性男性不育症或NOS；恶性肿瘤；肾显微血管炎；显微镜下多脉管炎；混合型结缔组织病相关性肺病；Morbus Bechterev；运动神经元病症；粘膜类天疱疮；多发性硬化(所有亚型：原发进行性，继发进行性，复发缓和性(relapsing remitting)等)；多器官衰竭；肌痛脑炎/Royal Free疾病；重症肌无力；脊髓异常增生综合征；心肌梗死；心肌炎；肾病综合征；神经根障碍；神经病；非酒精性脂肪性肝炎；非甲非乙型肝炎；视神经炎；器官移植排斥；骨关节炎；
骨质溶解；卵巢癌；卵巢衰竭；胰腺炎；寄生虫病；帕金森病；少关节的JRA；类天疱疮；落叶状天疱疮；寻常天疱疮；周围动脉闭塞性疾病(PAOD)；周围血管疾病(PVD)；外周动脉疾病(PAD)；晶状体性葡萄膜炎；静脉炎；结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)；多软骨炎；
风湿性多肌痛；白发症；多关节的JRA；多发性内分泌缺陷综合征；多肌炎；多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏；风湿性多肌痛(PMR)；传染后间质性肺病；炎症后间质性肺病；泵后综合征；过早卵巢衰竭；原发性胆汁性肝硬变；原发性粘液性水肿；原发性帕金森综合征；原发性硬化性胆管炎；原发性硬化性肝炎；原发性血管炎；前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)；前列腺炎；银屑病；1型银屑病；2型银屑病；银屑病性关节炎；银屑病性关节病；结缔组织病继发的肺动脉高压；结节性多动脉炎的肺表现；单纯红细胞再生障碍；原发性肾上腺机能不足；放射性纤维化；反应性关节炎；Reiter氏病；复发型视神经脊髓炎；肾脏病NOS；再狭窄；类风湿性关节炎；类风湿性关节炎相关性间质性肺病；风湿性心脏病；SAPHO(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)；肉状瘤病；精神分裂症；Schmidt氏综合征；硬皮病；继发性淀粉样变性；休克肺；巩膜炎；坐骨神经痛；继发性肾上腺机能不足；脓毒病综合征；脓毒性关节炎；脓毒性休克；血清反应阴性关节病；聚硅氧烷相关的结缔组织病；Sjögren氏病相关性肺病；Sjögren氏综合征；Sneddon-Wilkinson皮肤病；精子自身免疫性；脊椎关节病；关节强硬性脊椎炎；Stevens-Johnson综合征(SJS)；Still氏病；中风；交感性眼炎；全身性炎症应答综合征；全身性红斑狼疮；全身性红斑狼疮相关性肺病；全身性硬皮病；全身性硬皮病相关性间质性肺病；Takayasu氏病/动脉炎；颞动脉炎；Th2型和Th1型介导的疾病；甲状腺炎；中毒性休克综合征；弓形体视网膜炎；中毒性表皮坏死松解；横贯性脊髓炎；TRAPS(肿瘤坏死因子受体I型(TNFR)相关性周期综合征)；具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性；1型变态反应；1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)；2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)；II型糖尿病；溃疡性结肠炎性关节病；溃疡性结肠炎；荨麻疹；普通型间质性肺炎(UIP)；葡萄膜炎；脉管炎性弥散性肺病；
脉管炎；春季结膜炎；病毒性视网膜炎；白癜风；Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)；韦格纳氏肉芽肿病；湿黄斑变性；伤口愈合；耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病。
强直性脊柱炎相关性肺病；抗磷脂抗体综合征；再生障碍性贫血；动脉硬化；关节病；哮喘；
动脉粥样化疾病/动脉硬化；动脉粥样硬化；特应性变态反应；特应性湿疹；特应性皮炎；
萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退；自身免疫性大疱性疾病；自身免疫性皮炎；自身免疫性糖尿病；与链球菌感染相关的自身免疫性病症；自身免疫性肠病；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性肝炎；自身免疫性听力丧失；自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)；自身免疫介导的低血糖；自身免疫性心肌炎；自身免疫性嗜中性白细胞减少症；自身免疫性过早卵巢衰竭；自身免疫性血小板减少症(AITP)；自身免疫性甲状腺病；自身免疫性葡萄膜炎；闭塞性细支气管炎；Behcet氏病；睑炎；支气管扩张；大疱性类天疱疮；恶病质；心血管病；灾变性抗磷脂综合征；乳糜泻；颈椎关节强硬；衣原体；胆汁郁积(choleostasis)；慢性活动性肝炎；慢性嗜酸性肺炎；慢性疲乏综合征；与器官移植相关的慢性免疫性疾病；慢性缺血；慢性肝病；慢性粘膜皮肤念珠菌病；疤痕性类天疱疮；具有多发性硬化风险的临床孤立综合征(CIS)；常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)；结缔组织病相关性间质性肺病；结膜炎；Coombs阳性溶血性贫血；儿童期发病性精神病；慢性阻塞性肺病(COPD)；克罗恩氏病；隐原性自身免疫性肝炎；隐原性纤维化肺泡炎；泪囊炎；抑郁；皮炎硬皮病；皮肌炎；皮肌炎/多肌炎相关性肺病；糖尿病性视网膜病；糖尿病；扩张型心肌病；盘状红斑狼疮；椎间盘突出；盘脱垂；弥散性血管内凝血；药物诱导的肝炎；药物诱导的间质性肺病；药物诱导的免疫性溶血性贫血；心内膜炎；子宫内膜异位；眼内炎；肠病性滑膜炎；巩膜外层炎；多形性红斑；重型多形性红斑；女性不育；纤维化；纤维化肺疾病；妊娠期类天疱疮；巨细胞性动脉炎(GCA)；肾小球肾炎；甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)；Goodpasture氏综合征；痛风性关节炎；移植物抗宿主病(GVHD)；
Grave氏病；B群链球菌(GBS)感染；Guillain-Barré综合征(GBS)；含铁血黄素沉着病相关性肺病；枯草热；心力衰竭；溶血性贫血；过敏性紫癜；乙型肝炎；丙型肝炎；Hughes综合征；亨廷顿氏舞蹈病；甲状腺机能亢进；甲状旁腺机能减退；特发性白细胞减少；特发性血小板减少症；特发性帕金森病；特发性间质性肺炎；特应性肝病；IgE介导的变态反应；免疫性溶血性贫血；内含体肌炎；传染病；传染性眼炎性疾病；炎性肠病；炎性脱髓鞘疾病；
炎性心脏病；炎性肾病；胰岛素依赖性糖尿病；间质性肺炎；IPF/UIP；虹膜炎；青少年慢性关节炎；青少年性恶性贫血；青少年类风湿性关节炎；Kawasaki氏病；角膜炎；干燥性角膜结膜炎；Kussmaul病或Kussmaul-Meier病；Landry氏麻痹；朗格汉斯细胞组织细胞增多症；线性IgA疾病；网状青斑；莱姆关节炎；淋巴细胞性浸润性肺病；黄斑变性；特发性男性不育症或NOS；恶性肿瘤；肾显微血管炎；显微镜下多脉管炎；混合型结缔组织病相关性肺病；Morbus Bechterev；运动神经元病症；粘膜类天疱疮；多发性硬化(所有亚型：原发进行性，继发进行性，复发缓和性(relapsing remitting)等)；多器官衰竭；肌痛脑炎/Royal Free疾病；重症肌无力；脊髓异常增生综合征；心肌梗死；心肌炎；肾病综合征；神经根障碍；神经病；非酒精性脂肪性肝炎；非甲非乙型肝炎；视神经炎；器官移植排斥；骨关节炎；
骨质溶解；卵巢癌；卵巢衰竭；胰腺炎；寄生虫病；帕金森病；少关节的JRA；类天疱疮；落叶状天疱疮；寻常天疱疮；周围动脉闭塞性疾病(PAOD)；周围血管疾病(PVD)；外周动脉疾病(PAD)；晶状体性葡萄膜炎；静脉炎；结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)；多软骨炎；
风湿性多肌痛；白发症；多关节的JRA；多发性内分泌缺陷综合征；多肌炎；多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏；风湿性多肌痛(PMR)；传染后间质性肺病；炎症后间质性肺病；泵后综合征；过早卵巢衰竭；原发性胆汁性肝硬变；原发性粘液性水肿；原发性帕金森综合征；原发性硬化性胆管炎；原发性硬化性肝炎；原发性血管炎；前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)；前列腺炎；银屑病；1型银屑病；2型银屑病；银屑病性关节炎；银屑病性关节病；结缔组织病继发的肺动脉高压；结节性多动脉炎的肺表现；单纯红细胞再生障碍；原发性肾上腺机能不足；放射性纤维化；反应性关节炎；Reiter氏病；复发型视神经脊髓炎；肾脏病NOS；再狭窄；类风湿性关节炎；类风湿性关节炎相关性间质性肺病；风湿性心脏病；SAPHO(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)；肉状瘤病；精神分裂症；Schmidt氏综合征；硬皮病；继发性淀粉样变性；休克肺；巩膜炎；坐骨神经痛；继发性肾上腺机能不足；脓毒病综合征；脓毒性关节炎；脓毒性休克；血清反应阴性关节病；聚硅氧烷相关的结缔组织病；Sjögren氏病相关性肺病；Sjögren氏综合征；Sneddon-Wilkinson皮肤病；精子自身免疫性；脊椎关节病；关节强硬性脊椎炎；Stevens-Johnson综合征(SJS)；Still氏病；中风；交感性眼炎；全身性炎症应答综合征；全身性红斑狼疮；全身性红斑狼疮相关性肺病；全身性硬皮病；全身性硬皮病相关性间质性肺病；Takayasu氏病/动脉炎；颞动脉炎；Th2型和Th1型介导的疾病；甲状腺炎；中毒性休克综合征；弓形体视网膜炎；中毒性表皮坏死松解；横贯性脊髓炎；TRAPS(肿瘤坏死因子受体I型(TNFR)相关性周期综合征)；具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性；1型变态反应；1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)；2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)；II型糖尿病；溃疡性结肠炎性关节病；溃疡性结肠炎；荨麻疹；普通型间质性肺炎(UIP)；葡萄膜炎；脉管炎性弥散性肺病；
脉管炎；春季结膜炎；病毒性视网膜炎；白癜风；Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)；韦格纳氏肉芽肿病；湿黄斑变性；伤口愈合；耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病。
[0197] 可使用本发明的抗体和抗体部分来治疗罹患自身免疫疾病的人，所述自身免疫疾病尤其是与炎症、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、多发性硬化症有关的自身免疫疾病和其它自身免疫疾病。
[0198] 亦可将本发明的抗体或抗体部分与一种或多种对治疗自身免疫和炎性疾病有用的另外的治疗剂一起给予。
[0199] 可单独或联合使用本发明的抗体或其抗原结合部分来治疗所述疾病。应该理解，可单独使用本发明的抗体或其抗原结合部分，或将其与另外的药剂例如治疗剂联合使用，所述另外的药剂由技术人员针对其所预期的目的来选择。例如，另外的药剂可为本领域公认的可用于治疗待用本发明的抗体治疗的疾病或病症的治疗剂。另外的药剂亦可为对治疗组合物赋予有益属性的药剂，例如，影响组合物粘度的药剂。
[0200] 还应该理解，包括在本发明中的组合为可用于其预期目的那些组合。以下所示药剂为阐明性目的，并非意欲限制。为本发明的部分的组合，可为本发明的抗体和至少一种选自以下列表的另外药剂。组合亦可包括多于一种另外的药剂，例如，两种或三种另外的药剂，如果该组合使得所形成的组合物可实现其预期功能。
[0201] 具体的组合为非类固醇类的抗炎药物，亦称作NSAID，其包括药物，像布洛芬。其它的组合为皮质类固醇，包括泼尼松龙；当其与本发明的抗TNF-α抗体联合治疗患者时，通过逐渐减少所需的类固醇剂量，可降低或甚至消除熟知的使用类固醇带来的副作用。对于类风湿性关节炎、可与本发明的抗体或抗体部分联合的治疗剂的非限制性实例包括以下：细胞因子抑制性抗炎药物(CSAID)；其它人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21，干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。可将本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞表面分子的抗体联合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80 (B7.1)、CD86 (B7.2)、CD90，CTLA或其配体，包括CD154 (gp39或CD40L)。
[0202] 治疗剂的特定组合可干扰自身免疫和随后的炎症级联的不同点；具体实例包括TNF拮抗剂，如嵌合、人源化或人TNF抗体、D2E7 (PCT公开号WO 97/29131)、CA2 TM TM(Remicade )、CDP 571和可溶的p55或p75 TNF受体、其衍生物、(p75TNFR1gG) (Enbrel )或p55TNFR1gG (Lenercept)，还有TNF-α转化酶(TACE)抑制剂；同样地，IL-1抑制剂(白细胞介素-1-转化酶抑制剂、IL-1RA等)可因同样的原因有效。其它的组合为与白细胞介素11的组合。再其它的组合为与自身免疫应答中可与TNF-α的功能并行起作用、依赖于TNF-α的功能或与TNF-α的功能协同作用的其它关键角色组合。再其它的组合为与非耗尽性的抗-CD4抑制剂的组合。再其它的组合为与包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体在内的共-刺激途径CD80 (B7.1)或CD86 (B7.2)的拮抗剂的组合。
[0203] 亦可将本发明的抗体或其抗原结合部分与例如以下药剂联合：甲氨蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉嗪、氯喹(chloroquinine)/羟氯喹、青霉胺、金硫代苹果酸盐(aurothiomalate)(肌内和经口)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇(经口、吸入和局部注射)、β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵(ipratropium)和氧托品(oxitropium)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓剂、补体抑制剂、肾上腺素能药物、干扰促炎细胞因子例如TNF-α或IL-1 (例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)的信号转导的药剂、IL-1β转化酶抑制剂、TNF-α转化酶(TACE)抑制剂、T-细胞信号转导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶的p55或p75 TNF受体和衍生物TMp75TNFRIgG (Enbrel 和p55TNFRIgG (Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来昔布(celecoxib)、叶酸、硫酸羟氯喹、罗非昔布(rofecoxib)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)、萘普生(naproxen)、伐地考昔(valdecoxib)、柳氮磺胺吡啶、甲泼尼龙、美洛昔康(meloxicam)、乙酸甲基氢化泼尼松、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安奈德丙酮化合物、萘磺酸右丙氧芬/apap、叶酸盐、萘普酮、双氯芬酸(diclofenac)、吡罗昔康、依托度酸、双氯酚酸钠、奥沙普秦(oxaprozin)、盐酸羟可酮、重酒石酸二氢可待因酮/apap、双氯酚酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素(anakinra)、人重组体、盐酸曲马多、双水杨酸酯、舒林酸、氰钴胺素/fa/吡哆醇、扑热息痛、阿仑膦酸钠、强的松龙、硫酸吗啡、盐酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺(glucosamine sulf)/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸奥洛他定(olopatadine hcl)、米索前列醇、甲氧萘丙酸钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥昔单抗(rituximab)、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801、和美苏帕玛(Mesopram)。特定组合包括甲氨蝶呤或来氟洛米，并且在中等或重度类风湿性关节炎的情况下，环孢菌素。
[0204] 本发明的药物组合物可包括"治疗有效量"或"预防有效量"的本发明的抗体或抗体部分。"治疗有效量"指在必需的剂量和时间下达到所需治疗结果的有效的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可由本领域的技术人员确定，其可视诸如疾病状态、个体的年龄、性别和体重及个体中抗体或抗体部分引起所需应答的能力等因素而变化。治疗有效量亦是这样的一个量，在这个量下，抗体或抗体部分的治疗上有益的效应超过任何毒性或有害效应。"预防有效量"指在必需的剂量和时间下达到所需预防结果的有效的量。通常，因为在疾病前或疾病的早期在受试者中使用预防性剂量，所以预防有效量应小于治疗有效量。
[0205] 可调整给药方案以提供所需的最佳应答(例如治疗性或预防性应答)。例如，可给予单次推注，随时间可给予数次分开的剂量，或根据治疗情形的紧迫性所指示的，可适当减少或增加剂量。为了便于给予和保持剂量的一致性，以单位剂型配制胃肠外的组合物特别有利。单位剂型指适于待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每一单位含有与所需药物载体缔合的经计算产生所期需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的单位剂型的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特性和待达到的具体治疗或预防效果，和(b)配混(compound)这种用于治疗个体中敏感性的活性化合物的领域固有的局限性。
[0206] 要注意的是剂量值可随待减轻的病况的类型和严重性而变化。更应该理解，对于任何具体的受试者，应随时间推移根据个体需要和给药人员或监管组合物的给予的人员的专业判断来调整具体的给药方案，本文所提出的剂量范围仅为例示性的，并非意欲限制要求保护的组合物的范围或实践。
[0207] 本领域的技术人员易于明白，在不脱离本文所公开的本发明范围或实施方案的范围下，可使用适宜的等同物来对本发明的方法作出其它适宜的改进和改编。现在业已详细阐述了本发明，通过参考以下实施例将更加清楚地理解本发明，包括所述实施例仅为阐明目的，并非意欲限制本发明。
[0208] 实例1：重组抗-人TNF-α抗体
[0209] 实例1.1：重组嵌合抗-人TNF-α抗体的构建和表达
[0210] 通过细菌中的同源重组，将编码鼠抗-人TNF-α单克隆抗体MAK195的重链恒定区的DNA用编码含有2个铰链区氨基酸突变的人IgG1恒定区的cDNA片段替代。这些突变为位点234 (EU编号)的亮氨酸变为丙氨酸和位点235的亮氨酸变为丙氨酸(Lund等(1991) J. Immunol. 147:2657-2662)。将这些抗体的每一个的轻链恒定区用人κ恒定区替代。通过共-转染连接到pHybE表达质粒上的嵌合重链和轻链cDNA，在HEK293细胞中瞬时表达全长嵌合抗体。通过蛋白A琼脂糖色谱法纯化含有重组嵌合抗体的细胞上清液，并通过加入酸性缓冲液来洗脱结合的抗体。中和抗体并透析到PBS中。
[0211] 然后通过ELISA测试纯化的嵌合抗-人TNF-α单克隆抗体结合hTNF-α蛋白的能力，以确认抗原结合。
[0212] 实例1.2：移植CDR的抗-人TNF-α抗体的构建
[0213] 通过应用本领域熟知的标准方法，将单克隆抗体MAK195的VH和VL链的CDR序列(见上表5)移植到不同的人重链和轻链接纳体序列中。
[0214] 基于VH和VL序列与本发明的单克隆抗体MAK195的VH和VL序列的比对，选择下列已知的人序列：
[0215] (a) VH4-59 (IGHV4-59)和VH3-53 (IGHV3-53)以及用于构建重链接纳体序列的连接序列hJH4
[0216] (b) 1-39/O12和3-15/L2以及用于构建轻链接纳体序列的hJK2
[0217] 通过将MAK195中相应的VH和VL CDR移植到所述接纳体序列中，制备CDR-移植的、人源化改良VH和VL序列(亦见上表6)。
[0218] 实例1.3：CDR-移植的抗体中构架回复突变的构建
[0219] 为产生人源化抗体构架回复突变，通过从头合成可变区和/或使用突变的引物和PCR及本领域熟知的方法(见例如WO 2007/042261；WO 99/54440；Traunecker等(1987) EMBO J., 10(12):3655-9，和Lanzavecchia和Scheidegger (1987) Eur. J. Immunol.,17(1):105-11)，将突变引入到按照实施例1.2制备的CDR-移植的抗体序列中。如下所述为每一CDR-移植物构建回复突变和其它突变的不同组合。以下示出所提出的每一人源化抗体的设计型式的概述。这些突变的残基编号基于Kabat编号系统。
[0220] 对于重链hMAK195VH.1z，将一个或多个以下游标和VH/VL界面残基回复突变如下：G27→F，I29→L，I37→V，I48→L，V67→L，V71→K，T73→N，N76→S，和F78→I。
[0221] 另外的突变包括如下：Q1→E。
[0222] 对于重链hMAK195VH.2z，将一个或多个以下游标和VH/VL界面残基回复突变如下：A24→V，F29→L，V48→L，F67→L，R71→K，S49→G，N76→S，和L78→I。
[0223] 另外的突变包括如下：Q1→E，I12→V，和V29→F。
[0224] 对于轻链hMAK195Vk.1，将一个或多个以下游标和VH/VL界面残基回复突变如下：A43→S。
[0225] 对于轻链hMAK195Vk.2z，将一个或多个以下游标和VH/VL界面残基回复突变如下：A43→S，I58→V。
[0226] 另外的突变包括如下：V13→L，E70→D，和S80→P。
[0227] 实例1.4：含有构架回复突变的人源化抗-hTNF-α的重链和轻链
[0228]
[0229] 实例1.5：人源化抗-hTNF-α hMAK195抗体VH/VL配对
[0230]
[0231] 实例1.6：使用BIACORE技术测定亲和力
[0232] 表7：Biacore分析中使用的试剂
[0233]抗原 商品名称 销售商 目录号
TNFα 重组人TNF-α/TNFSF1AR&D systems 210-TA
TNFα 重组人TNF-α/TNFSF1AR&D systems 210-TA
[0234] BIACORE方法：
[0235] BIACORE测定(Biacore, Inc. Piscataway, NJ)用结合速率和解离速率常数的动力学测量来测定抗体的亲和力。用Biacore® 1000或3000仪器，使用流动的(running) HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7.4]、150 mM NaCl、3 mM EDTA和0.005%表面活性剂P20)，在25℃时通过基于表面等离振子共振的测量来测定抗体对靶抗原(例如纯化的重组靶抗原)的结合。所有化学品自Biacore® AB (Uppsala, Sweden)获得或另外自文中所述的不同来源获得。例如，用标准胺偶联试剂盒按照厂家说明书和程序在25 μg/ml下，将在10 mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释的大约5000 RU的山羊抗-鼠IgG (Fcγ)片段特异性的多克隆抗体(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, Ill., US)横过CM5研究级生物传感器芯片而直接固定。用乙醇胺封闭生物传感器表面未反应的部分。将流动池(flowcell) 2和4中修饰的羧甲基葡聚糖表面用作反应表面。将流动池1和3中无山羊抗-鼠IgG的未修饰的羧甲基葡聚糖用作参照表面。对于动力学分析，使用Biaevaluation 4.0.1软件，将衍生自
1:1 Langmuir结合模型的速率方程同时拟合到所有八个注射的结合和解离阶段(使用全局拟合分析)。将纯化的抗体稀释至HEPES-缓冲盐水中以用于在山羊抗-鼠IgG特异性的反应表面捕获。将作为配体(25 μg/ml)而被俘获的抗体以流速5 μl/分钟注射到反应-1 -1 -1
基质上。在25 μl/分钟的连续流速下测定结合和解离速率常数kon (M s )和koff (s )。
在范围为10-200 nM的不同抗原浓度下通过进行动力学结合测量来导出速率常数。然后通过下述公式KD = koff/kon根据动力学速率常数计算抗体和靶抗原之间反应的平衡解离常数
6 -1 -1
(M)。将结合记录为时间的函数，并计算动力学速率常数。在本测定中，可测量快达10 M s-6 -1
的结合速率和慢至10 s 的解离速率。
1:1 Langmuir结合模型的速率方程同时拟合到所有八个注射的结合和解离阶段(使用全局拟合分析)。将纯化的抗体稀释至HEPES-缓冲盐水中以用于在山羊抗-鼠IgG特异性的反应表面捕获。将作为配体(25 μg/ml)而被俘获的抗体以流速5 μl/分钟注射到反应-1 -1 -1
基质上。在25 μl/分钟的连续流速下测定结合和解离速率常数kon (M s )和koff (s )。
在范围为10-200 nM的不同抗原浓度下通过进行动力学结合测量来导出速率常数。然后通过下述公式KD = koff/kon根据动力学速率常数计算抗体和靶抗原之间反应的平衡解离常数
6 -1 -1
(M)。将结合记录为时间的函数，并计算动力学速率常数。在本测定中，可测量快达10 M s-6 -1
的结合速率和慢至10 s 的解离速率。
[0236] 表8：抗-hTNF-α抗体的BIACORE分析
[0237]
[0238] 保持了通过Biacore技术表征的所有人源化构建体的结合，其与鼠亲本抗体具有可比性。
[0239] 实例1.7：人TNF-α的中和
[0240] 让L929细胞生长至半-汇合的密度，用0.25%胰蛋白酶(Gibco#25300)收获细胞。用PBS洗涤细胞，计数，以1E6个细胞/mL重悬于含有4 μg/mL放线菌素D的测定介质中。
以100 μL体积和5E4个细胞/孔将细胞接种于96-孔板(Costar#3599)。在测定介质中将抗体和对照IgG稀释至4X浓度，实施1:4系列稀释。在测定介质中将huTNF-α稀释至
400 pg/mL。以1:2稀释方案将抗体样品(200 μL)加入到huTNF-α(200 μL)中，让其在室温下孵育0.5小时。
以100 μL体积和5E4个细胞/孔将细胞接种于96-孔板(Costar#3599)。在测定介质中将抗体和对照IgG稀释至4X浓度，实施1:4系列稀释。在测定介质中将huTNF-α稀释至
400 pg/mL。以1:2稀释方案将抗体样品(200 μL)加入到huTNF-α(200 μL)中，让其在室温下孵育0.5小时。
[0241] 将100 μL抗体/人TNF-α溶液加入到铺板的细胞中使终浓度为100 pg/mL huTNF-α和150 nM–0.0001 nM抗体。让板在37℃、5% CO2下孵育20个小时。为定量测定存活力，从孔中取出100 μL，加入10 μL的WST-1试剂(Roche，目录号11644807001)。让板在测定条件下孵育3.5个小时。用Spectromax 190 ELISA板读数仪在OD 420-600 nm下读板。若干测定的平均EC50包括在表9中。
[0242] 表9：人TNF-α与人源化抗-hTNF-α抗体的中和测定
[0243]
[0244] 所有抗-hTNF-α抗体在TNF-α中和测定中显示中和。
[0245] 实例1.8：人源化单克隆抗体的物理化学稳定性和体外稳定性分析
[0246] 尺寸排阻色谱法
[0247] 用水将抗体稀释至2.5 mg/mL，使用TSK凝胶G3000 SWXL柱(Tosoh Bioscience，目录号k5539-05k)在Shimadzu HPLC系统上分析20 mL。用211 mM的硫酸钠、92 mM的磷酸钠，pH 7.0，以流速0.3mL/分钟从柱中洗脱样品。HPLC系统的操作条件如下：
[0248] 流动相：211 mM Na2SO4、92 mM Na2HPO4*7H2O、pH 7.0
[0249] 梯度：等度
[0250] 流速：0.3mL/分钟
[0251] 检测波长：280 nm
[0252] 自动进样器冷却器温度：4℃
[0253] 柱加热炉温度：环境温度
[0254] 运行时间：50分钟
[0255] 表10含有表示为单体百分比的抗体构建体的纯度数据(预期分子量的未凝聚蛋白质)，其如以上方案所测定。
[0256] 表10：通过尺寸排阻色谱法测定的抗-hTNF-α抗体的纯度
[0257]
[0258] 抗-hTNF-α抗体显示出极好的SEC特征，且大部分显示>95%的单体。
[0259] 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
[0260] 在还原和非还原两种条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分析抗体。用AFP04C批次的阿达木单抗(Adalimumab)作为对照。对于还原条件，将样品与含100 mM DTT的2X tris-甘氨酸SDS-PAGE样品缓冲液(Invitrogen，目录号LC2676，批次1323208)以1:1混合，在60℃下加热30分钟。对于非还原条件，将样品与样品缓冲液以1:1混合，在100℃下加热5分钟。将还原的样品(每泳道10 mg)点样在
12%的预凝的tris-甘氨酸凝胶上(Invitrogen，目录号EC6005box，批次6111021)，将非还原的样品(每泳道10 mg)点样在8%-16%的预凝的tris-甘氨酸凝胶上(Invitrogen，目录号EC6045box，批次6111021)。使用SeeBlue Plus 2 (Invitrogen，目录号LC5925，批次
1351542)作为分子量标记。在Xcell SureLock mini cell gel box (Invitrogen，目录号EI0001)中运行胶，通过首先施加75伏的电压使样品堆积到凝胶中，接着用125伏的恒定电压直到染料前端到达凝胶底部，来分离蛋白质。使用的电泳缓冲液为1X tris-甘氨酸SDS缓冲液，由10X tris-甘氨酸SDS缓冲液(ABC, MPS-79-080106))制备而得。将凝胶用胶体蓝染色液(Invitrogen，目录号46-7015, 46-7016)染色过夜，用Milli-Q水脱色直到背景透明。然后用Epson Expression扫描仪(型号1680, S/N DASX003641)扫描染色后的凝胶。
12%的预凝的tris-甘氨酸凝胶上(Invitrogen，目录号EC6005box，批次6111021)，将非还原的样品(每泳道10 mg)点样在8%-16%的预凝的tris-甘氨酸凝胶上(Invitrogen，目录号EC6045box，批次6111021)。使用SeeBlue Plus 2 (Invitrogen，目录号LC5925，批次
1351542)作为分子量标记。在Xcell SureLock mini cell gel box (Invitrogen，目录号EI0001)中运行胶，通过首先施加75伏的电压使样品堆积到凝胶中，接着用125伏的恒定电压直到染料前端到达凝胶底部，来分离蛋白质。使用的电泳缓冲液为1X tris-甘氨酸SDS缓冲液，由10X tris-甘氨酸SDS缓冲液(ABC, MPS-79-080106))制备而得。将凝胶用胶体蓝染色液(Invitrogen，目录号46-7015, 46-7016)染色过夜，用Milli-Q水脱色直到背景透明。然后用Epson Expression扫描仪(型号1680, S/N DASX003641)扫描染色后的凝胶。
[0261] 沉降速度分析
[0262] 将抗体装载到三个标准的两段式碳环氧树脂中心杯(two-sector carbon epon centerpiece)的每一个样品室中。这些中心杯具有1.2 cm的光路长度，并建有蓝宝石窗口。用PBS作为参照缓冲液，每一室含有140 µL。使用Beckman ProteomeLab XL-I分析性超速离心机(系列号PL106C01)的4-孔(AN-60Ti)转子同时检测所有样品。
[0263] 拟定运行条件程序，使用ProteomeLab (v5.6)进行离心控制。在分析之前让样品和转子热平衡一个小时(20.0 ± 0.1℃)。在3000 rpm下对适当小室装载进行确认，记录每一小室的单个扫描。沉降速率条件如下：
[0264] 样品室体积：420 mL
[0265] 参照室体积：420 mL
[0266] 温度：20℃
[0267] 转子速度：35,000 rpm
[0268] 时间：8:00小时
[0269] 紫外波长：280 nm
[0270] 径向步长：0.003 cm
[0271] 数据收集：每步一个数据点，无信号平均。
[0272] 总扫描数：100
[0273] 完整抗体的LC-MS分子量测量
[0274] 通过LC-MS分析完整抗体的分子量。用水将每种抗体稀释至大约1 mg/mL。使用带有蛋白质microtrap (Michrom Bioresources, Inc,目录号004/25109/03)的1100 HPLC (Agilent)系统来除盐，将5 mg样品引入到API QSTAR Pulsar i质谱仪上(Applied Biosystems)。使用小梯度来洗脱样品。用流动相A (HPLC水中的0.08% FA、0.02% TFA)和流动相B (乙腈中的0.08% FA和0.02% TFA)以50 mL/分钟的流速运行梯度。在4.5千伏喷雾电压下操作质谱仪，扫描范围为2000-3500质荷比。
[0275] 抗体轻链和重链的LC-MS分子量测量
[0276] 通过LC-MS来分析抗体轻链(LC)、重链(HC)和去糖基化HC的分子量测量。用水将抗体稀释至1 mg/mL，用终浓度为10 mM的DTT在37℃下在30分钟内将样品还原为LC和HC。为将抗体去糖基化，将100 mg的抗体与2 mL的PNGase F、5 mL的10% N-辛基葡糖苷在37℃下于总体积100 mL中孵育过夜。去糖基化后，用终浓度为10 mM的DTT在37℃下在30分钟内还原样品。使用带C4柱(Vydac，目录号214TP5115, S/N 060206537204069)的Agilent 1100 HPLC系统来除盐，将样品(5 mg)引入到API QSTAR Pulsar i质谱仪上(Applied Biosystems)。使用小梯度来洗脱样品。用流动相A (HPLC水中的0.08% FA、0.02% TFA)和流动相B (乙腈中的0.08% FA和0.02% TFA)以50 mL/分钟的流速运行梯度。在4.5千伏喷雾电压下操作质谱仪，扫描范围为800-3500质荷比。
[0277] 肽作图
[0278] 在75 mM碳酸氢铵中用终浓度为6 M的盐酸胍让抗体在室温下变性15分钟。用终浓度为10 mM的DTT在37℃下在60分钟内还原变性后的样品，接着用50 mM吲哚乙酸(IAA)在黑暗中37℃下实施30分钟烷化。烷化后，让样品在4℃下对四升10 mM的碳酸氢铵透析过夜。用10 mM的碳酸氢铵(pH 7.8)将透析后的样品稀释至1 mg/mL，用胰蛋白酶(Promega，目录号V5111)或Lys-C (Roche，目录号11 047 825 001)以1:20 (w/w)的胰蛋白酶/Lys-C:抗体比将100 mg的抗体在37℃下消化4小时。用1 mL的1 N HCl来终止消化。为了用质谱仪检测对肽作图，通过反相高效液相色谱(RPHPLC)在带有Agilent1100 HPLC系统的C18柱(Vydac，目录号218TP51, S/N NE9606 10.3.5)上分离40 mL消化液。用流动相A (HPLC级水中的0.02% TFA、0.08% FA)和流动相B (乙腈中的0.02% TFA和0.08% FA)以50 mL/分钟的流速梯度运行肽分离。在4.5千伏喷雾电压的正离子模式(positive mode)下操作API QSTAR Pulsar i质谱仪，扫描范围为800-2500质荷比。
[0279] 二硫键作图
[0280] 为使抗体变性，将100 mL的抗体与300 mL的100 mM碳酸氢铵中的8 M盐酸胍混合。检查pH以确保其在7-8之间，让样品在终浓度为6M的盐酸胍中于室温下变性15分钟。用Milli-Q水将变性样品部分(100 mL)稀释至600 mL，以使盐酸胍的终浓度为1 M。用胰蛋白酶(Promega，目录号V5111，批次22265901)或Lys-C (Roche，目录号11047825001，批次12808000)以1:50胰蛋白酶或1:50 Lys-C:抗体(w/w)比(4.4 mg酶:220 mg样品)
让样品(220 mg)在37℃下消化约16个小时。将另外的5 mg胰蛋白酶或Lys-C加入到样品中，让其在37℃下继续消化另外2小时。通过向每种样品中加入1 mL的TFA来终止消化。通过RPHPLC用在Agilent 1100 HPLC系统上的C18柱(Vydac，目录号218TP51 S/N NE020630-4-1A)来分离消化后的样品。用流动相A (HPLC级水中的0.02% TFA、0.08% FA)和流动相B (乙腈中的0.02% TFA和0.08% FA)以50 mL/分钟的流速，在与用于肽作图的梯度相同的梯度下运行分离。HPLC操作条件与肽作图中所用的条件相同。在4.5千伏喷雾电压的正离子模式下操作API QSTAR Pulsar i质谱仪，扫描范围为800-2500质荷比。通过将观测到的肽的分子量与经二硫键连接的胰蛋白酶或Lys-C肽的预测分子量匹配来分配二硫键。
让样品(220 mg)在37℃下消化约16个小时。将另外的5 mg胰蛋白酶或Lys-C加入到样品中，让其在37℃下继续消化另外2小时。通过向每种样品中加入1 mL的TFA来终止消化。通过RPHPLC用在Agilent 1100 HPLC系统上的C18柱(Vydac，目录号218TP51 S/N NE020630-4-1A)来分离消化后的样品。用流动相A (HPLC级水中的0.02% TFA、0.08% FA)和流动相B (乙腈中的0.02% TFA和0.08% FA)以50 mL/分钟的流速，在与用于肽作图的梯度相同的梯度下运行分离。HPLC操作条件与肽作图中所用的条件相同。在4.5千伏喷雾电压的正离子模式下操作API QSTAR Pulsar i质谱仪，扫描范围为800-2500质荷比。通过将观测到的肽的分子量与经二硫键连接的胰蛋白酶或Lys-C肽的预测分子量匹配来分配二硫键。
[0281] 游离巯基的测定
[0282] 用来定量抗体中游离半胱氨酸的方法是基于Ellman的试剂5,5’-二硫-双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)与巯基(SH)的反应，该反应产生特征性的发色团产物5-硫-(2-硝基苯甲酸) (TNB)。反应用下式阐释：
[0283] DTNB+RSH→RS-TNB+TNB¯+H+
[0284] 使用Cary 50分光光度计测量TNB¯在412 nm下的吸光度。使用2-巯基乙醇(β-ME)的稀释液作为游离SH的标准品来绘制吸光度曲线，根据样品在412 nm下的吸光度确定蛋白质中游离巯基的浓度。
[0285] 通过用HPLC级水将14.2 M β-ME系列稀释至终浓度为0.142 mM来制备β-ME标准品母液。然后制备每一浓度的一式三份标准品。使用超过滤器(amicon ultra) 10,000 MWCO离心过滤器(Millipore，目录号UFC801096，批次L3KN5251)将抗体浓缩至10 mg/mL，将缓冲液变换为阿达木单抗所用的配制缓冲液(5.57 mM磷酸二氢钠、8.69 mM磷酸氢二钠、106.69 mM NaCl、1.07 mM柠檬酸钠、6.45 mM柠檬酸、66.68 mM甘露醇，pH 5.2，0.1% (w/v) Tween®)。于室温下在摇床上将样品混合20分钟。然后将180 mL的100 mM Tris缓冲液(pH 8.1)加入到每一样品和标准品中，接着加入300 mL的10 mM磷酸缓冲液(pH 8.1)中的2 mM DTNB。充分混合后，在Cary 50分光光度计上测量样品和标准品在412 nm下的吸光度。通过绘制游离SH的量和β-ME标准品的OD412 nm来获得标准曲线。减去空白后基于该曲线来计算样品的游离巯基含量。
[0286] 弱阳离子交换色谱法
[0287] 用10 mM的磷酸钠(pH 6.0)将抗体稀释到1 mg/mL。使用带WCX-10 ProPac 分析柱(Dionex，目录号054993, S/N 02722)的Shimadzu HPLC系统来分析电荷异质性。将样品装载到采用80%流动相A (10 mM磷酸钠、pH 6.0)和20%流动相B (10 mM磷酸钠、500 mM NaCl、pH 6.0)的柱中，以流速1.0 mL/分钟进行洗脱。
[0288] 寡糖分布(profiling)
[0289] 用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记的试剂来衍生抗体的PNGaseF处理后释放的寡糖。通过正向高效液相色谱(NPHPLC)来分离荧光标记的寡糖，并且基于与已知标准品比较的驻留时间来表征寡糖的不同形式。
[0290] 首先用PNGaseF消化抗体以从重链的Fc部分中剪切N-连接的寡糖。将抗体(200 mg)置于含有2 mL PNGaseF和3 mL 10% N-辛基葡糖苷的500 mL Eppendorf管中。加入磷酸盐缓冲盐水以使总体积为60 mL。在设定为700 RPM的Eppendorf恒温混合器中，让样品于37℃下孵育过夜。亦用PNGaseF消化AFP04C批次的阿达木单抗来作为对照。
[0291] PNGaseF处理后，在设定为750 RPM的Eppendorf恒温混合器中，让样品于95℃下孵育5分钟，以沉淀出蛋白质，然后将样品置于Eppendorf离心机中以10,000 RPM离心2分钟，以向下旋转沉淀的蛋白质。将含有寡糖的上清液转移到500 mL Eppendorf管中，在speed-vac中于65℃干燥。
[0292] 使用购自Prozyme (目录号GKK-404，批次132026)的2AB标记试剂盒来用2AB标记寡糖。根据厂家说明书来制备标记的试剂。将乙酸(150 mL，试剂盒中提供)加入到DMSO小瓶(试剂盒中提供)中，通过上下吸取溶液数次将其混合。将乙酸/DMSO混合物(100 mL)转移到含2-AB染料的小瓶(恰在使用前)，混合直到染料充分溶解。然后将染料溶液加入到还原剂小瓶中(试剂盒中提供)，充分混合(标记的试剂)。将标记的试剂(5 mL)加入到每一干燥的寡糖样品小瓶中，彻底混合。将反应小瓶置于设定为65℃和700-800 RPM的Eppendorf恒温混合器中，反应2小时。
[0293] 标记反应后，使用来自Prozyme的GlycoClean S柱(cartridge) (目录号GKI-4726)去除过量的荧光染料。在加入样品之前，用1 mL Milli-Q水洗涤柱，接着用1 mL
30%乙酸溶液洗涤5次。恰在加入样品前，将1 mL的乙腈(Burdick and Jackson，目录号AH015-4)加入到柱中。
30%乙酸溶液洗涤5次。恰在加入样品前，将1 mL的乙腈(Burdick and Jackson，目录号AH015-4)加入到柱中。
[0294] 所有乙腈通过柱之后，将样品点在新洗过的盘中央，让其吸附到盘上达10分钟。用1 mL乙腈洗涤盘，接着用1 mL 96%的乙腈洗涤五次。将柱置于1.5 mL Eppendorf管之上，用3次Milli-Q水洗涤(每次洗涤400 mL)来洗脱2-AB标记的寡糖。
[0295] 使用连接Shimadzu HPLC系统的Glycosep N HPLC (目录号GKI-4728)柱来分离寡糖。Shimadzu HPLC系统由系统控制器、脱气器、二元泵、带有样品冷却器的自动进样器和荧光检测器组成。
[0296] 在高温下的稳定性
[0297] 用适当的缓冲液、表面活性剂、稳定剂和/或糖类将抗体的终浓度调节至2 mg/mL。然后让抗体溶液过滤除菌，在无菌条件下制备0.25 mL的等分试样。将等分试样置于-80℃、5℃、25℃或40℃下1、2或3周。在孵育期结束后，通过尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE来分析样品。
[0298] 在还原和非还原两种条件下通过SDS-PAGE来分析稳定性样品。所用的程序与本文所述一样。将凝胶用胶体蓝染液(Invitrogen，目录号46-7015, 46-7016)染色过夜，用Milli-Q水脱色直到背景透明。然后用Epson Expression扫描仪(型号1680, S/N DASX003641)扫描染色后的凝胶。为获得更高的灵敏性，用银染试剂盒(Owl Scientific, Gel Company, San Francisco, Calif. US)对同样的凝胶进行银染，并且使用厂家给出的推荐程序。
[0299] 实例1.9：HEK 293-6E细胞中的转染和表达
[0300] 将抗-hTNF-α抗体载体构建体转染到293细胞用于产生蛋白质。使用的293瞬时转染程序为在以下文献中公开的方法的改良：Durocher等(2002) Nucl. Acids Res.30(2e9):1-9和Pham 等(2005) Biotech. Bioeng. 90(3):332-44。转染中使用的试剂包括：
[0301] HEK 293-6E细胞(稳定表达EBNA1的人胚肾细胞系；自加拿大国家研究委员会获得)，在设置为130 rpm、37℃和5% CO2的加湿培养箱中的一次性锥形瓶中培养。
[0302] 培养基：FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen 12338-018)加上25 μg/mL遗 传 霉 素 (Geneticin)(G418) (Invitrogen 10131-027) 和 0.1% Pluronic F-68 (Invitrogen 24040-032)。
[0303] 转染培养基：FreeStyle 293表达培养基加上10 mM HEPES (Invitrogen15630-080)。
[0304] 聚乙烯亚胺(PEI)母液：1 mg/mL无菌母液， pH 7.0，用线性25 kDa PEI (Polysciences)制备，在低于-15℃下保存。
[0305] 添加胰蛋白胨的培养基(Tryptone Feed Medium)：FreeStyle 293表达培养基中含有5% w/v 胰蛋白胨N1的无菌母液(Organotechnie, 19554)。
[0306] 用于转染的细胞的制备：在转染前大约2-4小时，通过离心收集HEK 293-6E细胞，以每毫升大约1,000,000个活细胞的细胞密度重悬于培养基中。对于每次转染，将40 mL的细胞悬液转移到一次性的250-mL锥形瓶中，孵育2-4个小时。
[0307] 转染：将转染培养基和PEI母液预温热至室温(RT)。对于每次转染，让25μg的质粒DNA和50μg的聚乙烯亚胺(PEI)在5 mL的转染培养基中混合，在室温下孵育15-20分钟以允许形成DNA:PEI复合物。对于BR3-Ig转染，每次转染使用25μg的BR3-Ig质粒。将每5-mL DNA:PEI复合物混合物加入到40-mL先前制备的培养物中，并返回到设置为130 rpm、37℃和5% CO2的加湿培养箱中。20-28个小时后，将5 mL添加胰蛋白胨的培养基加入到每一转染中，继续培养六天。
[0308] 表11含有HEK 293-6E细胞中表达的以毫克/升表示的亲本抗体的产量数据。
[0309] 表11：HEK 293-6E细胞中抗-hTNF-α抗体的瞬时表达产量
[0310]
[0311] HEK 293-6E细胞中所有抗体表达良好。在大多数情况下，从HEK 293-6E细胞的上清液中可容易地获得>50 mg/L的纯化抗体。
[0312] 通过引用并入
[0313] 本发明通过引用以其整体将分子生物学和药物递送领域熟知的技术并入。这些技术包括但不限于在以下出版物中所描述的技术：Ausubel等(编辑)，分子生物学的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons, NY (1993)；Ausubel, F. M.等编辑的精编分子生物学实验指南(Short Protocols In Molecular Biology) (第4版，1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X)；可控药物生物利用度药物产品设计和性能(Controlled Drug Bioavailability Drug Product Design and Performance)，Smolen和Ball (编辑)，Wiley, New York (1984)；核酸和蛋白质的结晶，实用方法(Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach)第二版(编辑：Ducruix和Giegé) (牛津大学出版社，New York，1999)中Giegé等所著的第1章，第1-16页；控制释放的医药应用第II卷：应用和评估 (Medical Applications of Controlled Release, Vol. II, Applications and Evaluation) (编辑：Langer和Wise) (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984)一书中Goodson, J.M.所著的第6章，第115-138页；免疫学研究专著 (Research Monographs in Immunology) (总编辑：J.L. Turk) (Elsevier，New York，1981)第3卷中Hammerling等编辑的"单克隆抗体和T-细胞杂交瘤"第563-587页；Harlow等的抗体：实验指南(Antibodies: A Laboratory Manual)，(冷泉港实验室出版社，第2版，1988)；Kabat等，免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest) (国立卫生研究院, Bethesda, Md. (1987)；Kabat, E. A.等(1991)免疫学感兴趣的蛋白质序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生和人类服务部，NIH公开号No. 91-3242；Kontermann和Dubel编辑的抗体工程(Antibody Engineering) (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)；Kriegler，基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual)，Stockton Press，NY (1990)；Lu和Weiner编辑的用于基因功能分析的克隆和表达载体(Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis) (2001) BioTechniques Press. Westborough, Mass. 298 pp. (ISBN 1-881299-21-X)；Goodson, J.M.的控制释放的医药应用(Medical Applications of Controlled Release) (编辑：Langer和Wise) (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1974)；Old和Primrose的基因操作原理：基因工程介绍(Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering) (第3版，1985) Blackwell Scientific Publications, Boston；微生物学研究(Studies in Microbiology)，V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4)；Sambrook等分子克隆：实验指南(Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (第2版，1989)，冷泉港出版社，NY. 第
1-3卷(ISBN 0-87969-309-6)；持续和控制释放药物递送系统(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)，(J.R. Robinson编辑) (Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)；Winnacker, E.L. 从基因到克隆(From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology)(1987) VCH Publishers, N.Y. (由Horst Ibelgaufts翻译), 第634页(ISBN 0-89573-614-4)。
1-3卷(ISBN 0-87969-309-6)；持续和控制释放药物递送系统(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)，(J.R. Robinson编辑) (Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)；Winnacker, E.L. 从基因到克隆(From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology)(1987) VCH Publishers, N.Y. (由Horst Ibelgaufts翻译), 第634页(ISBN 0-89573-614-4)。
[0314] 本申请中各处引用的所有引用的参考文献(包括参考文献、专利、专利申请和网站)的内容以其整体通过引用明确地并入本文，其中所引用的参考文献亦如此。除非另外指出，否则本发明的实践将采用本领域熟知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术。
[0315] 等价实施方案
[0316] 在不脱离本发明的精神或其本质特征的情况下，本发明可以其它具体形式体现。因此，认为前述实施方案在各方面都是阐明性的而非限制本文所述的本发明。因此，通过所附权利要求书而非前述说明来表明本发明的范围，因此落入权利要求等价实施方案的含义和范围内的所有变化都意欲包括在本文之内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法 | 2020-05-08 | 762 |
| 一类含异丙醇胺亚结构的乙酰氧基熊果酸哌嗪类化合物及其制备方法和应用 | 2020-05-13 | 489 |
| 萘酰亚胺苯并咪唑类化合物及其应用 | 2020-05-11 | 445 |
| 昆虫病原真菌球孢白僵菌与闹羊花素复配的杀虫剂 | 2020-05-11 | 630 |
| 一种对非靶生物体具有低毒性的新型天然灭藻剂 | 2020-05-12 | 1018 |
| 一种空气净化处理设备 | 2020-05-08 | 758 |
| 具有杀有害生物效用的分子以及与其相关的中间体、组合物和方法 | 2020-05-08 | 548 |
| 一种VOC废气处理装置 | 2020-05-11 | 626 |
| アルキニルフェニル置換アミド化合物及び有害生物防除剤 | 2020-05-12 | 681 |
| 殺真菌剤としてのピコリンアミド | 2020-05-12 | 651 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈