PROCEDE POUR LA LUTTE BIOLOGIQUE OONTRE LA VARROATOSE ET DISPOSITIF POUR LA MISE EN OEUVRE

DE CE PROCEDE La présente invention porte sur un procédé de lutte biologique contre la varroatose, para- si tose grave de l 'abei l le qui est due à Varroa jacobson i Oud . , acarien ectoparasite spécifique du genre Apis. Ce procédé de luttre biologique comporte deux aspects: d'abord celui du diagnos- tic de cette parasitose, et, ^' dans le cas où il est présent, le piégeage et la destruction de 1 'acarien . La présente invention porte également sur des di spositifs de piégeage pour la mise en oeuvre de ce procédé. La varroatose est apparue en France en

1982 , après s'être propagée en Asie et en Europe de l 'Ouest. El le fait également des ravages en Afrique et en Amérique du Sud, et el le est pré¬ sente depuis quelques mois aux USA. Varroa jacobsoni trouve, dans les colonies de l 'abei lle domestique Ap is Me I lif ica , les condi tions cl imatiques et trophiques optimales dont ila besoin pour se développer. En prélevant 1 ' hé o 1 yrnphe des ouvrières et des mâles - chez les adultes comme chez les larves et les nympheS'¬ il provoque des troubles importants chez ces in¬ sectes , qui entraînent généralement leur mort précoce . La colonie d'abei lles est donc très af¬ faibl ie, et elle disparai t au bout de 4 ans env i - ron . De plus, les colonies parasitées sont rapidement contaminées par des infections se¬ condaires, en particul ier des viroses, qui accélè¬ rent encore leur extinction.

FEUILLE DE REMPLACEMENT A titre d'exemple, une enquête réal isée par le Syndicat des Producteurs de Miel de France à la fin de l 'année 1986 a révélé que, dans la région méditerranéenne, toutes les colonies étaient parasitées, et qu'une grande partie d'entre elles était dans une situation critique. La disparition, ou même l 'affaiblissement, des colonies ad' importantes conséquences négati¬ ves, aussi bien au plan agronomique qu'au plan Û éco log i que :

La disparition des colonies d'abeilles en¬ traîne une diminution de la pollinisation de nom¬ breuses plantes cultivées, l 'abeille étant le principal insecte po 11 in i sateur . Les effets néga- 5 tifs sur certaines productions végétales sont im¬ portants en grandes cultures, en production de semences hybrides, en arbo icul ure et en cultures de peti ts fruits. Egalement, la disparition des colonies d'abeil les entraîne une moins grande ren- 0 tabi l ité des exploitations apicoles, par suite des pertes de colonies, de la diminution des récoltes de miel , et des surcoûts de production dus aux traitements chimiques . Du point de vue écologi¬ que, les abeilles participent d'une façon générale 5 à l 'équil ibre écologique en pollinisant de nom¬ breuses plantes sauvages, et leur disparition ris¬ que de contrarier cet équilibre.

Les seuls traitements actuellement effica¬ ces contre Varroa jacobsoni sont les traitements 0 chimiques à base de molécules acaricides. Cependant , l'u il isa ion de ces produits présente différents inconvénients : d'une part, les aca¬ riens deviennent plus ou moins rapidement résis¬ tants à ces molécules , et, d'autre part, ils 5 risquent de ternir l' image des produits sains et

FEUILLE DE REMPLACEMENT naturels de la ruche et en particul ier du miel . Bien qu' aucune trace de résidu n'ai t jamais été détectée en France, il n'est pas possible de pré¬ juger de l 'aveni r sur ce sujet. De plus, le mode d'uti l isation de ces molécules peut présenter cer¬ ta ins inconvénients : si leur durée d'action est courte (de quelques heures à quelques jours) , les nombreux varroas, qui se trouvent à l ' intérieur des cel l ules operculées, ne sont pas atteints par les molécules et émergeront quelques jours plus tard pour se reproduire à leur tour et prolonger l ' infestation ; de tel les méthodes ont donc une efficac i té l imi tée. A l ' inverse, si leur durée d' action est longue (quelques semaines) , lès molé- cules peuvent passer dans la cire ou le miel au bout d'un certain temps et les contaminer. De plus , l 'uti l isation d'acaricides pendant de lon¬ gues périodes n'est pas sans présenter de ri sques de toxicité pour les abei l les el les-mêmes. On observe que, pour se reprodui re, la fe¬ mel le de Varroa jacobsoni qui tte l 'abei l le adul te et énètre dans une cel lule contenant une larve d'ouvrière ou de ma le, avec une préférence pour les larves de ma les, envi ron deux jours avant 1 ' opercu 1 ati on . Les Déposants ont alors pu démon¬ trer l 'existence de kairomones émi ses par les lar¬ ves d ' Apis mel li fica l igustica qui ont un effet attract if sur Varroa jacobsoni dans les condi tions de température de la colonie . Les principes ac- ti fs de ces kairomones sont à la base du procédé de lutte biologique qui fai tl 'objet de la présen¬ te invention et dont la mise au point est devenue urgente compte tenu du fait que, comme indiqué ci- dessus , cet acarien représente actuel lemen t , au niveau internat ional , le plus grave danger qui me¬ nace les colonies de l 'abei l le Api s mel lif ica.

ΈUILLE DE REMPLACEMENT La présente invention porte donc d'abord sur un procédé pour la lutte biologique contre

Varroa jacobsoni , caractérisé par le fait qu'on introduit, dans le milieu où peut être présent le- dit acarien, un produit attractif constitué par: un extrait hexanique total de larves d'abei lles, notamment des larves de mâles et des larves d'ouvrières, en particul ier, des larves de mâles ( faux-bourdons ),ces larves étant notamment des larves d'a¬ beilles Ap is me 11 if ica 1 i gus t ica ; une fraction active (c'est-à-dire une fraction responsable de l'attraction de Varroa jacobsoni) d'un extrait hexani- que total de larves d' abe i 11es , ce te fraction résultant notamment d'un frac¬ tionnement sur une colonne de silice de l 'extrai t hexanique total précité; au moins un ester ac if dérivant d'un alcool al îphatique en C^-Cg ,comme le méthanol et l'éthanol,et d'un acide car- boxylique en ~-^vr_~~-'2 _< ' ^ chaîne droite ramifiée, saturé ou comprenant une ou plusieurs doubles liaisons cis ou trans, conjuguées ou non, un cycle benzénique ou un hétérocycle pouvant être inclus dans la chaîne dudït acide;

- un produit constitué par un mélange de: -palmitate de méthyle, -palmitate d'éthyle,

-stéarate de méthyle, -stéarate d'éthyle, -oléate de méthyle, -oléate d'éthyle, -l inoléate de méthyle,

FEUILLE DE REMPLACEMENT - 1 i no léate d ' é thy le , -l inolénate de méthyle, -linolénate d'éthyle; ou encore par un mélange actif d'au moins deux de ces esters; -du palmi tate de méthyle, du palmi tate d'éthyle, du l inolénate de méthyle ou un mélange de deux de ces esters ou un mélan¬ ge des trois, ou encore un mélange compor- tant au moins l 'un de ces esters avec au moins un autre ester ne présentant pas en lui-même l 'activité attractive, -un mélange d'esters du type de ceux définis ci-dessus, et obtenu par transes- téri fica ion à partir d'une hui le, comme l 'huile d'arachide, l 'huile de tournesol . Conformément à un mode de réal isation pré¬ féré de ce procédé, on introduit le produit at¬ tractif dans le mi l ieu où 1 'acarien Varroa jacobsoni peut être présent, à une température comprise entre 30 et 36°C.

On peut également associer au produi t at¬ tractif au moins un adjuvant destiné à en augmen¬ ter la volatilité, cet adjuvant étant choisi notamment parmi des esters organiques plus vola¬ ti ls que ceux indiqués ci-dessus et ne présentant pas l'activité attractive selon l ' invention.

L'association avec un tel adjuvant permet¬ tra d'appl iquer ce procédé de lutte biologique aux températures inférieures à 3O ⁰ C, qui peuvent ré¬ gner, suivant les saisons, dans la ruche, en par¬ ticul ier dans la partie inférieure de la ruche, qui est la plus commode d'accès pour disposer le piège selon l ' invention, tel qu' il sera décrit ci - après .

FEUILLE DE REMPLACEMENT On peut également moduler la vitesse de volati lisation du produit attractif, en solubil i¬ sant celui-ci dans une substance organique , tel le qu'une paraffine, une cire végétale, la cire d'abeille ; en le plaçant sous la forme d'une sus¬ pension colloïdale dans l 'eau, immobilisée ou non par un agent gélifiant ; ou encore en l ' incluant dans un support solide, comme la terre d' infusoires . Egalement, on peut prévoir d'associer au produit attractif au moins une hormone, tel le qu'une hormone juvénile, ainsi qu'au moins un di¬ luant sol ide inerte, comme la terre d' infusoires, l 'alumine, la cellulose ou une cellulose modifiée, le po 1 yoxyé th lène , les matières végétales sèches, les polymères comme le polyéthylène ou le polyc- hlorure de vinyle.

Il est également envisageable d'appliquer le produit attractif par pulvérisation ou vaporî- sation (aérosol).

Dans le cas où -l 'on vise à piéger 1 " acarien, on peut, ou bien associer au produit attractif un moyen pour piéger I ' acarien par ag¬ glutination ; ou bien un pesticide ou un acaricide de contact notamment peu ou pas volatil, ce qui l 'empêchera de proliférer.

Dans un mode de réal isation préféré,on ap¬ plique le produit attractif dans la ruche, à l 'entrée de la ruche ou à l 'extérieur de la ruche, au sein d'un piège, en empêchant, si besoin est, au moyen d'une gri lle protectrice, les abeilles de pénétrer dans ledit piège.

En fonction de la température de la colo¬ nie (qui varie en particulier avec la saison et la présence de couvain), et en fonction de

FEUILLE DE REMPLACEMENT l 'emplacement dans lequel on place le piège (dans, à l 'entrée de ou en dehors de la ruche), on asso¬ cie avantageusement à ce procédé un traitement thermique , de façon à en augmenter l 'efficacité . On a en effet constaté que le palmitate de méthyle notamment est très actif à 34°C, mais qu' il ne l 'est plus à 22°C; or, il se trouve que 34°C est la température moyenne du couvain d'abeil les. Pour cette molécule en particul ier, il est donc intér- essant de noter que la température adéquate de son efficacité est légèrement supérieure à son point de fusion (28-30°C).

Ainsi , le procédé de lutte biologique se¬ lon l' invention présente deux aspects comp 1 érren- ta i res :

- d'une part, il peut être util isé comme procédé de diagnostic de la paras i tose (méthode d'avertissement): l 'apiculteur sera ainsi informé de la présence du pa- rasite et de l' importance de 1 ' infesta ti on et donc éventuel lement procéder à une application contrôlée d'un traitement acar ic i de ;

-d'autre part, il pourra être uti l isé comme procédé de lutte proprement dite, les acariens étant éliminés au moyen de pièges (les molécules actives étant uti¬ l isées en leurres ch imi ques ) ,en étant simplement piégés, par exemple par une substance adhésive, ou tués, par exemple, par un acaricide de contact. Ainsi, la présente invention concerne éga¬ lement un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé tel qu' il vient d'être défini, ce disposi- tif étant caractérisé par le fait qu' il consiste

FEUILLE DE REMPLACEMENT en un piège capable d'attirer 1 ' acarien Varroa ja¬ cobsoni par la présence du produit attractif tel que défini ci-dessus, éventuellement associé à au moins un adjuvant destiné à en augmenter la vola- til ité, et/ou à en moduler la vitesse de volatili¬ sation , et/ou à au moins un di luant inerte, et/ou à au moins une hormone.

Dans un mode de réal isation particulier, le piège comprend un support portant un revêtement adhésif dans lequel est incorporée une quantité de produit attractif, et, le cas échéant, d'un pesti¬ cide, d'un acaricide et/ou d'un agent stérilisant, ou encore un support poreux imprégné d'une quan¬ tité de produit attractif et, le cas échéant, de pesticide , d'acaricide , et/ou d'agent stérili¬ sant . En particulier, on peut utiliser un support al longé que l'on disposera à plat sur le sol de la ruche, au centre de celle-ci .

Dans un autre mode de réalisation parti- culier, le piège est constitué par un boîtier ou¬ vert renfermant le produit attractif , le cas échéant associé à au moins un adjuvant tel que dé¬ fini ci-dessus, et/ou à au moins un pesticide, un acaricide et/ou un agent stérilisant, l'ouverture dudit boîtier pouvant être fermée par une grille empêchant les abeilles de pénétrer dans ledit boî¬ tier . Ainsi, dans le cas d'une adjonction d'un acaricide de contact (par exemple, en cas de très forte i nfesta i on ) , il ne serait plus à craindre que cet acaricide pol lue la colonie, puisque, d'une part, les abeilles n'auraient pas de contact avec ce produit (présence de la grille protectrice ); et d'autre part, l'acaricide ne se¬ rait pas diffusé dans la ruche sous la forme d'aérosol comme il l'est dans certaines méthodes

FEUILLE DE REMPLACEMENT actuellement autorisées , et n'atteindrait donc pas les rayons où est stockée la récolte.

Les disposi tifs selon l ' invention peuvent également être associés à un moyen de chauffage, comrne une résistance chauffante, de façon à ac¬ croître l 'efficacité du procédé.

Ainsi, le principal avantage du procédé se¬ lon l ' invention est d'util iser des molécules qui sont généralement présentes naturel lement dans la colonie d'abei l les, et qui ne risquent donc pas de polluer les différents produits de la ruche: miel , pol len, gelée royale, propol is, cire. C'est un procédé qui est d'un emploi aisé, et convient aus¬ si bien aux apiculteurs professionnels qu'aux ama- teurs .

On décrira maintenant l ' isolement et l ' iden ification des substances actives de l ' invention , puis le comportement d'attraction de Varroa jacobsoni par des composés extraits de lar- ves d ' abe i 11 es .

I-Isolement et identification des substan¬ ces ac ti ves a )Extrac t ion :

Les larves mâles d'abei l les Ap is me 11 ifi ca ligustica ont été prélevées deux jours avant 1 ' opercu 1 a ion de leurs cel lules. Trois cents lar¬ ves ont été extraites dans 50 ml d'hexane, pendant une heure, à la température ambiante (6 équiva¬ lents larves (Eql ) par ml ). b)Chromatograph ie sur co 1 onne :

8 ml d'extrait hexanique (48 Eql ), ont été évaporés et chrorna tograph iés sur une colonne de si lice SDS (70 - 230 mesh) longueur 20 cm, diamè¬ tre 0,5 cm . La colonne de si l ice a été lavée abondamment avec l 'acétate d'éthyle et restabil i-

FEUILLE DE REMPLACEMENT sέe par l 'hexane. L'extrait a été élue successive¬ ment avec 4 ml d'hexane (fraction FI ) , 4 ml de dich 1oromé thane (F2), et 4 ml d'acétate d'éthyle (F3) . La fraction active F2 (voir paragraphe II) a été évaporée sous un courant d'azote, et reprise dans 2,7 ml d'hexane. Cette solution hexanique est analysée en CPG. c )Chroma ograph ie en phase gazeuse: L'analyse en CPG a été effectuée sur un chroma tographe Carlo Erba 6CGO équipé d'un injec¬ teur in column, d'un détecteur FID et d'un inté¬ grateur .

Deux types de colonne capillaires ont été util isés pour l'analyse de ^" cette fraction active: -OVI greffée (longueur : 50 m, diamètre:

0,32 mm, programme : 50 : 200°C/10°C/mn ) 2QO à 30O ⁰ C/5°C/mn, gaz vecteur : hydrogène à 4 x IO Pa -Carbowax CW20M (longueur : 50 m; diamè- tre : 0,32 tτm. prograrmie : 4O-26O ⁰ C/3 ^Q C/mn) , gaz vecteur : hydrogène 4 x 10 Pa .

Sur la colonne apolaire OVI , on observe 6 pics avec des épaulements pour certains pics. Sur la colonne polaire CW 20M, on obtient une bonne résolution, et on observe au total 10 pics. d)Coupiage CG/5M:

L'unité de couplage CG/SM est composée d'un chromatographe Varian 3400 équipé d'un injec- teur Sp li Spl itless et d'une colonne CW 20M (longueur : 50 m, diamètre : 0,32 mm), gaz vecteur hélium et d'un spectromètre de masse Finigan Mat Incos 50. Le chroma ogrammε résultant est repré- sent sur la figure 1

_F εuιu _* ε

Tous les 10 pics ( a à j ) qui composent La fraction active F2 ont été identifiés et quan¬ i fi s : a)palmitate de méthyle 0,26 ..g/Eql b )palmi tate d'éthyle 0,09 ^^g/Eql c)stéarate de méthyle 0,08 Λg/Eql d)stéarate d'éthyle 0,04 ^g/Eql e)oléate de méthyle 0,07 .^g/Eql

10 f)oléate d'éthyle 0,03

^* 0, 18 ^ g/Eql 15 Leurs spectres de masse et leurs temps de rétention, en CPG sur deux colonnes de polarité différente sont identiques avec ceux de référence obtenus commercialement chez Sigma.

I .Etude du compo r ernent d' attract ion de Varroa

20 jacobson i en présence de di f fé rentes substances is sues de 1 ' insecte hôte .

Cette étude a été réal isée dans un ol fac- tomètre dynamique à quatre choix, qui permet le contrôle rigoureux des flux dans les quatre champs

25 odorisés ou non (Vet et al, Phys io 1. Entomo 1.8 ,pâges 97-106 (1983); Kaiser et al , J. Insect.Behav (1988) (sous presse). Dans le pro¬ tocole choisi , sur les quatre champs de 1 ' ol fac omè re , un ou deux selon les cas sont

30 odorisés, les autres étant inodores . Le disposi¬ ti f était placé dans une enceinte thermostatée à 32 +_ 1°C (humidité relative : 90 + 5%) , qui est la température correspondant à la préférence thermi¬ que de 1 'acarien (le Conte et Arnold, Ap i do I og ie ,

35 16(2) ,pages 155-164 (1988). La répartition de

FEUILLE DE REMPLACEMENT Varroa jacobsoni dans les différents champs a été analysée selon deux méthodes com lémentaires: i ) une représentation sous la forme de niveaux de gris d' intensité croissante, établie grâce à un programme informatisé et correspondant à la présence cumulée de Varroa jacobsoni pendant toute la durée de l 'expérience (Backchine et al . 1988, en préparation ). ii )le nombre moyen de varroas présents dans les champs odorisés et dans les champs témoins a été calculé en fonction du temps passé dans chaque champ .

La figure 2 du dessin annexé représente la distribution spatiale des femel les de Varroa j a- 5 cobson i dans l ' ol factome tre .

A: témoin: les quatre champs sont i nodores .

B: palmitate de méthyle: deux des quatre champs (supérieur gauche et inférieur droit) sont odorisés avec du palmitate. de méthyle; les deux autres champs sont inodores.

La figure 3 il lustre les réponses olfacti¬ ves des femelles de Varroa jacobsoni au palmitate de méthyle et à d'autres composés d'extraits de 5 larves ma les d'abeilles.

Chacun des champs d'un olfactomètre dyna¬ mique à quatre choix était traversé par un flux d'air, à la vitesse de 0,9 _-»-_ O, 1 l/h. Selon les cas, un ou deux des champs étaient odorisés, les Q autres étant inodores . Les larves d'abei lles, ou les différents extraits et composés dont l 'efficacité biologique était à tester, étaient disposés dans une fiole en verre connectée à un bras de l ' ol fac ometre . Les extraits étaient dé- 5 posés sur un papier filtre Whatman (GF/F) de 2 x 2

U1U.E DE BEMPS-ACε^εNT cm ; les autres fioles recevant un papier fi l tre t moin des mêmes dimensions. Les extraits chimi¬ ques étaient renouvelés toutes les deux expérimen¬ tations ; auparavant, 1 ' ol fac tome tre était nettoyé à l 'alcool et rincé à l 'eau disti l lée. Le disposi¬ ti f subissait une rotation de 90° après 7 tests consécutifs , afin d'éliminer l ' interférence d'autres signaux dans l 'orienta ion des acariens. Les varroas uti l isés étaient des feme l ies prélevées dans une colonie d'abei lles et mainte¬ nues à 22°C pendant 7 à 9 jours sur des ouvrières dans une cagette d'élevage.

56 varroas répartis en deux séries ont été uti l isés pour chaque test. Les acariens ont été testés individuellement pendant 6 minutes 15 se¬ condes . Leur posi tion était relevée toutes les 5 secondes .

En l 'absence de stimulation odorante, les varroas se distribuent au hasard dans l ' ol fac tornè tre (figure 2).

Le temps passé dans chacun des quatre champs ne diffère pas si gn ifi cat i vement des autres

(test de Friedman, X ² = 32,76; DDL= 57) (figure 3).

En présence de 15 larves ma les vivan es d' Ap is me 11 if ica ligustica (âgées de 5-6 jours ), les acariens ont présenté un comportement d'attraction très significatif (X = 7,02: p<0,01) (figure 3) , démo trant ainsi que les signaux chi¬ mi ques sont impl iqués dans la reconnaissance des larves par les feme lies de Varroa jacobsoni .

Un extrai t hexanique de larves d'abei l les mâles de même âge que les précédentes, (représentant 1,2 Eql ) s'est révélé également très attractif (X ² = 7,6 ; p<0,01). Cet extrait a été fract ionné sur une colonne de silice en trois par-

FEUILLE DE REMPLACEMENT ties (voir paragraphe I). Chacune des trois frac¬ tions FI, F2 et F3 (représentant 1,8 Eql ) a été testée au moyen du test biologique décrit ci- dessus ; seule la fraction F2 s'est avérée attrac- tive (X ² = 7,28; p<0,01) ( fi gure 3).

L'efficacité biologique des molécules identifiées à partir des dix composés présents dans cette fraction a été testée à raison de 1 q de chaque constituant par champ odorisé. Le palmi- tate de méthyle (PM) , le palmitate d'éthyle (PE) et le linolénate de méthyle (LM) ont provoqué sépa¬ rément un comportement d'attraction de Varroa ja- cobson i identique à celui de l 'extrait total (figure 3) , alors que les ^* autres composés sont 5 sans effet.

Dans un autre essai, le mélange de deux mo¬ lécules : PM et SM (1/1) a été testé en compéti¬ tion avec le PM seul ; aucune différence significative n'apparaî entre les deux champs odorisés (X ² = 0,04). Le SM n'a donc aucun effet synergique sur 1 ' a tract ivi té entraînée par le PM utilisé seul.

De plus, 1 ' at trac tivi té du PM est étroite¬ ment dépendante de la température ambiante . Si à 5 la température de 32 +_ 1°C l'attraction du PM est hautement significative (figure 3), util isée à la température de 22°C, aucune différence significa¬ tive dans la répartition des varroas entre les champs odorisés par le PM et les champs témoins ϋ (X = 0,42) n'a pu être mise en évidence (figure 3) . La chaleur et les facteurs chimiques ont donc un effet synergique sur la manifestation du comportement d'attraction de Varroa jacobsoni . Le

FEUILLE DE REMPLACEMENT rôle crucial joué par la température dans les re¬ lations abe i 11 e-var roa a déjà été démontré (Le Conte et Arnold, 1986, 3 ^rd Meeting of the EC Varroa Experts' Group, Bad Homburg RFA; Le Conte et Arnold, 1987 ,A i do 1 og ie 18(4), pages 305 à 320)

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