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一种棘孢曲霉菌株及其应用

阅读：1028发布：2020-06-20

专利汇可以提供一种棘孢曲霉菌株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种棘孢曲霉菌株及其应用，该棘孢曲霉NH9于2019年4月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.17191，该技术不但能有效促进黄瓜植株生长并作为生物农药使用，而且成本低、操作简单、无污染、对环境不构成危害。，下面是一种棘孢曲霉菌株及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)NH9，其保藏编号为CGMCC17191。
2.根据权利要求1所述的棘孢曲霉菌株在促进植物生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物为黄瓜。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：将棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)NH9培养的菌液稀释50倍施加于幼苗的根部。
5.根据权利要求1所述的棘孢曲霉菌株在生物防治中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述生物防治为对植物的诱导抗病性作用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述诱导抗病性作用为诱导植物产生免疫信号，免疫信号为水杨酸。
8.根据权利要求5所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：所述诱导抗病性作用为诱导植物抵抗枯萎病。
9.根据权利要求8所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：所述枯萎病为由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病。
10.根据权利要求5～9任一项所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：所述植物为黄瓜。

说明书全文

一种棘孢曲霉菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用。

背景技术

[0002] 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)是曲霉属下的一种黑曲霉(AspergillusNiger)，一种丝状真菌。棘孢曲霉中具有各种生物活性代谢产物，例如抗菌因子aculeacinsA–G、α- 葡萄糖苷酶抑制因子aspergillusolA、抗微生物因子secalonic acids D and F等。这些化合物有着抗微生物、防污损、拒食活性和植物毒素等活性。现有报道中该类菌株诱导抗病能力未做深入挖掘探索。

[0003] 水杨酸是植物对多种病害的抗性和致病攻击的响应方面的一种重要的信号分子，在调节植物的生理生长中发挥关键作用。它是植物系统获得性抗性的重要诱导因子，是一系列防卫反应的信号途径中的重要组成成分。

[0004] 黄瓜(Cucumis sativus L.)是一种属于葫芦科的一年生攀援草本植物。中国各地普遍栽培，且各地区均有温室和大棚栽培种植。其富含蛋白质、糖类、维生素、胡萝卜素、尼克酸、钙、磷、铁等营养成分，是中国各地夏季主要蔬菜之一，茎藤药用，能消炎、祛痰、镇痉。但由于病害流行及其化学农药的使用，其农药残留严重。

[0005] 黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum)病原为尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum (Schl.)F.sp cucumerinum Owen)，属半知菌类真菌。是一种由土壤传染，通过根或根颈部侵入的系统性病害，是黄瓜生产上较难防治的病害之一，连作三年，会使黄瓜枯萎病发病率达到70％，产量减少60％以上，造成重大的损失。

发明内容

[0006] 为克服黄瓜存在枯萎病等生产上较难防治的病害、和由于病害流行及其化学农药的使用造成农药残留严重等问题，本发明提供一种棘孢曲霉菌株，和利用该棘孢曲霉菌株促进黄瓜植株生长、防治黄瓜枯萎病、诱导植物产生获得性抗病性的应用技术，该技术不但能有效促进黄瓜植株生长并作为生物农药使用，而且成本低、操作简单、无污染、对环境不构成危害。

[0007] 本发明人从中国天津宁河葡萄种植土壤中得到一株真菌，证明该真菌具有促进黄瓜植株生长、防治黄瓜枯萎病、诱导植物产生获得性抗病性的能力。该真菌经ITS基因序列同源性分析鉴定为棘孢曲霉Aspergillus aculeatus，其ITS rDNA基因序列序列表SEQ NO.1，其系统发育树见附图1所示，该菌株构成本发明的第一方面。

[0008] 由于该真菌具有促进黄瓜植株生长的能力，能够用于促进某类植物生长，特别是黄瓜。这构成本发明第二方面。其中优选的是，在使用时，将棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus) NH9培养的菌液稀释50倍施加于黄瓜幼苗的根部。

[0009] 同时，本发明第三方面是提供一种用于防治黄瓜枯萎病的菌剂及方法。菌剂的制作方法在于发酵。方法是将菌体接种于PDA液体培养基中150r/min、37℃培养7-10d。

[0010] 最后，本发明第四方面是提供一种诱导植物产生获得性抗病性的方法，其特征在于，通过添加本菌剂可诱导植物产生并积累水杨酸，实验条件是选用长势一致的黄瓜苗至第二片真叶长出时，将20～50倍NH9稀释液施用于植株根部，77～125h时水杨酸的积累量是对照组的1.3～3.5倍。

[0011] 本发明的优点和有益效果为：

[0012] 1、本申请提供的棘孢曲霉NH9能够促进黄瓜植株生长。50倍发酵液处理后促生长效果极显著高于对照组。其中125h时，与对照相比，植物株高20倍处理增长6.82％～ 10.32％，50倍处理增长33.28％～41％；植物根长20倍处理增长17.97％～20.03％，50 倍处理增长67.68％～77.32％；植物根系鲜重20倍处理增长321.7％～378.3％，50倍处理增长452.6％～497.9％；植物根系干重20倍处理增长155.4％～194.6％，50倍处理增长
232.7％～276.3％。

[0013] 2、本申请提供的棘孢曲霉NH9能够促防治黄瓜枯萎病。当棘孢曲霉NH9发酵液的施加量为黄瓜枯萎菌液的3倍或以上时，对黄瓜苗基本不产生致病作用或致病性不明显。

[0014] 3、本申请提供的棘孢曲霉NH9可诱导植物产生获得性抗病性，其依据是棘孢曲霉 NH9具有诱导植物产生并积累水杨酸的能力。在用棘孢曲霉NH9处理后(在54h～77h、 77h～101h两个实验组内)喷施稀释50倍浓度菌液的处理组和喷施稀释20倍浓度菌液的处理组的黄瓜幼苗叶片内水杨酸含量与对照组的相比具有显著性差异，77～125h时水杨酸的积累量是对照组的1.3～3.5倍。50倍处理效果高于20倍处理。

[0015] 其中，棘孢曲霉Aspergillus aculeatus于2019年4月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.17191。

附图说明

[0016] 图1是棘孢曲霉NH9的系统发育树。

[0017] 图2是棘孢曲霉NH9在20倍浓度、50倍浓度和对照组处理0、24h、54h、77h、101h、 125h后黄瓜幼苗株高变化的统计报告图。

[0018] 图3是棘孢曲霉NH9在20倍浓度、50倍浓度和对照组处理125h后黄瓜幼苗根长变化的统计报告图。

[0019] 图4是棘孢曲霉NH9在20倍浓度、50倍浓度和对照组处理125h后黄瓜幼苗根系鲜重变化的统计报告图。

[0020] 图5是棘孢曲霉NH9在20倍浓度、50倍浓度和对照组处理125h后黄瓜幼苗根系干重变化的统计报告图。

[0021] 图6是棘孢曲霉NH9在20倍浓度、50倍浓度和对照组处理125h后黄瓜幼苗根系的对比照片。

[0022] 图7是棘孢曲霉NH9防治黄瓜枯萎效果图。其中图A是黄瓜枯萎病菌+NH9处理(处理组)，植株健康生长；图B黄瓜枯萎病菌处理(对照组)，植株根茎部发病，说明棘孢曲霉NH9具有在黄瓜植株中防治枯萎病的作用。

[0023] 图8是棘孢曲霉NH9不同浓度处理黄瓜叶片水杨酸积累量统计报告图。

[0024] 对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

[0025] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

[0026] 实施例1：菌株的分离纯化及鉴定

[0027] 1.土壤采集：本试验对中国天津宁河葡萄种植土壤进行了采集，采集土样于4℃保存，为筛选土壤真菌备用。

[0028] 2.土壤真菌分离纯化：(1)取5g土壤加入1％的生理盐水中，分别形成为1∶102、1∶103、1∶104、1∶105和1∶106土壤稀释液，充分震荡后，吸取上述不同稀疏度的土壤稀释液各
100μL分别涂布于含有氨苄青霉素的PDA固体培养基上，然后将PDA固体培养基均置于28℃下培养2～3天。(2)经过培养后，挑选出典型的真菌菌落在PDA固体培养基上继续进行纯培养，得到棘孢曲霉Aspergillus aculeatus中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)No.17191。

[0029] 3.菌株鉴定：(1)用CTAB法提取真菌DNA。采用北京索拉宝公司提供的真菌基因组提取试剂盒提取菌株TJ的基因组DNA。(2)选用真菌ITS基因序列(见序列表SEQ NO.1)进行PCR扩增。(3)PCR所得产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程股份有限公司进行测序。(4)将拼接序列使用NCBI BLAST进行比对，得到对应的真菌，并构建系统发育树，如图1所示，以ITS rDNA基因序列同源性为基础构建形成10株相关真菌的系统发育树，可知棘孢曲霉NF39碱基序列相似性为99％，与本属菌种Aspergillus aculeatus无差异。

[0030] 实施例2：促进黄瓜植株生长实验

[0031] 1.菌株的发酵

[0032] 培养基:PDB培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH自然)

[0033] 菌种培养:将固体PDA培养基中的真菌少许接入液体培养基配方(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min)，放至摇菌箱内摇，培养时间7-10d。

[0034] 2.黄瓜幼苗灌菌

[0035] 将摇好的菌量取20mL和10mL，分别倒入500mL的锥形瓶中，添加蒸馏水至400mL 和500mL，使其定容稀释为20倍和50倍的同一菌的不同浓度的菌液，以纯蒸馏水作为对照，把稀释好的液体均匀倒入育苗穴盘内靠近植物根部的土壤周围，每棵幼苗植株浇 10mL。

[0036] 3.黄瓜生长指标的测定

[0037] 分别在黄瓜幼苗灌菌前及灌菌后24小时、54小时、77小时、101小时、125小时测量各幼苗的株高，并分别测量20倍稀释菌液、50倍稀释菌液以及对照组的黄瓜幼苗的根长、根的鲜重和根的干重。

[0038] 株高：即黄瓜幼苗植株上子叶至生长点的高度；

[0039] 根长：主根生出位置至根尖的长度；

[0040] 根的鲜重：将黄瓜幼苗的根部从土壤中取出，洗净、晾干后，分别测量其重量，所得数据为根的鲜重；

[0041] 根的干重：测量鲜重之后的根分别用滤纸包裹，做好标记，放进热鼓风干燥箱，在 121摄氏度下烘干8小时，取出，测量各根，所得数据为根的干重。

[0042] 4.实验结果

[0043] 如图2至图6所示，用棘孢曲霉NH9的20倍、50倍发酵液处理黄瓜植株根部。50 倍发酵液处理后促生长效果极显著高于对照组。其中125h时，与对照相比，植物株高20 倍处理增长6.82％～10.32％，50倍处理增长33.28％～41％；植物根长20倍处理增长 17.97％～20.03％，50倍处理增长67.68％～77.32％；植物根系鲜重20倍处理增长321.7％～
378.3％，50倍处理增长452.6％～497.9％；植物根系干重20倍处理增长155.4％～
194.6％， 50倍处理增长232.7％～276.3％。

[0044] 实施例3：诱导黄瓜抗枯萎病实验

[0045] 1.菌株的发酵

[0046] 培养基:PDB培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH自然)

[0047] 菌种培养:将固体PDA培养基中的真菌少许接入液体培养基配方(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min)，放至摇菌箱内摇，培养时间7-10d。

[0048] 2.黄瓜幼苗灌菌

[0049] 将摇好的菌量取20mL和10mL，分别倒入500mL的锥形瓶中，添加蒸馏水至400mL 和500mL，使其定容稀释为20倍和50倍的同一菌的不同浓度的菌液，把稀释好的液体与黄瓜枯萎菌液2:1、3:1的体积混合液，在每盆黄瓜幼苗灌根5mL处理，并设置只灌根黄瓜枯萎菌液
5ml，清水(CK)对照组观察现象，每组实验设置三个重复，并于48h、 5d、7d、10d、15d、20d观察现象。

[0050] 3.实验结果

[0051] 将棘孢曲霉NH9的发酵液与黄瓜枯萎菌液采取4:1～2的比例混合，取5～10ml灌根，发现在第7d时黄瓜底部叶片、茎部出现发黄但并没有失水萎蔫的现象。

[0052] 将棘孢曲霉NH9与黄瓜枯萎菌液采取6:1～2的比例混合，取5～10ml灌根，每天定期观察没有发现黄瓜叶片及茎部有明显的发黄、萎蔫、枯萎等症状。

[0053] 只施加5～10ml黄瓜枯萎菌液灌根的苗子在第5d发现叶子失水干枯的现象。

[0054] 当棘孢曲霉NH9发酵液的施加量为黄瓜枯萎菌液的3倍或以上时，对黄瓜苗基本不产生致病作用或致病性不明显。

[0055] 结合附图说明A是什么，B是什么。

[0056] 如图7中A是黄瓜枯萎病菌+NH9处理(处理组)，植株健康生长；图B黄瓜枯萎病菌处理(对照组)，植株根茎部发病，说明棘孢曲霉NH9具有在黄瓜植株中防治枯萎病的作用。

[0057] 实施例4：水杨酸测定实验

[0058] 1.菌液的发酵

[0059] 培养基:PDB培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH自然)

[0060] 菌种培养:将固体PDA培养基中的真菌少许接入液体培养基配方(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min)，放至摇菌箱内摇，培养时间7-10d。

[0061] 2.黄瓜幼苗灌菌

[0062] 将稀释浓度分别为20倍、50倍的NH9均匀灌于黄瓜幼苗根部周围，10mL/株，每个处理设三个重复，对照组植株喷PDA液体培养基。

[0063] 3.黄瓜幼苗植株上的叶片取样

[0064] 在上述处理后的24小时、54小时、77小时、101小时、125小时分别取黄瓜植株的顶端叶片做样本测定水杨酸含量。

[0065] 4.水杨酸的测定

[0066] 下文中水杨酸的提取、分离纯化及测定参考谷医林、卢春燕、Jennifer Smith-Becker 等所用方法。

[0067] (1)水杨酸的提取：取黄瓜幼苗植株上的叶片2.0g放进灭菌后或用甲醇清洗干净的研钵中，边研磨边分3-4次加入共6mL80％的冷甲醇(即在-20摄氏度下冰箱内放置的80％的甲醇)充分研磨，尽量使研钵壁和研磨棒上的残留样留至最少，样品倒入离心管时保持尽量不沾在管壁为最佳，使用超声波清洗机超声处理5min后，用天平将各样品通过 80％冷甲醇严格配平，放进高速低温离心机内以10000r/min再处理5min，吸取上清液至干净的离心管后，向原管内分两次加入95％预冷甲醇进行二、三次提取，每次2.5mL,所得上清液与第一次提取的上清液装于同一离心管内放进-20摄氏度冰箱内，冷冻1h，拿出后再次用天平通过添加95％预冷甲醇严格调平，放进高速低温离心机内以10000r/min 处理5min；所得上清液倒入规格10mL的蒸发瓶内，用全自动旋转蒸发仪蒸发浓缩到浓度为1％(即几乎全干)，停止仪器运作，拿下蒸发瓶用2mL甲醇冲洗，所得溶液内加 4％偏磷酸(W/V)2mL，取同水相等体积的乙酸乙酯(4mL)，待溶液有明显分层后，吸取上层液至蒸发瓶内，用旋转蒸发仪蒸发至近全干，用500微升甲醇冲洗，倒入2mL 的离心管内，得游离态水杨酸的粗样。

[0068] (2)硅胶板及展开液的制作：参照李兆亮、原永兵等的方法，将规格为GF254的硅胶与0.5％羟甲基纤维素钠(CMC)按W：V＝1:2的比例配制，均匀涂至10cm×20cm 的干净玻璃板上，厚度为0.5cm，在自然风下晾干待用；将甲苯、二氧六环、乙酸按V： V：V＝90:25:4的比例混匀倒入层析缸中，作为展开液待用。

[0069] (3)水杨酸的分离纯化：将2步骤中制得的硅胶板放入热鼓风干燥箱，在110摄氏度下活化0.5小时，把1步骤中得到的游离态水杨酸粗样用500微升甲醇溶解，然后在活化后的硅胶板左侧点30微升上述溶液样品、右侧点10微升做定位用的50ppm水杨酸 -甲醇溶液，将点样后的硅胶板放入2步骤中的展开液中，盖紧玻璃盖，进行层析。观察待展开液跑到接近硅胶板边缘时取出，置于自然风下晾干，在紫外光下观察标出标准水杨酸的位置，依此位置对照刮样品水杨酸于2mL离心管内，再加1mL甲醇，用漩涡仪漩涡后用超声机超声一段时间，以水杨酸几乎被甲醇洗脱为准，再放入离心机以10000 r/min的转速处理5分钟，取上清液，再放入离心机以10000r/min的转速处理10分钟。用注射器抽取上清液，通过0.22μm微孔过滤器打入规格2mL的进样瓶中，待用高效液相色谱仪测定水杨酸含量。

[0070] (4)水杨酸标准曲线的绘制：取水杨酸标品0.01g，倒至100mL锥形瓶中，用色谱甲醇定容至100mL，再用50mL锥形瓶通过添加色谱甲醇定容稀释，制成0.1ppm、0.5ppm、 1ppm、2ppm、5ppm的标准溶液，用注射器抽取不同浓度溶液，分别通过0.22μm微孔过滤器打入规格
2mL的进样瓶中；配制流动相(甲醇和0.1％乙酸)，经真空泵处理，再超声半小时后，封好口，与标液一起待用高效液相色谱仪测定、绘制标准曲线。

[0071] (5)黄瓜幼苗叶片内水杨酸含量的测量：将3、4中装有样品的进样瓶放入高效液相色谱仪，设置流动相甲醇和0.1％乙酸比例为V：V＝80:20、柱温为26摄氏度、流速为0.8mL/min，检测波长为300纳米，每次进样20微升。

[0072] 5.实验结果

[0073] 如图8所示，在处理后的24h-54h，用不同稀释倍数处理的黄瓜幼苗叶片内的水杨酸含量与对照组黄瓜幼苗叶片内的水杨酸相近，无明显差异；处理后的54h-77h，喷施稀释 50倍浓度菌液的处理组和喷施稀释20倍浓度菌液的处理组的黄瓜叶片内水杨酸含量与对照组的相比均有明显增加，其中在77h时，50倍菌液处理组水杨酸积累量约是对照组的3.5倍，20倍菌液处理组水杨酸积累量约是对照组的2.7倍；处理后的77h-101h，稀释50倍浓度菌液的处理组比稀释20倍浓度菌液的处理组的水杨酸含量增长幅度大，两个处理组的水杨酸含量均大于对照组，其中在101h时，50倍菌液处理组水杨酸积累量约是对照组的1.9倍，
20倍菌液处理组水杨酸积累量约是对照组的1.5倍。

[0074] 以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

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