一种白蚁胚胎发育研究方法
专利汇可以提供一种白蚁胚胎发育研究方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种白蚁胚胎发育的研究方法，包括不同发育阶段的白蚁卵胚胎 染色 研究和白蚁卵人工孵化研究，包括以下步骤：（1）收集白蚁卵；（2）白蚁卵前期处理；进行离巢饲养，即将清洗完毕的白蚁卵用灭过菌的刷子，扫至1.5%琼脂糖平板配有200PPM 四环素 和200PPM多菌灵的培养基上，用 封口膜 封口，放入恒温箱避光放置；（3）不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究包括卵壳的 软化 、卵的固定、白蚁卵的染色，制片与保存；（4）白蚁卵人工孵化研究，本方法通过DAPI染细胞核完整观察白蚁胚胎发育过程，建立人工离巢饲养白蚁卵的方法，探索白蚁卵离巢孵化的条件，为白蚁 生物 防治提供坚实的理论 基础 和实践指导。，下面是一种白蚁胚胎发育研究方法专利的具体信息内容。
1.一种白蚁胚胎发育的研究方法，其特征是：包括不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁卵人工孵化研究，包括以下步骤：
（1）收集白蚁卵
将工蚁、兵蚁、无翅繁殖蚁以10:1:1的比例养虫室避光饲养，获得无翅繁殖蚁产出的白蚁卵；
（2）白蚁卵前期处理
将白蚁卵清除白蚁卵表面的杂质和病原菌后进行离巢饲养，所述离巢饲养的具体方法为：在超净工作台中将清洗完毕的白蚁卵用灭过菌的刷子，扫至1.5%琼脂糖平板配有
200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养基上，用封口膜封口，放入恒温箱避光放置，获得不同发育天数的白蚁卵，以用于不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁卵人工孵化研究；
（3）不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究
a.卵壳的软化
将发育天数为1-30天白蚁卵先放到-80摄氏度冰箱冷冻处理10min，分别进行软化处理，处理时间和方法如下：
发育天数为1-7d的白蚁卵，加入30%次氯酸钠溶液处理8min，静止；
发育天数为8-15d的白蚁卵，加入50%次氯酸钠溶液处理10min，静止；
发育天数为16-22d的白蚁卵，加入70%次氯酸钠溶液处理8min，静止；
发育天数为23-30d的白蚁卵，加入80%次氯酸钠溶液处理10min，静止；
所述次氯酸钠溶液加样量为每25-35个白蚁卵样品，加入2ml上述次氯酸钠溶液；上述处理后均将次氯酸钠溶液用移液枪吸出，将软化处理后的白蚁卵用1×PBS润洗3次，所述PBS为磷酸缓冲液Phosphate Buffered Saline，pH为7.4；
b.卵的固定
上述软化处理后的白蚁卵，分别进行固定，所述白蚁卵固定方法如下：
上述不同发育天数的白蚁卵均加入10%多聚甲醛（Paraformaldehyde）溶液，每25-35个白蚁卵加入2ml的10%多聚甲醛溶液，室温下200 rpm摇1h固定，后用移液枪吸出多聚甲醛溶液；
c.白蚁卵的染色
上述不同发育天数的白蚁卵固化处理后，随即加入预先配好的染色液（DAPI：PBS =1:
1000），每25-35个白蚁卵加入1ml染色液，用锡纸包好避光保存，置于室温中染色16h，后将DAPI溶液用移液枪吸出，后加入1mlPBS（1×）清洗，每次静置10min，重复三次；
d.制片与保存
用移液枪将上述处理的白蚁卵与剩余溶液全部吸走至载玻片上，吸除PBS缓冲液后加入100μL 50%甘油（甘油：PBS=1：1）溶液，盖上盖玻片，观察胚胎发育情况；
（4）白蚁卵人工孵化研究
将采集发育天数为27-29天的白蚁卵，放入设有无菌的湿润原浆纸的培养皿中，配有润湿的松木条，并放入同一种群工蚁，白蚁卵和工蚁的数量比为25:10，进行人工孵化。
一种白蚁胚胎发育研究方法
技术领域
背景技术
发明内容
将工蚁、兵蚁、无翅繁殖蚁以10:1:1的比例养虫室避光饲养，获得无翅繁殖蚁产出的白蚁卵；
（2）白蚁卵前期处理
将步骤1获得的白蚁卵加入双蒸馏水，放至漩涡震荡仪低速震荡，将水吸出，重复三次以清除白蚁卵表面的杂质和病原菌后进行离巢饲养，离巢饲养的具体方法为：在超净工作台中将清洗完毕的白蚁卵用灭过菌的刷子，扫至1.5%琼脂糖平板配有200PPM四环素和
200PPM多菌灵的培养基上，用封口膜封口，放入恒温箱避光放置，不同天数的白蚁卵单独放置于培养基上以获得不同发育天数的白蚁卵；用于不同发育天数的白蚁卵胚胎进行染色，对白蚁胚胎发育和卵孵化进行研究；
（3）不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究
a.卵壳的软化
将步骤2中发育天数为1-30天白蚁卵先放到-80摄氏度冰箱冷冻处理10min，进行软化处理，依据不同的发育时期对其处理时间和方法不同，具体如下：
发育天数为1-7d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml30%次氯酸钠NaClO溶液处理8min，静止；
发育天数为8-15d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml50%次氯酸钠NaClO溶液处理10min，静止；
发育天数为16-22d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml 70%次氯酸钠NaClO溶液处理8min，静止；
发育天数为23-30d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml 80%次氯酸钠NaClO溶液处理10min，静止；
处理后均将次氯酸钠NaClO溶液用移液枪吸出，将软化处理后的白蚁卵用1×PBS润洗3次，所述PBS为磷酸缓冲液Phosphate Buffered Saline，pH为7.4，所述PBS配制方法为：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.24g/L，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.44g/L，氯化钠(NaCl)：8g/L，氯化钾(KCl)：0.2g/L，用DD水定容到1L，采用浓盐酸调pH至7.4，高温高压灭菌后置于4摄氏度冰箱保存待用；
b.卵的固定
上述软化处理后的白蚁卵，分别进行固定，所述白蚁卵固定方法如下：
上述不同发育天数的白蚁卵加入10%多聚甲醛（Paraformaldehyde）溶液，每25-35个白蚁卵加入2ml的10%多聚甲醛，室温下200 rpm摇1h固定，后用移液枪吸出多聚甲醛；
c.白蚁卵的染色
上述不同发育天数的白蚁卵固化处理后，随即加入预先配好的染色液（体积比DAPI：
PBS =1:1000），即将1ml染色液加入至于5ml离心管的白蚁卵中，用锡纸包好避光保存，置于室温中染色16h，后将DAPI溶液用移液枪吸出，后加入1mlPBS（1×）清洗，每次静置10min，重复三次；
d.制片与保存
用移液枪将上述处理的白蚁卵与剩余溶液全部吸走至载玻片上，吸除PBS缓冲液后加入100μL 50%甘油（体积比甘油：PBS=1：1）溶液，盖上盖玻片，避光保存，在Olympus激光共聚焦扫描显微镜FV3000下观察胚胎发育情况；
（4）白蚁卵人工孵化研究
将采集发育天数为27-29天的白蚁卵，放入设有无菌的湿润原浆纸的培养皿中，配有润湿的松木条，并放入同一种群工蚁，白蚁卵和工蚁的数量比为25:10，5天观察孵化情况。
附图说明
图3为不同发育时期白蚁卵胚胎DAPI染色图，其中A：发育天数为胚胎发育早期（5天）的白蚁卵胚胎DAPI染色图，B：发育天数为胚胎发育中期（13天）的白蚁卵胚胎DAPI染色图，C：
发育天数为胚胎发育晚期（28天）的白蚁卵胚胎DAPI染色图；
图4.破壳孵化时不同处理对白蚁能否成功孵化的对比试验，其中A：正常生长的白蚁卵，B：死亡的白蚁卵。
具体实施方式
1.收集白蚁卵
将工蚁、兵蚁、无翅繁殖蚁以10:1:1的比例养虫室避光饲养，获得无翅繁殖蚁产出的白蚁卵；
2.白蚁卵前期处理
将步骤1获得的白蚁卵加入双蒸馏水，放至漩涡震荡仪低速震荡，将水吸出，重复三次以清除白蚁卵表面的杂质和病原菌后进行离巢饲养，离巢饲养的具体方法为：在超净工作台中将清洗完毕的白蚁卵用灭过菌的刷子，扫至1.5%琼脂糖平板配有200PPM四环素和
200PPM多菌灵的培养基上，用封口膜封口，放入恒温箱避光放置，获得不同发育天数的白蚁卵；用于不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁孵化研究；
3. 不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究
（1）卵壳的软化
将步骤2中发育天数为1-30天白蚁卵先放到-80摄氏度冰箱冷冻处理10min，分别进行软化处理，处理时间和方法如下：
发育天数为1-7d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml30%次氯酸钠NaClO溶液处理8min，静止；
发育天数为8-15d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml50%次氯酸钠NaClO溶液处理10min，静止；
发育天数为16-22d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml 70%次氯酸钠NaClO溶液处理8min，静止；
发育天数为23-30d的白蚁卵，分别取每日白蚁卵样品25-35个，加入2ml 80%次氯酸钠NaClO溶液处理10min，静止；
处理后均将次氯酸钠NaClO溶液用移液枪吸出，将软化处理后的白蚁卵用1×PBS润洗3次，所述PBS为磷酸缓冲液Phosphate Buffered Saline，pH为7.4，所述PBS配制方法为：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.24g/L，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.44g/L，氯化钠(NaCl)：8g/L，氯化钾(KCl)：0.2g/L，用DD水定容到1L，采用浓盐酸调pH至7.4，高温高压灭菌后置于4摄氏度冰箱保存待用；
（2）卵的固定
上述软化处理后的白蚁卵，分别进行固定，所述白蚁卵固定方法如下：
上述不同发育天数的白蚁卵均加入10%多聚甲醛溶液（Paraformaldehyde），每25-35个白蚁卵加入2ml的10%多聚甲醛溶液，室温下200 rpm摇1h固定，后用移液枪吸出多聚甲醛；
（3）白蚁卵的染色
上述不同发育天数的白蚁卵固化处理后，随即加入预先配好的染色液（体积比为DAPI：
PBS =1:1000），即将1ml染色液加入至于5ml离心管的白蚁卵中，用锡纸包好避光保存，置于室温中染色16h，后将DAPI溶液用移液枪吸出，后加入1mlPBS（1×）清洗，每次静置10min，重复三次；
（4）制片与保存
用移液枪将上述处理的白蚁卵与剩余溶液全部吸走至载玻片上，吸除PBS缓冲液后加入100μL 50%甘油（体积比为甘油：PBS=1：1）溶液，盖上盖玻片，避光保存，在Olympus激光共聚焦扫描显微镜FV3000下观察胚胎发育情况；
4. 白蚁卵人工孵化研究
将采集发育天数为27-29天的白蚁卵，放入设有无菌的湿润原浆纸的培养皿中，配有润湿的松木条，并放入同一种群工蚁，白蚁卵和工蚁的数量比为25:10，5天观察孵化情况。
1.收集白蚁卵
取12个45mm*9mm的培养皿，每个培养皿中铺上8层灭过菌的湿润原浆纸，配上一块润湿的松木条，将10只工蚁、1只兵蚁、10只无翅繁殖蚁放入培养皿中，用封口膜封好，置于27℃，湿度70%-80%养虫室避光饲养，大约30天开始收集无翅繁殖蚁产出的卵。
200PPM多菌灵的培养基（40mm*9mm）上，用封口膜封口，放入恒温箱避光放置，获得不同发育天数的白蚁卵，供不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁卵孵化研究用；
离巢饲养的试验结果：
图1为上述离巢饲养条件下，发育天数为20天的白蚁卵的发育状况，其中采用1.5%琼脂糖平板配有200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养基饲养的白蚁卵发育良好，而对比只采用
1.5%琼脂糖平板的白蚁卵已经被真菌感染死亡，因此可见，200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养条件可以有效的抑制白蚁卵周围的真菌和细菌，同时对白蚁卵没有有害的影响，白蚁卵可以正常生长，即本方法提高了白蚁卵在离巢的条件下生长发育的存活时间，节约了白蚁的人工饲养条件。
将步骤2中发育天数为1-30天白蚁卵放到-80摄氏度冰箱冷冻处理10min，分别扫进5ml离心管进行软化处理，处理时间和方法如下：
1-7d白蚁卵——30%次氯酸钠NaClO溶液处理8min用量为2ml，静止；
8-15d白蚁卵——50%次氯酸钠NaClO溶液处理10min用量为2ml，静止；
16-22d白蚁卵——70%次氯酸钠NaClO溶液处理8min用量为2ml，静止；
23-30d白蚁卵——80%次氯酸钠NaClO溶液处理10min用量为2ml，静止；
处理后均将次氯酸钠NaClO溶液为用移液枪吸出，将软化处理后的白蚁卵用1×PBS润洗3次，所述PBS为磷酸缓冲液Phosphate Buffered Saline，pH为7.4，所述PBS配方为：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.24g/L，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.44g/L，氯化钠(NaCl)：8g/L，氯化钾(KCl)：0.2g/L，用DD水定容到1L，采用浓盐酸调pH至7.4，高温高压灭菌后置于4摄氏度冰箱保存待用；
（2）卵的固定
将步骤4每日收集的卵软化处理后，分别进行固定，所述白蚁卵固定方法如下：
每个处理每日卵均加入2ml 10%多聚甲醛溶液（Paraformaldehyde），室温下200 rpm摇
1h固定，后用移液枪吸出多聚甲醛；
（3）白蚁卵的染色
上述白蚁卵固化处理后，随即加入预先配好的染色液（DAPI：PBS =1:1000），即将1ml染色液加入至于5ml离心管的白蚁卵中，用锡纸包好避光保存，置于室温中染色16h，后将DAPI溶液用移液枪吸出，后加入1mlPBS（1×）清洗，每次静置10min，重复三次。
处理1：放入在45mm*9mm的培养皿中铺上8层灭过菌的湿润原浆纸上，配上一块润湿的松木条，并放入10头同一种群工蚁，其中18颗卵依然正常存活，5d后全部孵化。
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