具有解硅功能的阿氏芽孢杆菌及其应用
阅读：229发布：2020-05-21
专利汇可以提供具有解硅功能的阿氏芽孢杆菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 微 生物 领域，具体而言，涉及一种具有解 硅 功能的阿氏芽孢杆菌及其应用。该菌株选自：1)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:17204；保藏时间为：2019年01月16日；和/或；2)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:17203；保藏时间为：2019年01月16日。该菌株具有解硅能 力 ，且还能够促进 植物 生长、耐 碱 、耐盐、耐缺 氧 ，具有很好的应用前景。，下面是具有解硅功能的阿氏芽孢杆菌及其应用专利的具体信息内容。
1.分离的阿氏芽孢杆菌菌株，其选自：
1)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:
17204；保藏时间为：2019年01月16日；
和/或；
2)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:
17203；保藏时间为：2019年01月16日。
2.具有下列特性的阿氏芽孢杆菌菌株：
a)其为权利要求1所述菌株的后代、突变体或衍生物，和
b)具有解硅功能。
3.根据权利要求2所述的菌株，其还具有促进植物生长的功能；优选的，其还具有增加作物根部干重的功能。
4.根据权利要求2所述的菌株，其在含有不高于5％NaCl的培育体系下仍然具有解硅功能。
5.根据权利要求2所述的菌株，其在不高于20％KNO3的培育体系下仍能生长，且含有不高于10％KNO3的培育体系下仍然具有解硅功能。
6.根据权利要求2所述的菌株，其在6.5≤pH≤10的培育体系下仍具有解硅功能。
7.根据权利要求2所述的菌株，其在不低于10％氧浓度的培育体系下仍具有解硅功能。
8.组合物，其含有权利要求1和/或2～7任一项所述菌株的培养物；
优选的，所述组合物为液体、冷冻或干燥粉末形式；
优选的，所述组合物还包含农业有效量的选自以下的化合物或组合物：营养素、肥料、杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂以及杀虫剂。
9.权利要求1或2～7任一项所述菌株，或权利要求8所述的组合物在解硅方面的应用；
优选的，所述硅以单质硅或硅离子的形式存在；
优选的，所述硅以硅离子与另一种元素的缔合物或者与另一种元素络合键合物的形式存在；
优选的，所述硅以硅酸盐或含硅矿物的形式存在。
10.一种增强植物的健康、生长或产量的方法，所述方法包括将有效量的权利要求8所述的组合物施用于所述植物或施用于所述植物的周围环境。
具有解硅功能的阿氏芽孢杆菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 硅元素已被国际土壤学界确认为是继氮、磷、钾之后的第四种植物营养元素，它是禾本科和根块类作物的必需养分。研究表明，水稻施硅后，穗中的含氮量上升，淀粉和蛋白质合成被促进，籽粒饱满[1]；硅对冬瓜吸收和积累氮素有显著促进作用，成熟期间氮素和矿质元素的含量均与施硅量呈正相关[2]；施硅可提高土壤中磷的有效性及植物的含磷量[3,4]，[5]导致钾在植物体内中的绝对量多数增加或略有增加 ；同时硅肥的施用，对水稻、燕麦、小麦[6,7]、甘蔗[8]、高粱[1]等作物的生长和产量以及品质有显著的提高作用。硅元素除了在植物生长方面起作用外，还可以提高植物抗病性[9,10]、抗虫性[5]、缓解金属离子毒害[11,12]、缓解盐胁迫[13]、增强抗旱性[14]。由于中国掠夺式的种植模式，使得土壤中有效硅的含量大幅[16]
度下降，缺硅耕地占全国耕地面积的50％以上 ，因此可见使用硅肥的重要性。
度下降，缺硅耕地占全国耕地面积的50％以上 ，因此可见使用硅肥的重要性。
[0003] 由于自然界中，硅的分布极广，仅次于氧，在地壳中含量占第二位，主要以二氧化硅和硅酸盐形式存在。土壤中硅含量占70％左右，但均呈非常稳定的结晶态和非晶态[15]，溶解度很低，植物难以吸收。因此，筛选可以分解土壤中难溶性含硅矿物的微生物，开发生物性硅肥成为了解决我国硅肥的重要途径。微生物肥料不仅可以有效利用土壤中的难溶性含硅矿物，同时可以抗病、改善土壤，一举多得。
[0004] 国内解硅微生物多为硅酸盐细菌(Bacillus mucilaginosus)，这是一类具有把钾从非水溶性的钾矿中游离出来的一类细菌，国内又称钾细菌。该细菌已被开发出提高钾肥利用的微生物肥料，一些报道称，该类细菌具有解硅功能。初此之外，国外也报道了假单胞菌、根瘤菌、芽孢菌等微生物具有解硅功能，但发现的这些细菌对硅酸盐矿物水解能力并不是很强，更没有见到它们被开发成把硅矿物转化成植物可以吸收利用的硅肥的报道。
[0005] 2009年4月印度科学家在地球同温层顶部发现3种新微生物细菌，它们并不存在于地面上，具有抵御强烈紫外线辐射的能力。科学家在样本中总共发现12种细菌和6种真菌，其中8种微生物是基于16S RNA基因序列，与地面上的已知微生物种有98％的相似性。但其中有3种细菌是新物种，它们比邻近的物种具有非常高的抗紫外线能力。然而，在当前的研究中科学家并未确定这3种来自同温层微生物的起源，在未来的研究中科学家将进一步探索揭示其起源之谜。第一种新微生物细菌被命名为“霍伊尔降解菌”(Janibacter hoylei)，是以受人尊敬的天体物理学家佛雷德·霍伊尔命名，第二种微生物细菌被命名为“伊斯隆恩西斯杆菌”(Bacillus isronensis)，这个命名代表对印度航天研究组织(ISRO)进行的此次气球实验取得成功的认可，第三种微生物细菌被命名为“阿耶波多杆菌”(Bacillus aryabhata)，是以印度著名古代天文学家阿耶波多(Aryabhata)命名。
[0006] 现有技术中有报道阿氏芽孢杆菌的菌株可以降解甘蔗渣(单菌验证)，降解甘蔗渣产葡萄糖与果糖；菌落呈圆形，黄色，边缘光滑整齐。但有关阿氏芽孢杆菌的相关研究仍然不够深入，特别是具有特定功能的阿氏芽孢杆菌菌株的筛选与研究很少。
[0007] 有鉴于此，特提出本发明。
[0008] 参考文献
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发明内容
[0027] 本发明涉及一种分离的阿氏芽孢杆菌菌株，其选自：
[0028] 1)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:17204；保藏时间为：2019年01月16日；
[0029] 和/或；
[0030] 2)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:17203；保藏时间为：2019年01月16日。
[0031] CGMCC No:17203和CGMCC No:17204均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址均为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0033] 根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种组合物，其含有如上所述的菌株。
[0034] 根据本发明的另一方面，本发明还涉及如上所述菌株，或如上所述的组合物在解硅方面的应用。
[0035] 根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种增强植物的健康、生长或产量的方法，所述方法包括将有效量的如上所述的组合物施用于所述植物或施用于所述植物的周围环境。
[0037] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0038] 图1为本发明一个实施方式中菌株MB22与菌株MB35-5的解硅能力测定结果；
[0039] 图2为本发明一个实施方式中所提供菌株的耐盐、耐酸碱测定结果；
[0040] 图3为本发明一个实施方式中所提供菌株在不同培养条件下菌株的解硅能力。
[0041] 本申请提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)：
[0042] 1)菌株名为MB35-5，保存编号CGMCC No:17204；
[0043] 2)菌株名为MB22，保存编号CGMCC No:17203；
[0044] 均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；经保藏中心于2019年01月16日检测为存活菌株并保藏。
具体实施方式
[0045] 本发明涉及一种分离的阿氏芽孢杆菌菌株，其选自：
[0046] 1)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:17204；保藏时间为：2019年01月16日；
[0047] 和/或；
[0048] 2)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:17203；保藏时间为：2019年01月16日。
[0049] 上述菌株具有解硅功能。
[0050] 解硅功能可按照本发明实施例——“3解硅能力性测定”中所定义的方法进行测定，MB35-5菌株的解硅圈大小为4.5mm左右，例如6mm，5mm，4mm，3.5mm，3mm，2.5mm，2mm；
[0051] MB22菌株的解硅圈大小为6mm左右，例如8mm，7mm，6.5mm，6mm，3mm，2.5mm，2mm。
[0052] 根据本发明的一方面，本发明还涉及具有下列特性的阿氏芽孢杆菌菌株：
[0053] a)其为如上所述菌株的后代、突变体或衍生物，和
[0054] b)具有解硅功能。
[0055] 本发明请求保护上述保藏编号的阿氏芽孢杆菌菌株，以及在适度范围内发生突变，且仍然具有很强的解硅能力的后代、突变体和衍生物菌株。
[0056] 所谓“阿氏芽孢杆菌菌株的后代、突变体和衍生物菌株”，是指基因组高度类似MB35-5或MB22菌株的基因组的阿氏芽孢杆菌菌株。在本申请中，突变菌株可通过与SEQ ID NO：1(MB35-5)或SEQ ID NO：2(MB22)所示的16S rRNA同源性≥99％(例如99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的同源性)的方式进行限定，也可以通过基因组方面高度类似涵盖：
[0057] 一种阿氏芽孢杆菌菌株的基因组同MB35-5或MB22菌株的基因组相比，包含至多150个突变事件，优选包含至多140个、130个、120个、110个、100个、90个、80个、70个、60个、
50个、40个、30个或20个突变事件。突变事件被限定为SNP(单核苷酸多态性)或INDEL(插入、缺失，及两者的组合)。按如下方式确定突变事件的数量：将MB35-5菌株的基因组视为对照，鉴定存在于突变株基因组中的突变事件，每种突变事件(SNP或INDEL)代表一个突变事件(即，例如，插入含若干个核苷酸的序列只视作一个突变事件)。在该语境中，本发明的突变株的基因组序列由同MB35-5或MB22菌株相比所含突变事件的数量限定，除这种限定方式外，还可额外由其与MB35-5或MB22菌株的基因组序列的同一性百分比限定，其中同一性百分比在本文表示在一种菌株的基因组中发现存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比，具体地讲：a)在MB35-5或MB22菌株的基因组中发现并存在于突变菌株的基因组中的序列的百分比，或b)在突变菌株的基因组序列中发现并存在于MB35-5或MB22菌株的基因组中的序列的百分比。因此，与MB35-5或MB22菌株的不同之处只有插入(一个或多个)或只有缺失(一个或多个)的突变菌株，具有的基因组与MB35-5或MB22菌株的基因组的同一性百分比为100％，因为在一种菌株的基因组中完全发现了另一种菌株的整个基因组序列。在一个具体实施例中，由突变事件数量限定的本发明的突变株的基因组序列，与MB35-5或MB22菌株的基因组序列的同一性百分比为至少90％、为至少91％、为至少92％、为至少93％、为至少
94％、为至少95％、为至少96％、为至少97％、为至少98％、为至少99％、为至少99.1％、为至少99.2％、为至少99.3％、为至少99.4％、为至少99.5％、为至少99.6％、为至少99.7％、为至少99.8％、为至少99.9％、为至少99.92％、为至少99.94％、为至少99.96％、为至少
99.98％或为至少99.99％，其中同一性百分比表示在一种菌株的基因组中发现并存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比；同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的，并且可使用基于Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。
50个、40个、30个或20个突变事件。突变事件被限定为SNP(单核苷酸多态性)或INDEL(插入、缺失，及两者的组合)。按如下方式确定突变事件的数量：将MB35-5菌株的基因组视为对照，鉴定存在于突变株基因组中的突变事件，每种突变事件(SNP或INDEL)代表一个突变事件(即，例如，插入含若干个核苷酸的序列只视作一个突变事件)。在该语境中，本发明的突变株的基因组序列由同MB35-5或MB22菌株相比所含突变事件的数量限定，除这种限定方式外，还可额外由其与MB35-5或MB22菌株的基因组序列的同一性百分比限定，其中同一性百分比在本文表示在一种菌株的基因组中发现存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比，具体地讲：a)在MB35-5或MB22菌株的基因组中发现并存在于突变菌株的基因组中的序列的百分比，或b)在突变菌株的基因组序列中发现并存在于MB35-5或MB22菌株的基因组中的序列的百分比。因此，与MB35-5或MB22菌株的不同之处只有插入(一个或多个)或只有缺失(一个或多个)的突变菌株，具有的基因组与MB35-5或MB22菌株的基因组的同一性百分比为100％，因为在一种菌株的基因组中完全发现了另一种菌株的整个基因组序列。在一个具体实施例中，由突变事件数量限定的本发明的突变株的基因组序列，与MB35-5或MB22菌株的基因组序列的同一性百分比为至少90％、为至少91％、为至少92％、为至少93％、为至少
94％、为至少95％、为至少96％、为至少97％、为至少98％、为至少99％、为至少99.1％、为至少99.2％、为至少99.3％、为至少99.4％、为至少99.5％、为至少99.6％、为至少99.7％、为至少99.8％、为至少99.9％、为至少99.92％、为至少99.94％、为至少99.96％、为至少
99.98％或为至少99.99％，其中同一性百分比表示在一种菌株的基因组中发现并存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比；同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的，并且可使用基于Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。
[0058] CGMCC No:17204和/或CGMCC No:17203菌株，以及其后代、突变体或衍生物菌株，其还具有促进植物生长的作用，例如增加作物根部干重。
[0059] CGMCC No:17204和/或CGMCC No:17203菌株，以及其后代、突变体和衍生物菌株，其在含有不高于5％NaCl的培育体系下仍然具有解硅功能；
[0060] 浓度可选择例如4.5％NaCl，4％NaCl，3.5％NaCl，3％NaCl，2.5％NaCl。
[0061] CGMCC No:17204和/或CGMCC No:17203菌株，其在不高于20％KNO3的培育体系下仍能生长，且含有不高于10％KNO3的培育体系下仍然具有解硅功能。
[0062] 生长体系下KNO3浓度可选择例如19％KNO3、18％KNO3、17％KNO3、16％KNO3、15％KNO3、14％KNO3、13％KNO3、12％KNO3、11％KNO3、10％KNO3、9％KNO3、8％KNO3、7％KNO3、6％KNO3、5％KNO3、4％KNO3、3％KNO3、2％KNO3。
[0063] 解硅体系下KNO3浓度可选择例如9％KNO3、8％KNO3、7％KNO3、6％KNO3、5％KNO3、4％KNO3、3％KNO3、2％KNO3。
[0064] CGMCC No:17204和/或CGMCC No:17203菌株，以及其后代、突变体和衍生物菌株，其在6.5≤pH≤10的培育体系下仍具有解硅功能；
[0065] pH可选择5、6、7、8、9。
[0066] CGMCC No:17204和/或CGMCC No:17203菌株，以及其后代、突变体和衍生物菌株，其在不低于10％氧浓度的培育体系下仍具有解硅功能；
[0067] 氧浓度还可以选择15％、20％、25％或更高。
[0068] 本发明还涉及组合物，其含有如上所述菌株的培养物。
[0069] 在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将阿氏芽孢杆菌菌株扩大培养制成组合物(特别是微生物菌剂)的形式以扩大其应用范围。
[0070] 本发明的组合物(优选地，在用作发酵剂培养物时)可为纯培养物或混合培养物。所以，本发明将纯培养物限定为这样一种培养物，其中全部或基本上全部培养物由本发明的同一种阿氏芽孢杆菌菌株组成。在替代形式中，将混合培养物限定为这样一种培养物，其包含若干种微生物，具体地讲包含若干种细菌菌株，包括本发明的阿氏芽孢杆菌菌株。
[0071] 在一些实施方式中，所述组合物中还包括具有解钾功能的菌株。
[0072] 所述组合物用于农业，可制成液体、冷冻或干燥粉末形式；或以本行业常用的制剂形式来表述，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。
[0074] 在一些具体的实施方式中，当所述组合物为冷冻或干燥粉末形式时，其包括固态载体；
[0075] 固体载体的例子包括矿石粉诸如陶土、滑石、膨润土、沸石、碳酸钙、硅藻土和白炭(White carbon)；植物面粉如玉米面和淀粉；和高分子化合物如聚乙烯醇的聚亚烷基二醇。另一方面，典型的液体载体包括各种有机溶剂如癸烷和十二烷，植物油，矿物油和水。
[0076] 在一些实施方式中，所述固态载体包括泥炭、草皮、滑石、褐煤、叶蜡石、蒙脱土、藻酸盐、压滤泥浆、锯屑、珍珠岩、云母、硅石、石英粉、钙基膨润土、蛭石、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、细沙以及粘土中的一种或多种。
[0077] 在一些实施方式中，所述组合物中包含助剂；
[0079] 这些助剂的总含量可以是0wt％至80wt％，载体的含量是从100wt％减去有效成分和助剂含量后的值。
[0080] 在一些具体的实施方式中，所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、丁基萘磺酸钠、海藻糖、甘油、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、烟酸、醇、缓冲盐、氯化钠、氨基酸、维生素类、蛋白质、多肽、多糖或单糖、酵母膏、白炭黑、茶皂素、脱脂奶中的一种或多种。
[0082] 上述成分可与本申请所提供的菌株配合以实现更佳的技术效果。
[0083] 在一些实施方式中，在所述组合物中，所述的阿氏芽孢杆菌菌株的活菌数量为107～12 -1 7～12 -1cfu·mL 或10 cfu·g 。
[0084] 也可以选择108cfu·mL-1、109cfu·mL-1、1010cfu·mL-1、1011cfu·mL-1。或108cfu·g-1、109cfu·g-1、1010cfu·mL-1、1011cfu·mL-1。
[0085] 本发明还涉及如上所述菌株，或如上所述的组合物在解硅方面的应用。
[0086] 在一些实施方式中，所述硅以单质硅或硅离子的形式存在；
[0087] 在一些实施方式中，所述硅以硅离子与另一种元素的缔合物或者与另一种元素络合键合物的形式存在；
[0088] 在一些实施方式中，所述硅以硅酸盐或含硅矿物的形式存在。
[0089] 硅酸盐可选自硅酸镁、氟硅酸镁、硅酸镁铝、硅酸钠、硅酸钾或硅酸钾钠等。
[0090] 含硅矿物可选自岛硅酸盐矿物、双硅酸盐矿物、环硅酸盐矿物、链硅酸盐矿物、单链链硅酸盐、双链链硅酸盐、页硅酸盐矿物、网硅酸盐矿物；
[0092] 本发明还涉及一种增强植物的健康、生长或产量的方法，所述方法包括将有效量的如上所述的组合物施用于所述植物或施用于所述植物的周围环境。
[0093] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0094] 实施例
[0095] 实验步骤
[0096] 1菌种筛选
[0097] 1.1土样的采集
[0098] 选择具有代表性的土壤，比如沙土、粘土、黑土等。样品可以来源于农田、牧草地、森林土等不同的区域，尤其是水稻和小麦田以及多年使用硅肥的土壤进行采样，每个点采集15～20克样品，同时标明来源地(省，县)、采集年和月、土壤的来源(植物，沙土、或其他)，放于80％甘油管中保藏在-80℃冰箱。
[0099] 1.2土样中目标微生物的富集
[0100] 第一步富集：取1g土样于10mL纯净水中摇匀，取其中100μL混合液于缺素R2A液体培养基中(酵母粉0.5g、胰蛋白胨0.5g、葡萄糖0.5g、磷酸氢二钾0.3g、丙酮酸钠0.3g、硅酸镁5.0g、水1L)，30℃震荡培养3天，取菌液稀释10-6、10-7、和10-8倍后涂布于R2A固体培养基(酵母粉0.5g、胰蛋白胨0.5g、蛋白胨0.75g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、丙酮酸钠0.3g、硅酸镁2.5g、琼脂15g、水1L)，挑取具有功能的菌株；
[0101] 第二步富集：取上一步富集的菌液100μL于1/2N缺素R2A培养基(酵母粉0.25g、胰蛋白胨0.25g、葡萄糖0.5g、磷酸氢二钾0.3g、丙酮酸钠0.3g、硅酸镁5.0g、水1L)，30℃震荡培养3天，取菌液稀释10-6、10-7、和10-8倍后涂皿，挑取具有解硅圈的功能菌株；
[0102] 第三步富集：取第二部富集的菌液100μL于1/2N缺素R2A培养基，30℃震荡培养3天，取菌液稀释10-6、10-7、和10-8倍后涂皿，挑取具有解硅圈功能的菌株。
[0103] 1.3重复验证
[0104] 为了确保菌株解硅能力的持续性，将从富集平皿上挑取的菌株，接种于含有0.25％硅酸镁的R2A固体培养基，30℃培养，每天观察实验结果，验证所挑取的菌落是否具有功能，排除假阳性菌落。
[0105] 2菌种鉴定
[0106] 2.1CTAB法提取细菌DNA
[0107] 1)、接种一单菌落于5mlR2A中，30℃培养过夜；
[0109] 3)、5000r/min离心10分钟，弃去上清。4/加入10mlTE离心洗涤后，用10mlTE溶解菌体，混匀，-20℃保存备用；
[0110] 4)、取3.5ml菌悬液，加入184μl10％SDS，混匀，加入37μl10mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时；
[0111] 5)、加入740μl5mol/LNaCl，再加入512μlCTAB/NaCl，混匀，65℃温育10分钟；
[0112] 6)、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；
[0113] 7)、上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；
[0114] 8)、加入0.6倍的异丙醇，混匀，10000r/min离心5分钟，收集DNA沉淀，用70％乙醇离心洗涤DNA沉淀；
[0115] 9)、用1mlTE溶解DNA，加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃保存。
[0116] 2.2扩增与测序
[0117] 采用16S rDNA通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序(北京美亿美生物技术有限公司)，根据获得的16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列，通过MEGA5.0软件，建立系统发育。
[0118] 3解硅能力性测定
[0119] 将上一步筛选得到的菌株，接种于还有0.5％硅酸镁的R2A培养基中，设置硅酸盐细菌为阳性对照，接种48h后，冲洗掉菌落，测定解硅圈的直径，单位mm。
[0120] 解硅能力＝解硅圈直径的毫米数+X；
[0121] X为加权系数，根据菌株解硅圈的透明程度，相应的为-2、-1、0、1、2。
[0122] 4菌株形态观察
[0123] 将筛选的菌株接种到R2A平板上，30℃培养24h，观察菌落的大小、形状、颜色、光泽度、黏稠度、隆起形状、透明度、边缘特征及有无芽孢等。
[0124] 5菌株抗逆性测定
[0125] 将筛选得到的菌株，接种到条件为pH5、pH10、5％NaCl、5％KNO3、10％KNO3、20％KNO3的R2A培养基上，观察菌株是否生长，以及生长是否受抑制和生长速度的快慢。同时进一步测定菌株在条件为pH5、pH10、5％NaCl、10％NaCl、5％KNO3、10％KNO3的R2A(含有1.0％硅酸镁)培养基上的解硅能力，按3中公式计算。
[0126] 6菌株需氧性测定
[0127] 采用三菱瓦斯化学株式会社生产的二氧化碳和微需氧Anaeropack，将氧气浓度控制在15％和10％，验证菌株在缺氧条件下的生长情况以及解硅能力。
[0128] 7溶血性检测
[0129] 将上部筛选得到的菌种接种到血琼脂平板培养基上(酪蛋白胰酶消化物10.0g、心胰酶消化物3.0g、玉米淀粉1.0g、琼脂13.0g、肉胃酶消化物5.0g、酵母浸出粉5.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000mL、羊血60mL)，30℃温箱培养18h，观察菌落形态，是否出现溶血环。
[0130] 8产孢率测定
[0131] 在无菌操作的条件下，先将洁净载玻片用酒精灼烧杀菌，标识出明显标本区域，在区域内滴一小滴磷酸盐缓冲液(0.2M、pH7.2)，用接种环刮取2～3个菌落，在滴的磷酸盐缓冲液内或者一小滴菌悬液，均匀涂成薄膜，晾干固定。晾干后，滴7.6％孔雀绿溶液与菌膜上，要全部覆盖涂的菌膜区，染色15～20分钟，水洗脱色，直至流出的水无绿色为止，淋去表面水，晾干后，复染，滴上0.5％沙黄溶液，染色2～3分钟，倾去染液稍微用水冲去染液并用滤纸吸干残液，晾干，即制成芽孢菌落标本。干燥后用油镜观察，芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。
[0132] 观察至少3个视野，计数每个视野中的芽孢数和细菌数，记录并计算出芽孢数平均值(A)和细菌数平均值(B)，按下式计算计算镜检芽孢率
[0133] 镜检芽孢率：N＝A/(A+B)×100％。
[0134] 式中：N:代表样品的镜检芽孢率；
[0135] A：代表样品的镜检视野中芽孢数的平均值；
[0136] B：代表样品的镜检视野中细菌数的平均值。
[0137] 9盆栽试验
[0138] 以蛭石为基质，每盆装土500g，先加入少量、等量的水使其湿润，选取大小均匀一致的郑单958以及爆花玉米(太谷县绿宝种业有限公司)种子，每盆栽种6粒，重复4盆，将菌液稀释50倍后，按照其生长要求，适时、适量的浇灌等量的菌液，15d后称量根干重。设置未接菌缺素R2A液体培养基为空白对照CK1，接种硅酸盐细菌的为阳性对照CK2。
[0139] 实验结果
[0140] 1菌株筛选
[0141] 本试验共从10个省16个市县采集到包含小麦、水稻、玉米、娃娃菜、西红柿、黄瓜、西蓝花、草莓、葡萄等19种农作物的34个土样。通过富集实验共筛选得到206株具有解硅功能的菌株。通过16S rDNA测序以及解硅能力、抗逆性、需氧性、溶血性、菌株生长特性、产孢率和盆栽试验验证，从中选择了两株具有生物安全性、产芽孢率高、解硅能力强、抗盐碱、弱氧条件下生长良好、不产生溶血环且对植物生长有促进作用的革兰氏阳性菌株——MB22和MB35-5，通过对这两株菌16s DNA序列分析，结果表明他们与Bacillus aryabhattai(阿氏芽孢杆菌)同源性高达99％。
[0142] 2菌株形态
[0143] 在R2A培养基上生长2天，菌落呈圆形，米黄色不透明，表面光滑较湿润,边缘规则，有晕环，中央凸起，直径1.5～2mm，圆形，有光泽，粘稠，微微隆起且边缘光滑整齐。
[0144] 3解硅能力
[0145] 表1和图1结果表明，菌株MB22和MB35-5的解硅能力明显高于对照硅酸盐菌株3016。
[0146] 表1 0.5％硅酸镁R2A培养基上菌株的解硅能力
[0147]
[0148]
[0149] 4菌株抗逆性:结果测定(表2，图2)发明菌株MB22和MB35-5与对照菌株3016相比具有很好的耐盐、耐碱特性和一定的耐酸性。
[0150] 表2不同条件下菌株的生长情况
[0151]
[0152] 5逆境下的解硅能力
[0153] 测定结果(表3)表明，发明菌株在高盐、高碱及微酸条件下依然具有解硅的功能，但是对照菌株硅酸盐细菌3016在测试的逆境条件下都不能很好的生长。
[0154] 表3不同培养条件下菌株的解硅能力
[0155]
[0156] 6弱氧条件下菌株的生存及解硅能力
[0157] 表4结果表明发明菌株MB22和MB35-5的解硅活性在缺氧条件下和不缺氧条件下都明显优于对照硅酸盐菌株和其他的细菌菌株。
[0158] 表4不同氧浓度下菌株的生存及解硅能力
[0159]
[0160] 7溶血性检测
[0161] 本发明所提供的两株菌株都不存在溶血环，实验表明发明菌株没有血溶反应。
[0162] 8产孢率测定：表5结果表明，在本实验同等条件下，发明菌株MB22和MB35-5的产孢率明显高于对照菌株硅酸盐菌株3016。
[0163] 表5菌株产孢率测定
[0164]菌株 3016(CK) MB22 MB35-5
产孢率 40％ 68％ 55％
产孢率 40％ 68％ 55％
[0165] 9盆栽试验
[0166] 表6结果表明硅酸盐细菌3016与发明菌株MB22和MB35-5对玉米根的生长具有促进作用，但MB22和MB35-5的促进作用要明显好于硅酸盐细菌和实验中的另外两株菌MB15-13和MB12-7。虽然两株发明菌株对小麦根的生长具有促进作用，但效果不如在玉米上明显。对照菌株硅酸盐细菌3016对小麦根的生长没有促进作用。另外两株测试菌株对小麦根的发育生长也有一定的作用。
[0167] 表6菌株对不同作物根部干重的影响
[0168]
[0169]
[0170] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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