枯草芽孢杆菌NB12及其培养方法和应用
阅读：291发布：2021-05-18
专利汇可以提供枯草芽孢杆菌NB12及其培养方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了枯草芽孢杆菌NB12及其培养方法和应用，该菌株于2011年10月24日保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.5383。经研究发现，该菌株对立枯丝核菌、香蕉 炭疽病 菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、 甘蔗 黑腐病菌、番茄叶霉病菌、 水 稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌均具有强烈的抑制作用，为广谱拮抗菌，可用于多种 植物 病害的防治，尤其是对水稻纹枯病和豆 角 苗期立枯病的防治效果较好，且具有对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不容易产生抗性等优点，能够进行商业开发，应用前景广阔。，下面是枯草芽孢杆菌NB12及其培养方法和应用专利的具体信息内容。
1.枯草芽孢杆菌NB12，于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.5383。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌NB12，其特征在于该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种生物菌剂，其特征在于含有权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌NB12或含有枯草芽孢杆菌NB12发酵液经过滤后的无菌滤液。
4.权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌NB12的扩大培养方法，其特征在于培养条件如下： 以LB或者BPY为培养基，在30℃、转速180 r/min条件下培养48h；
LB配方：酵母浸出粉 5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂 15～18 g、水1000 mL；
BPY配方：牛肉膏 5g 、酵母膏 5g 、葡萄糖 5g 、蛋白胨 10g 、NaCl 5g 、琼脂 20g 蒸馏水1000 mL ，调pH至 7.2。
5.权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌NB12在制备防治植物病原真菌或植物病原细菌引起的植物病害菌剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物病原真菌为立枯丝核菌、香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌或番茄叶霉病菌；所述植物病原细菌为水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
枯草芽孢杆菌NB12及其培养方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 植物病原菌（包括真菌、细菌、病毒等）引起的植物病害给农业生产造成了重大的经济损失。立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）是一种经济上非常重要的植物病原真菌。在我国，由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病已居水稻三大病害之首。该病菌除了可引起水稻、玉米等纹枯病外，还可引起其它很多植物（蔬菜、果树、林木、花卉等）的苗期立枯病。目前对该病的防治主要是使用化学农药（杀菌剂），而杀菌剂多是单作用位点的内吸性药剂，长期使用会使病原菌产生抗药性，并且会污染环境，而残留的杀菌剂会影响到食品安全。
[0003] 植物周围不仅存在病原菌，而且还存在着大量的非病原菌，其中有的还是病原菌的拮抗微生物。这些拮抗微生物可通过与病原菌的抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等机理来抑制病原菌，达到防治植物病害的目的。此外，拮抗微生物对环境安全，不像化学农药那样造成环境污染以及对人畜的毒害，同时拮抗微生物不易使病原菌产生耐药性，有些还具有促进植物生长的作用，且实际生产工艺简单。因此，利用拮抗微生物来防治植物病害的研究正越来越受到国内外的重视。目前，人们已经分离到多种对各种不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些己经进入实际应用阶段，产生了相当的社会效益和环境效益。
[0004] 人们对枯草芽孢杆菌（Bacillus spp.）的研究较多，该菌可产生多种生物活性物质，如枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素和短杆菌肽等，对病原菌具有明显的抑制作用，自身还可以合成α-淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等，可用于动物饲料添加剂，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用；同时该菌种还可以刺激植物生长发育。
[0005] 关于枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）在防治水稻纹枯病和其它病害方面也有报道，如中国专利申请号200410014484.1（公开号CN1590535）公开了一种枯草芽孢杆菌JA，对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌等多种植物病原菌都具有抑制作用；中国专利申请号200910212779.2（公开号 CN101697737A）公开了将枯草芽孢杆菌和三环唑复配后作为杀菌剂用于防治水稻稻瘟病，防治效果最高达84.67%；中国专利申请号201010175797.0（公开号CN101857848A）公开了一种水稻纹枯病生防菌枯草芽孢杆菌WJ-1及菌剂与应用，该菌剂对水稻纹枯病室内活体接种防治效果明显，最高可达95.74%；此外，相关的文献还有：陈志谊等. 枯草芽孢杆菌B-916防治水稻纹枯病的田间试验. 中国生物防治，1997；陈志谊等. 水稻纹枯病拮抗细菌B-916培养条件与发酵配方的研究. 西南农业学报，1999；陈卫良等. 拮抗细菌Bacillus subtilis A30对水稻病原菌的抑制作用. 浙江农业大学学报，1997；徐汉虹等. 枯草杆菌BS04菌株抑真菌素的初步研究. 农药，
2007；张丽霞等. 枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化, 植物病理学报，2005。
2007；张丽霞等. 枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化, 植物病理学报，2005。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于，提供一株具有可抑制包括水稻纹枯病菌和豆角苗期立枯病菌在内的多种植物病原菌的广谱拮抗菌菌株。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：枯草芽孢杆菌NB12，该菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.5383。该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008] 本发明还提供了一种生物菌剂，该生物菌剂含有枯草芽孢杆菌NB12或含有枯草芽孢杆菌NB12发酵液（即培养液）经过滤后的无菌滤液，所述无菌滤液优选用枯草芽孢杆菌NB12培养液经过离心取得的上清再经过细菌过滤器过滤获得。
[0009] 该枯草芽孢杆菌（B. subtilis）NB12的培养方法，发酵（培养）条件如下：培养基为LB（酵母浸出粉 5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂 15～18 g、水1000 mL）或BPY培养基（牛肉膏 5g 、酵母膏 5g 、葡萄糖 5g 、蛋白胨 10g 、NaCl 5g 、琼脂 20g 蒸馏水1000ml ，调pH至 7.2），在30℃、转速180 r/min条件下培养48h即可。优选初始pH值为
7.0，40 mL/250 mL（种子/培养基）装液量。
7.0，40 mL/250 mL（种子/培养基）装液量。
[0010] 枯草芽孢杆菌（B. subtilis）NB12在制备防治植物病原菌引起的植物病害菌剂中的应用。所述植物病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）、荔枝霜疫霉菌（Peronophythora litchii）、甘蔗黑腐病菌（Ceratocystis adiposum）、番茄叶霉病菌（Fulvia fulva）、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）。
[0011] 枯草芽孢杆菌（B. subtilis）NB12在防治立枯丝核菌（R. solani）引起的植物病害中的应用，尤其对水稻纹枯病和豆角苗期立枯病防治效果较好。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明公布的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）NB12菌株对水稻纹枯病的防效较高，特别是对于水稻纹枯病菌菌核的萌发有明显的抑制作用，这在以往的文献中未见报道。菌核是水稻纹枯病初侵染的重要来源，抑制菌核的萌发能有效地控制该病害的发生，这是本发明的特点之一。同时，本发明的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）NB12菌株对其它多种植物病原菌也有很好的抑制作用，与中国专利公开的其它枯草芽孢杆菌菌株的防治对象不一样，尤其是能够用于蔬菜上防治苗期立枯病（R. solani），具有广泛的应用前景和价值。这在以往的文献中未见报道。
[0013] 经过实验证实，本发明的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）NB12发酵液（菌剂）对水稻纹枯病和豆角苗期立枯病均表现出良好的防治效果，其中对离体水稻叶片纹枯病的防效达86.2%，对该病菌菌核萌发抑制率达84.52%，对盆栽水稻纹枯病的防效为57.51%，对豆角苗期立枯病的防效为65.38%。由此可见，该生防细菌NB12菌株在防治立枯丝核菌病害方面具有巨大的应用前景。其菌剂的制备方法成熟，可开发成微生物农药，是化学农药的替代品，可用于水稻纹枯病等立枯丝核菌病害和其它植物病害的防治，对减少化学农药残留和污染、保护生态环境具有重要意义，是绿色农业和有机农业倡导的发展方向，符合我国现代农业发展的要求。因此，在工业生产中，只需较简单的微生物发酵和制剂设备，就能进行规模化推广应用，其市场前景是广阔的，将带来巨大的生态效益、社会效益和经济效益。
附图说明
附图说明
[0014] 图1. 菌株NB12的序列与相近菌株序列的系统发育树。
[0015] 图2. 枯草芽孢杆菌NB12对水稻纹枯病的防治效果，其中接种GD-118对照为不防治对照，CK为正常水稻对照。
具体实施方式
[0016] 实施例1 枯草芽孢杆菌NB12的筛选及鉴定1、菌株的筛选
（1）土壤样品的采集
本实验从华南农业大学农场果园采集土样，根据采集地的地形等采用5点法取样，每个点取样深度为耕作层或地表以下15 cm，取量200～250 g，每个地点采集的5个样本均匀混合，装入灭菌的封口聚乙烯袋，带回实验室马上分离。
（1）土壤样品的采集
本实验从华南农业大学农场果园采集土样，根据采集地的地形等采用5点法取样，每个点取样深度为耕作层或地表以下15 cm，取量200～250 g，每个地点采集的5个样本均匀混合，装入灭菌的封口聚乙烯袋，带回实验室马上分离。
[0017] （2）样品悬浮液的制备将土壤样品加入灭菌水中激烈震荡。样品：水=1：9（质量与体积比），如：10 g土壤加-1
入装有90 mL灭菌水的三角瓶中所得悬浮液浓度为10 ，每种样品各准备5支装有9mL灭-1 -2 -6
菌水的试管按10倍梯度稀释法，将上述浓度为10 的悬浮液稀释成10 ～10 的系列浓度悬浮液，即从1号试管中吸取1 mL悬浮液放入2号试管（盛有9 mL灭菌水）中，充分震荡混匀，再从2号试管中吸取1 mL悬浮液放入3号试管（盛有9 mL灭菌水）中，依此类推，直至第6支试管为止。
入装有90 mL灭菌水的三角瓶中所得悬浮液浓度为10 ，每种样品各准备5支装有9mL灭-1 -2 -6
菌水的试管按10倍梯度稀释法，将上述浓度为10 的悬浮液稀释成10 ～10 的系列浓度悬浮液，即从1号试管中吸取1 mL悬浮液放入2号试管（盛有9 mL灭菌水）中，充分震荡混匀，再从2号试管中吸取1 mL悬浮液放入3号试管（盛有9 mL灭菌水）中，依此类推，直至第6支试管为止。
[0018] （3）分离方法采用LB培养基（酵母浸出粉 5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂 15～18 g、水1000 mL）。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液0.5mL，滴加于培养基平板上（每个稀释度做
3个重复），用灭菌的L型玻棒涂布均匀，稍晾干，作好标记和日期，培养皿倒置，于25～28℃温箱中培养2～3 d，把平板上长出的单菌落挑出到新的培养基上纯化培养，对全部分离到的菌株（称为待测菌株）进行编号，然后对其拮抗活性进行初筛和复筛，以获得本专利菌株。
3个重复），用灭菌的L型玻棒涂布均匀，稍晾干，作好标记和日期，培养皿倒置，于25～28℃温箱中培养2～3 d，把平板上长出的单菌落挑出到新的培养基上纯化培养，对全部分离到的菌株（称为待测菌株）进行编号，然后对其拮抗活性进行初筛和复筛，以获得本专利菌株。
[0019] （4）拮抗菌的初筛和复筛采用平板对峙培养法，检测上述各种待测菌株对立枯丝核菌等病原菌的抑菌活性。用打孔器在培养好的立枯丝核菌等病原菌的菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块，接种在PDA平板中央，再将已经活化的各种待测菌株接种在立枯丝核菌等病原菌的菌丝块四周2~3cm处，每个PDA平板接种4个待测菌株，设置不接种待测菌株的对照，每处理3次重复。在
25~28℃下培养3~5 d，然后测量待测菌株与立枯丝核菌等病原菌之间的抑菌带宽度，作为拮抗活性强弱的指标。
25~28℃下培养3~5 d，然后测量待测菌株与立枯丝核菌等病原菌之间的抑菌带宽度，作为拮抗活性强弱的指标。
[0020] 经过上述初筛和复筛，获得一株对立枯丝核菌等多种病原菌具有强烈抑制作用的菌株，编号为NB12，保存备用。
[0021] 、NB12菌株的形态学、分子生物学和生理生化鉴定（1）NB12菌株的形态学鉴定
NB12菌株在LB培养基上培养3 d后观察，其单菌落圆形或不规则形，乳白色，表面粗糙有褶皱状突起，不透明，无光泽，粘质，不易乳化；在LB液体培养基中，轻度浑浊，色暗，表面形成完整白色粘质膜。
NB12菌株在LB培养基上培养3 d后观察，其单菌落圆形或不规则形，乳白色，表面粗糙有褶皱状突起，不透明，无光泽，粘质，不易乳化；在LB液体培养基中，轻度浑浊，色暗，表面形成完整白色粘质膜。
[0022] （2）NB12菌株的分子生物学鉴定经克隆和测序，得到NB12菌株的16S rDNA序列长度为1044bp，其序列如SEQ ID NO:1所示。
[0023] 将NB12菌 株 的16S rDNA序列 用Blast软 件与GenBank中 已 登陆 的Bacillus subtilis (FJ595878.1)、Bacillus amyloliquefaciens (FJ641035.1)、Bacillus polyfermenticus (EF178464.1)、Bacillus pumilus (EF178456.1)、Bacillus licheniformis (FJ713021.1)和Bacillus velezensis (AB245422.1)的16SrDNA序列进行同源性比较，构建系统发育树（图1）和相似系数表（表1）。
[0024] 表1 菌株NB12和其它不同菌株间16S rDNA序列相似系数的比较 1 2 3 4 5 6 7
1 **99.7 100 98.7 99.8 99.9 97.7
2 ** 99.9 98.9 99.6 99.7 97.6
3 ** 100 100 99.9 97.6
4 ** 99.7 99 97.6
5 ** 99.7 97.7
6 ** 97.6
7 **
注：1. Bacillus amyloliquefaciens FJ641035.1；2. Bacillus licheniformis FJ713021.1；3. Bacillus polyfermenticus EF178464.1；4. Bacillus pumilus EF178456.1；5. Bacillus subtilis FJ595878.1；6. Bacillus velezensis AB245422.1；
7. NB12菌株。
1 **99.7 100 98.7 99.8 99.9 97.7
2 ** 99.9 98.9 99.6 99.7 97.6
3 ** 100 100 99.9 97.6
4 ** 99.7 99 97.6
5 ** 99.7 97.7
6 ** 97.6
7 **
注：1. Bacillus amyloliquefaciens FJ641035.1；2. Bacillus licheniformis FJ713021.1；3. Bacillus polyfermenticus EF178464.1；4. Bacillus pumilus EF178456.1；5. Bacillus subtilis FJ595878.1；6. Bacillus velezensis AB245422.1；
7. NB12菌株。
[0025] 由系统发育树（图1）和相似系数表（表1）可看出，该菌株与Bacillus amyloliquefaciens FJ641035.1和Bacillus subtilis FJ595878.1的同源性最高，为97.7%。
[0026] （3）NB12菌株的生理生化鉴定根据《伯杰氏细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，测得枯草芽孢杆菌NB12菌株的生理生化实验结果如表2所示。
[0027] 表2 菌株NB12的生理生化性状生理生化性状 反应
接触酶 +
淀粉水解 +
柠檬酸盐利用 +
V-P实验 +
甘露醇产酸 +
卵磷脂酶 –
水解明胶 +
5℃生长 –
注：+表示呈阳性；–表示呈阴性
经过形态、生理生化特性及16S rDNA序列比对分析，最终将菌株NB12鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
接触酶 +
淀粉水解 +
柠檬酸盐利用 +
V-P实验 +
甘露醇产酸 +
卵磷脂酶 –
水解明胶 +
5℃生长 –
注：+表示呈阳性；–表示呈阴性
经过形态、生理生化特性及16S rDNA序列比对分析，最终将菌株NB12鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
[0028] 实施例2 枯草芽孢杆菌NB12对植物病原菌的抑制作用1、枯草芽孢杆菌NB12对苗期水稻纹枯病的防治实验
（1）水稻纹枯病菌供试菌株
本实验供试的水稻纹枯病菌菌株GD-118为本实验室保存的强致病力菌株。
（1）水稻纹枯病菌供试菌株
本实验供试的水稻纹枯病菌菌株GD-118为本实验室保存的强致病力菌株。
[0029] （2）苗期水稻纹枯病的防治试验将感病水稻品种武育粳3号催芽播于白色的大面包箱中，每盆6排，每排10株，共播
10盆。当水稻秧苗长到3叶1心时，采用谷粒接种体进行接种，即将稻谷粒平铺在接有菌株GD-118菌丝块的PDA平板上，待菌丝布满谷粒后，每株苗的基部接种2粒带菌稻谷。次日
10
进行喷施处理，共设置4个组，NB12菌液组喷施浓度为10 CFU/mL的菌液100mL，NB12无菌滤液组喷施无菌滤液（30℃、转速180 r/min条件下培养48h后的培养液离心收集上清，用细菌过滤器过滤，获得无菌滤液）100mL，井冈霉素对照组喷施浓度为40 µg/mL的井冈霉素溶液100 mL，另外选择一组不做任何处理作为阴性对照（即只接种GD-118的对照组），还有一组正常植株组（CK）。喷施后用塑料薄膜将水稻盖住，10 d左右待对照发病到合适程度后调查水稻秧苗的发病率和相对病斑高度，并计算病级和病情指数。病害分级（9级）标准采用（唐芳. 水稻纹枯病菌的致病力分化及遗传多样性研究. 广州: 华南农业大学硕士学位论文. 2009: 1–89.）的方法，病情指数计算参照文献（方中达.植病研究方法（第三版）.北京: 中国农业出版社, 1998: 11–12）的方法。病级和病情指数的计算公式如下：
病级 =（病斑高度÷植株高度）×9级
病情指数=[∑(各级病株数×相应级数)/调查总株数×最高级别值] ×100
防治结果见表3和图2。由表3可见，枯草芽孢杆菌NB12的防效达59.91%。
10盆。当水稻秧苗长到3叶1心时，采用谷粒接种体进行接种，即将稻谷粒平铺在接有菌株GD-118菌丝块的PDA平板上，待菌丝布满谷粒后，每株苗的基部接种2粒带菌稻谷。次日
10
进行喷施处理，共设置4个组，NB12菌液组喷施浓度为10 CFU/mL的菌液100mL，NB12无菌滤液组喷施无菌滤液（30℃、转速180 r/min条件下培养48h后的培养液离心收集上清，用细菌过滤器过滤，获得无菌滤液）100mL，井冈霉素对照组喷施浓度为40 µg/mL的井冈霉素溶液100 mL，另外选择一组不做任何处理作为阴性对照（即只接种GD-118的对照组），还有一组正常植株组（CK）。喷施后用塑料薄膜将水稻盖住，10 d左右待对照发病到合适程度后调查水稻秧苗的发病率和相对病斑高度，并计算病级和病情指数。病害分级（9级）标准采用（唐芳. 水稻纹枯病菌的致病力分化及遗传多样性研究. 广州: 华南农业大学硕士学位论文. 2009: 1–89.）的方法，病情指数计算参照文献（方中达.植病研究方法（第三版）.北京: 中国农业出版社, 1998: 11–12）的方法。病级和病情指数的计算公式如下：
病级 =（病斑高度÷植株高度）×9级
病情指数=[∑(各级病株数×相应级数)/调查总株数×最高级别值] ×100
防治结果见表3和图2。由表3可见，枯草芽孢杆菌NB12的防效达59.91%。
[0030] 表3 枯草芽孢杆菌NB12对水稻纹枯病的防治效果处理 发病率(%) 病情指数 防效(%)
NB12菌液组 63.46 19.39ed 59.91
NB12无菌滤液组 71.74 22.69d 53.09
井冈霉素对照组 67.39 14.99e 69.00
阴性对照组 100 48.37a 0
注：表中数据采用Duncan氏新复极差法（DMRT）进行差异显著性分析，同列数据后具有相同字母者表示在5%水平上（P=0.05）差异不显著。
NB12菌液组 63.46 19.39ed 59.91
NB12无菌滤液组 71.74 22.69d 53.09
井冈霉素对照组 67.39 14.99e 69.00
阴性对照组 100 48.37a 0
注：表中数据采用Duncan氏新复极差法（DMRT）进行差异显著性分析，同列数据后具有相同字母者表示在5%水平上（P=0.05）差异不显著。
[0031] 、枯草芽孢杆菌NB12无菌发酵液对水稻纹枯病菌菌核萌发的抑制实验（1）枯草芽孢杆菌NB12无菌发酵液的制备
将枯草芽孢杆菌NB12菌株活化，挑取单菌落在LB液体培养基上培养，在 180 r/min、
30 ℃和pH 7.0条件下培养2 d，将发酵得到的菌液在6 000 r/min下离心10 min，上清液用细菌过滤器（0.22 μm）过滤，即得到NB12的无菌发酵液（即无菌滤液）。
将枯草芽孢杆菌NB12菌株活化，挑取单菌落在LB液体培养基上培养，在 180 r/min、
30 ℃和pH 7.0条件下培养2 d，将发酵得到的菌液在6 000 r/min下离心10 min，上清液用细菌过滤器（0.22 μm）过滤，即得到NB12的无菌发酵液（即无菌滤液）。
[0032] （2）枯草芽孢杆菌NB12无菌发酵液对菌核萌发的抑制实验将GD-118菌株在PDA 平板上培养14 d左右直到菌核成熟，收集大小一致（平均直径
0.25 cm）的菌核进行如下处理（每处理50粒菌核）：常温下将菌核在枯草芽孢杆菌NB12的无菌发酵液、LB培养基和无菌水中浸泡30 min；取出晾干后，按10粒/平板、每处理做5个平板的重复的规格，用PDA平板进行菌核萌发实验。待无菌水对照的菌核完全萌发时，调查各处理的菌核萌发数和菌落直径。以菌落直径比菌核直径大0.1 cm视为萌发。试验结果见表4。
0.25 cm）的菌核进行如下处理（每处理50粒菌核）：常温下将菌核在枯草芽孢杆菌NB12的无菌发酵液、LB培养基和无菌水中浸泡30 min；取出晾干后，按10粒/平板、每处理做5个平板的重复的规格，用PDA平板进行菌核萌发实验。待无菌水对照的菌核完全萌发时，调查各处理的菌核萌发数和菌落直径。以菌落直径比菌核直径大0.1 cm视为萌发。试验结果见表4。
[0033] 表4 枯草芽孢杆菌NB12对水稻纹枯病菌菌核萌发的影响处理 菌核萌发率（%） 菌落直径（cm） 菌丝生长抑制率（%）
NB12无菌滤液 24 0.22±0.15 71.42
LB液体培养基 100 0.83±0.27 –
无菌水 100 0.77±0.27 –
注：–表示无抑制作用
3、枯草芽孢杆菌NB12对豆角苗期立枯病的防治实验
（1）供试菌株
用于接种豆角的立枯丝核菌（R. solani）菌种系由本实验室从罹病豆角上分离获得。
NB12无菌滤液 24 0.22±0.15 71.42
LB液体培养基 100 0.83±0.27 –
无菌水 100 0.77±0.27 –
注：–表示无抑制作用
3、枯草芽孢杆菌NB12对豆角苗期立枯病的防治实验
（1）供试菌株
用于接种豆角的立枯丝核菌（R. solani）菌种系由本实验室从罹病豆角上分离获得。
[0034] （2）枯草芽孢杆菌NB12对豆角苗期立枯病的防治在育苗盘中播种豆角，待豆角分化出两片子叶时，首先将枯草芽孢杆菌NB12发酵滤液
5mL喷施于植株茎基部，1d后接种直径6 mm的立枯丝核菌菌丝块（该组标记为NB12），同时设置BPY液体培养基、五氯硝基苯（PCNB）药液、灭菌水做以上相同处理进行对照（按顺序分别标记为NB12对照、PCNB和CK1），再设置空白对照（不接种任何菌，标记为CK2）。以上各组每个处理接种30株菌，28℃恒温室内，控制湿度70%左右，5 d后调查发病情况，计算每个处理的发病率。
5mL喷施于植株茎基部，1d后接种直径6 mm的立枯丝核菌菌丝块（该组标记为NB12），同时设置BPY液体培养基、五氯硝基苯（PCNB）药液、灭菌水做以上相同处理进行对照（按顺序分别标记为NB12对照、PCNB和CK1），再设置空白对照（不接种任何菌，标记为CK2）。以上各组每个处理接种30株菌，28℃恒温室内，控制湿度70%左右，5 d后调查发病情况，计算每个处理的发病率。
[0035] （3）枯草芽孢杆菌NB12对豆角苗期立枯病的防治效果由表5可见，枯草芽孢杆菌NB12发酵滤液可以明显抑制豆角苗立枯病的发生，防效达
65.38%，比五氯硝基苯（PCNB）药液的防效（61.54%）略高一些，但两者相比差异不显著。
65.38%，比五氯硝基苯（PCNB）药液的防效（61.54%）略高一些，但两者相比差异不显著。
[0036] 表5 枯草芽孢杆菌NB12对豆角苗期立枯病的防效处理 发病率（%） 防治效果（%）
NB12 30±0.00 65.38±0.00a
PCNB 33.33±5.77 61.54±6.66a
NB12对照 86.67±11.55
CK1 86.67±5.77
CK2 0.00±0.00
注：表中数据是三个重复的平均值±标准误，同列数据应用SPSS软件采用LSR法进行方差分析，具有不同字母者表示差异显著（P=0.05）。CK1为灭菌水对照，CK2为不接种任何菌的空白对照。
NB12 30±0.00 65.38±0.00a
PCNB 33.33±5.77 61.54±6.66a
NB12对照 86.67±11.55
CK1 86.67±5.77
CK2 0.00±0.00
注：表中数据是三个重复的平均值±标准误，同列数据应用SPSS软件采用LSR法进行方差分析，具有不同字母者表示差异显著（P=0.05）。CK1为灭菌水对照，CK2为不接种任何菌的空白对照。
[0037] 、枯草芽孢杆菌NB12对其它多种植物病原真菌和细菌的抑制实验（1）供试病原菌菌株
本实验所用的植物病原真菌和病原细菌菌株均为本实验室保存的菌株。
本实验所用的植物病原真菌和病原细菌菌株均为本实验室保存的菌株。
[0038] （2）对病原真菌的抑制作用用灭菌的接种针将枯草芽孢杆菌NB12接种于PDA培养基平板一边，同时将稻瘟病菌（P. oryzae）、小麦赤霉病菌（G. zeae）、香蕉枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cubense）、香蕉炭疽菌（C. musae）、荔枝霜疫霉菌（P. litchii）、甘蔗黑腐病菌（C. adiposum）和番茄叶霉病菌（C. fulvum）等病原真菌的菌丝块接种于PDA培养基平板另一边，进行对峙培养（每个平板接种一种病原菌与枯草芽孢杆菌NB12进行对峙），培养皿置于生化培养箱中、在28 ℃下培养2～3 d，观察抑菌状况及抑菌圈大小（表6）。
[0039] （3）对病原细菌的抑制作用用灭菌的接种针将枯草芽孢杆菌NB12接种于PSA平板（去皮马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15~20g，蒸馏水1000ml）中心，37 ℃下培养到菌落约为5 mm大小(24～48 h)。在培养皿盖上加3.0 mL氯仿，反扣培养皿2 h以杀死细菌。在通风厨抽去氯仿后在培养皿中倒入约200 μL水稻白叶枯病菌（X. oryzae pv. oryzae）或水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）等（见表6）菌液，均匀铺于培养基表面，在超净台上吹干，然后28 ℃下培养24 h左右，观察抑菌状况及抑菌圈大小（表6）。
[0040] 表6 枯草芽孢杆菌NB12对植物病原真菌和细菌的抑制结果病原菌 枯草芽孢杆菌NB12抑菌圈半径（cm）
香蕉炭疽病菌(Cm) 1.68±0.15
稻瘟病菌(Po) 2.05±0.19
小麦赤霉病菌(Gz) 1.21±0.06
香蕉枯萎病(Foc) 1.40±0.07
荔枝霜疫霉(Pl) 1.27±0.06
甘蔗黑腐病菌(Ca) 0.89±0.10
番茄叶霉病(Cf) 1.28±0.06
水稻白叶枯菌(Xooe) 1.33±0.12
水稻细菌性条斑病菌(Xooa) 1.39±0.12
综上所述，枯草芽孢杆菌NB12对立枯丝核菌（R. solani）、香蕉炭疽菌（C. musae）、稻瘟病菌（P. oryzae）、小麦赤霉病菌（G. zeae）、香蕉枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cubense）、荔枝霜疫霉菌（P. litchii）、甘蔗黑腐病菌（C. adiposum）和番茄叶霉病菌（C. fulvum）等重要经济作物病原真菌均具有强烈的抑制作用。同时，该拮抗菌对水稻白叶枯病菌（X. oryzae pv. oryzae）和水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）等植物病原细菌也有很强的拮抗作用。因此，枯草芽孢杆菌NB12为广谱拮抗菌，可用于多种植物病害的防治，尤其是对水稻纹枯病和豆角苗期立枯病的防治效果较好。
香蕉炭疽病菌(Cm) 1.68±0.15
稻瘟病菌(Po) 2.05±0.19
小麦赤霉病菌(Gz) 1.21±0.06
香蕉枯萎病(Foc) 1.40±0.07
荔枝霜疫霉(Pl) 1.27±0.06
甘蔗黑腐病菌(Ca) 0.89±0.10
番茄叶霉病(Cf) 1.28±0.06
水稻白叶枯菌(Xooe) 1.33±0.12
水稻细菌性条斑病菌(Xooa) 1.39±0.12
综上所述，枯草芽孢杆菌NB12对立枯丝核菌（R. solani）、香蕉炭疽菌（C. musae）、稻瘟病菌（P. oryzae）、小麦赤霉病菌（G. zeae）、香蕉枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cubense）、荔枝霜疫霉菌（P. litchii）、甘蔗黑腐病菌（C. adiposum）和番茄叶霉病菌（C. fulvum）等重要经济作物病原真菌均具有强烈的抑制作用。同时，该拮抗菌对水稻白叶枯病菌（X. oryzae pv. oryzae）和水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）等植物病原细菌也有很强的拮抗作用。因此，枯草芽孢杆菌NB12为广谱拮抗菌，可用于多种植物病害的防治，尤其是对水稻纹枯病和豆角苗期立枯病的防治效果较好。
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