耐草甘膦的侧孢短芽孢杆菌菌株、组合物和用途
阅读：560发布：2020-06-06
专利汇可以提供耐草甘膦的侧孢短芽孢杆菌菌株、组合物和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 微 生物 领域，具体而言，涉及一种耐草甘膦的侧孢短芽孢杆菌菌株、组合物和用途。所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16749；保藏时间为：2018年11月15日。该菌株具有很强的耐草甘膦抗性，因而在农业生产中具有更为广阔的应用范围。，下面是耐草甘膦的侧孢短芽孢杆菌菌株、组合物和用途专利的具体信息内容。
1.分离的侧孢短芽孢杆菌菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16749；保藏时间为：2018年11月15日。
2.权利要求1所述菌株的突变菌株，其16S rRNA基因序列与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有至少99％的同源性，且所述菌株能够耐受至少1.0mmol L-1草甘膦异丙胺盐。
3.组合物，其含有权利要求1或2所述的菌株的培养物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体、冷冻或干燥粉末形式。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物中包含助剂；
当所述组合物为冷冻或干燥粉末形式时，其还包括固态载体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述固态载体包括泥炭、草皮、滑石、褐煤、叶蜡石、蒙脱土、藻酸盐、压滤泥浆、锯屑、珍珠岩、云母、硅石、石英粉、钙基膨润土、蛭石、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、细沙以及粘土中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、丁基萘磺酸钠、海藻糖、甘油、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、烟酸、醇、缓冲盐、氯化钠、氨基酸、维生素类、蛋白质、多肽、多糖或单糖、酵母膏、白炭黑、茶皂素、脱脂奶中的一种或多种。
8.根据权利要求1～7任一项所述的组合物，其特征在于，其还包含农业有效量的选自以下的化合物或组合物：营养素、肥料、杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂以及杀虫剂。
9.权利要求1或2所述的菌株的培养方法，其特征在于，将所述侧孢短芽孢杆菌菌株于LB液体培养基或R2A培养基，或上述培养基经过稀释后的培养基中进行培养。
10.一种增强植物的健康、生长或产量的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1～8任一项所述的组合物施用于所述植物或施用于所述植物的周围环境。
耐草甘膦的侧孢短芽孢杆菌菌株、组合物和用途
技术领域
背景技术
[0002] 草甘膦是一种高效、低毒、广谱和内吸收传导、非选择性叶面喷施的除草剂，在农业生长中得到广泛的应用(陈世国等，2017)。草甘膦虽然为农业生产提供了较大的方便，但是其使土壤中存在大量的残留。国内外关于草甘膦的研究表明，按正常施用量1kg hm-2计算，表层13cm土壤中草甘膦残余量可达0.45～2mg kg-1；在草甘膦用量比较大的地区，其残-1存量高达10～20mg kg (Zhou et al.,2013)。这些残存的草甘膦不仅对土壤、水体等造成了较大的污染，还严重阻碍了土壤微生物的生长。如吴雪楠等(2016)研究表明草甘膦制剂对土壤微生物具有一定的抑制作用，并且随着药剂量的浓度升高而升高。这种抑制作用使很多施入土壤的功能微生物无法发挥作用。因此，筛选具有一定草甘膦耐受性的功能微生物对其功能的发挥具有重要意义。
[0003] 侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)是一种新型的生防菌，具有抗菌、杀虫、杀线虫、溶磷以及降解有机物的作用(郭菁等，2011，李悦等，2015)。随着对侧孢短芽孢杆菌研究的深入，侧孢短芽孢杆菌对病原真菌的抑制作用受到人们的关注。赵璟等(2012)研究发现，侧孢短芽孢杆菌对辣椒疫霉菌具有强烈的灭杀作用，其产生的抗菌肽对辣椒疫霉菌菌丝的生长、孢子囊的产生以及休止孢的萌发均具有抑制作用。李悦等(2015)发现侧孢短芽孢杆菌产生的胞外抗菌物质可以抑制辣椒疫霉菌和立枯丝核菌的生长。另外，侧胞短芽孢杆菌对烟草赤星病、稻瘟病(张淼等，2008)、小麦赤霉病(赵秋敏等，2006)、杨树溃疡病(Jiang et al.,2015)，以及对尖孢镰刀菌等革兰氏阳性细菌等都具有较强的拮抗作用(Saikia et al.,2011)。因此，侧胞短芽孢杆菌在农业生产中得到不断的推广和应用，尤其是在生物菌肥的研发和应用上。因此，筛选耐草甘膦侧孢短芽孢杆菌的菌株将有利于该菌在农业中的应用。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0005] 本发明通过提供新的微生物菌株、培养物、组合物，以及可用于增强植物的健康、生长和/或产量的方法解决前述需求。
[0006] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0007] 本发明涉及一种分离的侧孢短芽孢杆菌菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16749；保藏时间为：2018年11月15日。
[0008] 根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种组合物，其含有如上所述的侧孢短芽孢杆菌菌株的培养物。
[0009] 根据本发明的另一方面，本发明还涉及侧孢短芽孢杆菌菌株的培养方法，其包括将所述侧孢短芽孢杆菌菌株于LB液体培养基或R2A培养基，或上述培养基经过稀释后的培养基中进行培养。
[0010] 根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种增强植物的健康、生长或产量的方法，所述方法包括将有效量的如上所述的组合物施用于所述植物或施用于所述植物的周围环境。
[0012] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0013] 图1为不同侧孢短芽孢杆菌(包含本发明所提供的)在含有草甘膦异丙胺盐的培养基中的生长情况。
[0014] 本申请提供的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，菌株名为CE4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16749；经保藏中心于2018年11月15日检测为存活菌株并保藏。
具体实施方式
[0015] 本发明涉及一种分离的侧孢短芽孢杆菌菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16749；保藏时间为：2018年11月15日。
[0016] 其菌株名为CE4。
[0017] 该菌株在LB上菌落都为黄褐色，扁平，边缘光滑，中央突起；细胞杆状，芽孢侧生。该菌株通过紫外诱变来源于中国农科院农业资源与农业区划研究所的野生菌株菌株所获得。
[0018] 根据本发明的一方面，本发明还请求保护上述菌株的突变菌株，其16S rRNA基因序列与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有至少99％的同源性，且所述菌株能够耐受至少1.0mmol L-1草甘膦异丙胺盐。
[0019] 在一些实施方式中，所述侧孢短芽孢杆菌菌株的16S rRNA基因序列与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、
99.9％的同源性。
99.9％的同源性。
[0020] 在一些实施方式中，所述侧孢短芽孢杆菌菌株能够耐受1.0mmol L-1～2.0mmol L-1草甘膦异丙胺盐，或者1.1mmol L-1、1.2mmol L-1、1.3mmol L-1、1.4mmol L-1、1.5mmol L-1、1.6mmol L-1、1.7mmol L-1、1.8mmol L-1、1.9mmol L-1草甘膦异丙胺盐。
[0021] 草甘膦异丙胺盐的耐受实验所用培养基为1/5LB培养基；进一步的，培养温度为28℃～32℃。
[0022] 此外，所述侧孢短芽孢杆菌菌株及其突变菌株能够耐受不超过3％的NaCl浓度；进一步的，其培养环境为R2A培养基，培养时间为8h～16h。
[0023] 本发明请求保护上述保藏编号的侧孢短芽孢杆菌菌株，以及在适度范围内发生突变，且仍然能够耐受至少1.0mmol L-1草甘膦异丙胺盐的突变菌株。
[0024] 所谓“侧孢短芽孢杆菌菌株的突变菌株”，是指基因组高度类似CE4菌株的基因组的侧孢短芽孢杆菌菌株。在本申请中，表述“本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株”涵盖了所述突变株。突变菌株可通过上述16S rRNA同源性的方式进行限定，也可以通过基因组方面高度类似涵盖：
[0025] 一种侧孢短芽孢杆菌菌株的基因组同CE4菌株的基因组相比，包含至多150个突变事件，优选包含至多140个、130个、120个、110个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个或20个突变事件。突变事件被限定为SNP(单核苷酸多态性)或INDEL(插入、缺失，及两者的组合)。按如下方式确定突变事件的数量：将CE4菌株的基因组视为对照，鉴定存在于突变株基因组中的突变事件，每种突变事件(SNP或INDEL)代表一个突变事件(即，例如，插入含若干个核苷酸的序列只视作一个突变事件)。在该语境中，本发明的突变株的基因组序列由同CE4菌株相比所含突变事件的数量限定，除这种限定方式外，还可额外由其与CE4菌株的基因组序列的同一性百分比限定，其中同一性百分比在本文表示在一种菌株的基因组中发现存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比，具体地讲：a)在CE4菌株的基因组中发现并存在于突变菌株的基因组中的序列的百分比，或b)在突变菌株的基因组序列中发现并存在于CE4菌株的基因组中的序列的百分比。因此，与CE4菌株的不同之处只有插入(一个或多个)或只有缺失(一个或多个)的突变菌株，具有的基因组与CE4菌株的基因组的同一性百分比为100％，因为在一种菌株的基因组中完全发现了另一种菌株的整个基因组序列。在一个具体实施例中，由突变事件数量限定的本发明的突变株的基因组序列，与CE4菌株的基因组序列的同一性百分比为至少90％、为至少91％、为至少92％、为至少93％、为至少94％、为至少95％、为至少96％、为至少97％、为至少98％、为至少99％、为至少99.1％、为至少
99.2％、为至少99.3％、为至少99.4％、为至少99.5％、为至少99.6％、为至少99.7％、为至少99.8％、为至少99.9％、为至少99.92％、为至少99.94％、为至少99.96％、为至少99.98％或为至少99.99％，其中同一性百分比表示在一种菌株的基因组中发现并存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比；同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的，并且可使用基于Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。
99.2％、为至少99.3％、为至少99.4％、为至少99.5％、为至少99.6％、为至少99.7％、为至少99.8％、为至少99.9％、为至少99.92％、为至少99.94％、为至少99.96％、为至少99.98％或为至少99.99％，其中同一性百分比表示在一种菌株的基因组中发现并存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比；同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的，并且可使用基于Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。
[0026] CE4菌株的基因组可通过本领域惯用的技术手段测得。
[0027] 在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将侧孢短芽孢杆菌菌株扩大培养制成组合物(特别是微生物菌剂)的形式以扩大其应用范围。
[0028] 本发明的组合物(优选地，在用作发酵剂培养物时)可为纯培养物或混合培养物。所以，本发明将纯培养物限定为这样一种培养物，其中全部或基本上全部培养物由本发明的同一种侧孢短芽孢杆菌菌株组成。在替代形式中，将混合培养物限定为这样一种培养物，其包含若干种微生物，具体地讲包含若干种细菌菌株，包括本发明的侧孢短芽孢杆菌菌株。
[0029] 所述组合物用于农业，可制成液体、冷冻或干燥粉末形式；或以本行业常用的制剂形式来表述，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。
[0031] 在一些具体的实施方式中，当所述组合物为冷冻或干燥粉末形式时，其包括固态载体；
[0032] 固体载体的例子包括矿石粉诸如陶土、滑石、膨润土、沸石、碳酸钙、硅藻土和白炭(White carbon)；植物面粉如玉米面和淀粉；和高分子化合物如聚乙烯醇的聚亚烷基二醇。另一方面，典型的液体载体包括各种有机溶剂如癸烷和十二烷，植物油，矿物油和水。
[0033] 在一些实施方式中，所述固态载体包括泥炭、草皮、滑石、褐煤、叶蜡石、蒙脱土、藻酸盐、压滤泥浆、锯屑、珍珠岩、云母、硅石、石英粉、钙基膨润土、蛭石、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、细沙以及粘土中的一种或多种。
[0034] 在一些实施方式中，所述组合物中包含助剂；
[0036] 这些助剂的总含量可以是0wt％至80wt％，载体的含量是从100wt％减去有效成分和助剂含量后的值。
[0037] 在一些具体的实施方式中，所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、丁基萘磺酸钠、海藻糖、甘油、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、烟酸、醇、缓冲盐、氯化钠、氨基酸、维生素类、蛋白质、多肽、多糖或单糖、酵母膏、白炭黑、茶皂素、脱脂奶中的一种或多种。
[0039] 上述成分可与本申请所提供的菌株配合以实现更佳的技术效果。
[0040] 根据本发明的另一方面，本发明还涉及侧孢短芽孢杆菌菌株的培养方法，其包括将所述侧孢短芽孢杆菌菌株于LB液体培养基或R2A培养基，或上述培养基经过稀释后的培养基中进行培养。
[0041] 上述稀释后的培养基的稀释倍数可以选择1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7；稀释剂可选择对所述菌株生长无害的液体，例如水。
[0043] 根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种增强植物的健康、生长或产量的方法，所述方法包括将有效量的如上所述的组合物施用于所述植物或施用于所述植物的周围环境。
[0044] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0045] 实施例
[0046] 1.紫外诱变剂量的确定
[0047] 将活化好的侧孢短芽孢杆菌接种到含有50ml 1/5LB液体培养基(酵母提取粉：2.5g，胰蛋白胨：1g，NaCl：0.25％，pH:7.0±0.2定容至1L)的150ml锥形瓶中培养过夜，用等量的0.9％的生理盐水洗涤两次，并用0.9％生理盐水悬浮，取6ml悬浮液于紫外交联仪(能量：2J/m2)分别照射0,6,12,18,24,30s涂布平板并记录菌落数，实验结果如下：
[0048]
[0049] 2.侧胞短芽孢杆菌耐草甘膦异丙胺盐浓度的确定
[0050] 利用划线法将活化的侧孢短芽孢杆菌接种到含有不同浓度草甘膦异丙胺盐(0，0.5，0.8，0.9，1.0，2.0mmol L-1)的1/5LB培养基上，于30℃培养箱中培养，观测并记录生长情况。结果见下表：
[0051]
[0052] 注：“+”代表生长，“－”代表不生长
[0053] 3.侧孢短芽孢杆菌耐草甘膦异丙胺盐菌株的紫外筛选
[0054] 取致死率为99.97％的时间点，重复活化-洗涤-紫外诱变的过程，并取200μl诱变后的菌液接种到含有1.0mmol L-1 1/5LB固体培养基中，于30℃的培养箱中培养并观察菌株生长情况，初步筛选4株生长较好的侧孢短芽孢杆菌，保存并进行后续试验。将4株具有耐1mmol L-1菌株接种到不含草甘膦异丙胺盐的1/5LB液体培养基中，培养72h后取菌液接种到含1.0mmol L-1草甘膦异丙胺盐的1/5LB固体培养基中，于30℃培养，观察生长情况。结果表明，4株菌种只有1株侧孢短芽孢杆菌(菌株CE4)可以产生单菌落。其结果如图1所示。
[0055] 4.诱变菌株与野生菌株产孢能力测定
[0056] 将活化好的侧孢短芽孢杆菌(CE-CK)和筛选到的耐草甘膦异丙胺盐的侧孢短芽孢杆菌(CE4)接种到含有50ml R2A培养基的150ml锥形瓶中，培养12h，将OD600调整至一致，接种到新的R2A培养基中培养72h，利用显微镜测定两株菌的产芽孢率的区别，实验结果如下：
[0057]
[0058] 5.诱变菌株与野生菌株生长速度对比
[0059] 将活化好的侧孢短芽孢杆菌CE-CK和CE4接种到含有50ml 1/5LB液体培养基的150ml的锥形瓶中，培养12h，将OD600调整到一致，接种到新的含有50ml 1/5LB液体培养基的
150ml的锥形瓶中，每隔3h利用紫外分光光度计测定菌液的OD600，实验结果如下：
150ml的锥形瓶中，每隔3h利用紫外分光光度计测定菌液的OD600，实验结果如下：
[0060]
[0061] 6.平板对峙法测菌株对立枯丝核菌的拮抗作用
[0062] 立枯丝核菌经PDA培养基活化后，用镊子夹取菌块置于1/5LB固体培养基中心，将活化好的侧孢短芽孢杆菌CE-CK和CE4分别接种到培养基的四周，30℃培养72h。测定抑菌圈的大小，并记录实验结果。
[0063]
[0064] 7.测敏试纸法测菌株对抗生素的耐受性
[0065] 菌株抗生素敏感性实验，将侧孢短芽孢杆菌CE-CK和CE4培养过夜达到指数生长期，取100μl菌液涂布到1/5LB固体培养基上，将测敏试纸(OXOID)贴附在培养基表面，培养24h测定透明圈大小。
[0066]
[0067] 8.侧胞短芽孢杆菌耐盐性试样
[0068] 将活化好的侧孢短芽孢杆菌CE-CK和CE4分别接种到R2A培养基中培养过夜后，取100μl分别接种到含NaCl分别为1.0％,2.0％,3.0％,4.0％,5.0％的R2A培养基中，培养过夜，结果如下表。
[0069]
[0070]
[0071] 注：“+”代表生长，“－”代表不生长
[0072] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
[0073] 参考文献
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.Environmental pollution,2013,180:71-77.
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