技术领域
[0001] 本
发明涉及一种防治根结线虫病的土壤处理剂及其制备方法和应用方法，属于设施农业
病虫害防治领域。
背景技术
[0002] 根结线虫是一类非常重要的
植物病原线虫，广泛分布于世界各地。由于根结线虫有效种多，寄主范围广，可侵染几乎所有的常见作物，如蔬菜、花卉、
烟草、果树和
杂草等，严重威胁着农业的可持续生产。近年来，随着保护地蔬菜种植面积的扩大及连作年限的延长，特别是日光
温室的大面积推广，作物四季重茬严重，导致根结线虫病的发生区域随之不断扩大，危害也逐年加重，一般每年造成的经济损失为10～15％，严重时可达30～40％，甚至绝产。目前，根结线虫病害已成为制约我国设施农业可持续生产的主要病害之一。
[0003] 根结线虫生活史要经历卵、一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫及成虫6个阶段，该过程易受
温度、土壤湿度、土壤类型等环境因素的影响。其中侵染性二龄幼虫通过口针刺穿植物根部，侵入根尖组织内，通过食道分泌的有毒物质刺激寄主植物细胞发生各种复杂的生理和病理变化，从而使根系产生根结或结瘿，重病株根系萎缩畸形，吸收营养物质功能受损，导致植株发育不良、早衰等症状(王新荣，
马超，任路路，等.根结线虫引起的植物根结形态与形成机理研究进展[J]，华中农业大学学报，2010，29(2)： 251～256)。同时，根结线虫的侵入会在根部留下伤口，有利于其他土传病原
微生物的侵入，形成复合病害，从而造成更大的损失(路
雪君，廖晓兰，成飞雪，等.根结线虫的
生物防治研究进展[J]，中国农业科技导报，2010，12(4)：44～48)。此外，根结线虫具有繁殖速度快、产卵量大、抗逆性强、寄生性强等特点，且在无寄主植物存在的条件下，可以存活三年之久，因此防治难度较大。
[0004] 降低土壤中根结线虫的数量和该属在线虫群落中的占比是有效防治线虫病害的前提。目前生产上防治根结线虫病的方法主要包括：(1)农业防治；(2)物理防治；(3)
化学防治；(4)生物防治。利用
轮作、间作、套作、休闲、调节
播种期等措施可以在一定程度上减轻作物的根结线虫病害，但由于现代设施农业的作物种植区分布相对集中，种植的作物种类不多，而根结线虫的寄主范围又较宽，因此很难大面积推广实施，且种植
风险和局限性较大。物理防治措施如火焰高温消毒技术，可以有效杀灭浅层土壤中的根结线虫，但费工费时，且对深层活动线虫效果一般，难以彻底防治，同时还杀灭了土壤中的有益微生物，破坏了微生物生态平衡。化学防治是目前农业生产中使用最广泛的防治措施，如阿维菌素、
棉隆、克线磷、氯化苦、噻唑膦等杀线剂均有较好的防治效果，但化学杀线剂往往药效持久性较差，且长期使用会在土壤中残留并对地下
水源造成污染，还会增加线虫抗药性和
食品安全的风险，尤其对于生长周期较短的食叶类蔬菜，一些高毒的化学杀线剂已经被明确禁用。通过分离杀线虫的微生物并制成菌剂后施用至根结线虫病高发的土壤中是生物防治根结线虫病的主要措施，因其安全、环保、无污染等特点受到越来越多的重视，还具有明显的后效作用。但是，由于土壤环境极为复杂，土壤抑菌作用普遍存在，很大程度上限制了微生物菌剂药效的发挥，而且对于根结线虫数量很高的土壤，这种直接添加微生物菌剂的防效并不显著。此外，诸如筛选根结线虫抗性品种，通过基因工程导入抗线虫基因等手段均具有广泛的应用前景，但目前大都处于实验室研究阶段，离大面积推广应用还有很长的距离。
[0005] 目前，植物根结线虫病害已对我国设施农业的安全可持续生产带来严重威胁。因此，迫切需要寻求一种切实有效的防治设施农业根结线虫病的技术和产品。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服
现有技术的
缺陷，提供一种防治根结线虫病的土壤处理剂，土壤处理剂中的杀线主剂在土著微生物厌
氧分解过程中分泌产生大量的杀线物质，如细胞壁降解酶、乙酸等，且快速创造的厌氧环境也能杀灭线虫，从而达到有效降低线虫卵孵化率，杀灭二龄幼虫，降低根结线虫病高发土壤中根结线虫的数量和该属在线虫群落中的占比，减轻后茬作物根结线虫病害发生率。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种防治根结线虫病的土壤处理剂，它包括杀线主剂和杀线增效剂，所述杀线主剂包含杀线有机原料和促分解辅料；其中，[0008] 所述杀线有机原料为固体有机原料或液体有机原料，当所述杀线有机原料为固体有机原料时，所述杀线有机原料包含
农作物秸秆和糖厂下脚料中的至少一种；当所述杀线有机原料为液体有机原料时，所述杀线有机原料包含酒精
发酵液和糖蜜中的至少一种；
[0009] 所述促分解辅料包含有机催化物和专用微生物中的至少一种；
[0010] 所述杀线增效剂包含细菌杀线菌剂和
真菌杀线菌剂。
[0011] 进一步，当所述杀线有机原料为固体有机原料时，所述固体有机原料的细度为 0.1～2mm，以
质量百分比计，固体有机原料：水分<20％，总有机
碳>40％，总有机氮>0.5％；
当所述杀线有机原料为液体有机原料时，以质量百分比计，液体有机原料：水分<30％，总有机碳>30％，总有机氮>1.5％。
[0012] 进一步，所述杀线主剂中，所述杀线有机原料与促分解辅料的质量比为(95～100)：(0～5)。
[0013] 进一步，当所述杀线有机原料为固体有机原料时，所述固体有机原料为
甘蔗渣或苜蓿粉；当所杀线有机原料为液体有机原料时，述所述液体有机原料为糖蜜。
[0014] 进一步，所述促分解辅料包含专用微生物和有机催化物，所述专用微生物和有机催化物的质量比为(0.2～5)：1。
[0015] 进一步，所述专用微生物包含功能性
酵母菌、芽孢杆菌、放线菌和曲霉中的至少一种；所述有机催化物包含
纤维素酶和木质素酶中的至少一种。
[0016] 进一步，所述细菌杀线菌剂和真菌杀线菌剂的质量比为(0.2～5)：1，所述细菌杀线菌剂包含坚强芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌、苏
云金杆菌和橄榄色链霉菌中的至少一种，所述真菌杀线菌剂包含厚孢轮枝菌和淡紫紫孢菌中的至少一种。
[0017] 本发明还提供了一种防治根结线虫病的土壤处理剂的制备方法，制备方法的步骤中包含：
[0018] (a)制备杀线主剂：当杀线有机原料为固体有机原料时，将固体有机原料和促分解辅料以100～200r/min的搅拌速度混合均匀，并
粉碎，然后在温度为70～90℃的条件下干燥10～30min，自然冷却至室温，分等
包装后即得杀线主剂；当杀线有机原料为液体有机原料时，将液体有机原料和促分解辅料以50～100r/min的搅拌速度混合均匀，然后在温度为70～90℃的条件下干燥浓缩10～30min，自然冷却至室温，分等包装后即得杀线主剂；
[0019] (b)制备杀线增效剂：将细菌杀线菌剂和真菌杀线菌剂混合均匀，分等包装后即得杀线增效剂。
[0020] 本发明还提供了一种防治根结线虫病的土壤处理剂的应用方法，
[0021] 当杀线主剂中的杀线有机原料为固体有机原料时，方法步骤中包含：
[0022] 1)将待处理土壤灌水至最大田间持水量的50～60％，并维持3～5天；
[0023] 2)待土壤落干3～5天后，将所述杀线主剂按照500～2000kg/亩的比例均匀散布在土壤表面；
[0024] 3)将土壤的
耕作层翻耕0～30cm，使杀线主剂和土壤混合均匀；
[0025] 4)灌水至最大田间持水量后覆膜；
[0026] 5)厌氧处理15～30天，土温15～45℃，结束后揭膜，即完成对设施农业根结线虫的杀灭；
[0027] 6)将所述杀线增效剂按照5～15kg/亩的比例均匀施用在土壤表面；
[0028] 7)好氧处理3～5天，土温15～30℃，即完成对设施农业杀线的增效措施。
[0029] 当杀线主剂中的杀线有机原料为液体有机原料时，方法步骤中包含：
[0030] 1)将待处理土壤的耕作层翻耕0～30cm；
[0031] 2)将待处理土壤灌水至最大田间持水量的50～60％，并维持3～5天；
[0032] 3)将所述杀线主剂按照300～1000kg/亩的比例通
过喷灌均匀地喷洒在土壤表面；
[0033] 4)灌水至最大田间持水量后覆膜；
[0034] 5)厌氧处理15～30天，土温15～45℃，结束后揭膜，即完成对设施农业根结线虫的杀灭；
[0035] 6)将所述杀线增效剂按照5～15kg/亩的比例均匀施用在土壤表面；
[0036] 7)好氧处理3～5天，土温15～30℃，即完成对设施农业杀线的增效措施。
[0037] 进一步，所述膜为原生膜，所述原生膜的厚度为4～8丝。
[0038] 采用了上述技术方案后，本发明的杀线主剂在土著微生物厌氧分解过程中分泌产生大量的杀线物质如细胞壁降解酶、乙酸等，且快速创造的厌氧环境也能杀灭线虫，从而达到有效降低线虫卵孵化率，杀灭二龄幼虫，降低根结线虫病高发土壤中根结线虫的数量和该属在线虫群落中的占比，减轻后茬作物根结线虫病害发生率；本发明的应用方法能够有效降低土壤中根结线虫的数量和该属在线虫群落中的占比，杀线率高达81～95％，根结线虫属占比下降至12～31％，可用于解决因土壤中根结线虫富集导致的设施农业作物如蔬菜、花卉等连作障碍问题，对保证设施农业安全可持续生长具有重要的意义；与现有防治措施相比，本发明生态环保、防效稳定、持效长，适应各种设施农业作物连茬后根结线虫病害高发的土壤。
附图说明
[0039] 图1为本发明的
实施例1的线虫属水平的分布；
[0040] 图2为本发明的实施例2的线虫属水平的分布。
具体实施方式
[0041] 为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
[0042] 1、杀线有机原料和微生物菌剂的获得
[0043] 甘蔗渣、苜蓿粉和糖蜜由市场购买所得，其中甘蔗渣的总有机碳为445.0g/kg，总有机氮为4.39g/kg，碳氮比为101.4；苜蓿粉的总有机碳为399.1g/kg，总有机氮为13.45 g/kg，碳氮比为29.7；糖蜜的总有机碳为400.6g/kg，总有机氮为28.1g/kg，碳氮比为 14.2。微生物菌剂也由市场购买所得。
[0044] 2、杀线主剂和杀线增效剂的制备
[0045] 2.1包含甘蔗渣的杀线主剂的制备
[0046] 1)将甘蔗渣经过彻底粉碎后作为杀线有机原料，该有机原料的技术指标为：水分：10％；总有机碳：40％；总有机氮：0.5％；易氧化碳：8％；
[0047] 2)芽孢杆菌、曲霉按50：50的质量比例混合作为促分解辅料，其中，所述芽孢杆菌为解
淀粉芽孢杆菌；
[0048] 3)以质量百分比计，上述促分解辅料1％，余量为杀线有机原料；
[0049] 将上述杀线有机原料和促分解辅料混合，转速为100r/min，70℃干燥10min，然后室温下自然冷却10min，获得包含甘蔗渣的杀线主剂。
[0050] 2.2包含苜蓿粉的杀线主剂的制备
[0051] 1)将苜蓿经过彻底粉碎后作为杀线有机原料，该有机原料的技术指标为：水分： 8％；总有机碳：40％；总有机氮TN：1.3％；易氧化碳：10％；
[0052] 2)将芽孢杆菌、曲霉按按照50:50的质量比例混合作为促分解辅料，其中，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌；
[0053] 3)以质量百分比计，上述促分解辅料1％，余量为杀线有机原料，将上述杀线有机原料和促分解辅料混合，转速为150r/min，80℃干燥20min，然后室温下自然冷却 10～30min，获得包含苜蓿的粉杀线主剂。
[0054] 2.3包含糖蜜的杀线主剂的制备
[0055] 1)将糖蜜作为杀线有机原料，该液体有机原料的技术指标为：水分：12％；总有机碳：40％；总有机氮：2.5％；易氧化碳：15％；
[0056] 2)将酵母菌、
纤维素酶按50:50的质量比例混合作为促分解辅料；
[0057] 2)以质量百分比计，上述促分解辅料1％，余量为杀线有机原料，将上述杀线有机原料和促分解辅料混合，转速为50r/min，90℃干燥30min，然后室温下自然冷却30min，获得糖蜜杀线主剂。
[0058] 2.4杀线增效剂的制备
[0059] 将细菌杀线菌剂坚强芽孢杆菌和真菌杀线菌剂淡紫紫孢菌颗粒按30:70的质量比例混合均匀作为杀线增效剂。
[0060] 3、土壤中线虫的分离与鉴定
[0061] 3.1土壤中线虫的分离
[0062] 土壤中线虫的分离采用浅盘分离～
蔗糖密度离心连续提取法进行线虫分离。
[0063] 3.1.1浅盘分离
[0064] 将线虫
滤纸平铺在不锈
钢带网孔浅盘上，用水润湿，称取50g鲜土并将其均匀地平铺在滤纸上，在配套的塑料浅盘中加入适量的水，再将
不锈钢网孔浅盘置于塑料浅盘上，在土壤表面形成薄薄的水膜(约1mm)。将浅盘在25℃放置下48小时。
[0065] 48小时后，沥去不锈钢网孔浅盘中的水，再将滤纸上所有土壤轻刮到250mL离心管内，滤纸上残余的土壤冲洗到离心管内，准备蔗糖离心。同时，将塑料浅盘中线虫水悬液过两个套在一起的500目(孔径25μm)筛子，反复进行三次后将两个套筛中的线虫冲洗到计数小皿中。
[0066] 3.1.2蔗糖浮选
[0067] 用蔗糖密度离心法分离得到土壤中残留的线虫，向250mL离心管中补充水分至 100mL，在3000rpm下离心5min，弃去上清液。再加入100ml蔗糖溶液(浓度454g/L)，用胶皮棒迅速将土壤悬液搅拌均匀，1500rpm下离心5min，上清液立即倒入装有约三分之一
自来水的塑料浅盘中，以上述同种方法过500目套筛收集线虫。
[0068] 3.2土壤中线虫计数与鉴定
[0069] 3.2.1土壤中线虫计数
[0070] 将上述浅盘分离和蔗糖浮选分离得到的土壤线虫静置几小时后，在Motic SMZ～168 体式
显微镜下进行计数。线虫总数换算为每克干土(或者每100g干土)中线虫的数量。
[0071] 3.2.2土壤中线虫鉴定
[0072] 用量程为20μm的移液枪随机从计数小皿中吸取150～200条线虫放置于
载玻片上，盖好盖玻片并用无色指甲油密封盖玻片的四周，避免水分
蒸发影响线虫的形态特征。将载玻片置于Olympus BX50
光学显微镜下将线虫鉴定到属，线虫鉴定主要参考《中国土壤动物检索图鉴》及Bongers(1994)。
[0073] 4.实施例
[0074] 实施例1
[0075] 利用2.1、2.3和2.4中获得的土壤处理剂在连作六年的洋桔梗线虫病高发土壤中进行杀线试验。
[0076] 1)土样采集
[0077] 土样采集自云南省红河州石屏丽然花卉果蔬有限公司洋桔梗种植基地10号大棚，该大棚已连续种植洋桔梗六年且根结线虫病害较为严重，发生率达到50％左右。采集的土壤样品先加水至田间最大持水量的50～60％，25℃培养5天，随后落干3天待用，目的是促进线虫卵的孵化。
[0078] 2)试验设计
[0079] 室内培养实验共设置三个试验：
[0080] 1)不做任何处理的对照(CK)；
[0081] 2)包含甘蔗渣的土壤处理剂处理(SB)，即每个自封袋中装入100g新鲜土壤，加入1300kg/亩的包含甘蔗渣的杀线主剂，将土壤与杀线主剂充分混匀，加水
灌溉至田间最大持水量，在35℃条件下厌氧处理21天，处理结束后加入10kg/亩的杀线增效剂，25℃条件下好氧处理5天；
[0082] 3)包含糖蜜的土壤处理剂处理(MO)，即每个自封袋中装入100g新鲜土壤，加入800kg/亩的糖蜜杀线主剂，将土壤与杀线主剂充分混匀，加水灌溉至田间最大持水量，在35℃条件下厌氧处理21天，处理结束后加入5kg/亩的杀线增效剂，25℃条件下好氧处理5天。
[0083] 好氧处理结束后采集土壤样品进行线虫的分离、计数和鉴定。各个试验重复3次。
[0084] 3)线虫的分离、计数和鉴定
[0085] 土壤中线虫的分离、计数和鉴定如3.1和3.2所述。
[0086] 4)试验结果
[0087] 如表1所示，与对照相比，包含糖蜜的土壤处理剂和包含甘蔗渣的土壤处理剂均能显著降低土壤中根结线虫的数量，杀线率分别高达94.96％和81.42％，其中包含糖蜜的土壤处理剂的杀线效果优于甘蔗渣土壤处理剂。
[0088] 此外，如图1所示，线虫属水平分布显示，根结线虫属在CK处理的占比最高，达到90.14％，而MO和SB处理其占比分别为11.95％和30.52％，表明含糖蜜的土壤处理剂和含甘蔗渣的土壤处理剂均能有效降低土壤中根结线虫属在整个线虫群落中的占比，改善了线虫的群落结构组成。
[0089] 表1本发明中的土壤处理剂对洋桔梗连作土壤中根结线虫数量和杀线率的影响[0090]
[0091] 实施例2
[0092] 利用2.1、2.2和2.4中获得的甘蔗渣和苜蓿粉土壤处理剂在连作六年的洋桔梗线虫病高发土壤中进行杀线试验。
[0093] 1)土样采集
[0094] 土样采集自云南省红河州石屏丽然花卉果蔬有限公司洋桔梗种植基地17号大棚，该大棚已连续种植洋桔梗六年且根结线虫病害极为严重，发生率高达85％。采集的土壤样品先加水至田间最大持水量的50～60％，25℃培养5天，随后落干3天待用，目的是促进线虫卵的孵化。
[0095] 2)试验设计
[0096] 室内培养实验共设置三个试验：
[0097] 1)不做任何处理的对照(CK)；
[0098] 2)甘蔗渣土壤处理剂处理(SB)，即每个自封袋中装入100g新鲜土壤，加入1300kg/ 亩的包含甘蔗渣的杀线主剂，将土壤与杀线主剂充分混匀，加水灌溉至田间最大持水量，在35℃条件下厌氧处理21天，处理结束后加入10kg/亩的杀线增效剂，25℃条件下处理好氧5天；
[0099] 3)苜蓿粉土壤处理剂处理(AL)，即每个自封袋中装入100g新鲜土壤，加入1300kg/ 亩的包含苜蓿粉的杀线主剂，将土壤与杀线主剂充分混匀，加水灌溉至田间最大持水量，在35℃条件下厌氧处理21天，处理结束后加入15kg/亩的杀线增效剂，25℃条件下好氧处理5天。
[0100] 好氧处理结束后采集土壤样品进行线虫的分离、计数和鉴定。各试验重复3次。
[0101] 3)线虫的分离、计数和鉴定
[0102] 土壤中线虫的分离、计数和鉴定如3.1和3.2所述。
[0103] 4)试验结果
[0104] 如表2所示，与对照相比，包含甘蔗渣的土壤处理剂和包含苜蓿粉的土壤处理剂均能显著降低土壤中根结线虫的数量，杀线率分别高达91.48％和89.55％。此外，如图2 所示，线虫属水平分布显示，根结线虫属在CK处理的占比最高，达到93.06％，而SB 和AL处理，其占比分别为20.99％和15.24％，表明包含甘蔗渣的土壤处理剂和包含苜蓿粉的土壤处理剂均能有效降低土壤中根结线虫属在整个线虫群落中的占比，且经AL 处理后，根结线虫属的占比较SB处理低。
[0105] 表2：本发明的土壤处理剂对洋桔梗连作土壤中根结线虫数量和杀线率的影响[0106]
[0107] 本发明的工作原理如下：
[0108] 本发明的杀线主剂在土著微生物厌氧分解过程中分泌产生大量的杀线物质如细胞壁降解酶、乙酸等，且快速创造的厌氧环境也能杀灭线虫，从而达到有效降低线虫卵孵化率，杀灭二龄幼虫，降低根结线虫病高发土壤中根结线虫的数量和该属在线虫群落中的占比，减轻后茬作物根结线虫病害发生率；本发明的应用方法能够有效降低土壤中根结线虫的数量和该属在线虫群落中的占比，杀线率高达81～95％，根结线虫属占比下降至12～31％，可用于解决因土壤中根结线虫富集导致的设施农业作物如蔬菜、花卉等连作障碍问题，对保证设施农业安全可持续生长具有重要的意义；与现有防治措施相比，本发明生态环保、防效稳定、持效长，适应各种设施农业作物连茬后根结线虫病害高发的土壤。
[0109] 以上所述的具体实施例，对本发明解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
