一株毒杀植物寄生线虫的菌核青霉及其制备方法和应用
阅读：600发布：2020-06-11
专利汇可以提供一株毒杀植物寄生线虫的菌核青霉及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株毒杀 植物 寄生 线虫 的菌核青霉及其制备方法和应用。该菌核青霉的菌株号为D35，其在中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.12168。活性成分为用乙酸乙酯从菌核青霉D35的培养物中提取得到的溶于乙酸乙酯的物质的植物寄生线虫 抑制剂 ，对南方根结线虫的校正死亡率为100％。菌核青霉D35对南方根结线虫卵孵化的平均抑制率为99％。菌核青霉D35固体 发酵 培养物在没有任何助剂填加的条件下，45天时对黄瓜根结线虫病防效达83.9％，80天后对黄瓜根结线虫病防效仍达77.7％。经菌核青霉D35处理后的黄瓜苗根系发达，根结少，植株生长正常，对黄瓜安全。，下面是一株毒杀植物寄生线虫的菌核青霉及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.菌核青霉（Penicillium sclerotiorum），其菌株号为D35，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.12168。
2.权利要求1所述菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）的培养物，是将权利要求1所述的菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）在微生物培养基中培养得到的培养容器内的物质，所述物质包括所述菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）和所述菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）的代谢物。
3. 植物寄生线虫抑制剂，它的活性成分是权利要求1所述的菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）。
4.根据权利要求3所述的植物寄生线虫抑制剂，其特征在于：所述植物寄生线虫抑制剂是用乙酸乙酯从权利要求2所述的培养物中提取得到的溶于乙酸乙酯的物质。
5.根据权利要求3或4所述的植物寄生线虫抑制剂，其特征在于：所述植物寄生线虫为根结线虫。
6.根据权利要求5所述的植物寄生线虫抑制剂，其特征在于：所述根结线虫为南方根结线虫。
一株毒杀植物寄生线虫的菌核青霉及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围内，植物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重。据估计，全球每年因植物寄生线虫给农业、林业生产造成的损失高达1,570亿美元(Abad P,et al.2008.Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita.Nature Biotechnology,26:909-915)，而实际的损失远远超过估计，再者，线虫与其它生物相互作用而对植物产生的直接或间接影响还在急剧增加。
[0003] 目前对植物有害的线虫约有3000多种，在我国主要有根结线虫、胞囊线虫、松材线虫等。根结线虫可以危害114科超过3000种植物，是农业上为害最大的一类线虫，病害发生后，一般减产10％-15％左右，严重的高达75％以上，甚至绝收(A.G.Whitehead,1998.Plant Nematode Control.ISBN0851991882CAB International)。目前线虫防治仍以化学防治为主，但是线虫体表为不具细胞结构的角质层，神经系统又不发达，虫体通气性、透水性较差，对化学物质反应迟钝，所以化学杀线剂多为剧毒农药，对人畜毒性高，污染环境，很多已被禁止用于蔬菜和瓜果。目前虽有一些适于菜田使用的中、低毒杀线剂，但品种很少，给线虫的防治工作增添了困难，因此开发高效安全的生物杀线剂迫在眉睫。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何防治植物寄生线虫。
[0005] 为解决以上技术问题，本发明提供了一株菌核青霉。
[0006] 本发明所提供的菌核青霉，其菌株号为D35，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.12168。
[0007] 上述菌核青霉D35可以分生孢子、菌丝或含有分生孢子和/或菌丝的菌丝体的形式存在。
[0008] 上述菌核青霉D35的培养物也属于本发明的保护范围。
[0009] 本发明所提供的菌核青霉D35的培养物，是将菌核青霉D35在微生物培养基中培养得到的培养容器内的物质，所述物质包括所述菌核青霉和所述菌核青霉的代谢物。
[0010] 上述菌核青霉D35的培养物中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。
[0011] 上述菌核青霉D35的培养物中，所述固体培养基可为由糙米和水制成的固体培养基。所述糙米是稻谷脱去外保护皮层稻壳后的颖果，内保护皮层(果皮、种皮、珠心层)完好的稻米籽粒。
[0012] 为解决以上技术问题，本发明提供了植物寄生线虫抑制剂。
[0013] 本发明所提供的植物寄生线虫抑制剂，它的活性成分是菌核青霉D35和/或菌核青霉D35的代谢物。
[0014] 所述植物寄生线虫抑制剂具体可为用乙酸乙酯从菌核青霉D35的培养物中提取得到的溶于乙酸乙酯的物质。
[0015] 上述植物寄生线虫抑制剂中，所述植物寄生线虫可为根结线虫。
[0016] 上述植物寄生线虫抑制剂中，所述根结线虫可为南方根结线虫。
[0017] 上述菌核青霉D35和/或菌核青霉D35的代谢物和/或菌核青霉D35的培养物在制备植物寄生线虫抑制剂中的应用或在制备抑制植物寄生线虫危害黄瓜药剂中的应用也属于本发明的保护范围。
[0018] 上述菌核青霉D35和/或菌核青霉D35的代谢物和/或菌核青霉D35的培养物在抑制植物寄生线虫中的应用或抑制植物寄生线虫危害黄瓜中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019] 上述应用中，所述植物寄生线虫可为根结线虫。
[0020] 上述应用中，所述根结线虫可为南方根结线虫。
[0021] 上文中，所述植物寄生线虫抑制剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
[0022] 所述植物寄生线虫抑制剂中，上述菌核青霉D35可以分生孢子、菌丝或含有分生孢子和/或菌丝的菌丝体的形式存在。
[0023] 所述植物寄生线虫抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
[0025] 实验证明，活性成分为用乙酸乙酯从菌核青霉D35的培养物中提取得到的溶于乙酸乙酯的物质的植物寄生线虫抑制剂，在活性成分含量为1.5g/L对南方根结线虫的校正死亡率为100％。菌核青霉D35对南方根结线虫卵孵化的平均抑制率为99％。菌核青霉D35固体发酵培养物在没有任何助剂填加的条件下，45天时对黄瓜根结线虫病防效达83.9％，80天后对黄瓜根结线虫病防效仍达77.7％。经菌核青霉D35处理后的黄瓜苗根系发达，根结少，植株生长正常，对黄瓜安全。菌核青霉D35和/或菌核青霉D35的代谢物可用于植物寄生线虫的防治中。
[0026] 保藏说明
[0027] 菌种名称：菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)
[0028] 菌株编号：D35
[0029] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0030] 保藏机构简称：CGMCC
[0031] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0032] 保藏日期：2016年4月12日
[0035] 图2为菌核青霉D35在马丁平板上产孢情况。
[0036] 图3为菌核青霉D35分生孢子梗形态。
[0037] 图4为植物寄生线虫抑制剂处理45天的黄瓜根系。
[0038] 图5为CK处理45天的黄瓜根系。
具体实施方式
[0039] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 实施例1、菌核青霉D35的分离与鉴定
[0041] 1.1菌株分离
[0042] 采用稀释平板分离法从中国福建武夷山土样中分离菌株。称取土样10g放入90ml无菌水中，用1ml无菌移液管吸取1ml 10-1浓度的菌液于一管9ml无菌水中，摇匀即为10-2浓-4 -2 -3 -4度的菌液，同样方法，依次稀释到10 。将上述10 、10 和10 土壤菌液分别涂布到PDA平板上，吹干后倒置于25℃培养箱中培养3-5天，将分离到的真菌转接到PDA斜面上培养，待长好后，置于冰箱中保存。取编号为D35的菌株进行下述鉴定。
[0043] 1.2菌株鉴定
[0044] 1.2.1菌株形态观察
[0045] 将菌株D35用接种针挑至马丁培养基(培养基配方：葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、KH2PO4·3H2O 0.1g、MgSO4·7H2O 0.05g、0.1％孟加拉红溶液0.33ml、琼脂1.5～2g、蒸馏水100ml，自然pH，2％去氧胆酸钠溶液2ml(预先灭菌，临用前加入)，链霉素溶液(10 000u/ml)
0.33ml(临用前加入))平板中央，25℃培养箱中培养，72h后照相，并于显微镜下观察分生孢子梗及分生孢子的形态。从图1中可以看到菌株D35在马丁培养基上菌落呈圆形，初在边缘产生白色菌丝，渐变为橙黄色，从图2中可以看到分生孢子较多的面上近于暗绿色，产孢量大。从图3显微镜下可以看到D35菌丝有横隔，分生孢子梗顶端产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，分生孢子球形。鉴于分生孢子梗和菌落等典型形态特征，初步鉴定D35为青霉属真菌。
0.33ml(临用前加入))平板中央，25℃培养箱中培养，72h后照相，并于显微镜下观察分生孢子梗及分生孢子的形态。从图1中可以看到菌株D35在马丁培养基上菌落呈圆形，初在边缘产生白色菌丝，渐变为橙黄色，从图2中可以看到分生孢子较多的面上近于暗绿色，产孢量大。从图3显微镜下可以看到D35菌丝有横隔，分生孢子梗顶端产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，分生孢子球形。鉴于分生孢子梗和菌落等典型形态特征，初步鉴定D35为青霉属真菌。
[0046] 1.2.2分子生物学鉴定
[0047] 提取菌株D35的基因组DNA，-20℃保存备用。以提取的DNA为模板，扩增引物为真菌rDNA-ITS通用引物ITS1(5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’)和ITS2(5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’)。PCR扩增的反应体系为10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs 1.5μL，TaqDNA聚合酶0.7μL，引物1.5μL，模板DNA 1.5μL，ddH2O 17.3μL，总体积25μL。PCR扩增反应的条件为：94℃预变性2min，94℃变性45S，37℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min。PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后送生工生物工程(北京)有限公司测序。将所得序列与GenBank数据库中序列进行比对，通过MEGA5.0构建系统发育进化树。
[0048] 经测序获得菌株D35的rDNA-ITS序列(序列表中序列1)，通过Blast分析，选取与之同源性较高的菌株，利用软件MEGA5.0进行系统发育分析、Neighbor-Joining法构建菌株的rDNA-ITS系统发育树。结果表明D35与Penicillium aff.sclerotiorum聚在一个分支上，同源性为99％，因此，结合之前的形态特征，确定菌株D35为菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)。
[0049] 菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35已于2016年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12168。
[0050] 实施例2、植物根结线虫抑制剂及其杀线虫活性
[0051] 1.菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35的培养
[0052] 1.1试管种培养
[0053] 将菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35接入PDA培养基，在25℃培养7d，获得试管种。
[0054] 其中，马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，琼脂17g，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀，121℃条件下灭菌20分钟，得到PDA培养基。
[0055] 1.2菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35液体发酵培养
[0056] 将1.1的试管种接种到装有125mL PD液体培养基的500mL三角瓶中，25℃～28℃-1 -1下，摇床转速以200r·min ～220r·min 、发酵72h，得到菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35发酵液。
[0057] 其中，马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀，121℃条件下灭菌20分钟，得到PD液体培养基。
[0058] 1.3固体发酵培养
[0059] 将步骤1.2的菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35发酵液接种到装有固体发酵培养基的500mL三角瓶中，每瓶接种5mL发酵液，25℃培养40d，得到菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35固体发酵培养物。
[0060] 其中，固体发酵培养基：糙米80g，水125mL，121℃条件下灭菌20分钟，得到固体发酵培养基。糙米是稻谷脱去外保护皮层稻壳后的颖果，内保护皮层(果皮、种皮、珠心层)完好的稻米籽粒。
[0061] 2.植物寄生线虫抑制剂的制备
[0062] 将1.3的菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35固体发酵培养物，用玻璃棒将其搅碎，每瓶加入300mL乙酸乙酯，置20℃150rpm/min摇床上动态萃取24h，萃取3次，抽滤得乙酸乙酯相，用旋转蒸发仪(温度：30℃，转数：70转)旋转蒸发除去乙酸乙酯相中乙酸乙酯，得到乙酸乙酯萃取物，该乙酸乙酯萃取物即为植物寄生线虫抑制剂的活性成分。
[0063] 将乙酸乙酯萃取物(溶质)用甲醇(溶剂)溶解，配制成浓度为1.5g/L的溶液，即为植物寄生线虫抑制剂。
[0064] 3.植物寄生线虫抑制剂的杀线虫活性
[0065] 3.1南方根结线虫卵、卵囊及二龄幼虫的获得
[0066] 南方根结线虫用感病番茄品种佳粉15号室内盆栽接种方式保存。接种40d后，在番茄根系有大量卵囊出现，将根系用水轻轻冲洗，小心取下卵囊，放在0.5％次氯酸钠溶液中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放在盛有少量无菌水的培养皿内，4℃保存备用。
[0067] 另取部分卵囊放在盛有少量无菌水的培养皿内，25℃培养4d，每隔24h收集一次新孵化的南方根结线虫二龄幼虫，室温保存备用。
[0068] 将病根洗净，剪成0.5-1cm的小段，放入500mL三角瓶中，加1％次氯酸钠溶液200mL，剧烈震荡5min，用200目及500目网筛反复冲洗收集，通过500目网筛收集到纯净的南方根结线虫卵，4℃保存备用。
[0069] 3.2植物寄生线虫抑制剂对南方根结线虫二龄幼虫的抑制作用
[0070] 将植物寄生线虫抑制剂(浓度为1.5g/L)、甲醇分别加入经灭菌的40孔组织培养板，每孔100μL，植物寄生线虫抑制剂设4孔。其中甲醇为对照。通风橱中吹干，然后分别向每孔中各加入100μL线虫悬浮液(南方根结线虫二龄幼虫的含量为20.1±2.1条/100μL)，放入25℃培养箱中，24h后记录线虫死亡率，计算校正死亡率即为杀线虫药效。每处理重复4次。
该实验操作在无菌环境下进行。
该实验操作在无菌环境下进行。
[0071]
[0072]
[0073] 表1.植物寄生线虫抑制剂对南方根结线虫2龄幼虫的影响
[0074]
[0075] 注：CK：甲醇对照
[0076] 结果表明，植物寄生线虫抑制剂杀根结线虫活性很好，对南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率为100％(表1)。
[0077] 3.3植物寄生线虫抑制剂对南方根结线虫卵囊孵化的抑制作用
[0078] 在每个无菌的直径为6cm的塑料培养皿中放入3个表面消毒的发育较一致的卵囊，分别加入3mL植物寄生线虫抑制剂(浓度为1.5g/L)和甲醇。其中甲醇为对照。试验在25℃下进行，将各处理塑料培养皿用封口膜封严，以减少污染以及液体蒸发。7d后镜检各处理卵囊孵化情况。计算卵囊孵化线虫数和卵囊孵化的相对抑制率。每处理重复4次。该实验操作在无菌环境下进行。
[0079]
[0080] 表2.植物寄生线虫抑制剂对南方根结线虫卵囊孵化的影响
[0081]处理 卵囊平均孵化线虫(条) 相对抑制率(％)
植物寄生线虫抑制剂 1 99
CK 99 -
植物寄生线虫抑制剂 1 99
CK 99 -
[0082] 注：CK：甲醇对照
[0083] 结果表明，植物寄生线虫抑制剂(浓度为1.5g/L)能够抑制根结线虫卵的孵化，对南方根结线虫卵孵化平均抑制率为99％(表2)。
[0084] 通过以上对南方根结线虫活力和卵囊孵化的抑制作用试验结果表明，菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35是一株极具应用价值的真菌，特别是对南方根结线虫的杀线虫作用和对其卵囊孵化的抑制作用，显示出其良好的应用开发前景。
[0085] 3.4温室盆栽防治黄瓜南方根结线虫(Meloidogyne incognita)效果
[0086] 供试材料和方法：
[0087] 黄瓜：品种为北京402
[0088] 线虫：南方根结线虫Meloidogyne incognita
[0089] 黄瓜育苗于直径13cm、高10cm的营养钵中，育苗土为经处理过的无线虫园土和沙土按1:4比例混合。将1.3的菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35固体发酵培养物，用玻璃棒将其搅碎，得到植物寄生线虫抑制剂。等黄瓜苗长出4-5片真叶后接种根结线虫：将培养好的线虫配制成100条/mL的线虫悬浮液，在植株根周围均匀的插3个小孔，将线虫悬浮液滴入小孔中，每盆接种1500条线虫。当天进行药剂处理，设置接种线虫但不用药剂处理的黄瓜幼苗作为空白对照(CK)，每个处理3次重复，每次重复处理10株黄瓜苗。药剂处理方法为：植物寄生线虫抑制剂拌土后均匀撒施，植物寄生线虫抑制剂的施用量为100kg/2
hm ，施药后每盆浇等量的水，以不渗水为准，然后放置在温室中进行培养。正常田间管理，分别在施药后45天和80天调查根结数。根据根结数确定防治效果。
hm ，施药后每盆浇等量的水，以不渗水为准，然后放置在温室中进行培养。正常田间管理，分别在施药后45天和80天调查根结数。根据根结数确定防治效果。
[0090]
[0091] 表3.菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35固体发酵培养物温室盆栽试验结果
[0092]
[0093] 注：CK：空白对照
[0094] 结果表明，菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35固体发酵培养物在没有任何助剂填加的条件下，45天时对黄瓜根结线虫病防效达83.9％，80天后对黄瓜根结线虫病防效仍达77.7％(表3)。经菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)D35处理后的黄瓜苗根系发达，根结少，植株生长正常，未发现明显的药害(图4和图5)，对黄瓜安全，具有良好的应用价值，该浓度已经达到产业化开发利用的浓度要求。
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