用于使活细胞中核与染色体成像的融合蛋白
阅读：912发布：2023-12-20
专利汇可以提供用于使活细胞中核与染色体成像的融合蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供用于使活细胞中核与 染色 体成像的融合蛋白。本发明还提供包含所述融合蛋白的成像剂、编码所述成像剂的核酸、包含所述核酸的核酸构建体、载体，以及包含所述成像剂、核酸、核酸构建体或载体的细胞和包含上述之一的 试剂 盒 。本文所提供成像剂可用于例如使细胞的核及染色体成像、监测细胞中的核相关改变以及测试 生物 效应分子的活性。，下面是用于使活细胞中核与染色体成像的融合蛋白专利的具体信息内容。
1.成像剂，其包含具有一个或多个DNA结合结构域和一个或多个 荧光结构域的融合蛋白，其中所述融合蛋白被构建成定位在细胞的核 中。
2.权利要求1的成像剂，其中所述细胞为活细胞。
3.权利要求1-2中任一项的成像剂，其中所述DNA结合结构域选 自HMGB1、HMGB2和组蛋白H1。
4.权利要求1-3中任一项的成像剂，其中所述荧光结构域选自GFP、 EGFP、YFP、EYFP、CFP、ECFP、BFP、EBFP、RFP和DsRed。
5.权利要求1的成像剂，其中所述DNA结合结构域是HMGB1， 并且所述荧光蛋白是EGFP。
6.权利要求1-5中任一项的成像剂，所述成像剂还包含核定位结 构域。
7.权利要求6的成像剂，其中所述核定位结构域是来自SV40病毒 的核定位序列。
8.权利要求1-7中任一项的成像剂，所述成像剂还包含DNA结合 蛋白与荧光蛋白之间的接头肽。
9.权利要求1-8中任一项的成像剂，所述成像剂还包含细胞穿透 肽。
10.权利要求9的成像剂，其中所述细胞穿透肽选自：触角足基因 蛋白、TAT、transportan和多聚精氨酸。
11.含有权利要求1-10中任一项所述成像剂的细胞。
12.编码权利要求1-10中任一项所述成像剂的核酸。
13.核酸构建体，其包括与一个或多个DNA结合结构域、一个或 多个荧光结构域以及至少一个核定位结构域有效连接的启动子。
14.权利要求13的核酸构建体，其中所述启动子选自强组成型启 动子、弱组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。
15.权利要求14的核酸构建体，其中所述强组成型启动子是CMV 早期启动子。
16.权利要求14的核酸构建体，其中所述弱组成型启动子是截短 的CMV早期启动子。
17.权利要求13-16中任一项的核酸构建体，其中所述DNA结合 结构域选自HMGB1、HMGB2和组蛋白H1。
18.权利要求13-17中任一项的核酸构建体，其中所述荧光结构域 选自：GFP、EGFP、YFP、EYFP、CFP、ECFP、BFP、EBFP、RFP 和DsRed。
19.权利要求13-18中任一项的核酸构建体，其中所述DNA结合 结构域是HMGB1，并且所述荧光蛋白是EGFP。
20.权利要求13-19中任一项的核酸构建体，其中所述核定位结构 域是来自SV40病毒的核定位序列。
21.包含权利要求13-20任一项所述核酸构建体的载体。
22.权利要求21的载体，其具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2 的序列。
23.含有权利要求21-22中任一项所述载体的细胞。
24.成像方法，其包括以下步骤：
(a)将以下导入细胞：
(i)权利要求1-10中任一项的成像剂，或者
(ii)权利要求13-20中任一项的核酸构建体，其中所述构建体能 够在该细胞中表达成像剂；
(b)检测所述成像剂的荧光。
25.权利要求24的方法，其中所述检测步骤包括使细胞的核成像。
26.权利要求24的方法，其中所述检测步骤包括使细胞的染色体 成像。
27.监测细胞中一种或多种核相关改变的方法，其包括以下步骤：
(a)将以下导入测试细胞：
(i)权利要求1-10中任一项的成像剂，或者
(ii)权利要求13-20中任一项的核酸构建体，其中所述构建体能 够在该细胞中表达成像剂；和
(b)检测测试细胞中所述成像剂的一种或多种荧光改变，其中测试 细胞内成像剂的荧光与参照荧光相比的一种或多种改变指示了细胞中 的一种或多种核相关改变。
28.权利要求27的方法，其中所述一种或多种核相关改变包括一 种或多种染色体异常。
29.权利要求28的方法，其中所述一种或多种染色体异常选自缺 失、重复、倒位和易位。
30.权利要求27的方法，其中所述一种或多种核相关改变指示细 胞凋亡或细胞分裂。
31.权利要求27的方法，其中所述一种或多种荧光改变包括荧光 在水平或分布上的一种或多种改变。
32.观察一种或多种生物效应分子对细胞的一种或多种影响的方 法，其包括如下步骤：
(a)将以下引入测试细胞：
(i)权利要求1-10中任一项的成像剂，或者
(ii)权利要求13-20中任一项的核酸构建体，其中所述构建体能 够在该细胞中表达成像剂；
(b)将测试细胞与一种或多种生物效应分子接触；和
(c)检测测试细胞中成像剂的一种或多种荧光改变，其中测试细胞 中成像剂的荧光与参照荧光相比的一种或多种荧光改变指示所述一种 或多种分子对测试细胞的一种或多种影响。
33.权利要求32的方法，其中所观察的一种或多种生物效应分子 的影响是导致细胞死亡或染色体异常的毒性。
34.权利要求32的方法，其中所述一种或多种生物效应分子包括 选自以下的一种或多种分子：治疗剂、杀虫剂、除草剂、化合物、小分 子、毒素、核酸、蛋白质和肽。
35.成像试剂盒，其包括权利要求1-10中任一项所述的一种或多 种成像剂、权利要求13-20中任一项所述的核酸构建体、权利要求21-22 中任一项所述的载体或者权利要求12所述的细胞。
技术领域
发明内容
本发明的一个方面包括含有融合蛋白的成像剂(imaging agent)，所 述融合蛋白具有一个或多个DNA结合结构域和一个或多个荧光结构 域，其中所述融合蛋白构建成定位在细胞核中。在一些实施方案中，所 述细胞是活细胞。在一些实施方案中，所述DNA结合结构域选自 HMGB1、HMGB2和组蛋白H1。在一些实施方案中，所述荧光结构域 选自GFP、EGFP、YFP、EYFP、CFP、ECFP、BFP、EBFP、RFP 和DsRed。在一个说明性实施方案中，所述DNA结合结构域是HMGB1， 所述荧光结构域是EGFP。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含核定位结构域。在一个说 明性实施方案中，所述细胞核定位结构域是来自SV40病毒的核定位序 列。在一些实施方案中，所述融合蛋白在DNA结合结构域和荧光结构 域之间还含有接头肽。在一些实施方案中，所述融合蛋白还含有细胞穿 透肽。在一些说明性实施方案中，所述细胞穿透肽选自触角足基因蛋白 ANTP、TAT、transportan和多聚精氨酸。本发明的另一方面包括含有 所述成像剂的细胞。
本发明的另一方面包括含有启动子的核酸构建体，所述启动子与一 个或多个DNA结合结构域、一个或多个荧光结构域以及至少一个核定 位结构域有效连接。在一些实施方案中，所述启动子选自强组成型启动 子、弱组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。在一个说明 性实施方案中，所述强组成型启动子是CMV早期启动子。在一个说明 性的实施方案中，弱组成型启动子是截短的CMV早期启动子。
本发明的另一个方面包括含有核酸构建体的载体，所述核酸构建体 包含与一个或多个DNA结合结构域、一个或多个荧光结构域和至少一 个核定位结构域有效连接的启动子。在一个说明性实施方案中，所述载 体具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列。本发明还涉及转化或 转染了核酸载体的细胞，所述核酸载体包含与一个或多个DNA结合结 构域、一个或多个荧光结构域和至少一个核定位结构域有效连接的启动 子。
本发明的另一个方面包括成像方法，其包括以下步骤：
(a)将以下引入细胞中：
(i)本发明的成像剂，或
(ii)核酸构建体，其中所述构建体能够在细胞中表达本发明的成像剂；
(b)检测成像剂的荧光。
在一些实施方案中，检测步骤包括对细胞核成像。在一些实施方案中， 检测步骤包括对细胞的染色体成像。
本发明的另一个方面包括在细胞中监测与核相关的一种或多种变 化的方法，其包括下列步骤：
(a)将以下引入测试细胞中：
(i)本发明的成像剂，或
(ii)核酸构建体，其中所述构建体能够在细胞中表达本发明的成像 剂；和
(b)检测该测试细胞中成像剂荧光的一种或多种变化，
其中测试细胞中成像剂荧光与参考荧光相比的一种或多种变化可指示 细胞中的一种或多种核相关变化。在一些实施方案中，所述一种或多种 核相关变化包括一种或多种染色体异常。在一些实施方案中，所述一种 或多种染色体异常选自缺失、重复、倒位和易位。在一些实施方案中， 所述一种或多种核相关变化指示细胞凋亡或细胞分裂。在说明性实施方 案中，所述一种或多种荧光变化包括荧光水平或分布的一种或多种变 化。
本发明的另一个方面包括观察一种或多种分子对细胞的一种或多 种影响的方法，其包括以下步骤：
(a)将以下引入测试细胞中：
(i)本发明的成像剂，或
(ii)核酸构建体，其中所述构建体能够在细胞中表达本发明的成像 剂；
(b)使测试细胞与一种或多种分子接触；和
(c)检测测试细胞中成像剂荧光的一种或多种变化，
其中测试细胞中成像剂荧光与参考荧光相比的一种或多种变化可指示 一种或多种分子对测试细胞的一种或多种影响。
在一些实施方案中，所观察的一种或多种分子的影响是导致细胞死 亡或染色体异常的毒性。在一些实施方案中，所述一种或多种分子包括 选自下列组中的一种或多种分子：治疗剂、杀虫剂、除草剂、化合物、 小分子毒素、核酸、蛋白质和肽。
本发明的另一个方面包括成像试剂盒，其包含本文所述的成像剂、 编码本发明成像剂的核酸构建体、载体和/或细胞中的一种或多种。
附图说明
图1是pEGFP-lac载体中HMGB1-EGFP融合蛋白构建体的图示。
图2是证明在HEK 293FT和CHO细胞中HMGB1-EGFP融合蛋 白均存在核定位的显微照片。
图3是证明凋亡使细胞呈圆形并使HMGB1-EGFP扩散到整个细胞 的显微照片。
图4是ptrEGFP-HMGB1表达质粒的图示。
图5A和图5B是证明ptrEGFP-HMGB1表达质粒可以使染色体显 现的显微照片。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含核定位结构域。在一个说 明性实施方案中，所述细胞核定位结构域是来自SV40病毒的核定位序 列。在一些实施方案中，所述融合蛋白在DNA结合结构域和荧光结构 域之间还含有接头肽。在一些实施方案中，所述融合蛋白还含有细胞穿 透肽。在一些说明性实施方案中，所述细胞穿透肽选自触角足基因蛋白 ANTP、TAT、transportan和多聚精氨酸。本发明的另一方面包括含有 所述成像剂的细胞。
本发明的另一方面包括含有启动子的核酸构建体，所述启动子与一 个或多个DNA结合结构域、一个或多个荧光结构域以及至少一个核定 位结构域有效连接。在一些实施方案中，所述启动子选自强组成型启动 子、弱组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。在一个说明 性实施方案中，所述强组成型启动子是CMV早期启动子。在一个说明 性的实施方案中，弱组成型启动子是截短的CMV早期启动子。
本发明的另一个方面包括含有核酸构建体的载体，所述核酸构建体 包含与一个或多个DNA结合结构域、一个或多个荧光结构域和至少一 个核定位结构域有效连接的启动子。在一个说明性实施方案中，所述载 体具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列。本发明还涉及转化或 转染了核酸载体的细胞，所述核酸载体包含与一个或多个DNA结合结 构域、一个或多个荧光结构域和至少一个核定位结构域有效连接的启动 子。
本发明的另一个方面包括成像方法，其包括以下步骤：
(a)将以下引入细胞中：
(i)本发明的成像剂，或
(ii)核酸构建体，其中所述构建体能够在细胞中表达本发明的成像剂；
(b)检测成像剂的荧光。
在一些实施方案中，检测步骤包括对细胞核成像。在一些实施方案中， 检测步骤包括对细胞的染色体成像。
本发明的另一个方面包括在细胞中监测与核相关的一种或多种变 化的方法，其包括下列步骤：
(a)将以下引入测试细胞中：
(i)本发明的成像剂，或
(ii)核酸构建体，其中所述构建体能够在细胞中表达本发明的成像 剂；和
(b)检测该测试细胞中成像剂荧光的一种或多种变化，
其中测试细胞中成像剂荧光与参考荧光相比的一种或多种变化可指示 细胞中的一种或多种核相关变化。在一些实施方案中，所述一种或多种 核相关变化包括一种或多种染色体异常。在一些实施方案中，所述一种 或多种染色体异常选自缺失、重复、倒位和易位。在一些实施方案中， 所述一种或多种核相关变化指示细胞凋亡或细胞分裂。在说明性实施方 案中，所述一种或多种荧光变化包括荧光水平或分布的一种或多种变 化。
本发明的另一个方面包括观察一种或多种分子对细胞的一种或多 种影响的方法，其包括以下步骤：
(a)将以下引入测试细胞中：
(i)本发明的成像剂，或
(ii)核酸构建体，其中所述构建体能够在细胞中表达本发明的成像 剂；
(b)使测试细胞与一种或多种分子接触；和
(c)检测测试细胞中成像剂荧光的一种或多种变化，
其中测试细胞中成像剂荧光与参考荧光相比的一种或多种变化可指示 一种或多种分子对测试细胞的一种或多种影响。
在一些实施方案中，所观察的一种或多种分子的影响是导致细胞死 亡或染色体异常的毒性。在一些实施方案中，所述一种或多种分子包括 选自下列组中的一种或多种分子：治疗剂、杀虫剂、除草剂、化合物、 小分子毒素、核酸、蛋白质和肽。
本发明的另一个方面包括成像试剂盒，其包含本文所述的成像剂、 编码本发明成像剂的核酸构建体、载体和/或细胞中的一种或多种。
附图说明
图1是pEGFP-lac载体中HMGB1-EGFP融合蛋白构建体的图示。
图2是证明在HEK 293FT和CHO细胞中HMGB1-EGFP融合蛋 白均存在核定位的显微照片。
图3是证明凋亡使细胞呈圆形并使HMGB1-EGFP扩散到整个细胞 的显微照片。
图4是ptrEGFP-HMGB1表达质粒的图示。
图5A和图5B是证明ptrEGFP-HMGB1表达质粒可以使染色体显 现的显微照片。
具体实施方式
本文公开了用于使活细胞的核及染色体显现的蛋白质、核酸、细胞 和方法。特别是本发明提供了可以发出荧光并结合DNA的融合蛋白。 这些融合蛋白在活细胞中具有结合DNA的功能；因此它们可用于使核 及染色体成像，从而观察核及染色体的结构和动态过程。
研究者经常需要了解细胞和细胞培养物的生长状态。此状态可以通 过观察细胞及其核的形状与大小来确定，因为核结构是许多目的细胞事 件的早期标志。例如，核及染色体结构的显著变化是开始发生凋亡、有 丝分裂、减数分裂和细胞分裂的信号。观察这些变化对于研究和诊断人 类疾病的状态是很重要的，所述疾病包括但不限于癌症。
常使用Hoechst染料染色细胞，以进行这类观察。但是，这些染料 对细胞有毒性，经常用于已固定的细胞，即用于死细胞。本文描述可在 活细胞中展示细胞核而不伤害细胞的蛋白质。而且，所述蛋白质能够清 晰地显示凝聚染色体的形状和位置。使凝聚染色体显现的能力是很有意 义的，例如在细胞准备分裂或正在凋亡时很有意义。
在下面的描述中会频繁使用许多术语。这里对其进行解释以有助于 理解本发明。以下提供的术语参考说明书整体进行了更加全面的说明。
单位、前缀和符号可以表示为其公认的SI形式。除非另作说明，核 酸书写从左到右为5’到3’方向；氨基酸序列书写从左到右为氨基到羧基 方向。氨基酸在本文中可以表示为公知的三字母代码或IUPAC-IUBMB 命名委员会推荐的单字母代码。同样，核苷酸也可以表示为其广泛接受 的单字母代码。
在本文中，当没有数量词修饰或以“一种(个)”表示时，相应的 名词应理解为“一或多种(个)”，除非明确指明或者上下文中确切显示 并非如此。
本文所使用的“细胞穿透肽”指能够在体内和/或体外将其他肽、蛋 白质或核酸转导进细胞中的肽。
本文所使用的“DNA结合蛋白”指与DNA结合的蛋白质以及可能 对DNA具有普遍亲和力或对特定DNA序列有特异性亲和力的蛋白质。
本文所使用的“表达”指由结构基因产生多肽的过程。总体来说， 此过程包括从基因转录成RNA和将这种RNA翻译成多肽。
本文所使用的“荧光蛋白”指受到合适波长的电磁波激发时会以特 征性发射波长发出荧光的蛋白质。
本文所使用的“成像剂”表示任何可用于可视地报告细胞状态或者 亚细胞结构或细胞器的状态而在其他方面通常不对细胞产生影响的物 质。
本文所使用的术语“连接”、“缀合”或“融合”可以互换使用。这 些术语表示通过任何手段(包括化学缀合或重组)将两个或更多个元件 或组分结合到一起。融合蛋白表示包含两个或更多个区段的单个蛋白 质，这些区段分别对应于在自然界中通常不会如此连接在一起的多肽。 所述区段可以在物理上分开或在空间上分隔开，例如使用接头肽序列分 开。
本文所使用的“诱导型启动子”表示对刺激(如热休克、化学物质 等)的存在敏感的启动子。该刺激使得有效连接的核酸序列的转录水平 高于或低于不存在该刺激时有效连接的核酸序列的转录水平。
本文所使用的“核定位序列”(nuclear localization sequence，NLS) 表示能够指导蛋白质或多核苷酸定位于细胞核的多肽。
本文所使用的“核酸”表示单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸的多聚体或其嵌合体，除非另作限定，否则还包括具有天然核 苷酸基本性质(即可通过与天然存在核苷酸相似的方式与单链核酸杂 交)的已知类似物(如肽核酸)。
本文所使用的“有效连接”表示两序列之间的功能性连接。例如： 当启动子与结构基因相连时，启动子序列起始并介导结构基因的转录。 术语“有效连接”还指被连接的核酸序列是邻近的，并且当需要连接两 个或多个蛋白质编码区(任选地包括连接肽)时指序列是连续的并且处 在同一个读码框中。
本文所使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用，表 示氨基酸残基的多聚体。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是 相应天然存在氨基酸的人工化学类似物的氨基酸多聚体，以及仅含有天 然存在氨基酸的多聚体。术语多肽、肽和蛋白质还包括但不限于以下修 饰，如：糖基化、脂质附着、硫酸化、羧基化、羟基化、ADP核糖基 化以及添加其他复杂多糖。
本文所使用的“启动子”表示可以指导结构基因转录产生信使RNA (mRNA)的DNA序列。启动子通常位于基因的5’区，接近起始密码 子。如果启动子是诱导型启动子，那么应答于诱导剂时的转录水平会高 于不存在诱导剂时的转录水平。相反，如果启动子是组成型启动子，则 转录速率不会被诱导剂调控。
本文所使用的“强组成型启动子”表示在多数情况下有活性并指导 与其有效连接的核酸序列以高水平转录的启动子。“高水平转录”意为 细胞中约1/10的转录产物到约1/100的转录产物到约1/1000的转录产 物对应于所述有效连接的核酸序列。
本文所使用的“截短的启动子”表示通过去除其一部分正常序列而 变短的启动子，这通常使其活性降低，因此与该截短启动子有效连接的 核酸所表达的蛋白量低于相应的全长启动子所表达的蛋白量。
本文所使用的“载体”指能在宿主细胞中自主复制并用于转化或转 染细胞以进行基因操作的DNA分子，例如质粒、粘粒、噬粒或噬菌体。 表达载体允许转录插入其中的核酸。
本文所使用的“弱组成型启动子”表示在多数情况下有活性并指导 与其有效连接的核酸序列低水平转录的启动子。“低水平转录”意为细 胞中约1/10000的转录产物到约1/100000的转录产物到约1/500000的 转录产物对应于所述有效连接的核酸序列。
I.成像剂组合物
A.融合蛋白
一方面，本文提供可结合DNA的可检测成像剂。特别地，本文提 供可用于在生理条件下使活细胞显现的蛋白质、核酸、细胞和方法。成 像剂包括与荧光结构域结合的DNA结合结构域。成像剂可以进入活细 胞的核中并结合DNA。
成像剂含有DNA结合结构域。DNA结合结构域是对DNA具有特 异性亲和力或普遍亲和力的蛋白质。在一些实施方案中，在成像剂中使 用序列特异性DNA结合蛋白。序列特异性DNA结合蛋白通常识别和结 合特定的核苷酸序列(如TATA结合蛋白)。在其他实施方案中，成像 剂中使用非序列特异性DNA结合蛋白。非序列特异性DNA结合蛋白对 DNA具有普遍亲和力，即它们通常不对任何特定DNA序列具有显著的 偏好，而是通过总体结构和静电相互作用与DNA双螺旋相结合。因此 非序列特异性DNA结合蛋白会与任何DNA分子结合。
在一些实施方案中，蛋白质成像剂的DNA结合结构域是非序列特 异性DNA结合蛋白。一些非序列特异性DNA结合蛋白包括人高速泳动 族蛋白B1(HMGB1)、人高速泳动族蛋白B2(HMGB2)、其他HMG1 蛋白、其他HMG2蛋白、组蛋白H1、Sso7d和上述蛋白的其他同源物。 HMGB1和HMGB2通常在细胞核中表达。HMGB1存在于所有脊椎动 物的核中并且非常高度保守；例如，小鼠和大鼠HMGB1完全相同，并 且与人HMGB1仅有2个位置不同(Anderson等，J Leukoc Biol.2002 Dec；72(6)：1084-91)。因此，可以预计，任何特定的HMGB1变体在均 大多数细胞类型中都具有功能。在另一些实施方案中，DNA结合蛋白 可以是组蛋白。组蛋白是染色质的主要蛋白质成分，存在于细胞核中并 且高度保守。在一个实施方案中，所述组蛋白为组蛋白H1。
成像剂包含荧光蛋白结构域，以使活细胞中的核与染色体显现。荧 光蛋白质具有为蛋白质带来荧光特性的特定的氨基酸排列。由于这些氨 基酸，当蛋白质被特定波长的光子激发时，蛋白质发射波长更长的光子。 一般来说，荧光蛋白被紫外区的光子激发并发射可见光区的光子。在一 些实施方案中，所述荧光蛋白结构域是绿色荧光蛋白(GFP)。GFP的 最大激发和发射光谱分别为约495nm和509nm。因此，GFP是一种受 蓝光照射时发出绿色荧光的蛋白质。GFP在室温下不需要其他辅因子或 试剂就可以折叠和发出荧光，并在多种生物体和细胞类型中发挥功能， 包括但不限于细菌、酵母、真菌、植物、昆虫、蠕虫、哺乳动物和人。
具有特征性激发和发射波谱的GFP变体及其他荧光蛋白也是有用 的。在一些实施方案中，荧光蛋白可以是黄色荧光蛋白(YFP)、红色 荧光蛋白(RFP)、珊瑚虫红色荧光蛋白(DsRed)、蓝绿色荧光蛋白 (CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强 型黄色荧光蛋白(EYFP)、增强型蓝绿色荧光蛋白(ECFP)或增强型 蓝色荧光蛋白(EBFP)。在另一些实施方案中，荧光蛋白质是优化过的 荧光蛋白突变体。其他荧光蛋白质的实例为S65T GFP突变体、 Superfolder GFP、Azurite、mKalama1、Cerulean、CyPet、Citrine、 Venus和YPet。
在一个说明性实施方案中，HMGB1和EGFP的融合蛋白是使细胞 显现的成像剂。
荧光蛋白结构域和DNA结合结构域可以通过存在于同一多肽上而 彼此结合。在这个实施方案中，DNA结合蛋白和荧光蛋白结构域融合 在同一读码框中，从而使一个结构域的编码序列直接邻接另一个结构域 的编码序列或紧随其后。
在一些实施方案中，荧光结构域和DNA结合结构域可以通过连接 这两结构域的接头而彼此相连。所述接头可以是肽或者适当的化学基 团。除了物理连接两个蛋白质或多肽以外，接头可以无其他功能。在另 一些实施方案中，所述接头是与荧光结构域和DNA结合结构域一起框 内翻译的肽。接头部分应当足够长和柔软，以使DNA结合结构域与DNA 结合而不受到荧光结构域的空间位阻。任选地，所述接头部分是肽部分。 任选地，接头部分是长度为约1到30个氨基酸(任选地为约2到15个 氨基酸)的肽。在一个说明性实施方案中，接头部分是“-Gly-Gly-”接 头。连接性部分描述于例如Huston等，PNAS 85：5879-5883，1988， Whitlow等，Protein Engineering 6：989-995，1993和Newton等， Biochemistry 35：545-553，1996。
在一些实施方案中，荧光结构域和DNA结合结构域可以是在体外 或体内自发结合(self-associate)的分开的多肽。自发结合可以通过本 领域技术人员熟知的任何一种有用的蛋白二聚化结构域或偶联剂来介 导。一个蛋白二聚化结构域的实例是亮氨酸拉链，其介导AP1转录因 子的结合。可以用来介导自发结合的偶联剂实例是亲和素-生物素、抗 体-抗原对和受体-配体对。亲和素-生物素复合物是本领域技术人员熟知 的两分子之间最强的非共价结合之一。为了在体外或体内使用亲和素- 生物素来使成像剂自发结合，可将亲和素与DNA结合结构域或荧光结 构域连接，而将生物素与另一结构域连接。在将修饰的结构域引入细胞 之后，结构域由于亲和素-生物素复合物而自发结合，从而生成成像剂。 化学接头也可包括任何可以连接两个多肽的化学基团，比如酰胺、酯、 硫酯、磷酯、磷酰胺、酸酐、二硫化物、交联剂和本领域技术人员熟知 的其他连接。
成像剂还可包括核定位结构域，其通过与合适的细胞器靶向信号或 定位宿主蛋白融合而指导成像剂定位到细胞核。编码定位序列或信号序 列的多核苷酸可以连接或融合到编码成像剂的多核苷酸的5’端，以使信 号肽位于所得融合多核苷酸/多肽的氨基端。
例如，任何这些实施方案中的成像剂都可以含有核定位序列(NLS)。 NLS使与其相连的蛋白质输入细胞核中。因此，当成像剂包含NLS时， 此成像剂主要定位于核中而不显著渗漏到胞质中。NLS由带正电赖氨酸 或精氨酸一个或多个短序列组成，比如KKKRKV(SEQ ID NO：19) 或KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO：20)。这些信号被输入蛋白 结合，输入蛋白通过核孔将含有NLS的蛋白质输入核中。核定位序列 可以来自例如SV40大T抗原、核质蛋白、Chelsky序列、C-myc、hnRNP A1的M9结构域、酵母转录抑制子Matα2以及U snRNP的复合信号。
任何这些实施方案中的成像剂还可以包含细胞穿透肽。细胞穿透肽 有助于使与其连接的蛋白质穿过质膜进入细胞。细胞穿透肽可以包含多 阳离子短序列，比如RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：21)或 GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：22)。细胞穿透肽的实例包括触角 足基因蛋白、穿透素(penetratin)、TAT、transportan、Pep-1、S413-PV 和多聚精氨酸。
B.核酸
另一个方面，本文提供核酸构建体，所述核酸构建体编码可以结合 DNA并在活细胞中表达的成像剂。所述成像剂可以作为融合蛋白通过 重组DNA技术产生。
蛋白质的重组产生包括表达含有编码所述蛋白质的序列的核酸。编 码成像剂的核酸可以用本领域公知的方法得到。例如，可以使用基于目 的DNA序列的引物，通过聚合酶链式反应分离编码蛋白质的核酸。以 下文献中描述了PCR方法，例如：美国专利No.4,683,195；Mullis等， Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263，1987和Erlich编辑， PCR Technology，(Stockton Press，NY，1989)。荧光蛋白的突变体形 式可以通过编码荧光蛋白质的其他核酸的定点诱变得到或者通过随机 诱变得到，随机诱变是通过使用0.1mM MgCl2和不均衡的核苷酸浓度 提高原始多核苷酸的PCR错误率而实现的。参见如1994年11月10日 提交的美国专利申请No.08/337,915或者1995年11月10日提交的国际 申请PCT/US95/14692。
表达载体的构建和基因在转染细胞中的表达涉及使用本领域中公 知的分子克隆技术。参见Sambrook等，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1989)和Current Protocols in Molecular Biology，F.M. Ausubel等编辑。
任选地，用于将编码目的多肽表达的序列转染进细胞中的核酸可以 是表达载体的形式，所述表达载体中包括与编码表达目的多肽的核酸序 列有效连接的表达调控序列。本文所使用的术语“表达调控序列”表示 可以调控与其有效连接的核酸序列表达的核酸序列。当表达调控序列控 制和调节核酸序列的转录(并且适当时控制其翻译)时，该表达调控序 列即为与核酸序列有效连接。因此，表达调控序列可以包括适当的启动 子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前面的起始密码子(即ATG)、 内含子剪接信号、维持该基因的正确读码框以使mRNA正确翻译和终 止密码子。
包含成像剂编码序列和合适的转录/翻译调控序列的表达载体可以 用本领域技术人员公知的方法来构建。这些方法包括体外重组DNA技 术、合成技术和体内重组/基因重组。(参阅如Maniatis等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.， 1989中描述的技术)。
可以通过本领域技术人员公知的常规技术用重组DNA转化宿主细 胞。当宿主是原核细胞(如大肠杆菌)时，可以从在指数生长后收集并 且随后用本领域公知操作经CaCl2方法处理的细胞制备具有吸收DNA 能力的感受态细胞。或者，可以使用MgCl2或RbCl。转化也可以在形 成宿主细胞的原生质体后进行，或者通过电穿孔来实现。
当宿主是真核生物时，可以使用下列DNA转染方法：例如DNA- 脂质体复合体或磷酸钙共沉淀、常规机械方法(如显微注射)、电穿孔、 插入脂质体包裹的质粒或者病毒载体。还可以用编码成像剂的DNA序 列和编码可选择表型(例如嘌呤霉素、新霉素、潮霉素选择标记和单纯 疱疹病毒胸苷激酶基因)的另一种外源DNA分子共转染真核细胞。另 一种方法是使用真核病毒载体(如猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒)来 瞬时或稳定地感染或转化真核细胞并表达蛋白质。(Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman编辑.，1982)。
可通过任何常规方法分离和纯化在微生物或真核细胞中表达的多 肽，例如制备层析分离和免疫分离，例如涉及使用单克隆或多克隆抗体 或抗原的分离技术。
可以使用多种宿主表达载体系统来表达编码成像剂的序列。包括但 不限于微生物，例如转化了重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA 表达载体的细菌。取决于所使用的宿主/载体系统，在表达载体中可以 使用多种适合的转录和翻译元件中的任何一种，包括组成型和诱导型启 动子、转录增强子元件、转录终止子等(参见如Bitter等，Methods in Enzymology 153：516-544，1987)。例如，在细菌系统中克隆时，可以使 用诱导型启动子，例如λ噬菌体的pL、plac、ptrp和ptac(ptrp-lac 杂合启动子)等。在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用来自哺乳动 物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的 启动子(如逆转录病毒长末端重复、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K 启动子)。通过重组DNA或合成技术产生的启动子也可以用来提供插入 的荧光指示剂编码序列的转录。
在细菌系统中，可以根据所表达荧光指示剂的预期用途有利地选择 多种表达载体。例如，当需要产生大量荧光指示剂的时候，可以使用指 导表达易于纯化的高水平融合蛋白产物的载体。
在酵母中，可以使用多个包含组成型或诱导型启动子的载体。综述 可参考Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，Ausubel等编辑， Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience，第13章，1988；Grant等， Expression and Secretion Vectors for Yeast，Methods in Enzymology， Wu&Grossman编辑，31987，Acad.Press，N.Y.，第153卷，516-544页， 1987；Glover，DNA Cloning，第II卷，IRL Press，Wash.，D.C.，第3章， 1986；Bitter，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，Berger&Kimmel编辑，Acad.Press，N.Y.，第152卷， 673-684页，1987和The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces， Strathern等编辑，Cold Spring Harbor Press，第I卷和第II卷，1982。 可以使用组成型酵母启动子如ADH或LEU2或者诱导型启动子如GAL (Cloning in Yeast，第3章，R.Rothstein In：DNA Cloning第11卷，A Practical Approach，DM Glover编辑，IRL Press，Wash.，D.C.，1986)。 或者，可以使用促进外源DNA序列整合进酵母染色体的载体。
另一种可用来表达成像剂的表达系统是昆虫系统。在一个这样的系 统中，使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)作为表达外源基因的载体。此病毒 生长于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。荧光指示剂编码序 列可以克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中并置于 AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的调控之下。荧光指示剂编 码序列的成功插入会导致多角体蛋白基因失活，并产生非包含体型重组 病毒(即缺乏由多角体蛋白基因编码的蛋白外壳的病毒)。接着使用这 些重组病毒感染草地夜蛾细胞，插入的基因在该细胞中表达。参见Smith 等，J.Viol.46：584，1983；Smith，美国专利申请No.4,215,051。
可以改造利用重组病毒或病毒元件指导表达的哺乳动物细胞系统。 例如，当使用腺病毒表达载体时，成像剂编码序列可与腺病毒转录/翻 译控制复合体连接，例如与后期启动子和三联前导序列连接。然后可以 通过体外或体内重组将此嵌合基因插入到腺病毒基因组中。病毒基因组 非必需区域(如E1或E3区)中的插入会产生有活力并且能在感染宿 主中表达成像剂的重组病毒(参见如Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，81：3655-3659，1984)。或者，也可以使用牛痘病毒7.5K启动 子(参见如Mackett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：7415-7419，1982； Mackett等，J.Virol.49：857-864，1984；Panicali等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 79：4927-4931，1982)。
在一些实施方案中，可以改造基于牛乳头瘤病毒的载体，所述牛乳 头瘤病毒具有作为染色体外元件进行复制的能力(Sarver等，Mol.Cell. Biol.1：486，1981)。此DNA进入细胞后不久，质粒即复制到大约每细 胞100-200个拷贝。所插入cDNA的转录不需要质粒整合进宿主染色体， 因此获得高水平的表达。这些载体可以通过在质粒中引入选择标记(例 如neo基因)而用于稳定表达。或者，可以修饰反转录病毒的基因组， 以用作能够将成像剂基因引入宿主并指导其表达的载体(Cone& Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6349-6353，1984)。高水平的表 达可以通过使用诱导型启动子来实现，包括但不限于金属硫蛋白IIA启 动子和热激启动子。
在一个说明性实施方案中，可以通过稳定表达来长期高产量地生产 重组蛋白。可以使用适当表达调控元件(如启动子、增强子、转录终止 子、多腺苷酸化位点等)控制下的成像剂DNA和选择标记转化宿主细 胞，而不是使用包含细菌复制起点的表达载体。重组质粒中的选择标记 赋予细胞对选择的抗性，使细胞能够将质粒稳定整合到其染色体中，并 生长形成转化灶，接着可将转化灶克隆并扩大成细胞系。例如，在引入 外源DNA之后，可使改造细胞在富集培养基中生长1-2天，接着换成 选择培养基。可以使用多种选择系统，包括但不限于例如单纯疱疹病毒 胸苷激酶(Wigler等，Cell，11：223，1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转 移酶(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：2026，1962) 以及腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell，22：817，1980)基因分别可 用于tk-细胞、hgprt细胞或aprt细胞中。同样，抗代谢物抗性也可以 作为以下基因的选择基础：赋予对氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：3567，1980；O’Hare等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，8：1527，1981)；赋予对霉酚酸的抗性的gpt(Mulligan&Berg， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072，1981)；赋予对氨基葡糖苷G-418 的抗性的neo(Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.，150：1，1981)和赋 予对潮霉素的抗性的hygro(Santerre等，Gene，30：147，1984)。近来 还报道了其他选择基因：例如允许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB；允 许细胞利用组胺醇代替组氨酸的hisD(Hartman&Mulligan，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，85：8047，1988)，以及赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二 氟甲基)-DL-鸟氨酸(DFMO)的抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶) (McConlogue L.，In：Current Communications in Molecular Biology， Cold Spring Harbor Laboratory，1987年编辑)。
本文描述的构建体还可以包含使成像剂分离简化的标签。例如，抗 将多组氨酸标签(如6个组氨酸残基的标签)插入荧光蛋白的氨基端。 多组氨酸标签允许通过镍螯合色谱方便地一步式分离蛋白质。
可将表达载体转染到宿主细胞中，以表达重组核酸。可以选择表达 水平高的宿主细胞用于纯化荧光指示剂融合蛋白。大肠杆菌可用于这一 目的。或者，宿主细胞可以是选择用成像剂进行成像的原核或真核细胞。 这类细胞可以是如培养细胞或体内细胞。
成像剂的一个优点是它们是通过正常的蛋白质合成产生的。构建体 可以在大肠杆菌中大规模表达。当序列包含多组氨酸标签以通过镍螯合 色谱一步式纯化时，从细菌中纯化蛋白质将是很简单的。或者，可以在 目的宿主细胞中直接表达底物，以用于原位检测。
特别地，可通过调控序列来控制转录，例如通过与功能性编码核酸 序列有效连接的启动子和增强子来进行控制。启动子中包含被转录因子 和其他调节因子识别的特定DNA序列。转录因子起始与其有效连接的 核酸的转录。调节因子可以是调控转录水平的蛋白质或其他化学物质。 增强子是可以进一步调节核酸序列转录的顺式调节元件。
在一些实施方案中，编码成像剂的核酸构建体包含与编码成像剂的 核酸有效连接的启动子。该启动子可以是强组成型启动子、弱组成型启 动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。强组成型启动子活性很强， 因此可表达大量蛋白质，使成像细胞发出强荧光。弱组成型启动子具有 最低限度的活性，因此所表达蛋白质的量可以清晰地显示细胞中凝聚染 色体的位置和形状，而不会被荧光背景干扰。诱导型启动子应答于刺激， 因此可在很大范围内控制所编码多肽的表达水平，以用于多种应用。在 一些说明性实施方案中，强组成型启动子是CMV早期启动子。在一些 说明性实施方案中，弱组成型启动子是截短的CMV早期启动子。诱导 型启动子的实例有：可由IPTG诱导的lac启动子、可由热激诱导的hsp70 启动子、四环素诱导型启动子、RSL1诱导型启动子、糖皮质激素诱导 型启动子和其他激素诱导型启动子。
可将编码蛋白质成像剂的核酸构建体引入载体中。载体便于对核酸 构建体进行克隆、分离和操作。一些载体还包含用于特殊用途(例如控 制多肽在细胞内的表达水平)的序列。在一些实施方案中，所述载体包 括但不限于pGEM-T Easy、pBluescript、TOPO克隆载体、pCR-Script 和pT7Blue-T。在一些说明性实施方案中，包含成像剂的载体具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列。
另一方面，本文提供细胞，其包含成像剂、表达成像剂的核酸构建 体和/或包含表达荧光蛋白质成像剂的核酸构建体的载体。在一些实施 方案中，成像剂可以存在于多种人类癌细胞系中。人类癌细胞系的实例 包括但不限于A549、H1299、HeLa、HL60、K562、KG-1、Jurkat、 Lncap、MCF-7、MDA-MB-438、T47D、THP-1、U87、SHSY5Y、 MCF-10A、T84、Peer和BxPC3。也可以使用其他本领域技术人员公 知的人和非人细胞系。表达荧光蛋白质成像剂的细胞可以用来评估药物 和其他药剂在例如癌细胞和其他细胞类型中对细胞分裂、生长和凋亡的 影响。
在一个说明性的实施方案中，核酸构建体是pHMGB1-EGFP，其含 有下文所示的SEQ ID NO：1的序列：
特征 位置
CMV早期启动子 1..589
HMGB1 639..1286
EGFP 1326..2045
SV40/polyA 2199..2249
Kana/Neo 3276..4070
PUC复制起点 4655..5298
1 TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG
61 CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT
121 GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA
181 ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC
241 AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA
301 CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC
361 CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG
421 ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG
481 GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT
541 ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC CGTCAGATCC GCTAGCGCTA
601 CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA ATTCGATTAT GGGCAAAGGA GATCCTAAGA
661 AGCCGAGAGG CAAAATGTCA TCATATGCAT TTTTTGTGCA AACTTGTCGG GAGGAGCATA
721 AGAAGAAGCA CCCAGATGCT TCAGTCAACT TCTCAGAGTT TTCTAAGAAG TGCTCAGAGA
781 GGTGGAAGAC CATGTCTGCT AAAGAGAAAG GAAAATTTGA AGATATGGCA AAAGCGGACA
841 AGGCCCGTTA TGAAAGAGAA ATGAAAACCT ATATCCCTCC CAAAGGGGAG ACAAAAAAGA
901 AGTTCAAGGA TCCCAATGCA CCCAAGAGGC CTCCTTCGGC CTTCTTCCTC TTCTGCTCTG
961 AGTATCGCCC AAAAATCAAA GGAGAACATC CTGGCCTGTC CATTGGTGAT GTTGCGAAGA
1021 AACTGGGAGA GATGTGGAAT AACACTGCTG CAGATGACAA GCAGCCTTAT GAAAAGAAGG
1081 CTGCGAAGCT GAAGGAAAAA TACGAAAAGG ATATTGCTGC ATATCGAGCT AAAGGAAAGC
1141 CTGATGCAGC AAAAAAGGGA GTTGTCAAGG CTGAAAAAAG CAAGAAAAAG AAGGAAGAGG
1201 AGGAAGATGA GGAAGATGAA GAGGATGAGG AGGAGGAGGA AGATGAAGAA GATGAAGATG
1261 AAGAAGAAGA TGATGATGAT GAATCGTCGA CGGTACCGCG GGCCCGGGAT CCACCGGTCG
1321 CCACCATGGT GAGCAAGGGC GAGGAGCTGT TCACCGGGGT GGTGCCCATC CTGGTCGAGC
1381 TGGACGGCGA CGTAAACGGC CACAAGTTCA GCGTGTCCGG CGAGGGCGAG GGCGATGCCA
1441 CCTACGGCAA GCTGACCCTG AAGTTCATCT GCACCACCGG CAAGCTGCCC GTGCCCTGGC
1501 CCACCCTCGT GACCACCCTG ACCTACGGCG TGCAGTGCTT CAGCCGCTAC CCCGACCACA
1561 TGAAGCAGCA CGACTTCTTC AAGTCCGCCA TGCCCGAAGG CTACGTCCAG GAGCGCACCA
1621 TCTTCTTCAA GGACGACGGC AACTACAAGA CCCGCGCCGA GGTGAAGTTC GAGGGCGACA
1681 CCCTGGTGAA CCGCATCGAG CTGAAGGGCA TCGACTTCAA GGAGGACGGC AACATCCTGG
1741 GGCACAAGCT GGAGTACAAC TACAACAGCC ACAACGTCTA TATCATGGCC GACAAGCAGA
1801 AGAACGGCAT CAAGGTGAAC TTCAAGATCC GCCACAACAT CGAGGACGGC AGCGTGCAGC
1861 TCGCCGACCA CTACCAGCAG AACACCCCCA TCGGCGACGG CCCCGTGCTG CTGCCCGACA
1921 ACCACTACCT GAGCACCCAG TCCGCCCTGA GCAAAGACCC CAACGAGAAG CGCGATCACA
1981 TGGTCCTGCT GGAGTTCGTG ACCGCCGCCG GGATCACTCT CGGCATGGAC GAGCTGTACA
2041 AGTAAAGCGG CCGCGACTCT AGATCATAAT CAGCCATACC ACATTTGTAG AGGTTTTACT
2101 TGCTTTAAAA AACCTCCCAC ACCTCCCCCT GAACCTGAAA CATAAAATGA ATGCAATTGT
2161 TGTTGTTAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA
2221 TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA AACTCATCAA
2281 TGTATCTTAA GGCGTAAATT GTAAGCGTTA ATATTTTGTT AAAATTCGCG TTAAATTTTT
2341 GTTAAATCAG CTCATTTTTT AACCAATAGG CCGAAATCGG CAAAATCCCT TATAAATCAA
2401 AAGAATAGAC CGAGATAGGG TTGAGTGTTG TTCCAGTTTG GAACAAGAGT CCACTATTAA
2461 AGAACGTGGA CTCCAACGTC AAAGGGCGAA AAACCGTCTA TCAGGGCGAT GGCCCACTAC
2521 GTGAACCATC ACCCTAATCA AGTTTTTTGG GGTCGAGGTG CCGTAAAGCA CTAAATCGGA
2581 ACCCTAAAGG GAGCCCCCGA TTTAGAGCTT GACGGGGAAA GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA
2641 AGGAAGGGAA GAAAGCGAAA GGAGCGGGCG CTAGGGCGCT GGCAAGTGTA GCGGTCACGC
2701 TGCGCGTAAC CACCACACCC GCCGCGCTTA ATGCGCCGCT ACAGGGCGCG TCAGGTGGCA
2761 CTTTTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA CATTCAAATA
2821 TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA ATAATATTGA AAAAGGAAGA
2881 GTCCTGAGGC GGAAAGAACC AGCTGTGGAA TGTGTGTCAG TTAGGGTGTG GAAAGTCCCC
2941 AGGCTCCCCA GCAGGCAGAA GTATGCAAAG CATGCATCTC AATTAGTCAG CAACCAGGTG
3001 TGGAAAGTCC CCAGGCTCCC CAGCAGGCAG AAGTATGCAA AGCATGCATC TCAATTAGTC
3061 AGCAACCATA GTCCCGCCCC TAACTCCGCC CATCCCGCCC CTAACTCCGC CCAGTTCCGC
3121 CCATTCTCCG CCCCATGGCT GACTAATTTT TTTTATTTAT GCAGAGGCCG AGGCCGCCTC
3181 GGCCTCTGAG CTATTCCAGA AGTAGTGAGG AGGCTTTTTT GGAGGCCTAG GCTTTTGCAA
3241 AGATCGATCA AGAGACAGGA TGAGGATCGT TTCGCATGAT TGAACAAGAT GGATTGCACG
3301 CAGGTTCTCC GGCCGCTTGG GTGGAGAGGC TATTCGGCTA TGACTGGGCA CAACAGACAA
3361 TCGGCTGCTC TGATGCCGCC GTGTTCCGGC TGTCAGCGCA GGGGCGCCCG GTTCTTTTTG
3421 TCAAGACCGA CCTGTCCGGT GCCCTGAATG AACTGCAAGA CGAGGCAGCG CGGCTATCGT
3481 GGCTGGCCAC GACGGGCGTT CCTTGCGCAG CTGTGCTCGA CGTTGTCACT GAAGCGGGAA
3541 GGGACTGGCT GCTATTGGGC GAAGTGCCGG GGCAGGATCT CCTGTCATCT CACCTTGCTC
3601 CTGCCGAGAA AGTATCCATC ATGGCTGATG CAATGCGGCG GCTGCATACG CTTGATCCGG
3661 CTACCTGCCC ATTCGACCAC CAAGCGAAAC ATCGCATCGA GCGAGCACGT ACTCGGATGG
3721 AAGCCGGTCT TGTCGATCAG GATGATCTGG ACGAAGAGCA TCAGGGGCTC GCGCCAGCCG
3781 AACTGTTCGC CAGGCTCAAG GCGAGCATGC CCGACGGCGA GGATCTCGTC GTGACCCATG
3841 GCGATGCCTG CTTGCCGAAT ATCATGGTGG AAAATGGCCG CTTTTCTGGA TTCATCGACT
3901 GTGGCCGGCT GGGTGTGGCG GACCGCTATC AGGACATAGC GTTGGCTACC CGTGATATTG
3961 CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA TGGGCTGACC GCTTCCTCGT GCTTTACGGT ATCGCCGCTC
4021 CCGATTCGCA GCGCATCGCC TTCTATCGCC TTCTTGACGA GTTCTTCTGA GCGGGACTCT
4081 GGGGTTCGAA ATGACCGACC AAGCGACGCC CAACCTGCCA TCACGAGATT TCGATTCCAC
4141 CGCCGCCTTC TATGAAAGGT TGGGCTTCGG AATCGTTTTC CGGGACGCCG GCTGGATGAT
4201 CCTCCAGCGC GGGGATCTCA TGCTGGAGTT CTTCGCCCAC CCTAGGGGGA GGCTAACTGA
4261 AACACGGAAG GAGACAATAC CGGAAGGAAC CCGCGCTATG ACGGCAATAA AAAGACAGAA
4321 TAAAACGCAC GGTGTTGGGT CGTTTGTTCA TAAACGCGGG GTTCGGTCCC AGGGCTGGCA
4381 CTCTGTCGAT ACCCCACCGA GACCCCATTG GGGCCAATAC GCCCGCGTTT CTTCCTTTTC
4441 CCCACCCCAC CCCCCAAGTT CGGGTGAAGG CCCAGGGCTC GCAGCCAACG TCGGGGCGGC
4501 AGGCCCTGCC ATAGCCTCAG GTTACTCATA TATACTTTAG ATTGATTTAA AACTTCATTT
4561 TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA AAATCCCTTA
4621 ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG GATCTTCTTG
4681 AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG CTTGCAAACA AAAAAACCAC CGCTACCAGC
4741 GGTGGTTTGT TTGCCGGATC AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA CTGGCTTCAG
4801 CAGAGCGCAG ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC ACCACTTCAA
4861 GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG TGGCTGCTGC
4921 CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC CGGATAAGGC
4981 GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC GAACGACCTA
5041 CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCT ATGAGAAAGC GCCACGCTTC CCGAAGGGAG
5101 AAAGGCGGAC AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT
5161 TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC TCTGACTTGA
5221 GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG CCAGCAACGC
5281 GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT TTCCTGCGTT
5341 ATCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTAC CGCCATGCAT
在一个说明性实施方案中，核酸构建体是ptrEGFP-HMGB1，其含 有下文所示的SEQ ID NO：2的序列：
特征 位置
截短的CMV启动子 3..92
HMGB1 142..789
EGFP 829..1548
SV40/polyA 1702..1752
Kana/Neo 3809..3827
PUC复制起点 4158..4801
1 GCAACAACTC CGCCCCATTG ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA
61 TAAGCAGAGC TGGTTTAGTG AACCGTCAGA TCCGCTAGCG CTACCGGACT CAGATCTCGA
121 GCTCAAGCTT CGAATTCGAT TATGGGCAAA GGAGATCCTA AGAAGCCGAG AGGCAAAATG
181 TCATCATATG CATTTTTTGT GCAAACTTGT CGGGAGGAGC ATAAGAAGAA GCACCCAGAT
241 GCTTCAGTCA ACTTCTCAGA GTTTTCTAAG AAGTGCTCAG AGAGGTGGAA GACCATGTCT
301 GCTAAAGAGA AAGGAAAATT TGAAGATATG GCAAAAGCGG ACAAGGCCCG TTATGAAAGA
361 GAAATGAAAA CCTATATCCC TCCCAAAGGG GAGACAAAAA AGAAGTTCAA GGATCCCAAT
421 GCACCCAAGA GGCCTCCTTC GGCCTTCTTC CTCTTCTGCT CTGAGTATCG CCCAAAAATC
481 AAAGGAGAAC ATCCTGGCCT GTCCATTGGT GATGTTGCGA AGAAACTGGG AGAGATGTGG
541 AATAACACTG CTGCAGATGA CAAGCAGCCT TATGAAAAGA AGGCTGCGAA GCTGAAGGAA
601 AAATACGAAA AGGATATTGC TGCATATCGA GCTAAAGGAA AGCCTGATGC AGCAAAAAAG
661 GGAGTTGTCA AGGCTGAAAA AAGCAAGAAA AAGAAGGAAG AGGAGGAAGA TGAGGAAGAT
721 GAAGAGGATG AGGAGGAGGA GGAAGATGAA GAAGATGAAG ATGAAGAAGA AGATGATGAT
781 GATGAATCGT CGACGGTACC GCGGGCCCGG GATCCACCGG TCGCCACCAT GGTGAGCAAG
841 GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC
901 GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC
961 CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC
1021 CTGACCTACG GCGTGCAGTG CTTCAGCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC
1081 TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC
1141 GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC
1201 GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC
1261 AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG
1321 AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG
1381 CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCCG ACAACCACTA CCTGAGCACC
1441 CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC
1501 GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAAG CGGCCGCGAC
1561 TCTAGATCAT AATCAGCCAT ACCACATTTG TAGAGGTTTT ACTTGCTTTA AAAAACCTCC
1621 CACACCTCCC CCTGAACCTG AAACATAAAA TGAATGCAAT TGTTGTTGTT AACTTGTTTA
1681 TTGCAGCTTA TAATGGTTAC AAATAAAGCA ATAGCATCAC AAATTTCACA AATAAAGCAT
1741 TTTTTTCACT GCATTCTAGT TGTGGTTTGT CCAAACTCAT CAATGTATCT TAAGGCGTAA
1801 ATTGTAAGCG TTAATATTTT GTTAAAATTC GCGTTAAATT TTTGTTAAAT CAGCTCATTT
1861 TTTAACCAAT AGGCCGAAAT CGGCAAAATC CCTTATAAAT CAAAAGAATA GACCGAGATA
1921 GGGTTGAGTG TTGTTCCAGT TTGGAACAAG AGTCCACTAT TAAAGAACGT GGACTCCAAC
1981 GTCAAAGGGC GAAAAACCGT CTATCAGGGC GATGGCCCAC TACGTGAACC ATCACCCTAA
2041 TCAAGTTTTT TGGGGTCGAG GTGCCGTAAA GCACTAAATC GGAACCCTAA AGGGAGCCCC
2101 CGATTTAGAG CTTGACGGGG AAAGCCGGCG AACGTGGCGA GAAAGGAAGG GAAGAAAGCG
2161 AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA CGCTGCGCGT AACCACCACA
2221 CCCGCCGCGC TTAATGCGCC GCTACAGGGC GCGTCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG
2281 CGCGGAACCC CTATTTGTTT ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA
2341 CAATAACCCT GATAAATGCT TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTCCTGA GGCGGAAAGA
2401 ACCAGCTGTG GAATGTGTGT CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA
2461 GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG TCCCCAGGCT
2521 CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA GTCAGCAACC ATAGTCCCGC
2581 CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG
2641 GCTGACTAAT TTTTTTTATT TATGCAGAGG CCGAGGCCGC CTCGGCCTCT GAGCTATTCC
2701 AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG CAAAGATCGA TCAAGAGACA
2761 GGATGAGGAT CGTTTCGCAT GATTGAACAA GATGGATTGC ACGCAGGTTC TCCGGCCGCT
2821 TGGGTGGAGA GGCTATTCGG CTATGACTGG GCACAACAGA CAATCGGCTG CTCTGATGCC
2881 GCCGTGTTCC GGCTGTCAGC GCAGGGGCGC CCGGTTCTTT TTGTCAAGAC CGACCTGTCC
2941 GGTGCCCTGA ATGAACTGCA AGACGAGGCA GCGCGGCTAT CGTGGCTGGC CACGACGGGC
3001 GTTCCTTGCG CAGCTGTGCT CGACGTTGTC ACTGAAGCGG GAAGGGACTG GCTGCTATTG
3061 GGCGAAGTGC CGGGGCAGGA TCTCCTGTCA TCTCACCTTG CTCCTGCCGA GAAAGTATCC
3121 ATCATGGCTG ATGCAATGCG GCGGCTGCAT ACGCTTGATC CGGCTACCTG CCCATTCGAC
3181 CACCAAGCGA AACATCGCAT CGAGCGAGCA CG TACTCGGA TGGAAGCCGG TCTTGTCGAT
3241 CAGGATGATC TGGACGAAGA GCATCAGGGG CTCGCGCCAG CCGAACTGTT CGCCAGGCTC
3301 AAGGCGAGCA TGCCCGACGG CGAGGATCTC GTCGTGACCC ATGGCGATGC CTGCTTGCCG
3361 AATATCATGG TGGAAAATGG CCGCTTTTCT GGATTCATCG ACTGTGGCCG GCTGGGTGTG
3421 GCGGACCGCT ATCAGGACAT AGCGTTGGCT ACCCGTGATA TTGCTGAAGA GCTTGGCGGC
3481 GAATGGGCTG ACCGCTTCCT CGTGCTTTAC GGTATCGCCG CTCCCGATTC GCAGCGCATC
3541 GCCTTCTATC GCCTTCTTGA CGAGTTCTTC TGAGCGGGAC TCTGGGGTTC GAAATGACCG
3601 ACCAAGCGAC GCCCAACCTG CCATCACGAG ATTTCGATTC CACCGCCGCC TTCTATGAAA
3661 GGTTGGGCTT CGGAATCGTT TTCCGGGACG CCGGCTGGAT GATCCTCCAG CGCGGGGATC
3721 TCATGCTGGA GTTCTTCGCC CACCCTAGGG GGAGGCTAAC TGAAACACGG AAGGAGACAA
3781 TACCGGAAGG AACCCGCGCT ATGACGGCAA TAAAAAGACA GAATAAAACG CACGGTGTTG
3841 GGTCGTTTGT TCATAAACGC GGGGTTCGGT CCCAGGGCTG GCACTCTGTC GATACCCCAC
3901 CGAGACCCCA TTGGGGCCAA TACGCCCGCG TTTCTTCCTT TTCCCCACCC CACCCCCCAA
3961 GTTCGGGTGA AGGCCCAGGG CTCGCAGCCA ACGTCGGGGC GGCAGGCCCT GCCATAGCCT
4021 CAGGTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT
4081 AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC
4141 ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC
4201 GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG
4261 ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA
4321 ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC
4381 CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT
4441 GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA
4501 CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC
4561 TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC
4621 CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT
4681 GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT
4741 GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC
4801 TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG
4861 ATAACCGTAT TACCGCCATG CAT
I.使活细胞的核及染色体成像的方法
A.在活细胞中监测成像剂的方法
另一方面，本文提供了使活细胞成像的方法，其步骤包括向细胞中 引入成像剂、表达成像剂的核酸构建体和/或含有表达成像剂的核酸构 建体的载体，然后在活细胞中监测该成像剂。在一些实施方案中，所述 的方法可以用来使细胞中核或染色体的形状、大小、位置和/或状态显 像。对核与染色体状态的观察可用于监测细胞中的事件，因为特定的核 及染色体结构和/或排列可指示某些事件，例如凋亡、细胞分裂、有丝 分裂、减数分裂、癌症发生以及治疗剂或对细胞可能有或没有毒性的其 他试剂的影响。例如，凝聚染色体沿着细胞中心附近的有丝分裂纺锤体 进行定位的情况可指示细胞分裂。明显不同的细胞形态(包括细胞变 圆)、核破裂以及染色体的凝聚与断裂均可指示凋亡。
在一些实施方案中，成像剂可以直接引入细胞中。直接引入蛋白质 和肽的方法包括显微注射、细胞穿透肽、转染、微粒轰击、脂质体、脂 转染、细胞膜的透化作用、冻融、热休克、核转染、电穿孔、静电吸附 和受体介导的胞吞作用。在另一些实施方案中，成像剂由引入细胞中的 核酸构建体来表达。引入核酸构建体的方法包括显微注射、转化、转导、 转染、微粒轰击(“基因枪”)、脂质体、脂转染、细胞膜的透化作用、 冻融、热激、核转染、电穿孔、静电吸附和受体介导的胞吞作用。所述 核酸可以整合进染色体，可以作为独立复制的质粒存在，或者可以瞬时 表达。在各种情况中，成像剂的表达均可受强组成型启动子、弱组成型 启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子的控制。
在一个实施方案中，成像剂用于获得细胞中染色体和/或核的图像。 在一个实施方案中，使用者通过荧光显微镜直接观察所述图像。在另一 个实施方案中，所述图像通过荧光结构域在经适当波长激发之后所发射 的个体光子来显示。在数字图像处理器中将这些检测到的光子积累一段 时间之后，即可得到并构建一幅图像。至少有两种光电探测设备可以检 测个体光子并生成可以用图像处理器分析的信号。降噪光电探测设备中 灵敏度的提高是通过降低光子探测器的背景噪音，而不是放大光子信 号。主要通过冷却探测器阵列来降噪。该设备包括称为“薄型背照式” 冷却CCD照相机的电荷耦合器件(CCD)照相机。“薄型背照式”是指 使用超薄背板来减少探测光子所需的路径长度，从而提高量子效率。光 子放大设备在光子击中检测屏之前对其进行放大。这类设备包括带有增 强器(例如微通道增强器)的CCD照相机。微通道增强器可以包括金 属通道的阵列，它与照相机的检测屏垂直，截面与其大小相同。所述微 通道阵列置于待成像的样品、对象或动物与照相机之间。多数进入阵列 通道的光子会在射出通道前接触通道的侧壁。加在阵列上的电压使得每 次光子碰撞时释放许多电子。这些碰撞中产生的电子以“鸟枪”模式射 出通道，并通过照相机进行检测。图像处理器对光电探测装置通过光子 计数所产生的信号进行处理，以生成例如可在显示器上显示或在图像打 印机上打印的图像。当图像转换成数字文件形式后，它们可通过多种图 像处理程序来处理并打印。
在一个实施方案中，对成像剂发射的光子进行计数。如果采用光子 计数法，则对光子发射的测量会产生一个数值阵列，代表图像处理器中 每个像素位置所检测到的光子数。使用这些数值生成图像：将光子计数 标准化(对预选的固定值标准化，或者对任一像素上检测到的最大数值 标准化)，并将标准化的数值转换成显示器上显示的亮度(灰度)或颜 色(假色)。在假色的表示法中，典型的颜色分配如下。0光子计数的像 素定为黑色，低计数的为蓝色，并随计数的增加而提高颜色的波长，最 高的光子计数值为红色。颜色在显示器上的位置代表光子发射的分布， 相应地也代表发光成像剂的位置。
为了给细胞中的核和/或染色体提供参照标准，可以生成从中测量光 子发射的细胞的全彩图或全灰度图，例如在微光下打开成像室或成像盒 的门并测量反射的光子。所述全彩图或全灰度图可以在测量光子发射之 前或之后生成。将光子发射图与所述全彩图或全灰度图叠加，产生相对 于细胞的光子发射合成图。
如果需要随时间跟踪成像剂的定位和/或信号，例如记录一种处理对 成像剂分布和/或定位的影响，那么可以按选定的时间间隔重复进行光 子发射测量或成像，以生成一系列图像。间隔可以短至数分钟或长至数 天或数星期。
可以通过多种方法分析通过本文所述方法产生的图像和/或使用本 文所述成像剂产生的图像。包括从简单的肉眼观察、脑力评估和/或打 印硬拷贝到复杂的数字图像分析等。对分析中所得信息的解读取决于意 图观察的事件和所使用的实体。
在一些实施方案中，含有成像剂的细胞中的荧光水平与参照荧光水 平相比的差异可指示所研究的细胞事件。所述参照水平可以是对照细 胞。本领域技术人员能够根据研究的类型来选择合适的对照。在一个说 明性实施方案中，当细胞事件导致细胞的核或染色体失去完整性时，荧 光水平的差异可能是相对于参考荧光水平的荧光强度降低。在另一个说 明性实施方案中，当细胞事件导致细胞的核或染色体失去完整性时，荧 光水平的差异可以是荧光定位相对于参考细胞内荧光定位的改变。
B.筛选分子药剂的方法
该方法可在体内实施，其中测试化合物(如生物效应分子)和成像 剂(或者编码成像剂的载体)在允许检测细胞中的成像剂的条件下与细 胞样品接触。因此，本文也涉及预测医学领域，该领域是将诊断测定、 预后测定、药物基因组学和对临床试验的监测用于预后(预测)目的， 来分析生物效应分子对得自受试者的细胞样品的影响。
在一些实施方案中，对存在或不存在生物效应分子(药物或其他分 子药剂)时核与染色体的状态进行比较。在一个实施方案中，所述方法 可监测药剂对细胞中一种或多种核相关特征的影响。这些测定可用于基 础药物筛选和临床试验。例如，药剂增强(或减弱)一种或多种核相关 特征的效力可在患有与所述核相关特征有联系的疾病的受试者中进行 监测。可以通过施用药剂并观察应答(如荧光在量和定位上的改变)来 鉴定影响一种或多种核相关改变的药剂。这样，所述一种或多种核相关 改变能够作为标记，指示受试者对该药剂的生理应答。相应地，可以在 用该药剂治疗个体之前和治疗过程中的任何时间点测定这种应答状态。
在一个实施方案中，可以在引入成像剂或编码成像剂的核酸之前、 同时或之后对细胞或细胞群施用药剂。然后可对所述细胞或细胞群进行 成像，以确定荧光的总体水平和/或荧光的定位。在任何一种情况中， 数据均可通过计数图像中(或图像中特定的位置中)的像素来量化。可 将图像和/或量化的像素数据与参照或对照细胞进行比较。参照细胞可 以是未接触该药剂的相同细胞类型。
在一个实施方案中，成像剂被用来观察生物效应分子对癌细胞的影 响。例如，癌症细胞通常丧失进行凋亡和受控细胞分裂及生长的能力， 这些事件可通过成像剂所示核与染色体的位置和特征来进行追踪。在另 一些实施方案中，使用本文公开的成像剂观察化合物(包括但不限于杀 虫剂、除草剂、小分子、毒素、核酸和多肽)对细胞的影响。可进行测 试的生物效应分子的详细种类在下文提供。
本文还提供用于在样品的细胞中测试化合物生物活性的方法。所述 方法(本文也称为“筛选测定”)可以用来鉴定促进实现一种或多种细 胞状态(如凋亡、能量情况、代谢、染色体结构或动态或者细胞骨架的 组装)的调节剂，即候选物或测试化合物或药剂(如肽、拟肽、小分子 或其他药物)。本文还包括本文所述筛选测定中鉴定的化合物。
在一个实施方案中，将测试化合物的组合文库与成像剂联合使用， 来评估化合物对一种或多种细胞的影响。所述测试化合物可使用本领域 公知的任何多种组合文库法获得，这些方法包括：生物文库、空间可寻 址并行(spatially addressable parallel)固相或液相文库、需要解卷积 的合成文库法、“一珠一化合物”文库法和利用亲和色谱筛选的合成文 库法。生物文库法仅限于肽文库，而其他四种方法可以应用到肽，非肽 寡聚体或小分子化合物文库。参阅如Lam，1997.Anticancer Drug Design 12：145。
化合物和/或生物混合物(例如真菌、细菌或藻类提取物)的文库是 本领域已知的，并可使用本文描述的任何测定来进行筛选。合成分子文 库的方法实例可以在本领域找到，比如：DeWitt等，1993.Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91 11422；Zuckermann等，1994.J.Med.Chem.37：2678；Cho等，1993. Science 261：1303；Carrell等，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33： 2059；Carell等，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061和Gallop 等，1994.J.Med.Chem.37：1233。
化合物文库可存在于溶液(如：Houghten，1992.Biotechniques 13： 412-421)或珠子(Lam，1991.Nature 354：82-84)、芯片(Fodor，Nature 364：555-556，1993)、细菌(Ladner，美国专利No.5,223,409)、孢子 (Ladner，U.S.Pat.No.5,233,409)、质粒(Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89：1865-1869，1992)或噬菌体(Scott和Smith，Science 249：386-390 1990)中；Devlin，Science 249：404-406，1990；Cwirla等，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.87：6378-6382，1990；Felici，J.Mol.Biol.222：301-310，1991； Ladner，美国专利No.5,233,409.)。
本发明方法中使用的测试化合物可以由任何已知的文库提供，比如 包含无机和有机化合物、肽、蛋白质、激素、抗体等的小分子文库。或 者，测试化合物可来自任何生物来源，例如植物、组织、体液(如血、 淋巴)等。如果分析生物来源的测试化合物的调控潜力，则可以在加入 细胞中之前将这些来源匀浆。因此，测试化合物是以确定并且可再现的 形式加入细胞中的。这样的匀浆来源可以是细胞悬液，并可包含细胞、 细胞部分等。如果不这样加入匀浆的材料，则可以在加入细胞中之前(或 在加入之后)通过常规生化方法(例如色谱，如亲和色谱(HPLC、FPLC 等)、尺寸排阻色谱等)或者细胞分选测定、抗体检测等方法从这些匀 浆来源中分离或提取。
在一个实施方案中，仅有一种测试化合物与细胞接触。但是，可以 向样品中加入一种以上的测试化合物加入，例如2-10、2-50、2-100或 更多种测试化合物。这类实施方案允许同时筛选几种测试化合物。
对宿主细胞中成像剂的(改变的)荧光信号的检测是通过任何一种 前述的荧光检测方法实现的。可以观察与未接触测试化合物相比，接触 了这种化合物的细胞中荧光信号强度或定位的变化，从而显示测试化合 物对细胞的影响。
在某些实施方案中，可以用本文描述的成像剂来确定化疗剂对一种 或多种细胞的影响。药剂或因子可以包括在对细胞应用时引起DNA损 伤的任何化学物质。化疗剂包括但不限于：5-氟尿嘧啶、博来霉素、白 消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、放线菌 素D、柔红霉素、多柔比星、雌激素受体结合剂、依托泊苷、(VP16)、 法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、美 法仑、丝裂霉素、长春瑞滨、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、雷洛昔 芬、他莫昔芬、紫杉醇、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反铂、长春碱 和氨甲喋呤、长春新碱或前述物质的任何类似物或衍生变体。多数化疗 剂归入下列种类：烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、皮质类固醇激素、 有丝分裂抑制剂和亚硝基脲类、激素剂、混杂剂(miscellaneous agent) 及其任何类似物或衍生变体。
化疗剂和给药方法、剂量等为本领域技术人员熟知(参阅如： “Physicians Desk Reference，”Goodman&Gilman’s“The Pharmacological Basis of Therapeutics”和“Remington’s Pharmaceutical Sciences，”，相关部分通过参考并入本文)，并可与本文 所述的成像剂结合。根据所分析细胞的情况或类型，一些剂量改变将是 必要的。在任何情况下，负责给药的人员将确定合适的剂量。本文描述 了具体化疗剂的实例。当然，所有这些药剂均用于说明而非限制，技术 人员可以对特定的病人或用途使用其他药剂。技术人员可参考 “Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版，第33章，特别是 624-652页。根据受治个体的情况，一些剂量变化将是必要的。在任何 情况下，负责给药的人员将确定合适的剂量。
烷化剂是直接与基因组DNA相互作用以阻止癌细胞增殖的药物。 这类化疗药物代表了影响细胞周期中所有阶段的药剂，也就是说，他们 不是阶段特异性的。烷化剂可包括但不限于氮芥、氮丙啶、甲基三聚氰 胺、烷基磺酸酯、亚硝基脲或三嗪。它们包括但不限于白消安、苯丁酸 氮芥、顺铂、环磷酰胺(cytoxan)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、双氯乙基甲 胺(氮芥)和美法仑。
抗代谢物破坏DNA和RNA的合成。与烷化剂不同，他们特异性地 在S期中影响细胞周期。抗代谢物可以分为多个种类，例如叶酸类似物、 嘧啶类似物和嘌呤类似物和相关的抑制性化合物。抗代谢物包括但不限 于5氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟达拉滨、吉西他滨和氨甲喋 呤。
天然产物通常指最早从天然来源分离得到并已鉴定为具有药理学 活性的化合物。这些化合物、其类似物和衍生物可以从天然来源分离、 化学合成或用任何本领域技术人员公知的技术重组产生。天然产物包括 下列种类，例如有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、酶和生物应答调节剂。
有丝分裂抑制剂包括植物碱和其他能够抑制细胞分裂或有丝分裂 所需的蛋白质合成的天然药剂。它们在细胞周期的特定时期发生作用。 有丝分裂抑制剂包括如多西紫杉醇、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉 醇、泰素、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。
紫杉烷是一类从红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离的相关化 合物。紫杉烷包括但不限于诸如多西紫杉醇和紫杉醇的化合物。紫杉醇 与微管蛋白结合(其位点不同于长春花碱类的结合位点)并促进微管的 组装。
长春花碱类是一类已经鉴定为具有药物活性的植物碱。它们包括 诸如长春花碱(VLB)和长春新碱。
抗肿瘤抗生素同时具有抗微生物活性和细胞毒素活性。这些药物 通过对酶和有丝分裂进行化学抑制或改变细胞膜来干扰DNA。这些试 剂不是阶段特异性的，因此它们在细胞周期的所有时期中都发挥作用。 抗肿瘤抗生素的例子包括但不限于博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、 多柔比星(阿霉素)、普卡霉素(光辉霉素)和伊达比星。
当皮质类固醇激素用于杀死癌细胞或延缓其生长时，则认为它们 是化疗药物。皮质类固醇激素能够增强其他化疗剂的效用，因而他们通 常在联合治疗中使用。泼尼松和地塞米松是皮质类固醇激素的实例。
黄体酮类例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮已经用 于子宫内膜癌和乳腺癌。雌激素类例如己烯雌酚和乙炔基雌二醇已经用 于诸如乳腺癌和前列腺癌的癌症。抗雌激素类例如他莫昔芬已经用于诸 如乳腺的癌症。雄激素类例如丙酸睾酮和氟甲睾酮已经用于治疗乳腺 癌。抗雄激素类例如氟他胺已经用于治疗前列腺癌。促性腺素释放激素 的类似物例如亮丙瑞林已经用于治疗前列腺癌。
根据其活性，一些化疗剂并不属于前述种类。它们包括但不限于 铂配位络合物、蒽二酮、取代脲、甲肼衍生物、肾上腺皮质激素抑制剂、 安吖啶、L-天冬酰胺酶和维A酸。它们也可用于本文描述的组合物和方 法之中。
蒽二酮(例如米托蒽醌)已经用于治疗急性粒细胞性白血病和乳 腺癌。取代脲(例如羟基脲)已经用于治疗慢性粒细胞性白血病、真性 红细胞增多、自发性凝血细胞增多和恶性黑素瘤。甲基肼衍生物(例如 丙卡巴肼(N-甲基肼，MIH)已经用于治疗霍奇金病。肾上腺皮质激素抑 制剂(例如米托坦)已经用于治疗肾上腺皮质癌，而氨鲁米特已经用于 治疗霍奇金病。
凋亡(或称为程序性细胞死亡)是对于正常胚胎发育、保持成体 组织的内稳态和抑制癌症发生非常重要的过程(Kerr等，1972)。在其 他系统中，已经证明Bcl-2家族的蛋白质和ICE样蛋白酶是非常重要的 凋亡的调节剂和效应物。发现与滤泡性淋巴瘤相关的Bcl-2蛋白在应答 于多种凋亡刺激而控制凋亡和提高细胞存活方面发挥重要作用 (Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto 等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。现在认为，在进化上保守的Bcl-2 蛋白是一个相关蛋白质家族的成员，这个家族可以归类为死亡激动剂或 死亡拮抗剂。已经显示，这些不同的家族成员具有和Bcl-2类似的功能， 或者与Bcl-2功能相反而促进细胞死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、 Bad、Harakiri)。促凋亡剂的非限制性实例包括短杆菌肽、爪蟾抗菌肽、 二甲双胍、防卫素和杀菌肽。
在某些实施方案中，所述分子药剂是血管发生剂，例如血管紧张 素、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原活化剂的抑制剂、组织金属 蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、血小板因子IV、IP-10、Gro-β、 血小板反应素、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧氨三唑、CM101、 马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2(Regeneron)、干扰素-α、 除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己 酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、制 管张素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子IV 或米诺环素。
研究者经常需要了解细胞和细胞培养物的生长状态。此状态可以通 过观察细胞及其核的形状与大小来确定，因为核结构是许多目的细胞事 件的早期标志。例如，核及染色体结构的显著变化是开始发生凋亡、有 丝分裂、减数分裂和细胞分裂的信号。观察这些变化对于研究和诊断人 类疾病的状态是很重要的，所述疾病包括但不限于癌症。
常使用Hoechst染料染色细胞，以进行这类观察。但是，这些染料 对细胞有毒性，经常用于已固定的细胞，即用于死细胞。本文描述可在 活细胞中展示细胞核而不伤害细胞的蛋白质。而且，所述蛋白质能够清 晰地显示凝聚染色体的形状和位置。使凝聚染色体显现的能力是很有意 义的，例如在细胞准备分裂或正在凋亡时很有意义。
在下面的描述中会频繁使用许多术语。这里对其进行解释以有助于 理解本发明。以下提供的术语参考说明书整体进行了更加全面的说明。
单位、前缀和符号可以表示为其公认的SI形式。除非另作说明，核 酸书写从左到右为5’到3’方向；氨基酸序列书写从左到右为氨基到羧基 方向。氨基酸在本文中可以表示为公知的三字母代码或IUPAC-IUBMB 命名委员会推荐的单字母代码。同样，核苷酸也可以表示为其广泛接受 的单字母代码。
在本文中，当没有数量词修饰或以“一种(个)”表示时，相应的 名词应理解为“一或多种(个)”，除非明确指明或者上下文中确切显示 并非如此。
本文所使用的“细胞穿透肽”指能够在体内和/或体外将其他肽、蛋 白质或核酸转导进细胞中的肽。
本文所使用的“DNA结合蛋白”指与DNA结合的蛋白质以及可能 对DNA具有普遍亲和力或对特定DNA序列有特异性亲和力的蛋白质。
本文所使用的“表达”指由结构基因产生多肽的过程。总体来说， 此过程包括从基因转录成RNA和将这种RNA翻译成多肽。
本文所使用的“荧光蛋白”指受到合适波长的电磁波激发时会以特 征性发射波长发出荧光的蛋白质。
本文所使用的“成像剂”表示任何可用于可视地报告细胞状态或者 亚细胞结构或细胞器的状态而在其他方面通常不对细胞产生影响的物 质。
本文所使用的术语“连接”、“缀合”或“融合”可以互换使用。这 些术语表示通过任何手段(包括化学缀合或重组)将两个或更多个元件 或组分结合到一起。融合蛋白表示包含两个或更多个区段的单个蛋白 质，这些区段分别对应于在自然界中通常不会如此连接在一起的多肽。 所述区段可以在物理上分开或在空间上分隔开，例如使用接头肽序列分 开。
本文所使用的“诱导型启动子”表示对刺激(如热休克、化学物质 等)的存在敏感的启动子。该刺激使得有效连接的核酸序列的转录水平 高于或低于不存在该刺激时有效连接的核酸序列的转录水平。
本文所使用的“核定位序列”(nuclear localization sequence，NLS) 表示能够指导蛋白质或多核苷酸定位于细胞核的多肽。
本文所使用的“核酸”表示单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸的多聚体或其嵌合体，除非另作限定，否则还包括具有天然核 苷酸基本性质(即可通过与天然存在核苷酸相似的方式与单链核酸杂 交)的已知类似物(如肽核酸)。
本文所使用的“有效连接”表示两序列之间的功能性连接。例如： 当启动子与结构基因相连时，启动子序列起始并介导结构基因的转录。 术语“有效连接”还指被连接的核酸序列是邻近的，并且当需要连接两 个或多个蛋白质编码区(任选地包括连接肽)时指序列是连续的并且处 在同一个读码框中。
本文所使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用，表 示氨基酸残基的多聚体。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是 相应天然存在氨基酸的人工化学类似物的氨基酸多聚体，以及仅含有天 然存在氨基酸的多聚体。术语多肽、肽和蛋白质还包括但不限于以下修 饰，如：糖基化、脂质附着、硫酸化、羧基化、羟基化、ADP核糖基 化以及添加其他复杂多糖。
本文所使用的“启动子”表示可以指导结构基因转录产生信使RNA (mRNA)的DNA序列。启动子通常位于基因的5’区，接近起始密码 子。如果启动子是诱导型启动子，那么应答于诱导剂时的转录水平会高 于不存在诱导剂时的转录水平。相反，如果启动子是组成型启动子，则 转录速率不会被诱导剂调控。
本文所使用的“强组成型启动子”表示在多数情况下有活性并指导 与其有效连接的核酸序列以高水平转录的启动子。“高水平转录”意为 细胞中约1/10的转录产物到约1/100的转录产物到约1/1000的转录产 物对应于所述有效连接的核酸序列。
本文所使用的“截短的启动子”表示通过去除其一部分正常序列而 变短的启动子，这通常使其活性降低，因此与该截短启动子有效连接的 核酸所表达的蛋白量低于相应的全长启动子所表达的蛋白量。
本文所使用的“载体”指能在宿主细胞中自主复制并用于转化或转 染细胞以进行基因操作的DNA分子，例如质粒、粘粒、噬粒或噬菌体。 表达载体允许转录插入其中的核酸。
本文所使用的“弱组成型启动子”表示在多数情况下有活性并指导 与其有效连接的核酸序列低水平转录的启动子。“低水平转录”意为细 胞中约1/10000的转录产物到约1/100000的转录产物到约1/500000的 转录产物对应于所述有效连接的核酸序列。
I.成像剂组合物
A.融合蛋白
一方面，本文提供可结合DNA的可检测成像剂。特别地，本文提 供可用于在生理条件下使活细胞显现的蛋白质、核酸、细胞和方法。成 像剂包括与荧光结构域结合的DNA结合结构域。成像剂可以进入活细 胞的核中并结合DNA。
成像剂含有DNA结合结构域。DNA结合结构域是对DNA具有特 异性亲和力或普遍亲和力的蛋白质。在一些实施方案中，在成像剂中使 用序列特异性DNA结合蛋白。序列特异性DNA结合蛋白通常识别和结 合特定的核苷酸序列(如TATA结合蛋白)。在其他实施方案中，成像 剂中使用非序列特异性DNA结合蛋白。非序列特异性DNA结合蛋白对 DNA具有普遍亲和力，即它们通常不对任何特定DNA序列具有显著的 偏好，而是通过总体结构和静电相互作用与DNA双螺旋相结合。因此 非序列特异性DNA结合蛋白会与任何DNA分子结合。
在一些实施方案中，蛋白质成像剂的DNA结合结构域是非序列特 异性DNA结合蛋白。一些非序列特异性DNA结合蛋白包括人高速泳动 族蛋白B1(HMGB1)、人高速泳动族蛋白B2(HMGB2)、其他HMG1 蛋白、其他HMG2蛋白、组蛋白H1、Sso7d和上述蛋白的其他同源物。 HMGB1和HMGB2通常在细胞核中表达。HMGB1存在于所有脊椎动 物的核中并且非常高度保守；例如，小鼠和大鼠HMGB1完全相同，并 且与人HMGB1仅有2个位置不同(Anderson等，J Leukoc Biol.2002 Dec；72(6)：1084-91)。因此，可以预计，任何特定的HMGB1变体在均 大多数细胞类型中都具有功能。在另一些实施方案中，DNA结合蛋白 可以是组蛋白。组蛋白是染色质的主要蛋白质成分，存在于细胞核中并 且高度保守。在一个实施方案中，所述组蛋白为组蛋白H1。
成像剂包含荧光蛋白结构域，以使活细胞中的核与染色体显现。荧 光蛋白质具有为蛋白质带来荧光特性的特定的氨基酸排列。由于这些氨 基酸，当蛋白质被特定波长的光子激发时，蛋白质发射波长更长的光子。 一般来说，荧光蛋白被紫外区的光子激发并发射可见光区的光子。在一 些实施方案中，所述荧光蛋白结构域是绿色荧光蛋白(GFP)。GFP的 最大激发和发射光谱分别为约495nm和509nm。因此，GFP是一种受 蓝光照射时发出绿色荧光的蛋白质。GFP在室温下不需要其他辅因子或 试剂就可以折叠和发出荧光，并在多种生物体和细胞类型中发挥功能， 包括但不限于细菌、酵母、真菌、植物、昆虫、蠕虫、哺乳动物和人。
具有特征性激发和发射波谱的GFP变体及其他荧光蛋白也是有用 的。在一些实施方案中，荧光蛋白可以是黄色荧光蛋白(YFP)、红色 荧光蛋白(RFP)、珊瑚虫红色荧光蛋白(DsRed)、蓝绿色荧光蛋白 (CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强 型黄色荧光蛋白(EYFP)、增强型蓝绿色荧光蛋白(ECFP)或增强型 蓝色荧光蛋白(EBFP)。在另一些实施方案中，荧光蛋白质是优化过的 荧光蛋白突变体。其他荧光蛋白质的实例为S65T GFP突变体、 Superfolder GFP、Azurite、mKalama1、Cerulean、CyPet、Citrine、 Venus和YPet。
在一个说明性实施方案中，HMGB1和EGFP的融合蛋白是使细胞 显现的成像剂。
荧光蛋白结构域和DNA结合结构域可以通过存在于同一多肽上而 彼此结合。在这个实施方案中，DNA结合蛋白和荧光蛋白结构域融合 在同一读码框中，从而使一个结构域的编码序列直接邻接另一个结构域 的编码序列或紧随其后。
在一些实施方案中，荧光结构域和DNA结合结构域可以通过连接 这两结构域的接头而彼此相连。所述接头可以是肽或者适当的化学基 团。除了物理连接两个蛋白质或多肽以外，接头可以无其他功能。在另 一些实施方案中，所述接头是与荧光结构域和DNA结合结构域一起框 内翻译的肽。接头部分应当足够长和柔软，以使DNA结合结构域与DNA 结合而不受到荧光结构域的空间位阻。任选地，所述接头部分是肽部分。 任选地，接头部分是长度为约1到30个氨基酸(任选地为约2到15个 氨基酸)的肽。在一个说明性实施方案中，接头部分是“-Gly-Gly-”接 头。连接性部分描述于例如Huston等，PNAS 85：5879-5883，1988， Whitlow等，Protein Engineering 6：989-995，1993和Newton等， Biochemistry 35：545-553，1996。
在一些实施方案中，荧光结构域和DNA结合结构域可以是在体外 或体内自发结合(self-associate)的分开的多肽。自发结合可以通过本 领域技术人员熟知的任何一种有用的蛋白二聚化结构域或偶联剂来介 导。一个蛋白二聚化结构域的实例是亮氨酸拉链，其介导AP1转录因 子的结合。可以用来介导自发结合的偶联剂实例是亲和素-生物素、抗 体-抗原对和受体-配体对。亲和素-生物素复合物是本领域技术人员熟知 的两分子之间最强的非共价结合之一。为了在体外或体内使用亲和素- 生物素来使成像剂自发结合，可将亲和素与DNA结合结构域或荧光结 构域连接，而将生物素与另一结构域连接。在将修饰的结构域引入细胞 之后，结构域由于亲和素-生物素复合物而自发结合，从而生成成像剂。 化学接头也可包括任何可以连接两个多肽的化学基团，比如酰胺、酯、 硫酯、磷酯、磷酰胺、酸酐、二硫化物、交联剂和本领域技术人员熟知 的其他连接。
成像剂还可包括核定位结构域，其通过与合适的细胞器靶向信号或 定位宿主蛋白融合而指导成像剂定位到细胞核。编码定位序列或信号序 列的多核苷酸可以连接或融合到编码成像剂的多核苷酸的5’端，以使信 号肽位于所得融合多核苷酸/多肽的氨基端。
例如，任何这些实施方案中的成像剂都可以含有核定位序列(NLS)。 NLS使与其相连的蛋白质输入细胞核中。因此，当成像剂包含NLS时， 此成像剂主要定位于核中而不显著渗漏到胞质中。NLS由带正电赖氨酸 或精氨酸一个或多个短序列组成，比如KKKRKV(SEQ ID NO：19) 或KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO：20)。这些信号被输入蛋白 结合，输入蛋白通过核孔将含有NLS的蛋白质输入核中。核定位序列 可以来自例如SV40大T抗原、核质蛋白、Chelsky序列、C-myc、hnRNP A1的M9结构域、酵母转录抑制子Matα2以及U snRNP的复合信号。
任何这些实施方案中的成像剂还可以包含细胞穿透肽。细胞穿透肽 有助于使与其连接的蛋白质穿过质膜进入细胞。细胞穿透肽可以包含多 阳离子短序列，比如RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：21)或 GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：22)。细胞穿透肽的实例包括触角 足基因蛋白、穿透素(penetratin)、TAT、transportan、Pep-1、S413-PV 和多聚精氨酸。
B.核酸
另一个方面，本文提供核酸构建体，所述核酸构建体编码可以结合 DNA并在活细胞中表达的成像剂。所述成像剂可以作为融合蛋白通过 重组DNA技术产生。
蛋白质的重组产生包括表达含有编码所述蛋白质的序列的核酸。编 码成像剂的核酸可以用本领域公知的方法得到。例如，可以使用基于目 的DNA序列的引物，通过聚合酶链式反应分离编码蛋白质的核酸。以 下文献中描述了PCR方法，例如：美国专利No.4,683,195；Mullis等， Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263，1987和Erlich编辑， PCR Technology，(Stockton Press，NY，1989)。荧光蛋白的突变体形 式可以通过编码荧光蛋白质的其他核酸的定点诱变得到或者通过随机 诱变得到，随机诱变是通过使用0.1mM MgCl2和不均衡的核苷酸浓度 提高原始多核苷酸的PCR错误率而实现的。参见如1994年11月10日 提交的美国专利申请No.08/337,915或者1995年11月10日提交的国际 申请PCT/US95/14692。
表达载体的构建和基因在转染细胞中的表达涉及使用本领域中公 知的分子克隆技术。参见Sambrook等，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1989)和Current Protocols in Molecular Biology，F.M. Ausubel等编辑。
任选地，用于将编码目的多肽表达的序列转染进细胞中的核酸可以 是表达载体的形式，所述表达载体中包括与编码表达目的多肽的核酸序 列有效连接的表达调控序列。本文所使用的术语“表达调控序列”表示 可以调控与其有效连接的核酸序列表达的核酸序列。当表达调控序列控 制和调节核酸序列的转录(并且适当时控制其翻译)时，该表达调控序 列即为与核酸序列有效连接。因此，表达调控序列可以包括适当的启动 子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前面的起始密码子(即ATG)、 内含子剪接信号、维持该基因的正确读码框以使mRNA正确翻译和终 止密码子。
包含成像剂编码序列和合适的转录/翻译调控序列的表达载体可以 用本领域技术人员公知的方法来构建。这些方法包括体外重组DNA技 术、合成技术和体内重组/基因重组。(参阅如Maniatis等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.， 1989中描述的技术)。
可以通过本领域技术人员公知的常规技术用重组DNA转化宿主细 胞。当宿主是原核细胞(如大肠杆菌)时，可以从在指数生长后收集并 且随后用本领域公知操作经CaCl2方法处理的细胞制备具有吸收DNA 能力的感受态细胞。或者，可以使用MgCl2或RbCl。转化也可以在形 成宿主细胞的原生质体后进行，或者通过电穿孔来实现。
当宿主是真核生物时，可以使用下列DNA转染方法：例如DNA- 脂质体复合体或磷酸钙共沉淀、常规机械方法(如显微注射)、电穿孔、 插入脂质体包裹的质粒或者病毒载体。还可以用编码成像剂的DNA序 列和编码可选择表型(例如嘌呤霉素、新霉素、潮霉素选择标记和单纯 疱疹病毒胸苷激酶基因)的另一种外源DNA分子共转染真核细胞。另 一种方法是使用真核病毒载体(如猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒)来 瞬时或稳定地感染或转化真核细胞并表达蛋白质。(Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman编辑.，1982)。
可通过任何常规方法分离和纯化在微生物或真核细胞中表达的多 肽，例如制备层析分离和免疫分离，例如涉及使用单克隆或多克隆抗体 或抗原的分离技术。
可以使用多种宿主表达载体系统来表达编码成像剂的序列。包括但 不限于微生物，例如转化了重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA 表达载体的细菌。取决于所使用的宿主/载体系统，在表达载体中可以 使用多种适合的转录和翻译元件中的任何一种，包括组成型和诱导型启 动子、转录增强子元件、转录终止子等(参见如Bitter等，Methods in Enzymology 153：516-544，1987)。例如，在细菌系统中克隆时，可以使 用诱导型启动子，例如λ噬菌体的pL、plac、ptrp和ptac(ptrp-lac 杂合启动子)等。在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用来自哺乳动 物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的 启动子(如逆转录病毒长末端重复、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K 启动子)。通过重组DNA或合成技术产生的启动子也可以用来提供插入 的荧光指示剂编码序列的转录。
在细菌系统中，可以根据所表达荧光指示剂的预期用途有利地选择 多种表达载体。例如，当需要产生大量荧光指示剂的时候，可以使用指 导表达易于纯化的高水平融合蛋白产物的载体。
在酵母中，可以使用多个包含组成型或诱导型启动子的载体。综述 可参考Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，Ausubel等编辑， Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience，第13章，1988；Grant等， Expression and Secretion Vectors for Yeast，Methods in Enzymology， Wu&Grossman编辑，31987，Acad.Press，N.Y.，第153卷，516-544页， 1987；Glover，DNA Cloning，第II卷，IRL Press，Wash.，D.C.，第3章， 1986；Bitter，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，Berger&Kimmel编辑，Acad.Press，N.Y.，第152卷， 673-684页，1987和The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces， Strathern等编辑，Cold Spring Harbor Press，第I卷和第II卷，1982。 可以使用组成型酵母启动子如ADH或LEU2或者诱导型启动子如GAL (Cloning in Yeast，第3章，R.Rothstein In：DNA Cloning第11卷，A Practical Approach，DM Glover编辑，IRL Press，Wash.，D.C.，1986)。 或者，可以使用促进外源DNA序列整合进酵母染色体的载体。
另一种可用来表达成像剂的表达系统是昆虫系统。在一个这样的系 统中，使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)作为表达外源基因的载体。此病毒 生长于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。荧光指示剂编码序 列可以克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中并置于 AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的调控之下。荧光指示剂编 码序列的成功插入会导致多角体蛋白基因失活，并产生非包含体型重组 病毒(即缺乏由多角体蛋白基因编码的蛋白外壳的病毒)。接着使用这 些重组病毒感染草地夜蛾细胞，插入的基因在该细胞中表达。参见Smith 等，J.Viol.46：584，1983；Smith，美国专利申请No.4,215,051。
可以改造利用重组病毒或病毒元件指导表达的哺乳动物细胞系统。 例如，当使用腺病毒表达载体时，成像剂编码序列可与腺病毒转录/翻 译控制复合体连接，例如与后期启动子和三联前导序列连接。然后可以 通过体外或体内重组将此嵌合基因插入到腺病毒基因组中。病毒基因组 非必需区域(如E1或E3区)中的插入会产生有活力并且能在感染宿 主中表达成像剂的重组病毒(参见如Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，81：3655-3659，1984)。或者，也可以使用牛痘病毒7.5K启动 子(参见如Mackett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：7415-7419，1982； Mackett等，J.Virol.49：857-864，1984；Panicali等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 79：4927-4931，1982)。
在一些实施方案中，可以改造基于牛乳头瘤病毒的载体，所述牛乳 头瘤病毒具有作为染色体外元件进行复制的能力(Sarver等，Mol.Cell. Biol.1：486，1981)。此DNA进入细胞后不久，质粒即复制到大约每细 胞100-200个拷贝。所插入cDNA的转录不需要质粒整合进宿主染色体， 因此获得高水平的表达。这些载体可以通过在质粒中引入选择标记(例 如neo基因)而用于稳定表达。或者，可以修饰反转录病毒的基因组， 以用作能够将成像剂基因引入宿主并指导其表达的载体(Cone& Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6349-6353，1984)。高水平的表 达可以通过使用诱导型启动子来实现，包括但不限于金属硫蛋白IIA启 动子和热激启动子。
在一个说明性实施方案中，可以通过稳定表达来长期高产量地生产 重组蛋白。可以使用适当表达调控元件(如启动子、增强子、转录终止 子、多腺苷酸化位点等)控制下的成像剂DNA和选择标记转化宿主细 胞，而不是使用包含细菌复制起点的表达载体。重组质粒中的选择标记 赋予细胞对选择的抗性，使细胞能够将质粒稳定整合到其染色体中，并 生长形成转化灶，接着可将转化灶克隆并扩大成细胞系。例如，在引入 外源DNA之后，可使改造细胞在富集培养基中生长1-2天，接着换成 选择培养基。可以使用多种选择系统，包括但不限于例如单纯疱疹病毒 胸苷激酶(Wigler等，Cell，11：223，1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转 移酶(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：2026，1962) 以及腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell，22：817，1980)基因分别可 用于tk-细胞、hgprt细胞或aprt细胞中。同样，抗代谢物抗性也可以 作为以下基因的选择基础：赋予对氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：3567，1980；O’Hare等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，8：1527，1981)；赋予对霉酚酸的抗性的gpt(Mulligan&Berg， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072，1981)；赋予对氨基葡糖苷G-418 的抗性的neo(Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.，150：1，1981)和赋 予对潮霉素的抗性的hygro(Santerre等，Gene，30：147，1984)。近来 还报道了其他选择基因：例如允许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB；允 许细胞利用组胺醇代替组氨酸的hisD(Hartman&Mulligan，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，85：8047，1988)，以及赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二 氟甲基)-DL-鸟氨酸(DFMO)的抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶) (McConlogue L.，In：Current Communications in Molecular Biology， Cold Spring Harbor Laboratory，1987年编辑)。
本文描述的构建体还可以包含使成像剂分离简化的标签。例如，抗 将多组氨酸标签(如6个组氨酸残基的标签)插入荧光蛋白的氨基端。 多组氨酸标签允许通过镍螯合色谱方便地一步式分离蛋白质。
可将表达载体转染到宿主细胞中，以表达重组核酸。可以选择表达 水平高的宿主细胞用于纯化荧光指示剂融合蛋白。大肠杆菌可用于这一 目的。或者，宿主细胞可以是选择用成像剂进行成像的原核或真核细胞。 这类细胞可以是如培养细胞或体内细胞。
成像剂的一个优点是它们是通过正常的蛋白质合成产生的。构建体 可以在大肠杆菌中大规模表达。当序列包含多组氨酸标签以通过镍螯合 色谱一步式纯化时，从细菌中纯化蛋白质将是很简单的。或者，可以在 目的宿主细胞中直接表达底物，以用于原位检测。
特别地，可通过调控序列来控制转录，例如通过与功能性编码核酸 序列有效连接的启动子和增强子来进行控制。启动子中包含被转录因子 和其他调节因子识别的特定DNA序列。转录因子起始与其有效连接的 核酸的转录。调节因子可以是调控转录水平的蛋白质或其他化学物质。 增强子是可以进一步调节核酸序列转录的顺式调节元件。
在一些实施方案中，编码成像剂的核酸构建体包含与编码成像剂的 核酸有效连接的启动子。该启动子可以是强组成型启动子、弱组成型启 动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。强组成型启动子活性很强， 因此可表达大量蛋白质，使成像细胞发出强荧光。弱组成型启动子具有 最低限度的活性，因此所表达蛋白质的量可以清晰地显示细胞中凝聚染 色体的位置和形状，而不会被荧光背景干扰。诱导型启动子应答于刺激， 因此可在很大范围内控制所编码多肽的表达水平，以用于多种应用。在 一些说明性实施方案中，强组成型启动子是CMV早期启动子。在一些 说明性实施方案中，弱组成型启动子是截短的CMV早期启动子。诱导 型启动子的实例有：可由IPTG诱导的lac启动子、可由热激诱导的hsp70 启动子、四环素诱导型启动子、RSL1诱导型启动子、糖皮质激素诱导 型启动子和其他激素诱导型启动子。
可将编码蛋白质成像剂的核酸构建体引入载体中。载体便于对核酸 构建体进行克隆、分离和操作。一些载体还包含用于特殊用途(例如控 制多肽在细胞内的表达水平)的序列。在一些实施方案中，所述载体包 括但不限于pGEM-T Easy、pBluescript、TOPO克隆载体、pCR-Script 和pT7Blue-T。在一些说明性实施方案中，包含成像剂的载体具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列。
另一方面，本文提供细胞，其包含成像剂、表达成像剂的核酸构建 体和/或包含表达荧光蛋白质成像剂的核酸构建体的载体。在一些实施 方案中，成像剂可以存在于多种人类癌细胞系中。人类癌细胞系的实例 包括但不限于A549、H1299、HeLa、HL60、K562、KG-1、Jurkat、 Lncap、MCF-7、MDA-MB-438、T47D、THP-1、U87、SHSY5Y、 MCF-10A、T84、Peer和BxPC3。也可以使用其他本领域技术人员公 知的人和非人细胞系。表达荧光蛋白质成像剂的细胞可以用来评估药物 和其他药剂在例如癌细胞和其他细胞类型中对细胞分裂、生长和凋亡的 影响。
在一个说明性的实施方案中，核酸构建体是pHMGB1-EGFP，其含 有下文所示的SEQ ID NO：1的序列：
特征 位置
CMV早期启动子 1..589
HMGB1 639..1286
EGFP 1326..2045
SV40/polyA 2199..2249
Kana/Neo 3276..4070
PUC复制起点 4655..5298
1 TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG
61 CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT
121 GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA
181 ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC
241 AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA
301 CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC
361 CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG
421 ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG
481 GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT
541 ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC CGTCAGATCC GCTAGCGCTA
601 CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA ATTCGATTAT GGGCAAAGGA GATCCTAAGA
661 AGCCGAGAGG CAAAATGTCA TCATATGCAT TTTTTGTGCA AACTTGTCGG GAGGAGCATA
721 AGAAGAAGCA CCCAGATGCT TCAGTCAACT TCTCAGAGTT TTCTAAGAAG TGCTCAGAGA
781 GGTGGAAGAC CATGTCTGCT AAAGAGAAAG GAAAATTTGA AGATATGGCA AAAGCGGACA
841 AGGCCCGTTA TGAAAGAGAA ATGAAAACCT ATATCCCTCC CAAAGGGGAG ACAAAAAAGA
901 AGTTCAAGGA TCCCAATGCA CCCAAGAGGC CTCCTTCGGC CTTCTTCCTC TTCTGCTCTG
961 AGTATCGCCC AAAAATCAAA GGAGAACATC CTGGCCTGTC CATTGGTGAT GTTGCGAAGA
1021 AACTGGGAGA GATGTGGAAT AACACTGCTG CAGATGACAA GCAGCCTTAT GAAAAGAAGG
1081 CTGCGAAGCT GAAGGAAAAA TACGAAAAGG ATATTGCTGC ATATCGAGCT AAAGGAAAGC
1141 CTGATGCAGC AAAAAAGGGA GTTGTCAAGG CTGAAAAAAG CAAGAAAAAG AAGGAAGAGG
1201 AGGAAGATGA GGAAGATGAA GAGGATGAGG AGGAGGAGGA AGATGAAGAA GATGAAGATG
1261 AAGAAGAAGA TGATGATGAT GAATCGTCGA CGGTACCGCG GGCCCGGGAT CCACCGGTCG
1321 CCACCATGGT GAGCAAGGGC GAGGAGCTGT TCACCGGGGT GGTGCCCATC CTGGTCGAGC
1381 TGGACGGCGA CGTAAACGGC CACAAGTTCA GCGTGTCCGG CGAGGGCGAG GGCGATGCCA
1441 CCTACGGCAA GCTGACCCTG AAGTTCATCT GCACCACCGG CAAGCTGCCC GTGCCCTGGC
1501 CCACCCTCGT GACCACCCTG ACCTACGGCG TGCAGTGCTT CAGCCGCTAC CCCGACCACA
1561 TGAAGCAGCA CGACTTCTTC AAGTCCGCCA TGCCCGAAGG CTACGTCCAG GAGCGCACCA
1621 TCTTCTTCAA GGACGACGGC AACTACAAGA CCCGCGCCGA GGTGAAGTTC GAGGGCGACA
1681 CCCTGGTGAA CCGCATCGAG CTGAAGGGCA TCGACTTCAA GGAGGACGGC AACATCCTGG
1741 GGCACAAGCT GGAGTACAAC TACAACAGCC ACAACGTCTA TATCATGGCC GACAAGCAGA
1801 AGAACGGCAT CAAGGTGAAC TTCAAGATCC GCCACAACAT CGAGGACGGC AGCGTGCAGC
1861 TCGCCGACCA CTACCAGCAG AACACCCCCA TCGGCGACGG CCCCGTGCTG CTGCCCGACA
1921 ACCACTACCT GAGCACCCAG TCCGCCCTGA GCAAAGACCC CAACGAGAAG CGCGATCACA
1981 TGGTCCTGCT GGAGTTCGTG ACCGCCGCCG GGATCACTCT CGGCATGGAC GAGCTGTACA
2041 AGTAAAGCGG CCGCGACTCT AGATCATAAT CAGCCATACC ACATTTGTAG AGGTTTTACT
2101 TGCTTTAAAA AACCTCCCAC ACCTCCCCCT GAACCTGAAA CATAAAATGA ATGCAATTGT
2161 TGTTGTTAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA
2221 TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA AACTCATCAA
2281 TGTATCTTAA GGCGTAAATT GTAAGCGTTA ATATTTTGTT AAAATTCGCG TTAAATTTTT
2341 GTTAAATCAG CTCATTTTTT AACCAATAGG CCGAAATCGG CAAAATCCCT TATAAATCAA
2401 AAGAATAGAC CGAGATAGGG TTGAGTGTTG TTCCAGTTTG GAACAAGAGT CCACTATTAA
2461 AGAACGTGGA CTCCAACGTC AAAGGGCGAA AAACCGTCTA TCAGGGCGAT GGCCCACTAC
2521 GTGAACCATC ACCCTAATCA AGTTTTTTGG GGTCGAGGTG CCGTAAAGCA CTAAATCGGA
2581 ACCCTAAAGG GAGCCCCCGA TTTAGAGCTT GACGGGGAAA GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA
2641 AGGAAGGGAA GAAAGCGAAA GGAGCGGGCG CTAGGGCGCT GGCAAGTGTA GCGGTCACGC
2701 TGCGCGTAAC CACCACACCC GCCGCGCTTA ATGCGCCGCT ACAGGGCGCG TCAGGTGGCA
2761 CTTTTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA CATTCAAATA
2821 TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA ATAATATTGA AAAAGGAAGA
2881 GTCCTGAGGC GGAAAGAACC AGCTGTGGAA TGTGTGTCAG TTAGGGTGTG GAAAGTCCCC
2941 AGGCTCCCCA GCAGGCAGAA GTATGCAAAG CATGCATCTC AATTAGTCAG CAACCAGGTG
3001 TGGAAAGTCC CCAGGCTCCC CAGCAGGCAG AAGTATGCAA AGCATGCATC TCAATTAGTC
3061 AGCAACCATA GTCCCGCCCC TAACTCCGCC CATCCCGCCC CTAACTCCGC CCAGTTCCGC
3121 CCATTCTCCG CCCCATGGCT GACTAATTTT TTTTATTTAT GCAGAGGCCG AGGCCGCCTC
3181 GGCCTCTGAG CTATTCCAGA AGTAGTGAGG AGGCTTTTTT GGAGGCCTAG GCTTTTGCAA
3241 AGATCGATCA AGAGACAGGA TGAGGATCGT TTCGCATGAT TGAACAAGAT GGATTGCACG
3301 CAGGTTCTCC GGCCGCTTGG GTGGAGAGGC TATTCGGCTA TGACTGGGCA CAACAGACAA
3361 TCGGCTGCTC TGATGCCGCC GTGTTCCGGC TGTCAGCGCA GGGGCGCCCG GTTCTTTTTG
3421 TCAAGACCGA CCTGTCCGGT GCCCTGAATG AACTGCAAGA CGAGGCAGCG CGGCTATCGT
3481 GGCTGGCCAC GACGGGCGTT CCTTGCGCAG CTGTGCTCGA CGTTGTCACT GAAGCGGGAA
3541 GGGACTGGCT GCTATTGGGC GAAGTGCCGG GGCAGGATCT CCTGTCATCT CACCTTGCTC
3601 CTGCCGAGAA AGTATCCATC ATGGCTGATG CAATGCGGCG GCTGCATACG CTTGATCCGG
3661 CTACCTGCCC ATTCGACCAC CAAGCGAAAC ATCGCATCGA GCGAGCACGT ACTCGGATGG
3721 AAGCCGGTCT TGTCGATCAG GATGATCTGG ACGAAGAGCA TCAGGGGCTC GCGCCAGCCG
3781 AACTGTTCGC CAGGCTCAAG GCGAGCATGC CCGACGGCGA GGATCTCGTC GTGACCCATG
3841 GCGATGCCTG CTTGCCGAAT ATCATGGTGG AAAATGGCCG CTTTTCTGGA TTCATCGACT
3901 GTGGCCGGCT GGGTGTGGCG GACCGCTATC AGGACATAGC GTTGGCTACC CGTGATATTG
3961 CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA TGGGCTGACC GCTTCCTCGT GCTTTACGGT ATCGCCGCTC
4021 CCGATTCGCA GCGCATCGCC TTCTATCGCC TTCTTGACGA GTTCTTCTGA GCGGGACTCT
4081 GGGGTTCGAA ATGACCGACC AAGCGACGCC CAACCTGCCA TCACGAGATT TCGATTCCAC
4141 CGCCGCCTTC TATGAAAGGT TGGGCTTCGG AATCGTTTTC CGGGACGCCG GCTGGATGAT
4201 CCTCCAGCGC GGGGATCTCA TGCTGGAGTT CTTCGCCCAC CCTAGGGGGA GGCTAACTGA
4261 AACACGGAAG GAGACAATAC CGGAAGGAAC CCGCGCTATG ACGGCAATAA AAAGACAGAA
4321 TAAAACGCAC GGTGTTGGGT CGTTTGTTCA TAAACGCGGG GTTCGGTCCC AGGGCTGGCA
4381 CTCTGTCGAT ACCCCACCGA GACCCCATTG GGGCCAATAC GCCCGCGTTT CTTCCTTTTC
4441 CCCACCCCAC CCCCCAAGTT CGGGTGAAGG CCCAGGGCTC GCAGCCAACG TCGGGGCGGC
4501 AGGCCCTGCC ATAGCCTCAG GTTACTCATA TATACTTTAG ATTGATTTAA AACTTCATTT
4561 TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA AAATCCCTTA
4621 ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG GATCTTCTTG
4681 AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG CTTGCAAACA AAAAAACCAC CGCTACCAGC
4741 GGTGGTTTGT TTGCCGGATC AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA CTGGCTTCAG
4801 CAGAGCGCAG ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC ACCACTTCAA
4861 GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG TGGCTGCTGC
4921 CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC CGGATAAGGC
4981 GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC GAACGACCTA
5041 CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCT ATGAGAAAGC GCCACGCTTC CCGAAGGGAG
5101 AAAGGCGGAC AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT
5161 TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC TCTGACTTGA
5221 GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG CCAGCAACGC
5281 GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT TTCCTGCGTT
5341 ATCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTAC CGCCATGCAT
在一个说明性实施方案中，核酸构建体是ptrEGFP-HMGB1，其含 有下文所示的SEQ ID NO：2的序列：
特征 位置
截短的CMV启动子 3..92
HMGB1 142..789
EGFP 829..1548
SV40/polyA 1702..1752
Kana/Neo 3809..3827
PUC复制起点 4158..4801
1 GCAACAACTC CGCCCCATTG ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA
61 TAAGCAGAGC TGGTTTAGTG AACCGTCAGA TCCGCTAGCG CTACCGGACT CAGATCTCGA
121 GCTCAAGCTT CGAATTCGAT TATGGGCAAA GGAGATCCTA AGAAGCCGAG AGGCAAAATG
181 TCATCATATG CATTTTTTGT GCAAACTTGT CGGGAGGAGC ATAAGAAGAA GCACCCAGAT
241 GCTTCAGTCA ACTTCTCAGA GTTTTCTAAG AAGTGCTCAG AGAGGTGGAA GACCATGTCT
301 GCTAAAGAGA AAGGAAAATT TGAAGATATG GCAAAAGCGG ACAAGGCCCG TTATGAAAGA
361 GAAATGAAAA CCTATATCCC TCCCAAAGGG GAGACAAAAA AGAAGTTCAA GGATCCCAAT
421 GCACCCAAGA GGCCTCCTTC GGCCTTCTTC CTCTTCTGCT CTGAGTATCG CCCAAAAATC
481 AAAGGAGAAC ATCCTGGCCT GTCCATTGGT GATGTTGCGA AGAAACTGGG AGAGATGTGG
541 AATAACACTG CTGCAGATGA CAAGCAGCCT TATGAAAAGA AGGCTGCGAA GCTGAAGGAA
601 AAATACGAAA AGGATATTGC TGCATATCGA GCTAAAGGAA AGCCTGATGC AGCAAAAAAG
661 GGAGTTGTCA AGGCTGAAAA AAGCAAGAAA AAGAAGGAAG AGGAGGAAGA TGAGGAAGAT
721 GAAGAGGATG AGGAGGAGGA GGAAGATGAA GAAGATGAAG ATGAAGAAGA AGATGATGAT
781 GATGAATCGT CGACGGTACC GCGGGCCCGG GATCCACCGG TCGCCACCAT GGTGAGCAAG
841 GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC
901 GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC
961 CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC
1021 CTGACCTACG GCGTGCAGTG CTTCAGCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC
1081 TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC
1141 GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC
1201 GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC
1261 AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG
1321 AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG
1381 CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCCG ACAACCACTA CCTGAGCACC
1441 CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC
1501 GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAAG CGGCCGCGAC
1561 TCTAGATCAT AATCAGCCAT ACCACATTTG TAGAGGTTTT ACTTGCTTTA AAAAACCTCC
1621 CACACCTCCC CCTGAACCTG AAACATAAAA TGAATGCAAT TGTTGTTGTT AACTTGTTTA
1681 TTGCAGCTTA TAATGGTTAC AAATAAAGCA ATAGCATCAC AAATTTCACA AATAAAGCAT
1741 TTTTTTCACT GCATTCTAGT TGTGGTTTGT CCAAACTCAT CAATGTATCT TAAGGCGTAA
1801 ATTGTAAGCG TTAATATTTT GTTAAAATTC GCGTTAAATT TTTGTTAAAT CAGCTCATTT
1861 TTTAACCAAT AGGCCGAAAT CGGCAAAATC CCTTATAAAT CAAAAGAATA GACCGAGATA
1921 GGGTTGAGTG TTGTTCCAGT TTGGAACAAG AGTCCACTAT TAAAGAACGT GGACTCCAAC
1981 GTCAAAGGGC GAAAAACCGT CTATCAGGGC GATGGCCCAC TACGTGAACC ATCACCCTAA
2041 TCAAGTTTTT TGGGGTCGAG GTGCCGTAAA GCACTAAATC GGAACCCTAA AGGGAGCCCC
2101 CGATTTAGAG CTTGACGGGG AAAGCCGGCG AACGTGGCGA GAAAGGAAGG GAAGAAAGCG
2161 AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA CGCTGCGCGT AACCACCACA
2221 CCCGCCGCGC TTAATGCGCC GCTACAGGGC GCGTCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG
2281 CGCGGAACCC CTATTTGTTT ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA
2341 CAATAACCCT GATAAATGCT TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTCCTGA GGCGGAAAGA
2401 ACCAGCTGTG GAATGTGTGT CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA
2461 GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG TCCCCAGGCT
2521 CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA GTCAGCAACC ATAGTCCCGC
2581 CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG
2641 GCTGACTAAT TTTTTTTATT TATGCAGAGG CCGAGGCCGC CTCGGCCTCT GAGCTATTCC
2701 AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG CAAAGATCGA TCAAGAGACA
2761 GGATGAGGAT CGTTTCGCAT GATTGAACAA GATGGATTGC ACGCAGGTTC TCCGGCCGCT
2821 TGGGTGGAGA GGCTATTCGG CTATGACTGG GCACAACAGA CAATCGGCTG CTCTGATGCC
2881 GCCGTGTTCC GGCTGTCAGC GCAGGGGCGC CCGGTTCTTT TTGTCAAGAC CGACCTGTCC
2941 GGTGCCCTGA ATGAACTGCA AGACGAGGCA GCGCGGCTAT CGTGGCTGGC CACGACGGGC
3001 GTTCCTTGCG CAGCTGTGCT CGACGTTGTC ACTGAAGCGG GAAGGGACTG GCTGCTATTG
3061 GGCGAAGTGC CGGGGCAGGA TCTCCTGTCA TCTCACCTTG CTCCTGCCGA GAAAGTATCC
3121 ATCATGGCTG ATGCAATGCG GCGGCTGCAT ACGCTTGATC CGGCTACCTG CCCATTCGAC
3181 CACCAAGCGA AACATCGCAT CGAGCGAGCA CG TACTCGGA TGGAAGCCGG TCTTGTCGAT
3241 CAGGATGATC TGGACGAAGA GCATCAGGGG CTCGCGCCAG CCGAACTGTT CGCCAGGCTC
3301 AAGGCGAGCA TGCCCGACGG CGAGGATCTC GTCGTGACCC ATGGCGATGC CTGCTTGCCG
3361 AATATCATGG TGGAAAATGG CCGCTTTTCT GGATTCATCG ACTGTGGCCG GCTGGGTGTG
3421 GCGGACCGCT ATCAGGACAT AGCGTTGGCT ACCCGTGATA TTGCTGAAGA GCTTGGCGGC
3481 GAATGGGCTG ACCGCTTCCT CGTGCTTTAC GGTATCGCCG CTCCCGATTC GCAGCGCATC
3541 GCCTTCTATC GCCTTCTTGA CGAGTTCTTC TGAGCGGGAC TCTGGGGTTC GAAATGACCG
3601 ACCAAGCGAC GCCCAACCTG CCATCACGAG ATTTCGATTC CACCGCCGCC TTCTATGAAA
3661 GGTTGGGCTT CGGAATCGTT TTCCGGGACG CCGGCTGGAT GATCCTCCAG CGCGGGGATC
3721 TCATGCTGGA GTTCTTCGCC CACCCTAGGG GGAGGCTAAC TGAAACACGG AAGGAGACAA
3781 TACCGGAAGG AACCCGCGCT ATGACGGCAA TAAAAAGACA GAATAAAACG CACGGTGTTG
3841 GGTCGTTTGT TCATAAACGC GGGGTTCGGT CCCAGGGCTG GCACTCTGTC GATACCCCAC
3901 CGAGACCCCA TTGGGGCCAA TACGCCCGCG TTTCTTCCTT TTCCCCACCC CACCCCCCAA
3961 GTTCGGGTGA AGGCCCAGGG CTCGCAGCCA ACGTCGGGGC GGCAGGCCCT GCCATAGCCT
4021 CAGGTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT
4081 AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC
4141 ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC
4201 GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG
4261 ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA
4321 ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC
4381 CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT
4441 GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA
4501 CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC
4561 TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC
4621 CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT
4681 GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT
4741 GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC
4801 TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG
4861 ATAACCGTAT TACCGCCATG CAT
I.使活细胞的核及染色体成像的方法
A.在活细胞中监测成像剂的方法
另一方面，本文提供了使活细胞成像的方法，其步骤包括向细胞中 引入成像剂、表达成像剂的核酸构建体和/或含有表达成像剂的核酸构 建体的载体，然后在活细胞中监测该成像剂。在一些实施方案中，所述 的方法可以用来使细胞中核或染色体的形状、大小、位置和/或状态显 像。对核与染色体状态的观察可用于监测细胞中的事件，因为特定的核 及染色体结构和/或排列可指示某些事件，例如凋亡、细胞分裂、有丝 分裂、减数分裂、癌症发生以及治疗剂或对细胞可能有或没有毒性的其 他试剂的影响。例如，凝聚染色体沿着细胞中心附近的有丝分裂纺锤体 进行定位的情况可指示细胞分裂。明显不同的细胞形态(包括细胞变 圆)、核破裂以及染色体的凝聚与断裂均可指示凋亡。
在一些实施方案中，成像剂可以直接引入细胞中。直接引入蛋白质 和肽的方法包括显微注射、细胞穿透肽、转染、微粒轰击、脂质体、脂 转染、细胞膜的透化作用、冻融、热休克、核转染、电穿孔、静电吸附 和受体介导的胞吞作用。在另一些实施方案中，成像剂由引入细胞中的 核酸构建体来表达。引入核酸构建体的方法包括显微注射、转化、转导、 转染、微粒轰击(“基因枪”)、脂质体、脂转染、细胞膜的透化作用、 冻融、热激、核转染、电穿孔、静电吸附和受体介导的胞吞作用。所述 核酸可以整合进染色体，可以作为独立复制的质粒存在，或者可以瞬时 表达。在各种情况中，成像剂的表达均可受强组成型启动子、弱组成型 启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子的控制。
在一个实施方案中，成像剂用于获得细胞中染色体和/或核的图像。 在一个实施方案中，使用者通过荧光显微镜直接观察所述图像。在另一 个实施方案中，所述图像通过荧光结构域在经适当波长激发之后所发射 的个体光子来显示。在数字图像处理器中将这些检测到的光子积累一段 时间之后，即可得到并构建一幅图像。至少有两种光电探测设备可以检 测个体光子并生成可以用图像处理器分析的信号。降噪光电探测设备中 灵敏度的提高是通过降低光子探测器的背景噪音，而不是放大光子信 号。主要通过冷却探测器阵列来降噪。该设备包括称为“薄型背照式” 冷却CCD照相机的电荷耦合器件(CCD)照相机。“薄型背照式”是指 使用超薄背板来减少探测光子所需的路径长度，从而提高量子效率。光 子放大设备在光子击中检测屏之前对其进行放大。这类设备包括带有增 强器(例如微通道增强器)的CCD照相机。微通道增强器可以包括金 属通道的阵列，它与照相机的检测屏垂直，截面与其大小相同。所述微 通道阵列置于待成像的样品、对象或动物与照相机之间。多数进入阵列 通道的光子会在射出通道前接触通道的侧壁。加在阵列上的电压使得每 次光子碰撞时释放许多电子。这些碰撞中产生的电子以“鸟枪”模式射 出通道，并通过照相机进行检测。图像处理器对光电探测装置通过光子 计数所产生的信号进行处理，以生成例如可在显示器上显示或在图像打 印机上打印的图像。当图像转换成数字文件形式后，它们可通过多种图 像处理程序来处理并打印。
在一个实施方案中，对成像剂发射的光子进行计数。如果采用光子 计数法，则对光子发射的测量会产生一个数值阵列，代表图像处理器中 每个像素位置所检测到的光子数。使用这些数值生成图像：将光子计数 标准化(对预选的固定值标准化，或者对任一像素上检测到的最大数值 标准化)，并将标准化的数值转换成显示器上显示的亮度(灰度)或颜 色(假色)。在假色的表示法中，典型的颜色分配如下。0光子计数的像 素定为黑色，低计数的为蓝色，并随计数的增加而提高颜色的波长，最 高的光子计数值为红色。颜色在显示器上的位置代表光子发射的分布， 相应地也代表发光成像剂的位置。
为了给细胞中的核和/或染色体提供参照标准，可以生成从中测量光 子发射的细胞的全彩图或全灰度图，例如在微光下打开成像室或成像盒 的门并测量反射的光子。所述全彩图或全灰度图可以在测量光子发射之 前或之后生成。将光子发射图与所述全彩图或全灰度图叠加，产生相对 于细胞的光子发射合成图。
如果需要随时间跟踪成像剂的定位和/或信号，例如记录一种处理对 成像剂分布和/或定位的影响，那么可以按选定的时间间隔重复进行光 子发射测量或成像，以生成一系列图像。间隔可以短至数分钟或长至数 天或数星期。
可以通过多种方法分析通过本文所述方法产生的图像和/或使用本 文所述成像剂产生的图像。包括从简单的肉眼观察、脑力评估和/或打 印硬拷贝到复杂的数字图像分析等。对分析中所得信息的解读取决于意 图观察的事件和所使用的实体。
在一些实施方案中，含有成像剂的细胞中的荧光水平与参照荧光水 平相比的差异可指示所研究的细胞事件。所述参照水平可以是对照细 胞。本领域技术人员能够根据研究的类型来选择合适的对照。在一个说 明性实施方案中，当细胞事件导致细胞的核或染色体失去完整性时，荧 光水平的差异可能是相对于参考荧光水平的荧光强度降低。在另一个说 明性实施方案中，当细胞事件导致细胞的核或染色体失去完整性时，荧 光水平的差异可以是荧光定位相对于参考细胞内荧光定位的改变。
B.筛选分子药剂的方法
该方法可在体内实施，其中测试化合物(如生物效应分子)和成像 剂(或者编码成像剂的载体)在允许检测细胞中的成像剂的条件下与细 胞样品接触。因此，本文也涉及预测医学领域，该领域是将诊断测定、 预后测定、药物基因组学和对临床试验的监测用于预后(预测)目的， 来分析生物效应分子对得自受试者的细胞样品的影响。
在一些实施方案中，对存在或不存在生物效应分子(药物或其他分 子药剂)时核与染色体的状态进行比较。在一个实施方案中，所述方法 可监测药剂对细胞中一种或多种核相关特征的影响。这些测定可用于基 础药物筛选和临床试验。例如，药剂增强(或减弱)一种或多种核相关 特征的效力可在患有与所述核相关特征有联系的疾病的受试者中进行 监测。可以通过施用药剂并观察应答(如荧光在量和定位上的改变)来 鉴定影响一种或多种核相关改变的药剂。这样，所述一种或多种核相关 改变能够作为标记，指示受试者对该药剂的生理应答。相应地，可以在 用该药剂治疗个体之前和治疗过程中的任何时间点测定这种应答状态。
在一个实施方案中，可以在引入成像剂或编码成像剂的核酸之前、 同时或之后对细胞或细胞群施用药剂。然后可对所述细胞或细胞群进行 成像，以确定荧光的总体水平和/或荧光的定位。在任何一种情况中， 数据均可通过计数图像中(或图像中特定的位置中)的像素来量化。可 将图像和/或量化的像素数据与参照或对照细胞进行比较。参照细胞可 以是未接触该药剂的相同细胞类型。
在一个实施方案中，成像剂被用来观察生物效应分子对癌细胞的影 响。例如，癌症细胞通常丧失进行凋亡和受控细胞分裂及生长的能力， 这些事件可通过成像剂所示核与染色体的位置和特征来进行追踪。在另 一些实施方案中，使用本文公开的成像剂观察化合物(包括但不限于杀 虫剂、除草剂、小分子、毒素、核酸和多肽)对细胞的影响。可进行测 试的生物效应分子的详细种类在下文提供。
本文还提供用于在样品的细胞中测试化合物生物活性的方法。所述 方法(本文也称为“筛选测定”)可以用来鉴定促进实现一种或多种细 胞状态(如凋亡、能量情况、代谢、染色体结构或动态或者细胞骨架的 组装)的调节剂，即候选物或测试化合物或药剂(如肽、拟肽、小分子 或其他药物)。本文还包括本文所述筛选测定中鉴定的化合物。
在一个实施方案中，将测试化合物的组合文库与成像剂联合使用， 来评估化合物对一种或多种细胞的影响。所述测试化合物可使用本领域 公知的任何多种组合文库法获得，这些方法包括：生物文库、空间可寻 址并行(spatially addressable parallel)固相或液相文库、需要解卷积 的合成文库法、“一珠一化合物”文库法和利用亲和色谱筛选的合成文 库法。生物文库法仅限于肽文库，而其他四种方法可以应用到肽，非肽 寡聚体或小分子化合物文库。参阅如Lam，1997.Anticancer Drug Design 12：145。
化合物和/或生物混合物(例如真菌、细菌或藻类提取物)的文库是 本领域已知的，并可使用本文描述的任何测定来进行筛选。合成分子文 库的方法实例可以在本领域找到，比如：DeWitt等，1993.Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91 11422；Zuckermann等，1994.J.Med.Chem.37：2678；Cho等，1993. Science 261：1303；Carrell等，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33： 2059；Carell等，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061和Gallop 等，1994.J.Med.Chem.37：1233。
化合物文库可存在于溶液(如：Houghten，1992.Biotechniques 13： 412-421)或珠子(Lam，1991.Nature 354：82-84)、芯片(Fodor，Nature 364：555-556，1993)、细菌(Ladner，美国专利No.5,223,409)、孢子 (Ladner，U.S.Pat.No.5,233,409)、质粒(Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89：1865-1869，1992)或噬菌体(Scott和Smith，Science 249：386-390 1990)中；Devlin，Science 249：404-406，1990；Cwirla等，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.87：6378-6382，1990；Felici，J.Mol.Biol.222：301-310，1991； Ladner，美国专利No.5,233,409.)。
本发明方法中使用的测试化合物可以由任何已知的文库提供，比如 包含无机和有机化合物、肽、蛋白质、激素、抗体等的小分子文库。或 者，测试化合物可来自任何生物来源，例如植物、组织、体液(如血、 淋巴)等。如果分析生物来源的测试化合物的调控潜力，则可以在加入 细胞中之前将这些来源匀浆。因此，测试化合物是以确定并且可再现的 形式加入细胞中的。这样的匀浆来源可以是细胞悬液，并可包含细胞、 细胞部分等。如果不这样加入匀浆的材料，则可以在加入细胞中之前(或 在加入之后)通过常规生化方法(例如色谱，如亲和色谱(HPLC、FPLC 等)、尺寸排阻色谱等)或者细胞分选测定、抗体检测等方法从这些匀 浆来源中分离或提取。
在一个实施方案中，仅有一种测试化合物与细胞接触。但是，可以 向样品中加入一种以上的测试化合物加入，例如2-10、2-50、2-100或 更多种测试化合物。这类实施方案允许同时筛选几种测试化合物。
对宿主细胞中成像剂的(改变的)荧光信号的检测是通过任何一种 前述的荧光检测方法实现的。可以观察与未接触测试化合物相比，接触 了这种化合物的细胞中荧光信号强度或定位的变化，从而显示测试化合 物对细胞的影响。
在某些实施方案中，可以用本文描述的成像剂来确定化疗剂对一种 或多种细胞的影响。药剂或因子可以包括在对细胞应用时引起DNA损 伤的任何化学物质。化疗剂包括但不限于：5-氟尿嘧啶、博来霉素、白 消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、放线菌 素D、柔红霉素、多柔比星、雌激素受体结合剂、依托泊苷、(VP16)、 法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、美 法仑、丝裂霉素、长春瑞滨、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、雷洛昔 芬、他莫昔芬、紫杉醇、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反铂、长春碱 和氨甲喋呤、长春新碱或前述物质的任何类似物或衍生变体。多数化疗 剂归入下列种类：烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、皮质类固醇激素、 有丝分裂抑制剂和亚硝基脲类、激素剂、混杂剂(miscellaneous agent) 及其任何类似物或衍生变体。
化疗剂和给药方法、剂量等为本领域技术人员熟知(参阅如： “Physicians Desk Reference，”Goodman&Gilman’s“The Pharmacological Basis of Therapeutics”和“Remington’s Pharmaceutical Sciences，”，相关部分通过参考并入本文)，并可与本文 所述的成像剂结合。根据所分析细胞的情况或类型，一些剂量改变将是 必要的。在任何情况下，负责给药的人员将确定合适的剂量。本文描述 了具体化疗剂的实例。当然，所有这些药剂均用于说明而非限制，技术 人员可以对特定的病人或用途使用其他药剂。技术人员可参考 “Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版，第33章，特别是 624-652页。根据受治个体的情况，一些剂量变化将是必要的。在任何 情况下，负责给药的人员将确定合适的剂量。
烷化剂是直接与基因组DNA相互作用以阻止癌细胞增殖的药物。 这类化疗药物代表了影响细胞周期中所有阶段的药剂，也就是说，他们 不是阶段特异性的。烷化剂可包括但不限于氮芥、氮丙啶、甲基三聚氰 胺、烷基磺酸酯、亚硝基脲或三嗪。它们包括但不限于白消安、苯丁酸 氮芥、顺铂、环磷酰胺(cytoxan)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、双氯乙基甲 胺(氮芥)和美法仑。
抗代谢物破坏DNA和RNA的合成。与烷化剂不同，他们特异性地 在S期中影响细胞周期。抗代谢物可以分为多个种类，例如叶酸类似物、 嘧啶类似物和嘌呤类似物和相关的抑制性化合物。抗代谢物包括但不限 于5氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟达拉滨、吉西他滨和氨甲喋 呤。
天然产物通常指最早从天然来源分离得到并已鉴定为具有药理学 活性的化合物。这些化合物、其类似物和衍生物可以从天然来源分离、 化学合成或用任何本领域技术人员公知的技术重组产生。天然产物包括 下列种类，例如有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、酶和生物应答调节剂。
有丝分裂抑制剂包括植物碱和其他能够抑制细胞分裂或有丝分裂 所需的蛋白质合成的天然药剂。它们在细胞周期的特定时期发生作用。 有丝分裂抑制剂包括如多西紫杉醇、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉 醇、泰素、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。
紫杉烷是一类从红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离的相关化 合物。紫杉烷包括但不限于诸如多西紫杉醇和紫杉醇的化合物。紫杉醇 与微管蛋白结合(其位点不同于长春花碱类的结合位点)并促进微管的 组装。
长春花碱类是一类已经鉴定为具有药物活性的植物碱。它们包括 诸如长春花碱(VLB)和长春新碱。
抗肿瘤抗生素同时具有抗微生物活性和细胞毒素活性。这些药物 通过对酶和有丝分裂进行化学抑制或改变细胞膜来干扰DNA。这些试 剂不是阶段特异性的，因此它们在细胞周期的所有时期中都发挥作用。 抗肿瘤抗生素的例子包括但不限于博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、 多柔比星(阿霉素)、普卡霉素(光辉霉素)和伊达比星。
当皮质类固醇激素用于杀死癌细胞或延缓其生长时，则认为它们 是化疗药物。皮质类固醇激素能够增强其他化疗剂的效用，因而他们通 常在联合治疗中使用。泼尼松和地塞米松是皮质类固醇激素的实例。
黄体酮类例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮已经用 于子宫内膜癌和乳腺癌。雌激素类例如己烯雌酚和乙炔基雌二醇已经用 于诸如乳腺癌和前列腺癌的癌症。抗雌激素类例如他莫昔芬已经用于诸 如乳腺的癌症。雄激素类例如丙酸睾酮和氟甲睾酮已经用于治疗乳腺 癌。抗雄激素类例如氟他胺已经用于治疗前列腺癌。促性腺素释放激素 的类似物例如亮丙瑞林已经用于治疗前列腺癌。
根据其活性，一些化疗剂并不属于前述种类。它们包括但不限于 铂配位络合物、蒽二酮、取代脲、甲肼衍生物、肾上腺皮质激素抑制剂、 安吖啶、L-天冬酰胺酶和维A酸。它们也可用于本文描述的组合物和方 法之中。
蒽二酮(例如米托蒽醌)已经用于治疗急性粒细胞性白血病和乳 腺癌。取代脲(例如羟基脲)已经用于治疗慢性粒细胞性白血病、真性 红细胞增多、自发性凝血细胞增多和恶性黑素瘤。甲基肼衍生物(例如 丙卡巴肼(N-甲基肼，MIH)已经用于治疗霍奇金病。肾上腺皮质激素抑 制剂(例如米托坦)已经用于治疗肾上腺皮质癌，而氨鲁米特已经用于 治疗霍奇金病。
凋亡(或称为程序性细胞死亡)是对于正常胚胎发育、保持成体 组织的内稳态和抑制癌症发生非常重要的过程(Kerr等，1972)。在其 他系统中，已经证明Bcl-2家族的蛋白质和ICE样蛋白酶是非常重要的 凋亡的调节剂和效应物。发现与滤泡性淋巴瘤相关的Bcl-2蛋白在应答 于多种凋亡刺激而控制凋亡和提高细胞存活方面发挥重要作用 (Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto 等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。现在认为，在进化上保守的Bcl-2 蛋白是一个相关蛋白质家族的成员，这个家族可以归类为死亡激动剂或 死亡拮抗剂。已经显示，这些不同的家族成员具有和Bcl-2类似的功能， 或者与Bcl-2功能相反而促进细胞死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、 Bad、Harakiri)。促凋亡剂的非限制性实例包括短杆菌肽、爪蟾抗菌肽、 二甲双胍、防卫素和杀菌肽。
在某些实施方案中，所述分子药剂是血管发生剂，例如血管紧张 素、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原活化剂的抑制剂、组织金属 蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、血小板因子IV、IP-10、Gro-β、 血小板反应素、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧氨三唑、CM101、 马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2(Regeneron)、干扰素-α、 除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己 酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、制 管张素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子IV 或米诺环素。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本公开内容，这些实施例不应视为任何形 式的限制。
实施例1-HMGB1-EGFP融合蛋白构建体的制备
HMGB1cDNA序列是使用以下引物通过“基因组DNA剪接”策 略(An等，PLoS ONE 2(11)：e1179(2007))从基因组DNA中装配的。
表1.PCR引物
人HMGB1外显子引物(5′→3′)
人HMGB1重叠引物(5′→3′)
将HMGB1克隆到pGEM-T Easy(Promega)之后，对3个克隆 进行测序并与GenBank提供的野生型序列(NM_002128)进行比较。 将一个野生型克隆亚克隆进真核表达载体pEGFP-lac，得到5380bp的 构建体pHMGB1-EGFP，其中HMGB1基因与EGFP融合，并通过CMV 早期启动子和增强子表达(图1)。
实施例2-使活细胞的核成像
用如实施例1所述制备的pHMGB1-EGFP质粒转染人胚肾细胞 (HEK 293FT)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在平行的对照实验中， 用仅表达EGFP的质粒转染细胞。48小时之后，使用荧光显微镜观察 细胞。如图2的荧光显微镜图像所示，HMGB1-EGFP融合蛋白在两种 细胞中均定位到核中，从而使其成像。但是，在对照实验中，单独的 EGFP扩散到整个细胞，而无法提供可区分的核成像。因此，本文描述 的融合蛋白构建体可用于活细胞中核的成像。
实施例3-在活细胞中监测凋亡
用如实施例1所述制备的pHMGB1-EGFP质粒转染人胚肾细胞 (HEK 293FT)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在平行的对照实验中， 用仅表达EGFP的质粒转染细胞。24小时之后，从细胞培养基中除去 胎牛血清(FBS)来诱导凋亡。对照培养基中不除去FBS。再孵育48小时 之后，通过荧光显微镜观察细胞。如图3的荧光显微图像所示，FBS的 除去导致明显的细胞形状变圆(与凋亡相关)，以及因核的凋亡性破坏 导致的荧光扩散到整个细胞中。对照细胞保持其正常形状，荧光局限在 核内。因此，本文描述的融合蛋白构建体可用于在活细胞中监测凋亡。
实施例4-构建ptrEGFP-HMGB1表达质粒
如实施例1所述从基因组DNA中装配HMGB1 cDNA序列，并克 隆进真核表达载体pEGFP-lac，其中HMGB1基因与EGFP融合，并通 过截短的CMV早期启动子和增强子表达(图4，SEQ ID NO：2)。
实施例5-使活细胞中的染色体成像
用如实施例4所述制备的ptrEGFP-HMGB1质粒转染细胞(如 HEK 293FT或中国仓鼠卵巢细胞)。48小时之后，使用秋水仙素通过标 准核型分析步骤观察染色体。通过荧光显微术使细胞成像。结果示于图 5A和图5B，显示用ptrEGFP-HMGB1转染的细胞可提供可区分的染 色体成像。
实施例6-使接触生物效应分子的细胞成像
在此实施例中，用如实施例1所述制备的编码成像剂的核酸构建体 来转染培养的癌细胞系(例如选自表2的癌细胞系)。
表2.人类癌细胞系
细胞系 癌症类型 CCRF-CEM、HL-60(TB)、K-562、MOLT-4、 RPMI-8226、P388、P388/ADR 白血病 A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H226、 NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、 LXFL 529 非小细胞肺癌 COLO 205、HCC-2998、HCT-116、HCT-15、 HT29、KM12、SW-620、DLD-1、 KM20L2SNB-78、XF 498 结肠癌 SF-268、SF-295、SF-539、SNB-19、SNB-75、U251 CNS LOX IMVI、MALME-3M、M14、SK-MEL-2、 SK-MEL-28、SK-MEL-5、UACC-257、UACC-62、 RPMI-7951、M19-MEL 黑素瘤 IGR-OV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、 OVCAR-8、SK-OV-3 卵巢癌 786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF 393、 SN12C、TK-10、UO-31、RXF-631、SN12K1 肾癌 PC-3、DU-145、MCF7 前列腺癌 NCI/ADR-RES、MDA-MB-231、HS 578T、 MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T-47D、 MDA-MB-468 乳腺癌 DMS 114、SHP-77 小细胞肺癌
接着将转染细胞分成两份培养物。在一份培养物中，使细胞与适 当剂量的生物效应分子(如化疗剂或其他小分子，或者基于DNA或RNA 的药物)接触。第二份培养物中的细胞不进行处理。一段时间(1分钟、 30分钟、1小时、1天、1周等)之后，用荧光显微术使细胞成像。可 以观察核的完整性以及染色体的结构和动态。对处理细胞的染色体结构 和动态进行观察，并与未处理的细胞进行比较。通过测量图像中的像素 和/或荧光强度来量化数据。
与未处理对照培养物相比，经处理的培养物中细胞的荧光量减少 或位置改变(如扩散)可用于评估生物效应分子在癌细胞系中诱导凋亡 或其他核相关改变的效力。
等同方案
本发明不仅限于本申请中所述的具体实施方案，这些实施方案仅 旨在阐述本发明的单个方面。对于本领域技术人员而言显而易见的是， 可以进行许多修改和改变，而不偏离其构思和范围。结合上文的描述， 本发明范围内除本文所列举以外的功能等同的实施方案对于本领域技 术人员而言将是很明显的。这些修改和改变旨在与权利要求书所述等同 方案的完整范围一起落入权利要求书的范围内。应当理解，本发明不受 限于具体的方法、试剂、化合物组合物或生物体系，它们当然是可以变 化的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体的实施方案，而不 旨在限制。
对于本文中基本上任何单数和/或复数形式的术语而言，普通技术 人员可以将单数形式解释为复数形式和/或将复数形式解释为单数形 式，只要该上下文和/或应用中允许即可。为清楚起见，本文中也可能 明确表示了各种单数/复数形式的变换。
另外，当以马库什组的形式描述本发明的特征或方面时，本领域 技术人员会明白，本文也涵盖了该马库什组的任何个体成员或成员亚组 而言的描述。
就像本领域技术人员可以理解的那样，对于任何及全部目的，特别 是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还包括任何及全部可能的小 范围及其小范围的组合。任何列出的范围可以很容易地认为是对同一范围 分成相等的至少两部分、三部分、四部分、五部分、十部分等而进行了描 述。作为非限制性的实例，本文讨论过的每个范围可以容易地分为前三分 之一、中间三分之一和后三分之一等。本领域技术人员还会理解，词语例 如“多至”、“至少”、“多于”、“少于”等包括所提到的数值，并指可以如 上所述分成小范围的范围。最后，本领域技术人员会理解，范围包括每个 个体成员。因此，例如，含有1-3个细胞的组是指含有1个、2个或3个 细胞的组。类似的，含有1-5个细胞的组是指含有1个、2个、3个、4个 或5个细胞的组，依此类推。
尽管本文公开了多个方面和实施方案，但其他方面和实施方案对于 本领域技术人员来说也是显而易见的。本文公开的多个方面和实施方案仅 用于说明目的而非限制，真正的范围和构思由以下的权利要求进行说明。
序列表
<110>童贻刚
安小平
张昕
<120>用于使活细胞中核与染色体成像的融合蛋白
<130>091619-0125-0126
<140>
<141>
<160>22
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>5380
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成构建体
<400>1
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600
ccggactcag atctcgagct caagcttcga attcgattat gggcaaagga gatcctaaga 660
agccgagagg caaaatgtca tcatatgcat tttttgtgca aacttgtcgg gaggagcata 720
agaagaagca cccagatgct tcagtcaact tctcagagtt ttctaagaag tgctcagaga 780
ggtggaagac catgtctgct aaagagaaag gaaaatttga agatatggca aaagcggaca 840
aggcccgtta tgaaagagaa atgaaaacct atatccctcc caaaggggag acaaaaaaga 900
agttcaagga tcccaatgca cccaagaggc ctccttcggc cttcttcctc ttctgctctg 960
agtatcgccc aaaaatcaaa ggagaacatc ctggcctgtc cattggtgat gttgcgaaga 1020
aactgggaga gatgtggaat aacactgctg cagatgacaa gcagccttat gaaaagaagg 1080
ctgcgaagct gaaggaaaaa tacgaaaagg atattgctgc atatcgagct aaaggaaagc 1140
ctgatgcagc aaaaaaggga gttgtcaagg ctgaaaaaag caagaaaaag aaggaagagg 1200
aggaagatga ggaagatgaa gaggatgagg aggaggagga agatgaagaa gatgaagatg 1260
aagaagaaga tgatgatgat gaatcgtcga cggtaccgcg ggcccgggat ccaccggtcg 1320
ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 1380
tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 1440
cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 1500
ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca 1560
tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 1620
tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 1680
ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 1740
ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 1800
agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 1860
tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 1920
accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 1980
tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 2040
agtaaagcgg ccgcgactct agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 2100
tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 2160
tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 2220
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 2280
tgtatcttaa ggcgtaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt 2340
gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa 2400
aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa 2460
agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac 2520
gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga 2580
accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa 2640
aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc 2700
tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcaggtggca 2760
cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 2820
tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 2880
gtcctgaggc ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc 2940
aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg 3000
tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 3060
agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 3120
ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 3180
ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa 3240
agatcgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 3300
caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 3360
tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 3420
tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 3480
ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 3540
gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 3600
ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 3660
ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 3720
aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 3780
aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 3840
gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 3900
gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 3960
ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 4020
ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct 4080
ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac 4140
cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat 4200
cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cctaggggga ggctaactga 4260
aacacggaag gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg acggcaataa aaagacagaa 4320
taaaacgcac ggtgttgggt cgtttgttca taaacgcggg gttcggtccc agggctggca 4380
ctctgtcgat accccaccga gaccccattg gggccaatac gcccgcgttt ctcccttttc 4440
cccaccccac cccccaagtt cgggtgaagg cccagggctc gcagccaacg tcggggcggc 4500
aggccctgcc atagcctcag gttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 4560
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 4620
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 4680
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 4740
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 4800
cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 4860
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 4920
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 4980
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 5040
caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 5100
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 5160
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 5220
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 5280
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 5340
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgccatgcat 5380
<210>2
<211>4883
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成构建体
<400>2
gcaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 60
taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ctaccggact cagatctcga 120
gctcaagctt cgaattcgat tatgggcaaa ggagatccta agaagccgag aggcaaaatg 180
tcatcatatg cattttttgt gcaaacttgt cgggaggagc ataagaagaa gcacccagat 240
gcttcagtca acttctcaga gttttctaag aagtgctcag agaggtggaa gaccatgtct 300
gctaaagaga aaggaaaatt tgaagatatg gcaaaagcgg acaaggcccg ttatgaaaga 360
gaaatgaaaa cctatatccc tcccaaaggg gagacaaaaa agaagttcaa ggatcccaat 420
gcacccaaga ggcctccttc ggccttcttc ctcttctgct ctgagtatcg cccaaaaatc 480
aaaggagaac atcctggcct gtccattggt gatgttgcga agaaactggg agagatgtgg 540
aataacactg ctgcagatga caagcagcct tatgaaaaga aggctgcgaa gctgaaggaa 600
aaatacgaaa aggatattgc tgcatatcga gctaaaggaa agcctgatgc agcaaaaaag 660
ggagttgtca aggctgaaaa aagcaagaaa aagaaggaag aggaggaaga tgaggaagat 720
gaagaggatg aggaggagga ggaagatgaa gaagatgaag atgaagaaga agatgatgat 780
gatgaatcgt cgacggtacc gcgggcccgg gatccaccgg tcgccaccat ggtgagcaag 840
ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 900
ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 960
ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 1020
ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 1080
ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 1140
ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 1200
gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 1260
aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 1320
aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 1380
cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 1440
cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 1500
gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaaag cggccgcgac 1560
tctagatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc 1620
cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta 1680
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 1740
ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct taaggcgtaa 1800
attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 1860
tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata 1920
gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 1980
gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 2040
tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 2100
cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 2160
aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 2220
cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 2280
cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 2340
caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtcctga ggcggaaaga 2400
accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 2460
gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct 2520
ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc 2580
ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg 2640
gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc 2700
agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaagatcga tcaagagaca 2760
ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 2820
tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 2880
gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 2940
ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 3000
gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 3060
ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 3120
atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 3180
caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 3240
caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc 3300
aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg 3360
aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg 3420
gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc 3480
gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc 3540
gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg 3600
accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa 3660
ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc 3720
tcatgctgga gttcttcgcc caccctaggg ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa 3780
taccggaagg aacccgcgct atgacggcaa taaaaagaca gaataaaacg cacggtgttg 3840
ggtcgtttgt tcataaacgc ggggttcggt cccagggctg gcactctgtc gataccccac 3900
cgagacccca ttggggccaa tacgcccgcg tttcttcctt ttccccaccc caccccccaa 3960
gttcgggtga aggcccaggg ctcgcagcca acgtcggggc ggcaggccct gccatagcct 4020
caggttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 4080
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 4140
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 4200
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 4260
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 4320
atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 4380
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 4440
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 4500
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 4560
tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 4620
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 4680
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 4740
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 4800
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 4860
ataaccgtat taccgccatg cat 4883
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>3
ctgattttac ggaggttgat gtc 23
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>4
tcctttctct ttagcagaca tggt 24
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>5
aggtaagagg gcttaaaaca tgcta 25
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>6
cccacccaac aggaatttta tacta 25
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>7
tatagtattt gcaccctgtc caatg 25
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>8
accctaattt atttggtcct ctgc 24
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>9
ggatctacag atacgtgata ttttgg 26
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>10
gacagggcta tctaaagaca cattc 25
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>11
atgggcaaag gagatcct 18
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>12
agcagacatg gtcttccacc tctctgagca 30
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>13
ggaagaccat gtctgctaaa ga 22
<210>14
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>14
cttgggtgca ttgggat 17
<210>15
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>15
cccaatgcac ccaagaggcc tccttcggcc ttcttcct 38
<210>16
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>16
gcagcaatat ccttttcgta tttttccttc a 31
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>17
acgaaaagga tattgctgca tatcga 26
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>18
tgcgctagaa ccaactta 18
<210>19
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>19
Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210>20
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>20
Lys Arg Pro Ala Ala Thr LysLysAla Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210>21
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>21
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210>22
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>22
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
实施例1-HMGB1-EGFP融合蛋白构建体的制备
HMGB1cDNA序列是使用以下引物通过“基因组DNA剪接”策 略(An等，PLoS ONE 2(11)：e1179(2007))从基因组DNA中装配的。
表1.PCR引物
人HMGB1外显子引物(5′→3′)
人HMGB1重叠引物(5′→3′)
将HMGB1克隆到pGEM-T Easy(Promega)之后，对3个克隆 进行测序并与GenBank提供的野生型序列(NM_002128)进行比较。 将一个野生型克隆亚克隆进真核表达载体pEGFP-lac，得到5380bp的 构建体pHMGB1-EGFP，其中HMGB1基因与EGFP融合，并通过CMV 早期启动子和增强子表达(图1)。
实施例2-使活细胞的核成像
用如实施例1所述制备的pHMGB1-EGFP质粒转染人胚肾细胞 (HEK 293FT)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在平行的对照实验中， 用仅表达EGFP的质粒转染细胞。48小时之后，使用荧光显微镜观察 细胞。如图2的荧光显微镜图像所示，HMGB1-EGFP融合蛋白在两种 细胞中均定位到核中，从而使其成像。但是，在对照实验中，单独的 EGFP扩散到整个细胞，而无法提供可区分的核成像。因此，本文描述 的融合蛋白构建体可用于活细胞中核的成像。
实施例3-在活细胞中监测凋亡
用如实施例1所述制备的pHMGB1-EGFP质粒转染人胚肾细胞 (HEK 293FT)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在平行的对照实验中， 用仅表达EGFP的质粒转染细胞。24小时之后，从细胞培养基中除去 胎牛血清(FBS)来诱导凋亡。对照培养基中不除去FBS。再孵育48小时 之后，通过荧光显微镜观察细胞。如图3的荧光显微图像所示，FBS的 除去导致明显的细胞形状变圆(与凋亡相关)，以及因核的凋亡性破坏 导致的荧光扩散到整个细胞中。对照细胞保持其正常形状，荧光局限在 核内。因此，本文描述的融合蛋白构建体可用于在活细胞中监测凋亡。
实施例4-构建ptrEGFP-HMGB1表达质粒
如实施例1所述从基因组DNA中装配HMGB1 cDNA序列，并克 隆进真核表达载体pEGFP-lac，其中HMGB1基因与EGFP融合，并通 过截短的CMV早期启动子和增强子表达(图4，SEQ ID NO：2)。
实施例5-使活细胞中的染色体成像
用如实施例4所述制备的ptrEGFP-HMGB1质粒转染细胞(如 HEK 293FT或中国仓鼠卵巢细胞)。48小时之后，使用秋水仙素通过标 准核型分析步骤观察染色体。通过荧光显微术使细胞成像。结果示于图 5A和图5B，显示用ptrEGFP-HMGB1转染的细胞可提供可区分的染 色体成像。
实施例6-使接触生物效应分子的细胞成像
在此实施例中，用如实施例1所述制备的编码成像剂的核酸构建体 来转染培养的癌细胞系(例如选自表2的癌细胞系)。
表2.人类癌细胞系
细胞系 癌症类型 CCRF-CEM、HL-60(TB)、K-562、MOLT-4、 RPMI-8226、P388、P388/ADR 白血病 A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H226、 NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、 LXFL 529 非小细胞肺癌 COLO 205、HCC-2998、HCT-116、HCT-15、 HT29、KM12、SW-620、DLD-1、 KM20L2SNB-78、XF 498 结肠癌 SF-268、SF-295、SF-539、SNB-19、SNB-75、U251 CNS LOX IMVI、MALME-3M、M14、SK-MEL-2、 SK-MEL-28、SK-MEL-5、UACC-257、UACC-62、 RPMI-7951、M19-MEL 黑素瘤 IGR-OV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、 OVCAR-8、SK-OV-3 卵巢癌 786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF 393、 SN12C、TK-10、UO-31、RXF-631、SN12K1 肾癌 PC-3、DU-145、MCF7 前列腺癌 NCI/ADR-RES、MDA-MB-231、HS 578T、 MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T-47D、 MDA-MB-468 乳腺癌 DMS 114、SHP-77 小细胞肺癌
接着将转染细胞分成两份培养物。在一份培养物中，使细胞与适 当剂量的生物效应分子(如化疗剂或其他小分子，或者基于DNA或RNA 的药物)接触。第二份培养物中的细胞不进行处理。一段时间(1分钟、 30分钟、1小时、1天、1周等)之后，用荧光显微术使细胞成像。可 以观察核的完整性以及染色体的结构和动态。对处理细胞的染色体结构 和动态进行观察，并与未处理的细胞进行比较。通过测量图像中的像素 和/或荧光强度来量化数据。
与未处理对照培养物相比，经处理的培养物中细胞的荧光量减少 或位置改变(如扩散)可用于评估生物效应分子在癌细胞系中诱导凋亡 或其他核相关改变的效力。
等同方案
本发明不仅限于本申请中所述的具体实施方案，这些实施方案仅 旨在阐述本发明的单个方面。对于本领域技术人员而言显而易见的是， 可以进行许多修改和改变，而不偏离其构思和范围。结合上文的描述， 本发明范围内除本文所列举以外的功能等同的实施方案对于本领域技 术人员而言将是很明显的。这些修改和改变旨在与权利要求书所述等同 方案的完整范围一起落入权利要求书的范围内。应当理解，本发明不受 限于具体的方法、试剂、化合物组合物或生物体系，它们当然是可以变 化的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体的实施方案，而不 旨在限制。
对于本文中基本上任何单数和/或复数形式的术语而言，普通技术 人员可以将单数形式解释为复数形式和/或将复数形式解释为单数形 式，只要该上下文和/或应用中允许即可。为清楚起见，本文中也可能 明确表示了各种单数/复数形式的变换。
另外，当以马库什组的形式描述本发明的特征或方面时，本领域 技术人员会明白，本文也涵盖了该马库什组的任何个体成员或成员亚组 而言的描述。
就像本领域技术人员可以理解的那样，对于任何及全部目的，特别 是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还包括任何及全部可能的小 范围及其小范围的组合。任何列出的范围可以很容易地认为是对同一范围 分成相等的至少两部分、三部分、四部分、五部分、十部分等而进行了描 述。作为非限制性的实例，本文讨论过的每个范围可以容易地分为前三分 之一、中间三分之一和后三分之一等。本领域技术人员还会理解，词语例 如“多至”、“至少”、“多于”、“少于”等包括所提到的数值，并指可以如 上所述分成小范围的范围。最后，本领域技术人员会理解，范围包括每个 个体成员。因此，例如，含有1-3个细胞的组是指含有1个、2个或3个 细胞的组。类似的，含有1-5个细胞的组是指含有1个、2个、3个、4个 或5个细胞的组，依此类推。
尽管本文公开了多个方面和实施方案，但其他方面和实施方案对于 本领域技术人员来说也是显而易见的。本文公开的多个方面和实施方案仅 用于说明目的而非限制，真正的范围和构思由以下的权利要求进行说明。
序列表
<110>童贻刚
安小平
张昕
<120>用于使活细胞中核与染色体成像的融合蛋白
<130>091619-0125-0126
<140>
<141>
<160>22
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>5380
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成构建体
<400>1
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600
ccggactcag atctcgagct caagcttcga attcgattat gggcaaagga gatcctaaga 660
agccgagagg caaaatgtca tcatatgcat tttttgtgca aacttgtcgg gaggagcata 720
agaagaagca cccagatgct tcagtcaact tctcagagtt ttctaagaag tgctcagaga 780
ggtggaagac catgtctgct aaagagaaag gaaaatttga agatatggca aaagcggaca 840
aggcccgtta tgaaagagaa atgaaaacct atatccctcc caaaggggag acaaaaaaga 900
agttcaagga tcccaatgca cccaagaggc ctccttcggc cttcttcctc ttctgctctg 960
agtatcgccc aaaaatcaaa ggagaacatc ctggcctgtc cattggtgat gttgcgaaga 1020
aactgggaga gatgtggaat aacactgctg cagatgacaa gcagccttat gaaaagaagg 1080
ctgcgaagct gaaggaaaaa tacgaaaagg atattgctgc atatcgagct aaaggaaagc 1140
ctgatgcagc aaaaaaggga gttgtcaagg ctgaaaaaag caagaaaaag aaggaagagg 1200
aggaagatga ggaagatgaa gaggatgagg aggaggagga agatgaagaa gatgaagatg 1260
aagaagaaga tgatgatgat gaatcgtcga cggtaccgcg ggcccgggat ccaccggtcg 1320
ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 1380
tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 1440
cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 1500
ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca 1560
tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 1620
tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 1680
ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 1740
ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 1800
agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 1860
tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 1920
accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 1980
tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 2040
agtaaagcgg ccgcgactct agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 2100
tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 2160
tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 2220
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 2280
tgtatcttaa ggcgtaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt 2340
gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa 2400
aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa 2460
agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac 2520
gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga 2580
accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa 2640
aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc 2700
tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcaggtggca 2760
cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 2820
tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 2880
gtcctgaggc ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc 2940
aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg 3000
tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 3060
agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 3120
ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 3180
ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa 3240
agatcgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 3300
caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 3360
tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 3420
tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 3480
ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 3540
gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 3600
ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 3660
ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 3720
aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 3780
aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 3840
gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 3900
gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 3960
ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 4020
ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct 4080
ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac 4140
cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat 4200
cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cctaggggga ggctaactga 4260
aacacggaag gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg acggcaataa aaagacagaa 4320
taaaacgcac ggtgttgggt cgtttgttca taaacgcggg gttcggtccc agggctggca 4380
ctctgtcgat accccaccga gaccccattg gggccaatac gcccgcgttt ctcccttttc 4440
cccaccccac cccccaagtt cgggtgaagg cccagggctc gcagccaacg tcggggcggc 4500
aggccctgcc atagcctcag gttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 4560
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 4620
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 4680
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 4740
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 4800
cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 4860
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 4920
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 4980
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 5040
caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 5100
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 5160
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 5220
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 5280
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 5340
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgccatgcat 5380
<210>2
<211>4883
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成构建体
<400>2
gcaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 60
taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagcg ctaccggact cagatctcga 120
gctcaagctt cgaattcgat tatgggcaaa ggagatccta agaagccgag aggcaaaatg 180
tcatcatatg cattttttgt gcaaacttgt cgggaggagc ataagaagaa gcacccagat 240
gcttcagtca acttctcaga gttttctaag aagtgctcag agaggtggaa gaccatgtct 300
gctaaagaga aaggaaaatt tgaagatatg gcaaaagcgg acaaggcccg ttatgaaaga 360
gaaatgaaaa cctatatccc tcccaaaggg gagacaaaaa agaagttcaa ggatcccaat 420
gcacccaaga ggcctccttc ggccttcttc ctcttctgct ctgagtatcg cccaaaaatc 480
aaaggagaac atcctggcct gtccattggt gatgttgcga agaaactggg agagatgtgg 540
aataacactg ctgcagatga caagcagcct tatgaaaaga aggctgcgaa gctgaaggaa 600
aaatacgaaa aggatattgc tgcatatcga gctaaaggaa agcctgatgc agcaaaaaag 660
ggagttgtca aggctgaaaa aagcaagaaa aagaaggaag aggaggaaga tgaggaagat 720
gaagaggatg aggaggagga ggaagatgaa gaagatgaag atgaagaaga agatgatgat 780
gatgaatcgt cgacggtacc gcgggcccgg gatccaccgg tcgccaccat ggtgagcaag 840
ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 900
ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 960
ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 1020
ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 1080
ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 1140
ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 1200
gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 1260
aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 1320
aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 1380
cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 1440
cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 1500
gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaaag cggccgcgac 1560
tctagatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc 1620
cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta 1680
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 1740
ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct taaggcgtaa 1800
attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 1860
tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata 1920
gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 1980
gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 2040
tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 2100
cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 2160
aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 2220
cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 2280
cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 2340
caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtcctga ggcggaaaga 2400
accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 2460
gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct 2520
ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc 2580
ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg 2640
gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc 2700
agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaagatcga tcaagagaca 2760
ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 2820
tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 2880
gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 2940
ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 3000
gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 3060
ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 3120
atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 3180
caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 3240
caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc 3300
aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg 3360
aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg 3420
gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc 3480
gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc 3540
gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg 3600
accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa 3660
ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc 3720
tcatgctgga gttcttcgcc caccctaggg ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa 3780
taccggaagg aacccgcgct atgacggcaa taaaaagaca gaataaaacg cacggtgttg 3840
ggtcgtttgt tcataaacgc ggggttcggt cccagggctg gcactctgtc gataccccac 3900
cgagacccca ttggggccaa tacgcccgcg tttcttcctt ttccccaccc caccccccaa 3960
gttcgggtga aggcccaggg ctcgcagcca acgtcggggc ggcaggccct gccatagcct 4020
caggttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 4080
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 4140
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 4200
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 4260
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 4320
atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 4380
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 4440
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 4500
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 4560
tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 4620
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 4680
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 4740
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 4800
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 4860
ataaccgtat taccgccatg cat 4883
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>3
ctgattttac ggaggttgat gtc 23
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>4
tcctttctct ttagcagaca tggt 24
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>5
aggtaagagg gcttaaaaca tgcta 25
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>6
cccacccaac aggaatttta tacta 25
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>7
tatagtattt gcaccctgtc caatg 25
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>8
accctaattt atttggtcct ctgc 24
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>9
ggatctacag atacgtgata ttttgg 26
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>10
gacagggcta tctaaagaca cattc 25
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>11
atgggcaaag gagatcct 18
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>12
agcagacatg gtcttccacc tctctgagca 30
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>13
ggaagaccat gtctgctaaa ga 22
<210>14
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>14
cttgggtgca ttgggat 17
<210>15
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>15
cccaatgcac ccaagaggcc tccttcggcc ttcttcct 38
<210>16
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>16
gcagcaatat ccttttcgta tttttccttc a 31
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>17
acgaaaagga tattgctgca tatcga 26
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>18
tgcgctagaa ccaactta 18
<210>19
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>19
Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210>20
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>20
Lys Arg Pro Ala Ala Thr LysLysAla Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210>21
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>21
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210>22
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>22
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 玉米田除草剂组合物及其制备方法与应用 | 2020-07-18 | 1 |
| 触发响应性链碎裂聚合物 | 2020-09-28 | 1 |
| 一种金花菌铁观音茶的制作方法 | 2020-08-25 | 1 |
| 一种花田用中药复合型除草剂 | 2020-10-20 | 1 |
| 一种合成2,6-二氯-4-三氟甲基苯胺的方法 | 2022-12-18 | 1 |
| 农业种植用可分散油悬浮剂型除草剂手持式喷洒装置 | 2020-05-29 | 0 |
| 一种三行花生覆膜播种机 | 2021-04-06 | 0 |
| 3-(5,6-디하이드로-1,4,2-디옥사진-3-일)-Ｎ-[(4,6-디메톡시피리미딘-2-일)카바모일]피리딘-2-설폰아미드의 선택 염, 그의 제조방법, 및 제초제 및 식물 성장 조절제로서의 그의 용도 | 2023-05-15 | 0 |
| HERBICIDAL ISOXAZOLINE DERIVATIVES | 2023-02-23 | 0 |
| 双唑草酮E晶型及其制备方法和用途 | 2020-06-30 | 1 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈