一种嗅鞘细胞的纯化培养方法
阅读：980发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种嗅鞘细胞的纯化培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种嗅鞘细胞的纯化培养方法。本发明通过在培养早期阶段采用Forskolin增加了部分嗅鞘细胞的贴壁能 力 ，再利用低浓度胰酶消化后，去除其他类型的细胞，对留下的细胞进行培养扩增后，采用正常浓度的胰酶消化后重悬培养，通过上述方法，得到的嗅鞘细胞亚型单一、纯度大于98％且细胞能够长期存活，因此能够为脊髓损伤的病人提供稳定的 种子 细胞，为解决嗅鞘细胞移植 治疗 效果不稳定及并发症多的问题提供一种新的手段。，下面是一种嗅鞘细胞的纯化培养方法专利的具体信息内容。
1.一种嗅鞘细胞的纯化培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将新获取的嗅鞘细胞经消化处理后，采用完全培养基进行悬浮培养20～30h，得到细胞悬液；
S2、将细胞悬液进行贴壁培养，待细胞完全贴壁后，更换含有1～10μM Forskolin的完全培养基进行贴壁培养，待细胞长满培养皿后，用0.01～0.15％胰酶消化1～5min后停止消化，并采用缓冲液清洗培养皿；
S3、采用含有1～10μM Forskolin的完全培养基继续培养S2培养皿底部粘附的细胞，待细胞长满培养皿后，采用0.20～0.30％胰酶消化1～5min，将细胞吹打下来后停止消化，将细胞离心后采用含有1～10μM Forskolin的完全培养基重悬细胞制备得到细胞悬液；
S4、重复S2、S3步骤至得到纯化的嗅鞘细胞。
2.根据权利要求1所述的纯化培养方法，其特征在于，所述的完全培养基为含有10％新生胎牛血清的DMEM/F12培养基。
3.根据权利要求2所述的纯化培养方法，其特征在于，所述的完全培养基中包含谷氨酰胺、青霉素和链霉素。
4.根据权利要求1所述的纯化培养方法，其特征在于，所述的停止消化采用的是含有
2％新生胎牛血清的DMEM/F12培养基。
5.根据权利要求1所述的纯化培养方法，其特征在于，S1中，悬浮培养采用的是未进行包被的培养皿。
6.根据权利要求1所述的纯化培养方法，其特征在于，S2、S3中，贴壁培养采用的是包被PLL的培养皿。
7.根据权利要求1所述的纯化培养方法，其特征在于，含有Forskolin的完全培养基中Forskolin的浓度为3～7μM。
8.根据权利要求1所述的纯化培养方法，其特征在于，S2步骤中，待细胞长满培养皿后，优选采用0.05～0.10％胰酶消化2～3min后停止消化。
9.根据权利要求8所述的纯化培养方法，其特征在于，所述的胰酶中含有EDTA。
10.根据权利要求1所述的纯化培养方法，其特征在于，S4中，重复S2、S3步骤为3～6次。
一种嗅鞘细胞的纯化培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种嗅鞘细胞的纯化培养方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术
[0002] 脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重的中枢神经系统疾病,具有高致残率、青壮年多发等特点，不仅给患者带来严重的心理和生理伤害,还会给家庭及社会带来巨大的经济负担，流行病学资料显示,SCI世界年发病率较高，每百万人口为3.6～195.4例，因此脊髓损伤治疗显得尤为重要。
[0003] 嗅鞘细胞是一类特殊的神经胶质细胞，主要存在于嗅粘膜和嗅球中，对嗅觉神经系统的持续再生起了重要的作用，它具有促进轴突再生、神经营养，成髓鞘化等功能。它主要有星形胶质样和施旺细胞样两种亚类，星形胶质样嗅鞘细胞形状呈扁平型，而施旺样嗅鞘细胞呈双极梭形，这两种亚型在一定套件下能够相互转换。
[0004] 近年来，嗅鞘细胞移植是脊髓损伤修复的前言领域。很多研究报道了移植嗅鞘细胞能够使脊髓损伤病人恢复部分感觉功能及运动功能，并且发现嗅鞘细胞有与施旺细胞类似的成髓鞘能力。然而，临床研究也发现，由于嗅鞘细胞纯度不一，导致嗅鞘细胞移植后病人治疗效果不稳定且出现了较多的并发症，因此寻找一种高效的纯化嗅鞘细胞的方法就迫在眉睫。目前纯化嗅鞘细胞的方法有很多，主要的原理包括：利用细胞粘附差异筛选，细胞表面抗原筛选、不同胰酶浓度筛选以及利用不同选择性培养基进行筛选。随着细胞纯化方法的不断改进，嗅鞘细胞的活力和纯度也因此提高。
[0005] 目前，有很多不同的方法来纯化嗅鞘细胞，不过各有优缺点。Nash等人利用细胞粘附差异来纯化嗅鞘细胞的方法比较简单，获得的嗅鞘细胞的纯度能够达到93％以上，但是纯度随着传代次数的增加不断下降，因此不能够为细胞移植提供大量、稳定的移植细胞。免疫粘附法、荧光激活细胞分类等方法需要使用抗体进行筛选，操作复杂，成本较高，并且对细胞的活力有较大的影响。目前利用细胞粘附差异和结合选择性培养基的纯化方法，能够保持嗅鞘细胞高纯度的同时，保持嗅鞘细胞的活力。Liudmila N等人发现，使用差速贴壁方法后，单纯使用10％FBS DMEM/F12培养基培养基一周后，嗅鞘细胞的纯度及下降至40％。
[0006] Forskolin是一种腺苷酸环化酶激活剂，可以通过细胞膜，激活腺苷酸环化酶，使cAMP水平增高，进而激活蛋白激酶A(PKA)，活化的PKA可以磷酸化多种转录因子，进而调控细胞的粘附、增殖、分化。有研究表明，Forskolin作为有丝分裂原能够促进嗅鞘细胞的增殖，但是Forskolin与不同细胞增殖剂组合对于嗅鞘细胞的纯度及细胞活力影响也较大。利用Forskolin和GGF2(神经营养因子2)的选择性培养基，却能够使嗅鞘细胞保持纯度在90％-95％，并且能够存活较长时间(至少十一周)；使用Forskolin和BPE的组合时，嗅鞘细胞的的纯度却在2周内迅速下降。这些结果说明Forskolin和不同细胞增殖剂对嗅鞘细胞有不同影响。目前嗅鞘细胞的纯化中的主要问题是纯化后的细胞随着细胞的传代纯度不断下降、活力不断下降以及移植的嗅鞘细胞的稳定性较差，还没有一种嗅鞘细胞纯化方法能够获得纯度高且能够长期存活的嗅鞘细胞。
发明内容
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供一种嗅鞘细胞的纯化培养方法，通过在培养早期阶段采用Forskolin增加了部分嗅鞘细胞的贴壁能力，再利用低浓度胰酶消化后，去除其他类型的细胞，对留下的细胞进行培养扩增后，采用正常浓度的胰酶消化后重悬培养，通过上述方法，得到的嗅鞘细胞亚型单一、纯度大于98％且细胞能够长期存活，因此能够为脊髓损伤的病人提供稳定的种子细胞，为解决嗅鞘细胞移植治疗效果不稳定及并发症多的问题提供一种新的手段。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种嗅鞘细胞的纯化培养方法，包括如下步骤：
[0009] S1、将新获取的嗅鞘细胞经消化处理后，采用完全培养基进行悬浮培养20～30h，得到细胞悬液；
[0010] S2、将细胞悬液进行贴壁培养，待细胞完全贴壁后，更换含有1～10μM Forskolin的完全培养基进行贴壁培养，待细胞长满培养皿后，用0.01～0.15％胰酶消化1～5min后停止消化，并采用缓冲液清洗培养皿；
[0011] S3、采用含有1～10μM Forskolin的完全培养基继续培养S2培养皿底部粘附的细胞，待细胞长满培养皿后，采用0.20～0.30％胰酶消化1～5min，将细胞吹打下来后停止消化，将细胞离心后采用含有1～10μM Forskolin的完全培养基重悬细胞制备得到细胞悬液；
[0012] S4、重复S2、S3步骤至得到纯化的嗅鞘细胞。
[0013] 进一步地，所述的完全培养基为含有10％新生胎牛血清的DMEM/F12培养基。
[0015] 进一步地，所述的停止消化采用的是含有2％新生胎牛血清的DMEM/F12培养基。
[0016] 进一步地，S1中，悬浮培养采用的是未进行包被的培养皿。
[0017] 进一步地，S2、S3中，贴壁培养采用的是包被PLL的培养皿。
[0018] 进一步地，含有Forskolin的完全培养基中Forskolin的浓度为3～7μM。
[0019] 进一步地，S2步骤中，待细胞长满培养皿后，优选采用0.05～0.10％胰酶消化2～3min后停止消化。
[0020] 进一步地，所述的胰酶中含有EDTA。
[0021] 进一步地，S4中，重复S2、S3步骤为3～6次。
[0022] 进一步地，所述的嗅鞘细胞的纯化培养方法，具体包括如下步骤：
[0023] S1、将新取出的嗅球清洗后分离表面的血管和脑膜，剪碎至0.8～1.2mm3，加入0.25％胰酶消化15min，加入2％FBS培养基终止消化2min，离心去上清后采用10％FBS完全培养基重悬，过细胞筛后以10^5～7的密度接种至10％FBS完全培养基中进行悬浮培养24h，得到细胞悬液；
[0024] S2、将细胞悬液更换包被PLL的培养皿中进行差速贴壁培养，待细胞完全贴壁后，更换含有3～7μM Forskolin的10％FBS完全培养基进行差速贴壁培养，1.5～2.5天更换一次培养基，待细胞长满培养皿后，用0.05～0.10％胰酶消化2～3min，加入2％FBS培养基终止消化，采用移液枪吹打培养皿4～5次，并采用PBS缓冲液清洗培养皿1～3遍；
[0025] S3、采用含有3～7μM Forskolin的10％FBS完全培养基继续培养S2培养皿底部粘附的细胞，待细胞长满培养皿后，采用0.20～0.30％胰酶消化1～5min，将细胞吹打下来后加入2％FBS培养基停止消化，将细胞离心去上清后采用含有3～7μM Forskolin的10％FBS完全培养基重悬细胞制备得到细胞悬液；
[0026] S4、重复S2、S3步骤3～6次至得到纯化的嗅鞘细胞。
[0027] 本发明发现Forskolin能够增加部分嗅鞘细胞的粘附能力，利用低浓度胰酶(含EDTA，小于0.1％)消化后，粘附性强的嗅鞘细胞能够贴附在皿底，而其他类型的细胞则被胰酶消化掉。对留下的细胞再培养时，这类细胞迅速增殖，比例不断扩大，当长满皿后，再重新接种到新的包被有PLL的小皿上进行培养。经过2-3次相同方法纯化后，对这类细胞进行了P75、S100等嗅鞘细胞相关标志物检测，发现这些细胞能够同时表达P75和S100，而且该类细胞也呈现两种形态，一种是星形胶质样的扁平型和施旺样的双极形，两者形态能够进行转换。细胞处于增殖的时候，扁平型的星形胶质样嗅鞘细胞比例较高出现，当细胞密度变大时，细胞会转变为双极的施旺样嗅鞘细胞。有研究表明施旺样的嗅鞘细胞能够包裹脱髓鞘的轴突，促进脊髓损伤的修复，因此该这类嗅鞘细胞可能有较强的治疗潜能。
[0028] Forskolin增加部分嗅鞘细胞的粘附能力，可能是通过Forskolin-cAMP-PKA信号通路，增加了相关粘附分子的表达。而细胞粘附与细胞增殖又密切相关。我们观察到：纯化后的嗅鞘细胞在用10％FBS DMEM/F12后，细胞在第二天迅速出现交织成网后，且随着时间的延长，细胞开始漂浮，细胞活力变差，而在5μM Forskolin的10％FBS DMEM/F12培养基中，细胞能够迅速增长，并没有出现交织成网现象。我们通过CCK实验也证明了Forskolin促进了嗅鞘细胞的增殖。因此，我们推测Forskolin促增殖作用可能与增加了细胞的粘附相关。此外，我们建议在细胞贴壁后就使用Forskolin，防止细胞出现交织成网现象及活力变差的情况。
[0029] 本发明的有益效果是：
[0030] 本发明只进行一次24h的差速处理，耗时更短；本发明只需要使用Forskolin一种细胞增殖剂，但是能够获得较高的纯度(大于98％)，而且嗅鞘的活力较好(能够培养至少3个月)，可在一定程度上帮助解决临床上嗅鞘细胞移植后治疗效果不稳定和并发症多的问题；本发明不需要抗体筛选，比较经济，而且操作简单，能够进行多次传代，能够为脊髓损伤病人提供大量的种子细胞。附图说明
[0031] 图1为嗅鞘细胞纯化的流程图；TE：含EDTA的胰酶。step1：消化新生0-2天SD小鼠的嗅球得到的细胞悬液在未包PLL的小皿中处理24小时后，将剩下的细胞悬液接种到包被有PLL的小皿上，待细胞长满小皿后，用小于0.1％的胰酶(低浓度胰酶)消化细胞2min，留在皿底的粘附力较强的细胞用含有5μM Forskolin的10％FBS DMEM/F12培养基继续培养。Step2：当留在皿底的细胞长满小皿后，用0.25％的胰酶消化细胞，以15*10^4/每皿的密度接种到新的包被有PLL的小皿上继续培养。Step3：重复Step1和Step2的纯化步骤，嗅鞘细胞的纯度能够不断提高。
[0032] 图2为嗅鞘细胞培养过程中的形态学图片。
[0033] 图3为嗅鞘细胞纯化后传代的荧光显微镜图片。
具体实施方式
[0034] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0035] 实施例1：嗅鞘细胞的原代培养与纯化
[0036] 选取新生0-2天的SD大鼠，剪头，从颅底至鼻尖切开皮肤，打开颅骨，取出嗅球，嗅球放在预冷的PBS溶液中清洗两遍，在解剖显微镜下分离嗅球表面的血管和脑膜，用眼科剪剪碎组织，剪至大约为1mm3时加入0.25％胰酶消化15min，加入2％fbs培养基(2％新生胎牛血清的DMEM/F12培养基)终止消化2min，放入离心机中以1000rpm转速离心5min，弃上清，加入10％fbs培养基(10％新生胎牛血清的DMEM/F12培养基，含有谷氨酰胺、青霉素和链霉素)重悬细胞，经过100μm的细胞筛后，在血球计数板上计数，以10^6的密度接种在未包被PLL的35mm*15mm的小皿上，24小时后，将培养皿的细胞悬液重新接种在一个包被有PLL的35mm*
15mm的小皿上，待细胞完全贴壁后，更换含有5μM Forskolin的10％fbs完全培养基，两天换液一次，待细胞长满培养皿后，用小于0.1％胰酶(含EDTA)消化2min，用2％fbs DMEM/F12培养基停止消化，用1000ul的移液枪轻柔地吹打培养皿4-5次，PBS清洗培养皿两遍，用含有5μM Forskolin的10％FBS完全培养基继续培养底部粘附性较强的细胞。当这些粘附性较强的细胞长满后培养皿后，用0.25％胰酶消化2min，用1000μl的移液枪轻轻吹打培养皿，待细胞全部吹打下来后用2％FBS培养基停止消化2min，将细胞悬液以1000rpm离心5min，弃上清，用5μM Forskolin的10％fbs完全培养基重悬细胞，以15*10^4/皿的密度重新接种到一个包被有PLL的新的35*15mm的培养皿上继续培养。用相同的方法进行3-4次纯化后，对所得到的细胞进行P75或S100免疫荧光染色鉴定。
15mm的小皿上，待细胞完全贴壁后，更换含有5μM Forskolin的10％fbs完全培养基，两天换液一次，待细胞长满培养皿后，用小于0.1％胰酶(含EDTA)消化2min，用2％fbs DMEM/F12培养基停止消化，用1000ul的移液枪轻柔地吹打培养皿4-5次，PBS清洗培养皿两遍，用含有5μM Forskolin的10％FBS完全培养基继续培养底部粘附性较强的细胞。当这些粘附性较强的细胞长满后培养皿后，用0.25％胰酶消化2min，用1000μl的移液枪轻轻吹打培养皿，待细胞全部吹打下来后用2％FBS培养基停止消化2min，将细胞悬液以1000rpm离心5min，弃上清，用5μM Forskolin的10％fbs完全培养基重悬细胞，以15*10^4/皿的密度重新接种到一个包被有PLL的新的35*15mm的培养皿上继续培养。用相同的方法进行3-4次纯化后，对所得到的细胞进行P75或S100免疫荧光染色鉴定。
[0037] 免疫荧光染色：
[0038] P2代后，每次接种到包被有PLL培养皿的细胞汇合度达到80-90％后，进行免疫荧光染色。用4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS清洗三遍，每次5min；用0.2％Triton-100对细胞进行破膜处理30min，PBS清洗三遍，每次5min；用3％BSA(牛血清白蛋白)对细胞进行封闭处理30min，PBS清洗三遍，每次5min；用兔抗P75(1:200)或兔抗S100(1:50)抗体4℃孵育过夜，PBS清洗三遍，每次5min；荧光二抗室温孵育1小时，PBS清洗3遍，每次5min；Hochest33258室温孵育30min，PBS清洗，每次5min；核染完后莱卡荧光显微镜下观察并扫描。
[0039] 嗅鞘细胞百分率的测定：
[0040] 在10倍物镜的莱卡荧光显微镜下随机选取5个区域进行计数，分别计数细胞核的总数，P75或者S100阳性细胞和Hochest33258核共染的细胞数目，计算各抗体阳性细胞平均值的百分率，相关数据用 表示。
[0041] CCK8实验：
[0042] 通过CCK8实验来，说明Forskolin对于纯化的嗅鞘细胞增殖的影响。具体实验方法如：将纯化后的嗅鞘细胞(纯度大于98％)消化后用10％FBS完全培养基重悬，以3000/孔的密度接种到包被有PLL的96孔板上，待细胞完全贴壁后，更换10％FBS的DMEM/F12完全培养基或者含有5μM Forskolin的10％FBS DMEM/F12完全培养基培养。分别在1、3、5、7天，每孔加入CCK8 10ul，孵育3小时后，用多功能酶标仪在450nm和500nm波段测量各孔的OD值。进行三次重复实验。
[0043] 实施例2：嗅鞘细胞的原代培养的形态学观察
[0044] 我们采用了改良的Nash的差速贴壁方法，差速24小时后，将细胞悬液接种到包被有PLL的新的35*15mm的小皿上，约20分钟后细胞完全贴壁，更换含有5μM Forskolin的10％FBS的DMEM/F12完全培养基。此时的细胞呈球形，部分细胞聚集成团。4d后，观察到球形细胞周围出现了成团聚集的扁圆形细胞。6d后，培养皿中的扁圆形细胞迅速生长，其他形态的细胞同样生长较快。9d后，细胞长满小皿，扁圆形的细胞聚集成团，部分细胞逐渐变为双极或三极，较多的其他形态的细胞也分布在扁圆形的细胞中。用小于0.1％胰酶消化2min，吸出胰酶，用2％FBS的DMEM/F12完全培养基轻轻吹打培养皿4-5次，在显微镜下发现有部分粘附性较强的扁圆形或长条形细胞依旧存在皿底。PBS清洗两遍后，换上含有5μM的10％FBS的DMEM/F12培养基继续培养，待细胞重新长满培养皿后，发现扁圆形的细胞比例明显增加，其他类型的细胞比例明显减少。此时，用0.25％胰酶将重新长满的扁圆形细胞消化并以15*10^4/皿的密度接种到新的包被有PLL的35*15mm的培养皿上继续培养。以同样的方法纯化2-3次后，我们发现培养皿中的细胞形态均一，纯度较高，早期呈细胞形态呈扁圆形，生长迅速，待长满皿后，细胞形态呈双极的施旺细胞样状态，呈螺旋形生长，这种方法可以得到高纯度的单一亚型的嗅鞘细胞。本实施例的嗅鞘细胞的形态学照片如图2所示。
[0045] 实施例3：嗅鞘细胞的鉴定及纯度
[0046] 纯化后的细胞我们用兔抗P75抗体或兔抗S100抗体进行染色，并在荧光显微镜下拍片，10倍物镜下随机选取5个视野拍片，嗅鞘细胞的纯度＝P75抗体或者S100抗体及Hochest33258共阳性的细胞数/Hocheset 3325阳性细胞数。荧光显微镜图片如图3所示，嗅鞘细胞的纯度：P2(65.03±9.13)％、P3(82.59±8.98)％、P4(96.75±2.59)％、P5(98.17％±1.82)％、P6(99.09±1.57)％。
[0047] 实施例4：Forskolin促进嗅鞘细胞的增殖
[0048] 纯化后的嗅鞘细胞在含有5μM的Forskolin的10％FBS的DMEM/F12完全培养基中成团生长，增殖迅速，增殖能力不随着传代而减弱，目前培养3个月P10代嗅鞘细胞仍可传代，活力仍好；然而在10％FBS的DMEM/F12完全培养基中，细胞1天后即迅速交织成网，成双极或三极形态生长，细胞虽然增殖但是且随着培养时间的延长，约一周，细胞折光性变差，细胞开始漂浮，说明嗅鞘细胞的活力降低。CCK8实验结果显示：10％FBS+Forskolin组与10％FBS相比，1天和3天时，两组的OD值未见明显差异；5天、7天时，10％FBS+Forskolin组的OD值明显高于10％FBS组。实验表明Forskolin促进了嗅鞘细胞的增殖与活力。因此我们认为嗅鞘细胞培养的早期阶段就应该加入Forskolin来保持细胞活性。
[0049] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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