技术领域
[0001] 本实用新型涉及
食品安全免疫检测技术领域，具体涉及一种检测氨基糖苷类抗生素的胶体金试纸条组件。
背景技术
[0002] 氨基糖苷类抗生素因其分子结构都有一个氨基环醇类和一个或多个氨基糖分子，并由配糖键连接成苷而得名，多为极性化合物，易溶于
水，胃肠道不易吸收，一般需要注射
给药。氨基糖苷类抗生素的作用为与细菌核糖体结合，干扰细菌
蛋白质合成过程，是目前
治疗需
氧革兰阴性杆菌严重感染的重要药物。兽医临床中，常用的氨基糖苷类抗生素有卡那霉素、庆大霉素、新霉素、
链霉素四种，由于这些抗生素均有常见的肾毒性、
耳毒性、神经肌肉麻醉和变态反应，因此动物源性食品中的残留限量已经有了严格规定(以
牛奶为例，见表1)。实际生产中，乳品生产企业为了确保产品
质量，对这些药物残留的要求更严格，内控标准比国家标准要求更高。
[0003] 表1牛奶中氨基糖苷类抗生素的残留限量
[0004]序号 药物 残留限量(μg/kg)
1 卡那霉素 150
2 庆大霉素 200
3 新霉素 1500
4 链霉素 200
[0005] 目前，这上述卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素药物残留的国家标准检测方法主要为液相色谱
串联质谱法(LC-MS/MS)。该方法检测灵敏度高，但需要依赖大型仪器设备，价格昂贵且操作复杂，很大程度上限制了其在
基层牧场和乳品厂的应用，实际检测中多使用酶联免疫检测
试剂盒(ELISA)和胶体金检测试纸条。常规的ELISA试剂盒和胶体金试纸条多以单个药物为目标检测物，检测多种药物时，需要操作多个检测试剂盒或者试纸条，既繁琐又复杂，并且浪费时间和成本，因此有必要开发一种能同时检测这些药物残留的检测试纸条，来满足实际检测的需要。实用新型内容
[0006] 本实用新型的目的在于提供一种检测氨基糖苷类抗生素的胶体金试纸条组件，用以解决目前针对卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素药物残留检测时，常规的ELISA试剂盒和胶体金试纸条多以单个药物为目标检测物，检测多种药物时，需要操作多个检测试剂盒或者试纸条，既繁琐又复杂，并且浪费时间和成本，亟需开发一种能同时检测上述四种药物残留的检测试纸条的问题。
[0007] 为达到上述目的，本实用新型的技术方案为：一种检测氨基糖苷类抗生素的胶体金试纸条组件，它包括微孔板架、盒体、多个胶体金试纸、多个微孔试剂、多个塑料桶和多个一次性塑料吸管；
[0008] 所述胶体金试纸包括PVC
背板，在PVC背板的顶面左端附着有样品垫，在PVC背板的顶面右端附着有吸水垫，在样品垫与吸水垫之间的PVC背板顶面上还设置有
硝酸纤维素膜，在所述硝酸
纤维素膜上由左至右依次间隔
喷涂有卡那霉素检测线、庆大霉素检测线、新霉素检测线、链霉素检测线和质控线，且在卡那霉素检测线上喷涂有卡那霉素与牛血清
白蛋白或者卵清白蛋白偶联而成的检测
抗原，在庆大霉素检测线上喷涂有庆大霉素与牛血清白蛋白或者卵清白蛋白偶联而成的检测抗原，在新霉素检测线上喷涂有新霉素与牛血清白蛋白或者卵清白蛋白偶联而成的检测抗原，在链霉素检测线上喷涂有链霉素与牛血清白蛋白或者卵清白蛋白偶联而成的检测抗原，在质控线上喷涂有羊抗鼠IgG
抗体；
[0009] 所述微孔试剂包括包被有胶体金标记卡那霉素单克隆抗体、包被有胶体金标记庆大霉素单克隆抗体、包被有胶体金标记新霉素单克隆抗体、包被有胶体金标记链霉素单克隆抗体的塑料微孔，在塑料微孔的顶端敞口端通过塑料孔盖帽进行密封，且八个塑料微孔依次连接形成一组微孔试剂；
[0010] 所述盒体为长方形壳体，盒体的顶端敞口处设置有与盒体一侧连接的扣盖，在盒体的内部放置有纸托，在所述纸托上开设有多个孔位；
[0011] 每个塑料桶内放置有一组微孔试剂和八个胶体金试纸，且每个塑料桶放置在盒体中纸托上相应的孔位内。
[0012] 优选的，所述塑料桶的个数为十二个，所述纸托上开设有的孔位的个数为十二个。
[0013] 优选的，所述胶体金试纸的整体长度为7cm，胶体金试纸的整体宽度为4cm；所述卡那霉素检测线、庆大霉素检测线、新霉素检测线、链霉素检测线和质控线的整体宽度均为2mm。
[0014] 优选的，所述微孔板架为96孔塑料板架。
[0015] 优选的，所述一次性塑料吸管为0.2mL的一次性巴士吸管。
[0016] 优选的，所述卡那霉素检测线、庆大霉素检测线、新霉素检测线、链霉素检测线和质控线相互平行设置。
[0017] 本实用新型具有如下优点：
[0018] 本实用新型与与传统仪器方法和国家标准方法相比较，优点在于：一、检测灵敏、速度快、操作简便，单个样本检测时间为10min，检测灵敏度满足国家标准要求。并且操作简便，一般的奶站工人无需培训即可上手操作。对于卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四种药物残留检测分别可以达到20μg/kg、20μg/kg、50μg/kg和20μg/kg，可最大程度保障乳品中氨基糖苷类抗生素残留不超标。二、四种药物同时检测，检测样本仅需200微升，检测成本低廉，单个样本检测成本不超过5元，是仪器检测方法的百分之一，甚至更少，给检测单位节省大量成本。三、无需特殊仪器设备，适合于基层实验室和养殖场等场合检测应用，有助于从生产一线控制乳品质量。四、与一般的将单独试纸条物理组合形成的多联试纸条，如实用新型
专利CN204719028U公开的物理组合法制备的检测五种氨基糖苷类抗生素的胶体金试纸条专利相比较，本实用新型检测所需样本量小、生产原料成本低、生产工序简单等，特别是通过将胶体金标记的单克隆抗体放在微孔板中，检测时首先与样本混合孵育，有效地提高了检测灵敏度和检测准确性。
附图说明
[0019] 图1为本实用新型中胶体金试纸的主视结构示意图；
[0020] 图2为本实用新型中胶体金试纸的俯视结构示意图；
[0021] 图3为微孔试剂的结构示意图；
[0022] 图4是塑料桶的结构示意图；
[0023] 图5为微孔板架的结构示意图；
[0024] 图6为盒体及纸托的结构示意图。
具体实施方式
[0025] 以下
实施例用于说明本实用新型，但不用来限制本实用新型的范围。
[0026] 实施例1
[0027] 这里需要说明的是，所述方位词左、右、上、下均是以图1所示的视图为基准定义的，应当理解，所述方位词的使用不应限制本
申请所
请求的保护范围。
[0028] 下面结合附图和实施例对本
发明进一步说明。
[0029] 如图1至图6所示，一种检测氨基糖苷类抗生素的胶体金试纸条组件，它包括微孔板架10、盒体13、多个胶体金试纸1、多个微孔试剂8、多个塑料桶14和多个一次性塑料吸管；
[0030] 所述胶体金试纸1包括PVC背板2，在PVC背板2的顶面左端附着有样品垫4，在PVC背板2的顶面右端附着有吸水垫3，在样品垫4与吸水垫3之间的PVC背板2顶面上还设置有硝酸纤维素膜5，在所述硝酸纤维素膜5上由左至右依次间隔喷涂有卡那霉素检测线T1、庆大霉素检测线T2、新霉素检测线T3、链霉素检测线T4和质控线7，且在卡那霉素检测线T1上喷涂有卡那霉素与牛血清白蛋白或者卵清白蛋白偶联而成的检测抗原，在庆大霉素检测线T2上喷涂有庆大霉素与牛血清白蛋白或者卵清白蛋白偶联而成的检测抗原，在新霉素检测线T3上喷涂有新霉素与牛血清白蛋白或者卵清白蛋白偶联而成的检测抗原，在链霉素检测线T4上喷涂有链霉素与牛血清白蛋白或者卵清白蛋白偶联而成的检测抗原，在质控线7上喷涂有羊抗鼠IgG抗体；
[0031] 所述微孔试剂8包括包被有胶体金标记卡那霉素单克隆抗体、包被有胶体金标记庆大霉素单克隆抗体、包被有胶体金标记新霉素单克隆抗体、包被有胶体金标记链霉素单克隆抗体的塑料微孔8a，在塑料微孔8a的顶端敞口端通过塑料孔盖帽9进行密封，且八个塑料微孔8a依次连接形成一组微孔试剂8；
[0032] 所述盒体13为长方形壳体，盒体13的顶端敞口处设置有与盒体13一侧连接的扣盖，在盒体13的内部放置有纸托11，在所述纸托11上开设有多个孔位12；
[0033] 每个塑料桶14内放置有一组微孔试剂8和八个胶体金试纸1，且每个塑料桶14放置在盒体13中纸托11上相应的孔位12内。
[0034] 同时，将产品操作
说明书、质控报告等一起
包装于盒体中，形成完整的检测试剂盒。
[0035] 卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四种药物的单克隆抗体分别为鼠抗卡那霉素、鼠抗庆大霉素、鼠抗新霉素、鼠抗链霉素单克隆抗体，是通过卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四种药物与牛血清白蛋白或卵清蛋白等常规大分子载体蛋白偶联后免疫小鼠，取其脾细胞与瘤细胞融合制备获得的。
[0036] 本实用新型的组装方法为：
[0037] 一、胶体金标记单克隆抗体微孔试剂的准备：
[0038] (一)卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四种药物单克隆抗体的制备与筛选：
[0039] 将卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四种药物分别与卵清蛋白通过常规方法偶联后，分别免疫6～8周龄的Balb/C小鼠，50μg每只每次，首次免疫时与等量弗氏完全佐剂(sigma公司，货号为F5881)乳化混匀，后续免疫与弗氏不完全佐剂乳(sigma公司，货号为F5506)化混匀。免疫方式为皮下多点注射。
[0040] 多次免疫后
采血测定效价，待血清效价大于1:1000，且OD值大于1.5后，以100μg前述偶联物加强免疫，按照常规方法进行细胞融合，然后分别以卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素和双氢链霉素为标准品筛选特异性单克隆抗体。挑选抗体灵敏度以其残留限量标准要求为准，筛选优选单抗细胞株用于后续微孔试剂的生产。
[0041] (二)卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素药物单克隆抗体的纯化：
[0042] 采用体内诱生法制备以上单克隆抗体腹水单抗，收集腹水后以饱和
硫酸铵沉淀法纯化腹水抗体，具体操作参考文献进行。粗纯的腹水抗体继续以Protein G亲和层析柱纯化，具体操作参考亲和柱操作说明书进行，此处不再赘述。亲和纯化获得高纯度的单克隆抗体即可直接用于胶体金标记。
[0043] (三)胶体金的制备：
[0044] 取0.01％氯金酸水溶液100ml用恒温
电磁搅拌器加热至
沸腾，持续搅拌的情况下加入1％
柠檬酸三钠水溶液2.5ml，继续搅拌加热20min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存。
[0045] (四)胶体金颗粒标记单抗的制备：
[0046] 取制备好的胶体金颗粒溶液，用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液的pH值为8.2。置于磁
力搅拌器上，然后将纯化后的卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素单克隆抗体以PBS按照1:2000的比例稀释后加入胶体金溶液中搅拌反应60分钟，其中卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素四种药物单克隆抗体的比例分别为1:2:1:2(体积比)；然后将PEG20000溶液加入混合反应液中，使PEG的最终浓度约为1％，置于在4℃和条件下冷冻离心机上慢速，所述上慢速为11000～13000rpm，通过上慢速离心10分钟后弃去上清液。
[0047] 将下层沉淀用PBS反复洗涤并继续离心弃去多余上清液，最后将沉淀物以PBS缓冲液重悬，使最终的蛋白浓度约为25～50μg/mL左右。
[0048] 制备好的金标抗体按照100μL的量分装于96孔酶标板孔中，
冷冻干燥，然后以酶标板孔盖帽密封，此时，胶体金检测试纸条所用的微孔试剂制备完毕。制备好的微孔试剂置于4℃保存备用。
[0049] 二、检测线T1～T4、质控线7溶液的准备：
[0050] 将卡那霉素与牛血清白蛋白的偶联物以0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)稀释至20μg/mL作为卡那霉素检测线T1溶液备用；
[0051] 将庆大霉素与牛血清白蛋白的偶联物以0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)稀释至10μg/mL作为庆大霉素检测线T2溶液备用；
[0052] 将新霉素牛血清白蛋白的偶联物以0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)稀释至20μg/mL作为新霉素检测线T3溶液备用；
[0053] 将链霉素与牛血清白蛋白的偶联物以0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)稀释至25μg/mL作为链霉素检测线T4溶液备用；
[0054] 将商品化的羊抗鼠二抗以0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)稀释至200μg/mL备用。
[0055] 三、胶体金试纸的组装：
[0056] 用划膜仪在硝酸纤维素膜5上喷涂出五条线，即卡那霉素检测线T1、庆大霉素检测线T2、新霉素检测线T3、链霉素检测线T4和质控线7，包被量均为1.0μL/cm2；将喷涂好的硝酸纤维素膜5置于37℃干燥2h；然后将硝酸纤维素膜5粘贴在PVC背板2上，同时在PVC背板2靠近质控线7的一端粘贴上吸水垫3，在另一端粘贴上样品垫4。将粘贴好的PVC大板用切条机切成宽度为4mm的单条状。挑选其中吸水垫3、样品垫4完整，且质控线7、各检测线无损坏的单条作为备用。
[0057] 四、胶体金检测试剂盒的组装：
[0058] 将一组微孔试剂和八个胶体金试纸1装在含有干燥剂的塑料桶14中，贴好标签；十二个塑料桶14装在盒体13中纸托11上相应的孔位12内，然后贴好外标签，盒体13塑封后放置于2-8℃保存。
[0059] 五、本实用新型检测操作时的使用方法如下：
[0060] (一)准备样本和试纸条：将牛奶样本和试纸条从冷藏环境中取出，置于室温30min以上，使其充分回温。
[0061] (二)打开盒体13，根据检测样本的数量取相应数量的胶体金试纸1、微孔试剂8、一次性吸管和微孔板架10。
[0062] (三)将准备好的微孔试剂8放置在微孔板架10上，用一次性塑料吸管吸取0.2mL牛奶样本加入相应塑料微孔8a内，上下吸打三次，使得牛奶样本与冷冻干燥的胶体金标记的药物单克隆抗体充分混合，然后室温静置5min；
[0063] (四)取出试纸，将样品垫4端插入混匀的牛奶样本中，开始计时5min，完毕，根据试纸条说明书判断检测结果。
[0064] (五)分别比较卡那霉素检测线T1、庆大霉素检测线T2、新霉素检测线T3、链霉素检测线T4与质控线7的
颜色，如果相应检测线的颜色比质控线7的颜色浅或者不显色，则相应药物检测为阳性，如果相应检测线比质控线7的颜色深，则相应药物检测为阴性。如果质控线7不显色，则结果作废，需要更换胶体金试纸1重新检测。
[0065] 实施例2
[0066] 在上述技术方案
基础上，所述塑料桶14的个数为十二个，所述纸托11上开设有的孔位12的个数为十二个。如此设置，配备数量充足，满足实际使用需要。
[0067] 实施例3
[0068] 在上述技术方案基础上，所述胶体金试纸1的整体长度为7cm，胶体金试纸1的整体宽度为4cm；所述卡那霉素检测线T1、庆大霉素检测线T2、新霉素检测线T3、链霉素检测线T4和质控线7的整体宽度均为2mm。如此设置，体积小巧，操作方便，满足实际使用需要。
[0069] 实施例4
[0070] 在上述技术方案基础上，所述微孔板架10为96孔塑料板架。如此设置，塑料板架工作性能稳定，用于提供检测反应的
支撑载体，满足实际使用需要。
[0071] 实施例5
[0072] 在上述技术方案基础上，所述一次性塑料吸管为0.2mL的一次性巴士吸管。如此设置，工作性能稳定，使用方便，满足实际使用需要。
[0073] 实施例6
[0074] 在上述技术方案基础上，所述卡那霉素检测线T1、庆大霉素检测线T2、新霉素检测线T3、链霉素检测线T4和质控线7相互平行设置。如此设置，确保检测效果，满足实际使用需要。
[0075] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本实用新型作了详尽的描述，但在本实用新型基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本实用新型精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本实用新型要求保护的范围。
