技术领域
[0001] 本
发明生物医学的干细胞与组织工程学技术领域，尤其涉及一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法。
背景技术
[0002] 据统计，世界上现有不孕不育人群占育龄妇女的10% 左右；约1/5的妇女处于绝经期年龄段，随着人口老龄化
进程加快，越来越多女性将在雌
激素匮乏状态中度过更长时期；女性由于在工作和生活中面临的各种压
力，致使卵巢早衰出现年轻化趋势。在雌性不如动物生殖系统发育过程中，卵巢内绝大多数卵母细胞在发育过程中发生凋亡，因此在雌性生殖周期内能够发育成熟并排出的卵母细胞相比整个原始卵泡库来说非常少，同时我们对卵母细胞发生成熟的调控机制还知之甚少。因此，通过体外干细胞分化获得卵母细胞，可以介入卵巢早衰的
治疗，恢复卵巢功能，以及延缓女性绝经期的到来，同时也能使我们更好的理解动物生殖细胞发生发育过程及其机制。
[0003] 综合最近研究进展，之前的研究大都采用胚胎干细胞（ESC）作为原材料，但是ESC处在
哺乳动物个体发育的早期，在应用上存在伦理限制，并且取材困难，因此采用成体干细胞代替ESC向生殖细胞分化可以更好地解决问题。毛囊干细胞广泛分布于哺乳动物毛发中，取材十分方便，对
机体伤害最小，同时也不存在伦理问题限制。多项研究指出毛囊干细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的成体干细胞。
发明内容
[0004] 为解决
现有技术中存在的上述
缺陷并发扬优点，本发明旨在提供一种采用成体干细胞进行诱导分化培养，对机体伤害小、无伦理问题限制的卵母细胞体外培养方法。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法，包括将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞、将原始生殖细胞再次诱导分化为卵母细胞两个步骤，其中：
[0006] 1）将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞具体为：
[0007] ①原始细胞准备：分别提取培养了1-2代绿色
荧光转移基因小鼠的毛囊干细胞与野生型小鼠
成纤维细胞，并将野生型小鼠成纤维细胞采用丝裂霉素C处理，然后将毛囊干细胞与处理后的成纤维细胞按照数量比1:1的比例混合后待用；
[0008] ②选用DMEM高糖培养基作为原始生殖细胞诱导培养基，并在该培养基内加入以DMEM高糖总
质量计8% 12%质量分数的胎
牛血清、以DMEM高糖总体积计40 mIU/ml 60 mIU/~ ~ml促卵泡素、80 IU/ml 120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml 25 ng/ml骨形态发生因子、~ ~
0.20 mmol/L 0.25 mmol/L丙
酮酸钠、0.08 mmol/L 0.12 mmol/L非必需
氨基酸，1.5mmol/L~ ~
2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L 0.12 mmol/L β-巯基
乙醇, 8ng/ml 12 ng/ml表皮~ ~ ~
生长因子, 15ng/ml 25 ng/ml
碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml 50ng/ml干细胞生长因~ ~
子；培养
温度35℃-38℃，湿度不低于80%，环境中CO2浓度4%-6%；
[0009] ③将步骤①获得的待用混合细胞植入步骤②准备的原始生殖细胞诱导培养基，然后将培养基放置在
培养箱中，按常规方式进行培养8-10天，即获得诱导分化出的原始生殖细胞；
[0010] 2）将原始生殖细胞诱导分化为卵母细胞具体为：
[0011] ①准备卵母细胞诱导培养基：选用DMEM/F12培养基作为卵母细胞诱导培养基，并在培养基内加入以DMEM/F12总质量计12% 18%质量分数的胎牛血清、0.8% 1.2%质量分数~ ~的抗T细胞免疫毒素ITS、1.5% 2.5%质量分数的血清替代物B27、0.8% 1.2%质量分数的青~ ~
链霉素、以DMEM/F12总体积计1200 IU/ml 1800 IU/ml白细胞抑制因子LIF、40 mIU/ml 60 ~ ~
mIU/ml促卵泡素、8ng/ml 12 ng/ml表皮生长因子、0.08 mmol/L 0.12 mmol/L β-巯基乙~ ~
醇；培养温度35℃-38℃，湿度不低于80%，环境中CO2浓度4%-6%；
[0012] ②将1）中步骤③获得的原始生殖细胞稀释至0.8×106个/L 1.2×106个/L，然后~植入24孔板表面并放置在步骤①获得的培养基中悬浮培养，培养至通过常规方法检测出现尺寸不低于50μm的大细胞，且该类大细胞呈现典型卵母细胞形态、有类似透明带结构出现、表达卵母细胞特异基因，则所述大细胞为所需卵母细胞。
[0013] 上述毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法，其中：在步骤1）将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞和步骤2）将原始生殖细胞诱导分化为卵母细胞之间还增加有原始生殖细胞专向培养步骤，具体为：将1）中步骤③获得的原始生殖细胞放入专向培养基内进行培养，所述专向培养基具体为：以DMEM高糖培养基作为
基础，其内添加以DMEM高糖总质量计8% 12%质量分数的胎牛血清、以DMEM高糖总体积计15ng/ml 25 ng/ml骨形态发生因子、以~ ~
DMEM高糖总体积计0.20 mmol/L 0.25 mmol/L
丙酮酸钠、0.08 mmol/L 0.12 mmol/L非必需~ ~
氨基酸，1.5 mmol/L 2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L 0.12 mmol/L β-巯基乙醇, ~ ~
15ng/ml 25ng/ml表皮生长因子, 30ng/ml 50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml~ ~ ~
50ng/ml干细胞生长因子；培养时间3-5天，温度35℃-38℃，湿度不低于80%；环境中CO2浓度
4%-6%；经过一定时间专向培养后可获得更加纯化、数量更多、形态更佳的原始生殖细胞。
[0014] 上述毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法，其中：将原始生殖细胞诱导分化为卵母细胞的培养周期为20天-25天，可获得较多数量、形态典型、健康的卵母细胞。
[0015] 与现有技术相比较，本发明具有以下优点：采用小鼠毛囊干细胞及成纤维细胞作为原细胞进行专向诱导分化，一方面对机体伤害小，另一方面，也无伦理问题限制，具有更广阔的应用前景和重大的社会及经济意义；采用的培养基成份配置更为合理、营养更齐全且更专向，用于适用的毛囊干细胞专向培养卵母细胞的效率高、再现率高、纯度高、质量好；清楚地划分了初步诱导分化和最终诱导分化培养，一方面使本发明的专向性更强，另一方面也为实际应用的步骤优化提供了更大的空间和应用价值，也大大降低了培养难度，提高了再现性；本发明最终建立了小鼠毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法，以小鼠毛囊干细胞为材料，先在体外诱导分化为原始生殖细胞，再将分化的原始生殖细胞转到卵母细胞诱导培养基中，获得了典型卵子形态的卵母细胞，为毛囊干细胞向配子分化及研究应用提供了技术基础。
附图说明
[0016] 图1 为小鼠毛囊组织和毛囊干细胞培养图片。
[0017] 图2 为小鼠毛囊干细胞CD34表达检测分析图片。
[0018] 图3 为小鼠毛囊干细胞分化的原始生殖细胞图片。
[0019] 图4 为小鼠毛囊干细胞分化的原始生殖细胞基因表达检测图片。
[0020] 图5 为小鼠毛囊干细胞分化为卵母细胞的图片。
[0021] 图6 为小鼠
皮肤干细胞分化的卵母细胞检测图片。
具体实施方式
[0022] 下面通过具体
实施例和附图对本发明方法做进一步阐述。
[0023] 实施例1
[0024] 一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法，包括将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞、将原始生殖细胞再次诱导分化为卵母细胞两个步骤，其中：
[0025] 1）将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞具体为：
[0026] ①原始细胞准备：分别提取培养了1代绿色荧光转移基因小鼠的毛囊干细胞与野生型小鼠成纤维细胞，并将野生型小鼠成纤维细胞采用丝裂霉素C处理，然后将毛囊干细胞与处理后的成纤维细胞按照质量比1:1的比例混合后待用；
[0027] ②选用DMEM高糖培养基作为原始生殖细胞诱导培养基，并在该培养基内加入以培养基内DMEM高糖总质量计8%质量分数的胎牛血清、40 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml骨形态发生因子、0.20 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L β-巯基乙醇, 8ng/ml表皮生长因子, 15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml干细胞生长因子；培养温度35℃，湿度80%；环境中CO2浓度4%；
[0028] ③将步骤①获得的待用混合细胞植入步骤②准备的原始生殖细胞诱导培养基，然后将培养基放置在培养箱中，按常规方式进行培养8天，即获得诱导分化出的原始生殖细胞；
[0029] 2）将原始生殖细胞诱导分化为卵母细胞具体为：
[0030] ①准备卵母细胞诱导培养基：选用DMEM/F12培养基作为卵母细胞诱导培养基，并在培养基内加入以培养基内DMEM/F12总质量计12%质量分数的胎牛血清、0.8%质量分数的抗T细胞免疫毒素ITS、0.8%质量分数的青链霉素、1.5%质量分数的血清替代物B27、1200 IU/ml白细胞抑制因子LIF、40 mIU/ml促卵泡素、8ng/ml表皮生长因子、0.08 mmol/L β-巯基乙醇；培养温度35℃，湿度80%；环境中CO2浓度4%；
[0031] ②将1）中步骤③获得的原始生殖细胞稀释至0.8×106个/L，然后植入24孔板表面并放置在步骤①获得的卵母细胞诱导培养基中悬浮培养，培养20天后，通过常规方法检测出现尺寸不低于50μm的大细胞，且该类大细胞呈现典型卵母细胞形态、有类似透明带结构出现、表达卵母细胞特异基因，则所述大细胞为所需卵母细胞。
[0032] 实施例2
[0033] 一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法，包括将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞、原始生殖细胞专向培养、将原始生殖细胞再次诱导分化为卵母细胞三个步骤，其中：
[0034] 1）将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞具体为：
[0035] ①原始细胞准备：分别提取培养了2代绿色荧光转移基因小鼠的毛囊干细胞与野生型小鼠成纤维细胞，并将野生型小鼠成纤维细胞采用丝裂霉素C处理，然后将毛囊干细胞与处理后的成纤维细胞按照数量比1:1的比例混合后待用；
[0036] ②选用DMEM高糖培养基作为原始生殖细胞诱导培养基，并在该培养基内加入以培养基内DMEM高糖总质量计12%质量分数的胎牛血清、60 mIU/ml促卵泡素、120IU/ml白血病抑制因子、25ng/ml骨形态发生因子、0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.12 mmol/L非必需氨基酸，2.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 12ng/ml表皮生长因子, 25ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 50ng/ml干细胞生长因子；培养，温度38℃，湿度85%；环境中CO2浓度6%；
[0037] ③将步骤①获得的待用混合细胞植入步骤②准备的原始生殖细胞诱导培养基，然后将培养基放置在培养箱中，按常规方式进行培养10天，即获得诱导分化出的原始生殖细胞；
[0038] 2）原始生殖细胞专向培养，具体为：
[0039] 将1）中步骤③获得的原始生殖细胞放入专向培养基内进行培养，所述专向培养基具体为：以DMEM高糖培养基作为基础，其内添加以培养基内DMEM高糖总质量计8%质量分数的胎牛血清、15ng/ml骨形态发生因子、0.20 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L β-巯基乙醇, 15ng/ml表皮生长因子, 30ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml干细胞生长因子；培养时间3天，温度35℃，湿度80%；环境中CO2浓度4%；经过一定时间专向培养后可获得更加纯化、数量更多、形态更佳的原始生殖细胞。
[0040] 3）将原始生殖细胞诱导分化为卵母细胞具体为：
[0041] ①准备卵母细胞诱导培养基：选用DMEM/F12培养基作为卵母细胞诱导培养基，并在培养基内加入以培养基内DMEM/F12总质量计18%质量分数的胎牛血清、2.5%质量分数的血清替代物B27、1.2%质量分数的青链霉素、1.2%质量分数的抗T细胞免疫毒素ITS、以培养基内DMEM/F12总体积计1800 IU/ml白细胞抑制因子LIF、60 mIU/ml促卵泡素、12ng/ml表皮生长因子、0.12 mmol/L β-巯基乙醇；培养温度38℃，湿度85%；环境中CO2浓度6%；
[0042] ②将2）中获得的原始生殖细胞稀释至1.2×106个/L，然后植入24孔板表面并放置在步骤①获得的卵母细胞诱导培养基中悬浮培养，培养25天，通过常规方法检测出现尺寸不低于50μm的大细胞，且该类大细胞呈现典型卵母细胞形态、有类似透明带结构出现、表达卵母细胞特异基因，则所述大细胞为所需卵母细胞。
[0043] 实施例3
[0044] 大体与实施例2相同，其差别在于：
[0045] 2）原始生殖细胞专向培养，具体为：
[0046] 将1）中步骤③获得的原始生殖细胞放入专向培养基内进行培养，所述专向培养基具体为：以DMEM高糖培养基作为基础，其内添加以培养基内DMEM高糖总质量计12%质量分数的胎牛血清、以培养基内DMEM高糖总体积计25 ng/ml骨形态发生因子、0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.12 mmol/L非必需氨基酸，2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 25ng/ml表皮生长因子, 50 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 50ng/ml干细胞生长因子；培养时间5天，温度38℃，湿度85%；环境中CO2浓度6%；经过一定时间专向培养后可获得更加纯化、数量更多、形态更佳的原始生殖细胞。
[0047] 实施例4
[0048] 本实施例为了更详细地阐述本发明的毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法，结合图片、具体操作流程、用到的器具、具体药品的来源等，将方法的步骤更加详细地描述如下：
[0049] 1、小鼠毛囊干细胞的分离培养
[0050] 小鼠毛囊干细胞（HFSC）来源于新生7天，绿色荧光转基因小鼠的触须部毛囊。用手术
镊子将出生后7天小鼠毛囊从触须部皮肤上取下（图1中（1）），转移至
磷酸盐缓冲液（PBS,pH 7.0）+10% 胎牛血清（FBS）的操作液中，去掉与毛囊连接在一起的皮脂腺，立毛肌，脂肪等杂质并在新鲜DMEM/F-12中洗3次，置于0.25% Trypsin-0.04% EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F-12中洗3遍，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养基培养，毛囊干细胞培养基包含DMEM/F12；2%血清替代物 B27；20ng/ml 表皮生长因子；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子；1% 青链霉素，以培养当天为零代，每4天传代一次。图1中(2)是刚培养的皮肤干细胞悬液，图1中（3）是培养2天的毛囊干细胞，可见此时毛囊干细胞克隆球边缘清晰，结构紧凑。毛囊干细胞经过传代培养后，杂细胞数目减少，干细胞克隆球数目也越来越多（图1中（4））。对培养的毛囊干细胞进行CD34表达分析，结果显示，培养的毛囊干细胞中CD34阳性细胞比例达到85.5%（图2）。
[0051] 2、小鼠原始生殖细胞（PGC）的诱导
[0052] 收集1-2代的毛囊干细胞克隆球，用0.25% Trypsin消化，室温消化过程中吹打至单细胞，用10%胎牛血清终止消化，收集细胞，1500rpm离心5min；弃上清，加入少量原始生殖细胞诱导培养基悬浮细胞，将细胞稀释到细胞浓度为5×104个/ml 原始生殖细胞诱导培养基里；
[0053] 取1-3代成纤维细胞，倒掉培养基，加入4ml含有10μg丝裂霉素C的成纤维细胞培养基，置于培养箱中1.5-2小时，取出用磷酸盐缓冲液洗5遍，用0.25% Trypsin将贴壁的成纤维细胞消化下来，洗涤后加入原始生殖细胞诱导培养基并稀释至5×104个/ml，将两种细胞
混合液按体积1:1混合，加入到原始生殖细胞诱导培养基中并置于37℃、饱和湿度、5%CO2中培养，原始生殖细胞诱导培养基包括：DMEM高糖为基质, 10%质量分数的胎牛血清, 50 mIU/ml促卵泡素，100 IU/ml 白血病抑制因子，20 ng/ml 骨形态发生因子（BMP-4）， 0.23 mmol/L 丙酮酸钠, 0.1 mmol/L 非必需氨基酸, 2 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L β-巯基乙醇, 10 ng/ml 表皮生长因子, 20 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子, 40 ng/ml 干细胞生长因子。细胞悬液开始呈悬浮状态（图3中（1）），在培养的8-10天，出现折光度大，“亮晶晶”的细胞（图3中（2）），此时更换原始生殖细胞专向培养基，成分包括：DMEM高糖为基质, 10%质量分数的胎牛血清, 0.23 mmol/L 丙酮酸钠, 0.1 mmol/L 非必需氨基酸, 2 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L β-巯基乙醇, 20 ng/ml 表皮生长因子, 40 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子，20 ng/ml 骨形态发生因子（BMP-4），40 ng/ml 干细胞生长因子（SCF）（加入原始生殖细胞专向培养基后，培养基中原始生殖细胞数目随着培养时间的增加，数目越来越多（图3中（3-4））。收集这些分化的原始生殖细胞进行特异基因表达分析显示，在原始生殖细胞分化的前15天，分化的原始生殖细胞其生殖细胞特异基因表达逐渐升高（图4）。
[0054] 3、分化的PGC转移至卵母细胞诱导培养基
[0055] 收集分化的PGC并转移到卵母细胞诱导培养基中，稀释到1*106个/ml的浓度并置于悬浮24孔板培养（图5中（1）），卵母细胞诱导培养基成分如下：DMEM/F12为基质，以基质质量分数计15%胎牛血清，2%血清替代物B27，1% 青链霉素，1% 抗T细胞免疫毒素ITS，1500 IU/ml 白细胞抑制因子LIF，50 mIU/ml促卵泡素，10ng/ml 表皮生长因子，0.1 mmol/L β-巯基乙醇。诱导分化的第8天左右，会出现一些直径在30μm-50μm的大细胞（图5中（2）），在诱导分化的第12天，培养基中会出现众多直径在50μm以上的大细胞（图5中（3）），在卵子诱导第21天时，一些大细胞呈现典型卵母细胞形态，并有类似透明带结构出现（图5中（4））。
[0056] 4、细胞免疫荧光化学检测分化的卵母细胞特定基因表达
[0057] 取出分化的卵母细胞，弃培养基，PBS洗2遍，加入4％多聚甲
醛室温固定15分钟。或PBS洗3遍，每遍5分钟。用PBST（PBS+0.5%Trition-100）溶液进行透化，室温10分钟。PBS（磷酸亚缓冲液，PH 7.0）洗1遍，5分钟。加入含10％山羊血清或
马血清的PBST（PBS+0.5%Trition-100），室温封闭30－60分钟。弃封闭液，加入一抗（1：50－1：200）稀释于封闭液中，4℃过夜或37℃孵育2小时。1％ BSA的PBS洗3遍，每遍5分钟。加入二抗（1：50－1：200）稀释于二抗稀释液中，37℃避光放置1小时。PBS洗3遍，每遍5分钟。加入终浓度的DAPI，室温放置
5分钟。PBS洗3遍，每遍5分钟。加入500μl PBS或PBS甘油（1：1）在荧光
显微镜下拍照或避光保存。图6中（1-3）说明分化的卵母细胞呈Dazl阳性并在
细胞质表达，图6中（4-6）说明分化的卵母细胞呈Vasa阳性并在细胞质表达，图6中（7-9）说明分化的卵母细胞呈ZP-3阳性并在细胞核表达。
[0058] 对所公开的实施例的上述说明，仅为了使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种
修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
