一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法
技术领域
[0001] 本
发明实施例涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种马的骨骼肌卫星细胞的培养体系。
背景技术
[0002] 目前，赛马和娱乐用马是未来马产业发展的主流，而马在运动过程中肌肉会根据运动量的大小受到不同程度的损伤，使马的运动性能受到影响，而在赛马和马术运动中马具有良好的运动性能是必要的条件。骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中具有增殖、分化的肌源性干细胞，在骨骼肌再生过程中起着不可或缺的作用，骨骼肌卫星细胞在
机体成年后大部分是静止的，只会在组织受到损伤时，才会被激活进行增殖、分化，促进肌
纤维的修复。骨骼肌卫星细胞是用于研究肌肉生长发育，损伤与修复，与肌肉相关的
疾病等方面的重要细胞模型。
发明内容
[0003] 为此，本发明实施例提供一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法，以解决
现有技术中的缺乏有效对马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法问题。
[0004] 为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
[0005] 一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法，其包括将马肌肉
块灭菌、清除脂肪组织和结缔组织后，
粉碎成块状肌肉组织；
[0006] 将所述块状肌肉组织经胰蛋白酶消化后，离心分离得到第一上清液和第一沉淀物；
[0007] 将所述第一上清液离心，得到第二上清液和第二沉淀物，弃所述第二上清液，将所述第二沉淀物用增殖培养液重悬、离心后，得到第三上清液和第三沉淀物，弃所述第三上清液，将所述第三沉淀物增殖培养液悬浮，过细胞
过滤器，收集第一滤液，将所述第一滤液离心后，得到第四沉淀物；
[0008] 将所述第一沉淀物经过胶原酶消化处理后，过细胞过滤器，得到第二滤液，将所述第二滤液离心后，得到第四上清液和第五沉淀物，将所述第四上清液进一步离心得到第六沉淀物，将所述第五沉淀物和第六沉淀物混合后，用增殖培养液悬浮，离心后得到第五上清液和第七沉淀物；
[0009] 将所述第四沉淀物悬浮液和和第七沉淀物悬浮液混合，离心，得到第六上清液和第八沉淀物；
[0010] 所述第八沉淀物用增殖培养液悬浮，经细胞过滤器过滤后，得到第三滤液，将所述第三滤液离心，得到第九沉淀物马骨骼肌卫星细胞；
[0011] 将所述第九沉淀物用增殖培养液悬浮，培养，通过差速贴壁法纯化得到纯化的马骨骼肌卫星细胞。
[0012] 优选的，所述马肌肉块灭菌采用70％
乙醇浸泡灭菌。
[0013] 优选的，所述马肌肉块粉碎前，用含有青霉素
链霉素的DPBS冲洗所述马肌肉块直至DPBS澄清无血色。
[0014] 优选的，所述胰蛋白酶的
质量分数为0.25％。
[0015] 优选的，所述离心过程为700rpm-2000rpm，离心时间为5-15min。
[0016] 优选的，所述第一滤液、第二滤液均采用70μm细胞过滤器，所述第三滤液采用40μm过滤器。
[0017] 优选的，所述增殖培养液包括以下质量分数的原料：20％胎
牛血清，1％青霉素链霉素和两性霉素B以及余量的DMEM。
[0018] 优选的，所述胶原酶为Ⅳ型胶原酶，其通过DMEM稀释浓度至1mg/1mL。
[0019] 本发明实施例具有如下优点：
[0020] 本发明实施例建立马骨骼肌卫星细胞的培养体系及方法，分离出来成梭形，且生长状态良好，可以正常增殖传代的马骨骼肌卫星细胞。
[0021] 本发明实施例通过增加多次离心和清洗的步骤使得到的原代细胞干净无菌，并且通过差速贴壁法去除杂质、细胞碎片、
成纤维细胞等来纯化马骨骼肌卫星细胞。
[0022] 本发明实施例通过纯化提高骨骼肌卫星细胞的数量和纯度，为研究肌肉生长、肌肉损伤等科研院校提供了一种准确的骨骼肌卫星细胞的获取方法，为骨骼肌卫星细胞用于肌肉的再生和损伤修复提供有利条件和研究
基础，具有巨大的科研和社会价值。
附图说明
[0023] 为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0024] 图1为本发明实施例提供的原代培养的骨骼肌卫星细胞
显微镜图，其中，A：分离第1天的肌卫星细胞；B：原代第3天的肌卫星细胞；C：原代第5天的肌卫星细胞；D：原代第7天的肌卫星细胞；
[0025] 图2为本发明实施例提供的未分化与分化的肌卫星细胞图，其中，A：分化前达到80％汇合的肌卫星细胞；B：分化后产生肌管；
[0026] 图3为本发明实施例提供的差速贴壁法鉴定骨骼肌卫星细胞图，其中，A：成纤维细胞贴壁1h；B：成纤维细胞贴壁4h；C：成纤维细胞贴壁8h；D：骨骼肌卫星细胞贴壁1h；E：骨骼肌卫星细胞贴壁4h；F：骨骼肌卫星细胞贴壁8h；
[0027] 图4为本发明实施例提供的RT-PCR产物鉴定肌卫星细胞
电泳图，其中，M:maker，泳道1：GAPDH，泳道2：Pax7，泳道3：Myod，泳道4：Desmin；
[0028] 图5为本发麻实施例提供的免疫
荧光鉴定肌卫星细胞图，其中，A，D，G为肌卫星细胞Hoechst核染；B：Pax7阳性表达；E：Myod阳性表达；H：desmin阳性表达；C,F,I为Merged图。
具体实施方式
[0029] 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本
说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030] 本发明实施例中，Ⅳ型胶原酶的配置浓度为：1mg/1mL，用DMEM稀释并经0.22μm过滤器过滤。
[0031] 本发明实施例中，增殖培养液的配置方法为：20％胎牛血清(FBS)，1％青霉素链霉素和两性霉素B，DMEM补充，并经0.22μm过滤器过滤。
[0032] 本发明实施例中，分化培养液的配置方法为：2％马血清，1％青霉素链霉素，余量用DMEM补充，并经0.22μm过滤器过滤。
[0033] 本发明实施例中，DMEM购自gibco公司货号2066482。
[0034] 本发明实施例中，DPBS购自gibco公司货号2043115，DPBS为袋装粉末状，每袋的DPBS溶于1L的蒸馏
水内，由此配制成DPBS溶液。
[0035] 本发明实施例中所采用的仪器如下：TD6A-WS台式离心机、HWS-26型电热恒温水浴锅、Thermo Scientific HERAcell 150i CO2
培养箱、ZEISS倒置相差显微镜、CFX96实时荧光定量PCR仪器、Bio-Rad凝胶成像系统、ECHO revolve FL荧光显微镜
[0036] 实施例1、马骨骼肌卫星细胞的分离培养
[0037] 本发明实施例的马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法包括以下步骤：
[0038] 1、采集2岁的马匹的肌肉，在培养皿中用70％乙醇快速将马肌肉浸泡灭菌，将灭菌后的肌肉样品立即转移到含有青霉素链霉素的DPBS的新培养皿中，并用3倍体积的DPBS冲洗直至DPBS澄清无血色。其中，DPBS要提前加入1％青霉素链霉素并经0.22μm过滤器过滤。
[0039] 2、将冲洗后的马肌肉块上可见的脂肪和结缔组织用手术刀去除，在含有DMEM的培养皿中用
剪刀切碎块状马肌肉组织，并将该肌肉组织剪碎至1mm3大小。
[0040] 将剪碎后的肌肉组织转移到15mL离心管内，1000rpm离心5min。分离带有块状肌肉组织的沉淀与上清液，弃去上清液，收集肌肉组织沉淀于15mL离心管内，并加入3倍体积的0.25％胰蛋白酶消化，在37℃水浴中，每间隔10min振荡一次，消化1h。用移液管来回抽吸消化的肌肉组织10-15次，温和解离细胞。将15mL离心管200rpm离心5min,分离第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物保存在
冰上，将第一上清液转移到15mL离心管内，2000rpm离心
5min，得到第二上清液和第二沉淀物，用5mL增殖培养液重悬第二沉淀物，然后2000rpm离心
10min，得到第三上清液和第三沉淀物，将第三沉淀物用3mL增殖培养液悬浮第三沉淀物，悬浮液通过70μm的细胞过滤器，收集得到第一滤液，将第一滤液2000rpm离心10min，得到第四沉淀物，将第四沉淀物用1mL增殖培养液悬浮，置于冰上保存。
[0041] 用Ⅳ型胶原酶将第一沉淀物消化1h，同样用移液管抽吸10-15次，温和解离细胞，消化结束后用70μm过滤器过滤，得到第二滤液，然后，将第二滤液2000rpm离心5min，得到第四上清液和第五沉淀物，并将第四上清液再次2000rpm离心10min，得到第六沉淀物，之后将第五沉淀物和第六沉淀物混合，用5mL增殖培养液悬浮，将细胞悬液2000rpm离心5min，得到第五上清液和第七沉淀物，用1mL增殖培养液悬浮置于冰上。将第四沉淀物悬浮液和和第七沉淀物悬浮液混合，并2000rpm离心5min，收集沉淀。用5mL DPBS悬浮，再次2000rpm离心10min，收集沉淀，得到第八沉淀物。
[0042] 将第八沉淀物用5mL增殖培养液悬浮，并用40μm过滤器过滤，得到第三滤液，向第三滤液中加入增殖培养液使其体积在10mL，700rpm离心10min，收集沉淀，得到第九沉淀物。
[0043] 4、用2mL温热的增殖培养液悬浮第九沉淀物获得细胞悬液，将细胞悬液铺在培养皿中。利用差速贴壁法纯化骨骼肌卫星细胞，37℃和5％CO2下培养2h。将培养了两小时的细胞将上清液转移到新的培养皿中，37℃和5％CO2下培养，得到纯化的马骨骼肌卫星细胞。
[0044] 将上述培养得到的马骨骼肌卫星细胞，在显微镜下观察，如图1所示，骨骼肌卫星细胞在刚刚分离出来时呈圆形细胞，前三天只有少量细胞贴壁，之后贴壁细胞随着时间增长而逐渐增多，细胞贴壁后开始增殖生长，细胞呈梭形和长纤维形，在形态上与马骨骼肌卫星细胞形态相吻合，并且具有正常生长，增殖，传代的特性。
[0045] 实施例2、诱导分化法鉴定马骨骼肌卫星细胞
[0046] 将本发明实施例1培养得到的马骨骼肌卫星细胞在达到70％-80％汇合的时候，加入低血清的分化培养液进行诱导分化。如图2所示，结果发现用分化培养液诱导分化后，培养得到的细胞呈规律性的平行排列，细胞伸长、变细,大量增殖的细胞之间发生融合,并可以观察到肌管的形成，符合骨骼肌卫星细胞的分化特征。
[0047] 实施例3、差速贴壁法鉴定马骨骼肌卫星细胞
[0048] 实施例1细胞培养的过程中可能会受到成纤维细胞的污染，用差速贴壁法来纯化马骨骼肌卫星细胞，马骨骼肌卫星细胞贴壁时间较长，而成纤维细胞贴壁时间很快，对骨骼肌卫星细胞和成纤维细胞进行贴壁时间的观察，并根据此特征鉴定马骨骼肌卫星细胞。如图3所示，结果发现马骨骼肌卫星细胞的在1小时无细胞贴壁，而成纤维细胞在1小时就已经有少数开始贴壁，马骨骼肌卫星细胞的在4小时刚刚开始贴壁，而成纤维细胞已经开始贴壁生长，细胞形态开始呈长条纤维状。当贴壁时间为8小时，马骨骼肌卫星细胞开始贴壁生长，而成纤维细胞已经达到高度汇合，此结果符合骨骼肌卫星细胞贴壁时间长的特征。
[0049] 实施例4、RT-PCR法鉴定马骨骼肌卫星细胞
[0050] 从实施例1培养的细胞骨骼肌卫星细胞内提取RNA，反转录为cDNA，并根据特异性表达基因Myod、Pax7、Desmin设计相应的引物，其中所用到的引物如表1所示。RT-PCR反应体系reuse表2所示，反应条件如表3所示。
[0051] 表1
[0052] 序列号 Primer名称 序列(5'to 3')SEQ ID NO:1 myod1-S GAACCGCTACGATGGCACCTACTAC
SEQ ID NO:2 myod1-A CCACGATGCTAGACAGGCAGTCAAG
SEQ ID NO:3 pax7-S GTGCCCTCAGTGAGTTCGATTAGC
SEQ ID NO:4 pax7-A CTTGGCTTTATTCTCGCCGTCGT
SEQ ID NO:5 desmin-S GCCAAGCAGGCGATGATGGAGTAC
SEQ ID NO:6 desmin-A GTAGGACTGGATCTGGTGTCGGTAC
[0053] RT-PCR反应体系如表2所示。
[0054] 表2
[0055]
[0056] 表3
[0057]
[0058] 并将RT-PCR产物进行凝胶电泳跑胶，如图4所示，为扩增特异性表达基因Myod、Pax7、Desmin的DNA
片段，其中，扩增基因Myod的DNA片段大小为92bp，基因Pax7的DNA片段大小为100bp，基因Desmin的DNA片段大小为80bp。特异性表达基因Myod、Pax7、Desmin均为阳性表达，本发明实施例1培养出的细胞为马骨骼肌卫星细胞。
[0059] 实施例5、细胞免疫荧光鉴定马骨骼肌卫星细胞
[0060] 将实施例1培养得到的马骨骼肌卫星细胞，当细胞达到70％-80％汇合的时候，加入4％的多聚甲
醛固定40min并清洗一遍。透膜液4℃孵育过夜，清洗一遍，加入2％BSA封闭液封闭1h。用封闭液稀释一抗(Pax7、Myod、Desmin)4℃孵育过夜，清洗三遍，每遍十分钟。用清洗液稀释二抗室温下孵育1h，清洗三遍，每遍十分钟。用清洗液稀释hoechst核染十分钟，清洗一遍。将切片在荧光显微镜下观察并拍照。如图5免疫荧光照片图，结果显示特异性表达的Pax7、Myod、Desmin
抗体呈阳性表达，本发明实施例1培养得出的细胞为马骨骼肌卫星细胞。
[0061] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0062]
[0063]
