一种牙髓干细胞的制备方法
阅读：629发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种牙髓干细胞的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于细胞培养技术领域，特别是涉及一种 牙髓 干细胞的制备方法，该方法包括：从 牙齿 中取出牙髓组织并剪碎牙髓组织；将剪碎后的牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中，离心，然后去掉上清液，得到牙髓组织液；向牙髓组织液中添加Ⅰ型胶原酶，并在特定 温度 下消化；向消化后的牙髓组织液中继续添加牙髓干细胞培养基，并提纯得到牙髓干细胞单细胞悬液；基于牙髓干细胞单细胞悬液制备得到牙髓干细胞。本发明使用了酶消化法制备牙髓干细胞，酶消化法比组织贴壁法培养细胞具有更高效率的优点，细胞可以在短时间内贴壁，使后续干细胞培养更为简单快捷；本发明制备的细胞免疫原性低，适用人群范围广，且后续扩增方便，细胞活性高符合临床应用要求。，下面是一种牙髓干细胞的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种牙髓干细胞的制备方法，其特征在于，包括：
从牙齿中取出牙髓组织并剪碎所述牙髓组织；
将剪碎后的所述牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中，离心，然后去掉上清液，得到牙髓组织液；
向所述牙髓组织液中添加Ⅰ型胶原酶，并在特定温度下消化；
向消化后的所述牙髓组织液中继续添加所述牙髓干细胞培养基，并提纯得到牙髓干细胞单细胞悬液；
基于所述牙髓干细胞单细胞悬液制备得到牙髓干细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为10mg/ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牙髓组织液中的牙髓组织在Ⅰ型胶原酶中消化时，消化温度为37℃，消化时间为30-45min。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述牙髓组织液中的牙髓组织在Ⅰ型胶原酶中消化时，每隔10min震荡一次所述牙髓组织液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在将剪碎后的牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中然后离心时，离心条件如下：
离心温度20℃，离心力1200rpm/min--1500rpm/min，离心时间10分钟。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基于所述牙髓干细胞单细胞悬液制备得到牙髓干细胞，具体如下：
取出6孔板；
将所述牙髓干细胞单细胞悬液中的牙髓干细胞接种到6孔板中进行培养；
定时更换细胞培养液；
培养结束，得到牙髓干细胞。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在从牙齿中取出牙髓组织前，对牙齿进行清洁。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在对牙齿进行清洁时的清洁方式如下：
利用酒精或碘伏初步清洁牙齿表面；
将初步清洁后的牙齿浸于含有青霉素和链霉素的无菌PBS溶液中，进行消毒，得到清洁后的牙齿。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牙齿为智齿。
10.根据权利要求1-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
对所述牙髓干细胞进行流式细胞鉴定。
一种牙髓干细胞的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞技术领域，尤其设计一种牙髓干细胞的制备方法。
背景技术
[0002] 牙髓干细胞是来源于牙齿的间充质干细胞，具有很强的自我更新能力和多向分化潜能。体外人工添加不同的诱导剂或移植到特性的体内环境，可将牙髓干细胞诱导分化为成牙本质细胞、软骨细胞、肌细胞、肝细胞和胰腺细胞样细胞等多种组织细胞，并且，牙髓干细胞比一般的自体细胞免疫原性低，在未来细胞治疗进展中，具有很大的研究价值。
[0003] 在细胞培养制备中，传统技术单单利用牙髓组织是难以分离出牙髓干细胞，需要对牙髓组织进行处理，牙髓干细胞才会正常生长、增值。
[0004] 由于牙齿表面残留部分牙龈和牙周组织，在取出牙髓以及细胞培养的过程极易形成污染。同时，组织贴壁法成功率较低，且组织容易失活，14天的组织贴壁很有可能得不到牙髓干细胞，造成效率低，浪费时间等问题。
发明内容
[0005] 本发明实施方式主要提供一种通过组织消化法制备牙髓干细胞的制备方法，以解决传统牙髓干细胞难培养，制备效率低的技术问题。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明实施方式采用的一个技术方案是：提供一种牙髓干细胞的制备方法，所述方法包括：从牙齿中取出牙髓组织并剪碎所述牙髓组织；将剪碎后的所述牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中，离心，然后去掉上清液，得到牙髓组织液；向所述牙髓组织液中添加Ⅰ型胶原酶，并在特定温度下消化；向消化后的所述牙髓组织液中继续添加所述牙髓干细胞培养基，并提纯得到牙髓干细胞单细胞悬液；基于所述牙髓干细胞单细胞悬液制备得到牙髓干细胞。
[0007] 可选地，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为10mg/ml。
[0008] 可选地，所述牙髓组织液中的牙髓组织在Ⅰ型胶原酶中消化时，消化温度为37℃，消化时间为30-45min。
[0009] 可选地，所述牙髓组织液中的牙髓组织在Ⅰ型胶原酶中消化时，每隔10min震荡一次所述牙髓组织液。
[0010] 可选地，在将剪碎后的牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中然后离心时，离心条件如下：离心温度20℃，离心力1200rpm/min--1500rpm/min，离心时间10分钟。
[0011] 可选地，所述基于所述牙髓干细胞单细胞悬液制备得到牙髓干细胞，具体如下：取出6孔板；将所述牙髓干细胞单细胞悬液中的牙髓干细胞接种到6孔板中进行培养；定时更换细胞培养液，培养结束，得到牙髓干细胞。
[0012] 可选地，在从牙齿中取出牙髓组织前，对牙齿进行清洁。
[0014] 可选地，所述牙齿为智齿。
[0015] 可选地，所述方法还包括：对所述牙髓干细胞进行流式细胞鉴定。
[0016] 本发明实施例提供的牙髓干细胞的制备方法具有如下益效果：本发明获取的免疫细胞免疫原性低，适用人群范围广，制备出来的免疫细胞纯度较高，且后续扩增方便，细胞活性高；本发明通过组织消化法制备牙髓干细胞，使用了Ⅰ型胶原酶，Ⅰ型胶原酶主要水解结缔组织中胶原蛋白成分，用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，酶消化法比一般的组织贴壁法培养细胞具有更高效率的优点，细胞可以在短时间内贴壁，使后续干细胞培养更为简单快捷；本发明的制备方法是利用酒精或碘伏清洁牙齿表面，再将其浸于含有青霉素和链霉素的无菌PBS溶液中，对组织进行简单的消毒，避免后续培养的污染；制备过程中样本没有经过冻存，避免了加入冻存保护剂，因此最终的干细胞中没有任何新加的成分，降低人群中应用的风险。附图说明
[0017] 图1是本发明实施例提供的一种牙髓干细胞的制备方法的示意图。
具体实施方式
[0018] 为了使本发明的目的、方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
[0019] 本发明实施例首先提供一种牙髓干细胞的制备方法，如图1所示，所述方法包括如下步骤：
[0020] 步骤210、从牙齿中取出牙髓组织并剪碎所述牙髓组织。
[0022] 其中，该“从牙齿中取出牙髓组织”不限于从活体中收集牙髓组织，还包括冷冻保藏之后解冻牙髓组织。并且，该牙髓组织的来源不限于人类，并且可以是其他哺乳类动物。
[0023] 此步骤在从牙齿上取出所述牙髓组织之前，需要首先对对临床上拔出的正常牙齿进行清洁。其清洁方式如下：首先剔除牙齿表面残留的牙龈和牙周组织，再用精或碘伏清洁牙齿表面，并将牙齿置于含有青霉素和链霉素的无菌磷酸缓冲盐(PBS，phosphate buffer saline)溶液中，进行消毒，得到清洁后的牙齿。
[0025] 步骤220、将剪碎后的牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中，并再离心后去掉上清液，得到牙髓组织液。
[0026] 此步骤在于对牙髓组织进行初步处理，以得到可以后续培养的牙髓组织液。具体地，首先将剪碎的牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中，在离心后去掉上清液(细胞通过离心的方式使其聚集，帮助对其进行换液)，最后得到牙髓组织液，牙髓组织液中包含牙髓组织。
[0027] 不同的细胞组织适合不同的离心力，在一实施例中，该离心条件是室温20℃，离心力1200rpm/min--1500rpm/min，离心时间10分钟。叫小的离心力会由于离心力较小而导致细胞不容易分离，而较大的离心力则容易在离心过程中，让细胞之间容易撞击而裂开。
[0028] 步骤230、向所述牙髓组织液中添加Ⅰ型胶原酶在特定温度下消化。
[0029] 由于牙髓干细胞相互之间在牙髓组织液中会发生接触抑制，使其不能大规模，大量的增殖，相互之间无法进行分裂。牙髓干细胞需要增殖则需要通过消化使其中粘连得蛋白分解掉，使牙髓干细胞处于分散状态，这样有利于牙髓干细胞进行营养交换。
[0030] 此步骤即通过胶原酶对其进行消化，胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。
[0031] 具体地，本发明选用Ⅰ型胶原酶对其进行消化，Ⅰ型胶原酶主要用于用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离，用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞。Ⅰ型胶原酶的制备方法为本领域常技术人员所熟知，在此不再赘述。
[0032] 在消化过程中，温度升高，在未达到最适温度前，Ⅰ型胶原酶的活性会增强，直到达到最适温度时的最大活性，之后再升温则消化酶活性逐渐降低，当升高到一定温度时消化酶变性失活，在本发明限定的37℃，为Ⅰ型胶原酶的活性最适温度。消化时间为30-45min，在一些实施例中，为了防止牙髓组织沉积而消化不全，可以每隔10min震荡一次牙髓组织液。
[0033] 步骤240、向消化后的所述牙髓组织液中继续添加所述牙髓干细胞培养基，并离心、过滤得到牙髓干细胞单细胞悬液。
[0034] 在消化结束后，需要向消化后的所述牙髓组织液中继续添加所述牙髓干细胞培养基。
[0035] 在本实施例中，可以向消化后的所述牙髓组织液加入5倍体积的牙髓干细胞培养基，然后离心，使得牙髓组织液中的细胞置于完全培养基中，然后用70μm的细胞筛过滤，得到牙髓干细胞单细胞悬液。
[0036] 步骤250、基于所述髓干细胞单细胞悬液制备得到牙髓干细胞。
[0037] 在得到牙髓干细胞单细胞悬液后，可以对牙髓干细胞进行接种培养，在一具体实施例中，可以取出6孔板(6孔板的底面积为9.6cm2，培养液的量为2.5ml，细胞接种量1.2*106)，将牙髓干细胞接种到6孔板中进行培养。然后，每隔2天进行细胞换液，根据细胞生长情况进行传代，培养结束后，得到牙髓干细胞。当然在实际操作中，试验人员可以根据实际情况，选择合适此处的孔板并且及时进行细胞换液，以最终得到牙髓干细胞，本发明对此并不做限制。
[0038] 本发明实施例提供的牙髓干细胞的制备方法具有如下益效果：
[0039] 1、本发明获取的免疫细胞免疫原性低，适用人群范围广，制备出来的免疫细胞纯度较高，且后续扩增方便，细胞活性高；
[0040] 2、本发明制备方法使用了Ⅰ型胶原酶，Ⅰ型胶原酶主要水解结缔组织中胶原蛋白成分，用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，酶消化法比一般的组织贴壁法培养细胞具有更高效率的优点，细胞可以在短时间内贴壁，使后续干细胞培养更为简单快捷；
[0041] 3、本发明的制备方法是利用酒精或碘伏清洁牙齿表面，再将其浸于含有青霉素和链霉素的无菌PBS溶液中，对组织进行简单的消毒，避免后续培养的污染；
[0042] 4、制备过程中样本没有经过冻存，避免了加入冻存保护剂，因此最终的干细胞中没有任何新加的成分，降低人群中应用的风险。
[0043] 为了详细说明本发明的制备过程，以下通过多个具体实施例制备得到多份牙髓干细胞来进一步说明。该具体制备过程具体如下：
[0044] (1)收集临床上拔出的正常牙齿；
[0045] (2)清洁牙齿；
[0046] 剔除牙齿表面残留的牙龈和牙周组织，用酒精或碘伏清洁牙齿表面之后，将牙齿置于含有青霉素和链霉素的无菌PBS溶液中进行消毒，得到清洁后的牙齿。
[0047] (3)取出牙髓组织；
[0048] 具体取出方式如下：首先用高速裂钻横向切割清洁后的牙齿，然后用骨钳将清洁后的牙齿掰开，使用无菌的镊子或者拔髓针将牙髓组织取出，并使用外科手术剪刀将牙髓组织剪碎。
[0049] (4)离心分液；
[0050] 将剪碎的牙髓组织置于装有牙髓干细胞培养基的试管中，离心，然后去掉上清液，离心条件为室温20℃，离心力1500rpm/min，离心时间10分钟。
[0051] (5)向试管底部的牙髓组织加入10mg/ml的Ⅰ型胶原酶中，在37℃消化30-45min，每隔10min震荡一次。
[0052] (6)置于培养基培养；
[0053] 消化结束后，向试管中加入5倍体积的牙髓干细胞培养基，离心后，将牙髓干细胞置于完全培养基中，用70μm的细胞筛过滤，得到牙髓干细胞单细胞悬液；
[0054] (7)传代培养；
[0055] 将牙髓干细胞接种到6孔板中进行培养，平均每隔2天进行细胞换液，并根据牙髓干细胞的生长情况进行传代，传到P4代，培养结束后，进行流式细胞鉴定(对应实施例1)。
[0056] (8)按照上述步骤(1)-(7)的制备方法，重复19次，制备得到20份牙髓干细胞(对应表1中的实施例2-实施例20)。
[0057] (9)细胞计数和细胞活性检测；
[0058] 分别统计上述制备方法获得的总计20份牙髓干细胞，进行P4代细胞消化后，对其分别进行细胞计数和细胞活性检测，统计结果如表1所示(其中，表1中的干细胞数是通过Countstar的细胞计数仪IM1200进行检测，细胞活性运用台盼蓝染色法进行检测)。
[0059] 表1
[0060]
[0061] 由实施例1-实施例20通过相同的方法制备得到的牙髓干细胞的结果可以得出以下结论：
[0062] 本发明提出的牙髓干细胞的制备方法，最终制备得到的牙髓干细胞至P4代，牙髓干细胞总数能增多至1.0--1.6*107个，而传统的组织贴壁法制备得到的牙髓干细胞总数却小于1*107个，组织消化法制备得到的牙髓干细胞比传统方法制备的牙髓干细胞数量显著提升。
[0063] 本发明制备方法诱导出的牙髓干细胞活性都在96％以上，而传统的组织贴壁法备得到的牙髓干细胞有将近50％的牙髓干细胞其活性小于96％；并且在实施例2-实施例5中，组织贴壁法得到的牙髓干细胞的活性小于95％，而组织消化法得到的牙髓干细胞的活性要大于97％，由此可知，通过组织消化法得到的牙髓干细胞，其细胞活性大大提高，并且牙髓干细胞长势良好，符合临床应用要求。
[0064] Ⅰ型胶原酶消化作用缓，既操作简便又可提高细胞成活率，但价格相对较高，本发明实施例限定Ⅰ型胶原酶的浓度为10mg/ml，这是因为：Ⅰ型胶原酶的浓度太低，则消化时间过长，消化效果不明显，而Ⅰ型胶原酶的浓度过高，则会导致实验成本大大增加，选用浓度为10mg/mlⅠ型胶是由发明人经过创造性劳动所得。
[0065] 本发明实施例限定牙髓组织在Ⅰ型胶原酶中消化时，消化温度为37℃，消化时间为30-45min。在消化过程中，温度升高，在未达到最适温度前，Ⅰ型胶原酶的活性会增强，直到达到最适温度时的最大活性，之后再升温则消化酶活性逐渐降低，当升高到一定温度时消化酶变性失活，在本发明限定的37℃，为Ⅰ型胶原酶的活性最适温度。
[0066] 在将剪碎后的牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中然后离心时，本发明实施例限定离心条件如下：离心温度20℃，离心力1200rpm/min--1500rpm/min，离心时间10分钟。
[0067] 不同的细胞组织适合不同的离心力，本发明实施例限定立离心力为1200rpm/min--1500rpm/min，叫小的离心力会由于离心力较小而导致细胞不容易分离，而较大的离心力则容易在离心过程中，让细胞之间容易撞击而裂开；本发明还限定离心温度为20℃，这是因为更高的离心温度容易使得牙髓干细胞有可能因高温而失去活性。
[0068] 通过本发明实施例提供的牙髓干细胞的制备方法，由牙髓消化出来的牙髓干细胞不仅能扩增，同时由于牙髓干细胞的免疫原性低，所得到的细胞免疫原性也低，将来可适用于广大范围的人群，为未来的研究树立一个很好的方向。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种线粒体-核仁可逆迁移荧光碳点的制备及在监测细胞活性中的应用 | 2020-05-08 | 390 |
| 一种制备乳腺癌骨转移类器官的方法 | 2020-05-08 | 358 |
| 促进人脐带间充质干细胞增殖的方法和应用 | 2020-05-08 | 689 |
| 一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法 | 2020-05-11 | 86 |
| 一种牙髓干细胞的制备方法 | 2020-05-13 | 629 |
| 离体组织保存液及其保存方法和应用 | 2020-05-08 | 1034 |
| 一种分离制备牙髓干细胞的方法 | 2020-05-12 | 823 |
| 一种赏食兼用盆栽羽衣甘蓝的栽培方法 | 2020-05-12 | 585 |
| 一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其应用 | 2020-05-11 | 458 |
| 番鸭精液常温保存稀释液的配制方法 | 2020-05-12 | 801 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈