一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法
专利汇可以提供一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，属于细胞培养技术领域。该方法包括以下步骤：(1) 取材，新鲜人乳腺组织标本；（2）经机械剪切、胶原酶和透明质酸酶联合消化，制备乳腺组织细胞悬液；(3) 通过低速及差速离心使不同细胞组分分层、分离；（4）经多次离心、洗涤及贴壁培养进行纯化，得到乳腺组织的的不同细胞组分，分别为上皮细胞、基质细胞和前脂肪细胞。本发明可快速、简便和有效地从同一乳腺组织中分离纯化不同细胞组分，所培养各乳腺细胞数量充足、细胞活 力 和纯度达95％以上。可为乳腺及 乳腺癌 相关分子 生物 学研究提供非常有用的材料以及为乳腺微环境多细胞培养模型的构建奠定了 基础 。，下面是一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法专利的具体信息内容。
1.一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：以新鲜乳腺组织为材料，经机械剪切、胶原酶和透明质酸酶联合消化、差速离心、洗涤、贴壁培养纯化，分离培养人乳腺组织中的上皮细胞、基质细胞以及前脂肪细胞；具体步骤如下：
（1）乳腺组织细胞悬液制备：取乳腺组织小块，剔除乳腺组织中的血块、血管及纤维组织，浸泡于75%的酒精中消毒30s，然后用培养液清洗三次，并将其剪碎，置于培养皿中，加入相当于乳腺组织量5-10倍体积的消化培养液，置于恒温恒湿培养箱中，摇床80转/min，过夜消化12-17h；用不含血清的DMEM/F12：1:1溶液将消化液稀释1-2倍，反复轻轻吹打分散组织，经低速离心后吸出上层脂肪层，并去上清液，重复操作1-2次，将大部分脂肪去除后，加入DMEM/F12：1:1溶液分散即得乳腺组织细胞悬液；
（2）将所得乳腺组织细胞悬液转移至离心管进行第一次低速离心，离心后细胞悬液可分为较明显的上、中、下三层，用移液管小心将这三层液体分别转移至三个不同的无菌试管中，用于进一步分离纯化前脂肪细胞、基质细胞和上皮细胞；
（3）以上各试管中分别加入无酚红无血清DMEM/F12：1:1培养液，用移液管上下吹吸，混匀，然后室温下进行第二次低速离心，弃去上清，底层沉淀为细胞团，再加入和上面相同的培养液，混匀，同样条件离心，如此分别反复操作3-5次，以去除杂质和其他种类细胞；
（4）将步骤（3）反复洗涤沉淀获得的细胞团中分别加入三种类型细胞各自的生长培养
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液，吸打均匀成细胞悬液，调整细胞密度为1×10/cm，分别接种培养瓶中，置于培养箱中
37℃恒温培养，贴壁后，换液除去死亡及未贴壁细胞，继续培养，分别培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的3种乳腺细胞；
（5）细胞的纯化：采用反复贴壁法，将步骤(4)得到的3种乳腺细胞分别经过滤、计数
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调整细胞密度至5×10 /ml，种植在细胞培养瓶中，置37℃，5% CO2培养箱培养；待细胞铺至板底80%时，再依次重复1-2次，分别得到预纯化的三种乳腺细胞；去除培养基，并用DMEM/F12液冲洗，随后加入EDTA-胰酶混合消化液消化细胞，至倒置显微镜下观察80-90%细胞回缩时终止，加入生长培养液，分别得到纯化的3种乳腺细胞；
（6）乳腺细胞的传代培养：将步骤(5)纯化后的各细胞组分分别离心，并用培养液洗
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涤细胞2-3遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×10 /ml的密度植入培养瓶中置
37℃，5% CO2培养箱培养，2-3天更换培养液，一般可传5～9代。
2.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（1）所述的消化培养液为： DMEM/F12：1:1作为基础培养液，基础培养液中还包含
1.05mM CaCl2， 5% BSA, 10ng/mL霍乱毒素，6000-6300 U/mL 胶原蛋白酶和80-110 U/mL透明质酸酶。
3.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（1）所述的恒温恒湿培养箱的温度为条件37℃，培养箱的气体为5% CO2和95%空气。
4.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（2）所述的低速离心为500-800 rpm离心5-10min。
5.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（3）所述的DMEM/F12培养液，内含双抗：100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素和0.25 g/mL两性霉素B。
6.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（3）所述的第二次低速离心为1000-1200 rpm离心5-8min。
7.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（6）所述的离心为1000 rpm离心5 min。
8.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（4）所述的三种乳腺细胞的生长培养液分别为：
a. 上皮细胞培养液：低钙无酚红DMEM∶F12（1:1），0.04 mM CaCl2、含5ug/ml氢化可的松、5 μg/mL 胰岛素、200ng/ml霍乱毒素CTX、20 ng/mL表皮细胞生长因子EGF、双抗：
100U/ml 青霉素和100ug/ml 链霉素、 0.25 g/mL两性霉素B，加Chelex-100树脂处理过的
10% 胎牛血清；
b.前脂肪细胞培养液：高钙无酚红DMEM∶F12=1:1，1.05 mM CaCl2、含双抗：100U/ml 青霉素和100ug/ml 链霉素，加10 % 胎牛血清；
c.基质细胞培养液：高钙无酚红DMEM∶F12=1:1，1.05 mM CaCl2、含双抗：100U/ml 青霉素和100ug/ml 链霉素、5 μg/mL 胰岛素，加5 % 胎牛血清。
9.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：所述新鲜乳腺组织包括正常乳腺组织和乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织，取自乳腺肿瘤切除术、乳房成形术、乳腺增生区段切除术临床上手术切除的人体乳腺组织。
一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法
技术领域
背景技术
发明内容
（1）取乳腺组织小块，剔除乳腺组织中的血块、血管及纤维组织，浸泡于75%的酒精中消毒30s，然后用DMEM/F12（1:1）培养液清洗三次，并将其剪碎，置于培养皿中，加入相当于乳腺组织量5-10倍体积的消化培养液（DMEM/F12（1:1）基础培养液中包含1.05mM CaCl2,
5% BSA, 10ng/mL霍乱毒素，6000-6300 U/mL 胶原蛋白酶和80-110 U/mL 透明质酸酶），置于恒温恒湿培养箱中（5% CO2，95% 空气，37℃），摇床80转/min，过夜消化12-17h；用不含血清的DMEM/F12溶液将消化液稀释1-2倍，反复轻轻吹打分散组织，经低速离心后吸出上层脂肪层，并去上清液，重复操作1-2次，将大部分脂肪去除后，加入DMEM/F12溶液分散即得乳腺组织细胞悬液；
（2）将所得乳腺组织细胞悬液转移至离心管进行第一次低速离心（500-800 rpm，
5-10min），离心后可分为较明显的上、中和下三层，用移液管小心将其分别转移至不同的无菌试管中，分别用于进一步分离纯化前脂肪细胞、基质细胞和上皮细胞；
（3）以上各试管中分别加入无酚红无血清DMEM/F12（1:1）培养液，内含双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素）和 0.25 g/mL两性霉素B），用移液管上下吹吸，混匀，然后室温下进行第二次低速离心（1000-1200 rpm, 5-8min），弃去上清，底层沉淀为细胞团，再加入和上面相同的培养液，混匀，同样条件离心，如此分别反复操作3-5次，以去除杂质和其他种类细胞；
（4）将步骤（3）反复洗涤沉淀获得的细胞小球中分别加入三种类型细胞各自的生长
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培养液，吸打均匀成细胞悬液；调整细胞密度为1×10/cm，接种培养瓶中，置于培养箱中
37℃恒温培养，贴壁后，换液除去死亡及未贴壁细胞，继续培养，分别培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的3种乳腺细胞；
（5）细胞的纯化：采用反复贴壁法，将步骤(4)得到的3种乳腺细胞分别经过滤、计数调
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整细胞密度至5×10 /ml，种植在细胞培养瓶中，置37℃，5% CO2培养箱培养；待细胞铺至板底80%时，再依次重复1-2次，分别得到预纯化的三种乳腺细胞；去除培养基，并用DMEM/F12液冲洗，随后加入EDTA-胰酶混合消化液消化细胞，至倒置显微镜下观察80-90%细胞回缩时终止，加入生长培养液，分别得到纯化的3种乳腺细胞；
（6）乳腺细胞的传代培养：将步骤(5)纯化后的各细胞组分分别离心（1000 rpm， 5
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min），并用培养液洗涤细胞2-3遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×10 /ml的密度植入培养瓶中置37℃，5% CO2培养箱培养，2-3天更换培养液，一般可传5～9代；
（7）三种乳腺细胞的生长培养液分别为：
a. 上皮细胞培养液：低钙无酚红DMEM/F12（1:1）（0.04 mM CaCl2），含5ug/ml氢化可的松、5 μg/mL 胰岛素、200ng/ml霍乱毒素（CTX）、20 ng/mL表皮细胞生长因子（EGF），双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素）和 0.25 g/mL两性霉素B，加Chelex-100树脂处理过的10% 胎牛血清；
b.前脂肪细胞培养液：高钙无酚红DMEM/F12（1:1）（1.05 mM CaCl2），含双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素），加10 % 胎牛血清；
c.基质细胞培养液：高钙无酚红DMEM/F12（1:1）（1.05 mM CaCl2），含双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素）和5 μg/mL 胰岛素，加5 % 胎牛血清。
（2）本发明建立的人乳腺组织不同细胞组分的分离培养方法简便易行，所获细胞活力和纯度达95％以上，可为相关研究提供较好的细胞模型。
附图说明
图3原代培养人乳腺上皮细胞免疫荧光鉴定（1300X）. A．乳腺上皮细胞核（DAPI染色），荧光显微镜下呈蓝色；B. 同一视野下的乳腺上皮细胞Cytokeratin在细胞质中的表达，荧光显微镜下呈红色；C. 是A和B的叠加；
图4原代培养人乳腺基质细胞免疫荧光鉴定（430X）. A．乳腺基质细胞核（DAPI染色），荧光显微镜下呈蓝色；B. 同一视野下的乳腺上皮细胞Vimentin在细胞质中的表达，荧光显微镜下呈红色；C. 是A和B的叠加；
图5人乳腺前脂肪细胞的鉴定（200 X）.A. 分化后形成的脂肪滴; B. 脂肪细胞油红-O染色。
具体实施方式
长培养液，吸打均匀成细胞悬液。调整细胞密度为1×10/cm，接种培养瓶中，置于培养箱中
37℃恒温培养，贴壁后，换液除去死亡及未贴壁细胞，继续培养。分别培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的3种乳腺细胞；
（3）细胞的纯化：采用反复贴壁法，将步骤(2)得到的3种乳腺细胞分别经过滤、计数调
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整细胞密度至5×10 /ml，种植在细胞培养瓶中，置37℃，5% CO2培养箱培养；待细胞铺至板底80%时，再依次重复1-2次，分别得到预纯化的三种乳腺细胞；去除培养基，并用DMEM/F12液冲洗，随后加入EDTA-胰酶混合消化液消化细胞，至倒置显微镜下观察80-90%细胞回缩时终止，加入生长培养液，分别得到纯化的3种乳腺细胞；
（4）乳腺细胞的传代培养：将步骤(3)纯化后的各细胞组分分别离心（1000 rpm， 5
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min），并用培养液洗涤细胞2-3遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×10 /ml的密度植入培养瓶中置37℃，5% CO2培养箱培养，2-3天更换培养液，一般可传5～9代；
（5）三种乳腺细胞的生长培养液分别为：
a. 上皮细胞培养液：低钙无酚红DMEM/F12（1:1）（0.04 mM CaCl2），含5ug/ml氢化可的松、5 μg/mL 胰岛素、200ng/ml霍乱毒素（CTX）、20 ng/mL表皮细胞生长因子（EGF），双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素）和 0.25 g/mL两性霉素B，加Chelex-100树脂处理过的10% 胎牛血清；
b.前脂肪细胞培养液：高钙无酚红DMEM/F12（1:1）（1.05 mM CaCl2），含双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素），加10 % 胎牛血清；
c.基质细胞培养液：高钙无酚红DMEM/F12（1:1）（1.05 mM CaCl2），含双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素）和5 μg/mL 胰岛素，加5 % 胎牛血清；
（6）形态观察及鉴定
每天用倒置显微镜直接观察贴壁的活细胞生长情况，并拍照。
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