技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，具体地，涉及一种原代鸡肝细胞的分离培养方法。
背景技术
[0002] 利用原代肝细胞进行体外实验，与其他体外及体内实验方法相比，有自身显著的优点。原代培养的肝细胞不受体内神经内分泌系统的复杂影响，且能保持肝细胞的特异性功能，并维持对一些
激素的
反应性，因此，原代培养的肝细胞是研究肝脏物质代谢及其调节机制的极好模型。
[0003] 肝细胞的分离最初采用的是离体灌流法。到1975年，Seglen采用原位两步胶原酶灌流法成功地分离得到高活率的大鼠肝细胞，1992年，Fraslin等对Seglen的原位两步灌9 9
流法进行改进，并应用于成年鸡肝细胞的分离，每只鸡的肝脏可获得0.5×10-1×10个肝细胞，细胞活率在75%-95%之间。同之前的肝脏离体灌流相比较，原位灌流由于鸡只的肝脏和心脏尚有一定血液循环能
力，使得初步冲洗灌流液灌流效果好，不易凝血和出现灌流死
角，所以鸡肝细胞的分离大多采用原位灌流方法。但是，原位灌流也存在一个巨大的问题，灌流肝脏始终处于开放的
腹腔环境中，而鸡只又不可能完全无菌，这就导致肠道、
羽毛及鸡只附带杂物等对肝脏灌流造成污染的
风险，而细胞污染是所有细胞培养都要面临的棘手问题，细胞一旦污染，会严重影响细胞的正常生长和代谢。同时，胶原酶价格昂贵，每只鸡肝脏的消化灌流都要消耗几百毫升的胶原酶灌流液，导致灌流成本高昂。
[0004] 另外，肝细胞的培养有赖于血清的存在，在普通培养液中，如不加血清，绝大部分肝细胞不能增殖。血清的主要作用在于提供细胞生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，维持细胞较好的生长状态，促进细胞的生长与分裂增殖。然而加入血清培养细胞也有其不利的方面：第一，血清成分非常复杂、不明确，在肝细胞培养中使用血清，会影响肝细胞
基础代谢，对以肝细胞培养为基础的研究和生产造成影响；第二，血清中的某些生物活性物质会毒害肝细胞并干扰其生物转化；第三，血清可能带来病毒、
真菌和支原体等微
生物污染的危险；第四，血清中的某些蛋白会对生物测定产生干扰，不便于对实验结果的分析。而对于鸡肝细胞的无血清培养，国内尚未建立成熟的、培养时间长、
稳定性高的方法。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对上述技术现状，提供一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，降低鸡肝细胞分离过程的污染和灌流成本，同时，建立一种适于鸡肝细胞培养的无血清培养方法。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
[0007] 一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤1：将取得的鸡肝脏使用添加有2%双抗的D-Hanks溶液浸泡冲洗后，灌注37℃预热的灌流液A8分钟-10分钟，然后灌注37℃预热的灌流液B5分钟-8分钟；其中，所述的灌流液A配方为：15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HPO4·12H2O，并添加有0.6mM/L的EGTA及2%双抗，所述的灌流液B配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/LKCl，0.7mM/L Na2HPO4·12H2O，3mM/L CaCl2，并添加有2%双抗；
[0009] 步骤2：将肝脏转移到无菌的烧杯里，把烧杯浸泡在37℃-38℃恒温
水浴锅中，用80mL37℃预热的灌流液C循环灌注消化20分钟-25分钟；所述的灌流液C的配方为：0.05g/L胶原酶，15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HPO4·12H2O，3mM/L CaCl2；
[0010] 步骤3：将消化完毕的肝脏使用含2%双抗的D-Hanks溶液洗脱肝细胞，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到肝细胞；
[0011] 步骤4：将分离得到的肝细胞使用无血清培养液稀释，并接入细胞板或细胞瓶培养；所述的无血清培养液配方为：基础培养液，0.5mg/L地塞米松，5mg/L转
铁蛋白，0.5mg/L
牛胰岛素，10μg/L亚硒酸钠，20μg/L肝细胞生长因子，1%的双抗，其中，所述的基础培养液选自Williams'medium E基础培养液、DMEM基础培养液、L-15基础培养液或1640基础培养液。
[0012] 所述的步骤1中灌注灌流液A的速度优选30mL/min，灌注灌流液B的速度优选50mL/min，所述的步骤2中循环灌注灌流液C的速度优选20mL/min。
[0013] 所述的步骤1中灌流液A的pH优选7.6，灌流液B的pH优选7.6，所述的步骤2中的灌流液C的pH优选7.4。
[0014] 所述的无血清培养液配方中的基础培养液优选Williams'medium E基础培养液。
[0015] 所述的灌流液C配方中的胶原酶优选IV型胶原酶或II型胶原酶，进一步优选IV型胶原酶。
[0017] 有益效果：
[0018] 与现有的鸡肝细胞分离培养方法相比，本发明的原代鸡肝细胞的分离培养方法在原有方法基础上进行了重大的改进，建立了成熟的鸡肝细胞无血清培养方法，排除了加入血清培养肝细胞的诸多弊端，且使无血清培养的鸡肝细胞培养时间长、分化好、细胞活力高，达到与加入血清培养相同的效果；另外，灌流肝脏采用离体灌流方法，在分离细胞过程中最大限度减少了细胞污染的风险，并降低了灌流成本，同时获得了同原位灌流相同甚至更好的灌流效果。本发明的原代鸡肝细胞的灌流液A在原有灌流液成分的基础上添加了0.6mM/L的EGTA及2%的双抗。EGTA一方面可以起到抗凝的作用，使灌流更充分，无灌流死角，使离体冲洗灌流可以获得同原位灌流相同的效果；另一方面，EGTA可以去除肝细胞间
2+
的Ca 依赖性粘附因子，使肝细胞间连接变松散，提高所得肝细胞的分离度。同时，EGTA相比较另一螯合剂EDTA，对于肝细胞的毒性小，基本不影响肝细胞功能和代谢。添加2%的双抗，即200U/mL青霉素和200μg/mL链霉素，可以抑制血液和肝脏中可能存在的细菌污染。
2+ 2+
由于胶原酶的作用需要Ca 活化，所以在灌流液B中含有3mM/L的CaCl2，Ca 可以有效螯合灌流液A残存于肝脏中的EGTA，防止肝脏中残留EGTA结合灌流液C中的CaCl2，影响胶原酶活性。灌流液B中亦添加了2%的双抗，用于防止污染。另外，灌流液A和灌流液B均在配制好后进行高压灭菌处理，而后加入2%双抗备用，保证了灌流液本身洁净无菌。
[0019] 离体冲洗灌流后将肝脏转入到无菌烧杯中，将无菌烧杯置于37℃-38℃恒温水浴锅中，进行循环灌流消化步骤。灌注的消化灌流液C灌注经过肝脏后，均留置于烧杯中，浸泡着肝脏，可以起到保温肝脏，维持胶原酶良好活性的作用，有助于更好地消化肝脏。更重要的是，这部分灌流液C可以
回收利用立即进行再次灌注，将原有的胶原酶灌流液消耗量由300mL～600mL，降至60mL～100mL，这就大大节约了灌流成本。灌流液C中含有的3mM/L的CaCl2，可以活化IV型胶原酶，进一步提高了灌流效果。另外，整个循环灌流消化过程，放置肝脏的烧杯始终处于在37℃-38℃恒温水浴锅，这就保证了灌流液C中胶原酶的高活性，从而带来更好的灌流效果。
[0020] 消化冲洗完毕后进行分离培养中，其中的冲洗和重悬使用含2%双抗的D-Hanks溶液，节约了成本的同时，基本排除了分离细胞最后一步污染的风险和可能。
[0021] 细胞培养采用无血清培养液，无血清培养液在基础培养液中加入了地塞米松、转铁蛋白、牛胰岛素、亚硒酸钠、肝细胞生长因子及1%的双抗。地塞米松为体内重要的激素，参与细胞的糖代谢、脂类代谢等，可以调节鸡肝细胞的增殖与功能表达。转铁蛋白的主要作用是调节鸡肝细胞铁元素的代谢，通过肝细胞表面的转铁蛋白受体将铁元素转移到肝细胞内，同时转铁蛋白还可以与其他微量元素结合，从而调节鸡肝细胞的生长增殖与功能表达。培养液中加入的牛胰岛素可通过作用于鸡肝细胞表面的胰岛素受体，增强肝细胞对
葡萄糖的摄入和利用，同时促进RNA、
蛋白质和
脂肪酸的合成，抑制肝细胞凋亡，从而增强肝细胞的活力与功能。亚硒酸钠作为人体的必需微量元素硒的存在形式，可以保护肝细胞免受
氧化应激的作用。肝细胞生长因子不仅能刺激肝细胞的再生，促进肝细胞功能恢复，而且可改善肝
纤维化，在损伤因子刺激时保护肝细胞。相关文献显示，应用于大鼠原代肝细胞的无血清培养方法中，培养液种除添加了上述组分外，还单独或组合添加有表皮生长因子、纤粘连蛋白以及胰高血糖素。但对于鸡肝细胞原代细胞，培养条件经过
发明人的不断摸索和优化，发现表皮生长因子、纤粘连蛋白以及胰高血糖素并不是培养所必须的，添加这三种组分进行培养，同本发明的方法培养的肝细胞在
细胞增殖、细胞活力及稳定性上并无明显差异。所以，本发明的培养方法，在保证了良好培养效果的同时，优化了培养液组分，节约了培养成本。使用本发明的无血清培养方法培养的鸡肝细胞，生长稳定，活力高，最长可培养20天以上，甚至比一般血清培养时间还要长，为以鸡肝细胞培养为基础的物质代谢研究及生物产品制备奠定了良好的基础。
[0022] 本发明的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，灌流液A加入肝细胞毒性小的EGTA松散了肝细胞间连接，提高了所分离肝细胞离散程度，灌流液A、灌流液B及D-Hanks冲洗液中加入双抗，防止了污染的发生，消化灌流时采用循环灌流消化，大大节约了灌流成本。建立的鸡肝细胞的无血清培养方法，使其与传统的血清培养方法相比，在细胞数量、活力和功能等方面，达到同样的效果，从而解决了血清的存在带来的种种弊端，为以鸡肝细胞培养为基础的物质代谢研究及生物产品制备奠定了基础。
附图说明
[0023] 图1刚分离的鸡肝细胞。
[0024] 图2培养一周后的细胞。
具体实施方式
[0025] 为了进一步说明本发明的内容，下面结合本发明的
实施例作进一步详细描述。
[0026] 实施例1
[0027] 本实施例以30日龄1.5kg健康白羽肉鸡分离培养肝细胞。取肝脏前禁食3小时，翅下静脉注射肝素钠2250IU，5分钟后，脑部处死，用0.1%新洁尔灭溶液浸泡鸡只消毒，确保
皮肤及被毛均被溶液打湿。然后将鸡带入无菌室，仰面固定，用酒精
棉擦拭腹部皮肤。打开腹腔，先结扎入右肝的右肝
门静脉的属支肠系膜总静脉、胰十二指肠静脉和腺胃脾静脉，再结扎入左肝门静脉的胃腹静脉、胃左静脉和腺胃后静脉，最后结扎后腔静脉和髂总静脉。剪断血管，取出肝脏，转入超净台操作。
[0028] 将取得的肝脏用38℃预热的含2%双抗的生理盐水冲洗浸泡肝脏，之后在肝门静脉
插管，将插管结扎在肝门静脉内。
[0029] 用100mL
注射器吸取37℃预热的灌流液A，以30mL/min的流速灌注，持续10分钟，然后吸取37℃预热的灌流液B以50mL/min的流速灌注5分钟，期间可对肝脏进行适当按摩和加压。灌流液A配方为：15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HPO4·12H2O，并添加有0.6mM/L的EGTA及2%双抗，所述的灌流液B配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HPO4·12H2O，3mM/L CaCl2，并添加有2%双抗。
[0030] 离体冲洗灌流完毕后，将肝脏转移到无菌的烧杯里，把烧杯浸泡在37℃-38℃恒温水浴锅中（恒温水浴锅置于超净台中），用80mL38℃预热的灌流液C以20mL/min的流速循环灌注消化20分钟，即使用注射器将灌注流出的存于烧杯中的灌流液C回收，再次进行灌注，如此反复。灌流液C的配方为：0.05g/L胶原酶，15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/LNa2HPO4·12H2O，3mM/L CaCl2。
[0031] 将消化冲洗完毕的肝脏转移至无菌平皿中，轻轻撕开肝被膜，用含2%双抗的D-Hanks液150mL洗脱肝细胞，并用移液枪反复吹打5分钟分散细胞，然后将细胞悬液先后通过孔径为100目和200目的不锈
钢筛，过滤到烧杯中。静置沉淀细胞10分钟后，从液面吸弃50mL细胞上悬液。剩余100mL细胞悬液，将其分装到2个50mL塑料离心管，500r/min离心3分钟，倒掉上清，每个离心管用50mL含2%双抗的D-Hanks溶液再次重悬细胞，500r/min离心3分钟，倒掉上清。每个离心管用含有0.5mg/L地塞米松，5mg/L转铁蛋白，0.5mg/L牛胰岛素，10μg/L亚硒酸钠，20μg/L肝细胞生长因子及1%的双抗的无血清Williams'medium E培养液重悬细胞。将两个离心管的细胞合在一起，反复吹打，使细胞分散均匀。取0.5mL细胞悬液与0.5mL0.4%台盼蓝溶液混匀，1分钟后在
血细胞计数板上进行细胞计数，计算出肝细胞产量和肝细胞实时存活率。另取0.5mL细胞悬液于新的计数板上，高倍镜（400×）下观察可见细菌污染情况，取10个
视野计每个视野内细菌数，统计10个视野内细菌总数。
5
最后根据所计算肝细胞
密度，用无血清培养液稀释肝细胞至5×10个/mL接种6孔细胞板（如图1所示，可见刚分离到的鸡肝细胞分离度高、活力好，并且没有可见细菌污染），每2天换液一次，连续培养。一周后镜下观察细胞，如图2所示，呈多角形，细胞长势良好，胞浆内容物丰富，核大、透亮，核仁清晰可见，细胞间相互
接触连接成片状，铺满细胞培养板孔底。
[0032] 对比实施例1
[0033] 对比实施例一采用原位两步灌流法，灌注37℃预热的灌流液A′(lOmmol/L HEPES，137mmol/L NaCl，3mmo1/L KCl，3mmo1/L Na2HPO4,pH7.5)，待肝脏稍鼓胀时剪开后腔静脉，已流速3OmL/min持续灌注12分钟。
[0034] 消化前灌流的流出液体变清后，进行第二步消化灌流，即以20m L/min速率灌入37℃预热的灌流液B′(含0.6g/L CaCl2和0.4g/L IV型胶原酶的灌流液A′),灌注15分钟。
[0035] 待消化彻底完全后，摘取肝脏，放入一无菌平皿中，撕掉肝脏包膜，使用Williams'medium E基础培养基洗脱肝组织，分别过100目、200目细胞筛。所得肝细胞悬液用Williams'medium E基础培养液清洗2次(即500r/min离心3分钟)，用贴壁培养液(含10%胎牛血清及1%双抗的Williams'medium E基础培养液)重悬，然后采用台盼蓝拒染法检测细胞活率、血细胞计数板计数、观察统计细菌污染情况，最后接种6孔细胞板，每2天换液一次，连续培养。
[0036] 使用本方法及对比实施例所述方法，发明人均做了数十次的实验进行比较，并进行了数据的统计，上述两个实施例所用方法分离培养的肝细胞相比较，如表1所示：
[0037] 表1
[0038]
[0039] 由此可以看出，本发明的鸡肝细胞分离培养方法不但保持了原位两步灌流法分离肝细胞的良好分离度和活性，而且降低了制备细胞的成本，同时解决了鸡原代肝细胞易遭细菌污染的问题，通过无血清培养方法的建立，使其与传统的血清培养方法相比，在细胞数量、活力和功能等方面，达到同样的效果，从而解决了血清的存在带来的种种弊端，为以鸡肝细胞培养为基础的物质代谢研究及生物产品制备奠定了基础。
