用于改善杀虫剂的增效剂
阅读：600发布：2020-05-11
专利汇可以提供用于改善杀虫剂的增效剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于有机 磷酸 酯(OP)、 氨 基 甲酸 酯(CM)和/或拟 除虫菊 酯 /合成 杀虫剂 (SP)的增效剂。本发明进一步涉及包括有机磷酸酯、氨基甲酸酯和/或拟 除虫菊酯 /合成拟除虫菊酯、以及至少一种 硼 酸衍 生物 的组合物。本发明还提供了用于杀死 害虫 的方法。，下面是用于改善杀虫剂的增效剂专利的具体信息内容。
1.一种用于杀死害虫的杀虫剂组合物，所述杀虫剂组合物包括以下中的至少一种的协同有效组合：有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸酯(CM)和合成拟除虫菊酯(SP)；和至少一种硼酸衍生物或其盐。
2.根据权利要求1所述的杀虫剂组合物，其用于昆虫。
3.根据权利要求1或2所述的杀虫剂组合物，其中，所述硼酸衍生物是芳基硼酸或其盐，其中所述芳基任选地被1-5个取代基取代，其中每一个取代基独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基、芳氧基、O-CH2Ph、O-CH2-芳基、CH2-O-芳基、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、-C(O)NHR、-NHC(O)R、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基、C1-C5直链或支链烷氧烷基、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环，每一个可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、NHR、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、-O-CH2-芳基(例如-OCH2Ph，OCH2-2-氟苯基)、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H，或-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、-C(O)-吗啉，或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；并且其中，
R是C1-C5直链或支链烷基、C1-C5直链或支链烷氧基、苯基、芳基、或杂芳基，其可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；或两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的杀虫剂组合物，其中，所述硼酸衍生物由式I的结构表示：
其中，
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基(例如甲基)、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基(例如，-OiPr、-OtBu、-OCH2-Ph)、芳氧基(例如OPh)、R6R7、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基(例如OCF3)、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如，吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、4-甲基-哌嗪)，每一个可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、-NHCO-烷基、COOH、C(O)O-烷基、C(O)H；
或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；并且
R6为O、(CH2)n、C(O)、C(O)O、OC(O)、C(O)NH、C(O)N(R)、NHC(O)、N(R)CO、NHSO2、N(R)SO2、SO2NH、SO2N(R)、S、SO、SO2、NH、N(R)、OCH2、或CH2O；
R和R7各自独立地为C1-C5直链或支链烷基(例如t-Bu、i-Pr)、C1-C5直链或支链卤代烷基(例如CF3)、C1-C5直链或支链烷氧基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如吗啉)、苯基、芳基(例如，
2-氯苯基、2-氟苯基)、萘基、苄基、或杂芳基，每一个可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；或两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环；并且
n是1到6之间的整数。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的杀虫剂组合物，其中，所述硼酸衍生物选自：
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的杀虫剂组合物，其中，所述组合物对杀死农作物的害虫有作用，所述农作物包括蔬菜作物、花卉栽培、观赏作物、药用植物和经济植物。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的杀虫剂组合物，其中，所述组合物对杀死农业动物的害虫和家养动物的害虫有作用，所述农业动物包括绵羊、牛、山羊，所述家养动物诸如为猫、狗、鸟、猪、鱼。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的杀虫剂组合物，其中，所述组合物杀死包括以下的害虫：绿头苍蝇(例如，Calliphora stygia、铜绿蝇(Lucilia cuprina))、螺旋蝇(例如，螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax))、蟑螂、蜱、蚊子(例如，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus))、蟋蟀、家蝇(例如，Musca domestica)、沙蝇、螫蝇(例如，厩螫蝇(Stomoxys calcitrans))、蚂蚁、白蚁、跳蚤、蚜虫(例如绿桃蚜虫)、蛀虫(例如玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲米蛀虫))、甲壳虫(例如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多甲壳虫))、飞蛾，或其任何组合。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的杀虫剂组合物，其中，所述OP是乙酰甲胺磷、丙硫特普、甲基谷硫磷、甲基吡噁磷、卡巴呋喃三硫磷、毒虫畏、毒死蜱、乙基毒死蜱(CPE)、蝇毒磷巴毒磷、育畜磷、内吸磷、二嗪农、敌敌畏、百治磷、乐果、敌噁磷、乙拌磷、二乙基-4-甲基伞形酮磷酸酯、乙基-4-硝基苯基苯基硫代磷酸酯、乙硫磷、丙线磷、伐灭磷、苯线磷、杀螟硫磷、主索磷、倍硫磷、地虫磷、异丙胺磷、马拉硫磷、甲胺磷、杀扑磷、甲基对硫磷、速灭磷、久效磷、二溴磷、甲基异内吸磷亚砜、对硫磷、甲拌磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、硫甲双磷、四乙基焦磷酸酯、特丁硫磷、司替罗磷、敌百虫，或其任意组合。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的杀虫剂组合物，其中，所述OP是二嗪农、马拉硫磷或乙基毒死蜱(CPE)。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的杀虫剂组合物，其中，所述组合物对动物和/或人类无毒。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的杀虫剂组合物，其中，所述硼酸衍生物是羧酸酯酶(CBE)的选择性共价抑制剂。
13.一种用于杀死害虫的方法，所述方法包括使害虫群体与有效量的根据权利要求1-
12中的任一项所述的组合物接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，使所述群体接触包括使所述群体暴露于所述杀虫剂，以使得所述组合物被所述害虫摄入并足以杀死所述群体的至少50％。
15.一种用于杀死植物或动物上的害虫的方法，所述方法包括使所述植物或动物与根据权利要求1-12中的任一项所述的组合物接触，其中所述组合物对杀虫剂活性具有协同效应。
16.一种杀死害虫的方法，包括抑制害虫中由羧酸酯酶(CBE)介导的有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸酯(CM)和/或拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯(SP)抗性，所述方法包括使硼酸衍生物或其盐与OP、CM和/或SP杀虫剂组合方式与所述害虫接触。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述CBE是野生型CBE、CBE的同源物或突变的CBE。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，所述CBE是αE7 CBE的野生型或突变型或其同源物。
19.根据权利要求16、17或18所述的方法，其中，所述CBE是LcαE7、野生型LcαE7、突变的LcαE7、其同源物，或其组合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述突变的LcαE7(或其同源物)中的突变是Gly137Asp(或同源物中的等同突变)。
21.一种增强OP、CM和/或SP杀虫剂的方法，包括在将所述OP、CM和/或SP杀虫剂与害虫接触之前、之后、或与此同时将硼酸衍生物或其盐与所述害虫接触。
22.根据权利要求13-21中的任一项所述的方法，其中，所述害虫是绿头苍蝇(例如，Calliphora stygia、铜绿蝇(Lucilia cuprina))、螺旋蝇(例如，螺旋锥蝇螺(Cochliomyia hominivorax))、蟑螂、蜱、蚊子(例如，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus))、蟋蟀、家蝇(例如，Musca domestica)、沙蝇、螫蝇(例如，厩螫蝇(Stomoxys calcitrans))、蚂蚁、白蚁、跳蚤、蚜虫(例如绿桃蚜虫)、蛀虫(例如玉米螟(Ostrinia nubilalis(欧洲米蛀虫))、甲壳虫(例如马铃薯甲虫
(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多甲壳虫))、飞蛾，或其任何组合。
23.根据权利要求16-22中的任一项所述的方法，其中，所述硼酸衍生物是芳基硼酸或其盐，其中所述芳基任选地被1-5个取代基取代，其中每一个所述取代基独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基(例如甲基)、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基(例如，-OiPr、-OtBu、-OCH2-Ph)、芳氧基(例如OPh)、O-CH2Ph、O-CH2-芳基、CH2-O-芳基、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、-C(O)NHR、-NHC(O)R、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基(例如OCF3)、C1-C5直链或支链烷氧烷基、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如，吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、4-甲基-哌嗪)，每一个可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、NHR、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、-O-CH2-芳基(例如-OCH2Ph、OCH2-2-氟苯基)、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H，或-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、-C(O)-吗啉，或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；并且其中，
R是C1-C5直链或支链烷基、C1-C5直链或支链烷氧基、苯基、芳基、或杂芳基，其可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；或两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环(例如吗啉)。
24.根据权利要求16-23中的任一项所述的方法，其中，所述硼酸衍生物由式I的结构表示：
其中，
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基(例如甲基)、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基(例如，-OiPr、-OtBu、-OCH2-Ph)、芳氧基(例如OPh)、R6R7、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基(例如OCF3)、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如，吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、4-甲基-哌嗪)，每一个可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、-NHCO-烷基、COOH、C(O)O-烷基、C(O)H；
或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；
R6为O、(CH2)n、C(O)、C(O)O、OC(O)、C(O)NH、C(O)N(R)、NHC(O)、N(R)CO、NHSO2、N(R)SO2、SO2NH、SO2N(R)、S、SO、SO2、NH、N(R)、OCH2、或CH2O；
R和R7各自独立地为C1-C5直链或支链烷基(例如t-Bu、i-Pr)、C1-C5直链或支链卤代烷基(例如CF3)、C1-C5直链或支链烷氧基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如吗啉)、苯基、芳基(例如，
2-氯苯基、2-氟苯基)、萘基、苄基、或杂芳基，每一个可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；或两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环；并且
n是1到6之间的整数。
25.根据权利要求16-24中的任一项所述的方法，其中，所述硼酸衍生物选自：
26.根据权利要求13-25中的任一项所述的方法，其中，所述方法对动物和/或人类无毒。
27.根据权利要求13-26中的任一项所述的方法，其中，所述害虫对OP、CM、和/或SP杀虫剂具有抗性。
28.根据权利要求13-27中的任一项所述的方法，其中所述OP是乙酰甲胺磷、丙硫特普、甲基谷硫磷、甲基吡噁磷、卡巴呋喃三硫磷、毒虫畏、毒死蜱、乙基毒死蜱(CPE)、蝇毒磷巴毒磷、育畜磷、内吸磷、二嗪农、敌敌畏、百治磷、乐果、敌噁磷、乙拌磷、二乙基-4-甲基伞形酮磷酸酯、乙基-4-硝基苯基苯基硫代磷酸酯、乙硫磷、丙线磷、伐灭磷、苯线磷、杀螟硫磷、丰索磷、倍硫磷、地虫磷、异丙胺磷、马拉硫磷、甲胺磷、杀扑磷、甲基对硫磷、速灭磷、久效磷、二溴磷、甲基异内吸磷亚砜、对硫磷、甲拌磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、硫甲双磷、四乙基焦磷酸酯、特丁硫磷、司替罗磷、敌百虫，或其任意组合。
29.根据权利要求13-28中的任一项所述的方法，其中，所述OP是二嗪农、马拉硫磷或乙基毒死蜱(CPE)。
用于改善杀虫剂的增效剂
发明领域
[0001] 本发明涉及用于有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸酯(CM)和/或拟除虫菊酯/合成杀虫剂(SP)的增效剂。本发明还涉及包括有机磷酸酯、氨基甲酸酯、和/或拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯、和至少一种硼酸衍生物的组合物。本发明还提供了用于杀害虫的方法。
背景技术
[0002] 随着世界人口的增加，农业生产力对于维持粮食安全至关重要。杀虫剂在保护作物和牲畜以及在控制昆虫传播的疾病方面发挥着不可或缺的作用。它们可以控制农作物害虫和疾病载体，对全球粮食安全和健康至关重要。它们在发展中国家尤为重要；在发展中国家，昆虫载体是近20％的传染病的诱因。使用注有杀虫剂的网和对住宅的滞留喷洒是控制传染病传播最有效的手段之一。然而，杀虫剂的广泛使用对昆虫种群施加了进化选择压力，并且对杀虫剂的毒性作用具有抵抗力的昆虫个体已被选择性地保留下来。杀虫剂抗性已经普遍并已成为了亟待解决的全球性问题。自二十世纪40年代以来，具有已知的杀虫剂抗性的昆虫种类的数量迅速增加，并且近期已超过580种。这样的抗性引起杀虫剂失效，并导致使用量增加，对非目标物种产生显著影响并且对农业工作者造成伤害。
[0003] 有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸酯(CM)和合成拟除虫菊酯(SP)是一些最广泛使用的杀虫剂种类，但由于杀虫剂抗性的出现，它们的功效已下降。抗性通常由羧酸酯酶(CBE)介导，羧酸酯酶先螯合或水解杀虫剂，然后抑制其效力。OP和CM通过磷酸化/氨基甲酰化活性位点丝氨酸亲核试剂来抑制胆碱能神经肌肉接头处的乙酰胆碱酯酶(AChE)。这造成无休止的神经信号传导和死亡。SP通过阻止压敏钠通道的关闭而导致机体麻痹，从而破坏神经功能。已经有若干种昆虫物种被记载具有CBE介导的对OP、CM、和SP的抗性，其中最常见的抗性机制涉及羧酸酯酶(CBE)。CBE可以通过过量表达以螯合杀虫剂，或通过突变以获得新的杀虫剂水解酶功能；这两种机制都使得CBE能够在杀虫剂到达其目标AChE之前将杀虫剂拦截下来。因此，抑制CBE可以恢复OP(对其耐性已经进化)的有效性，并且昆虫的CBE抑制剂可以用作OP/CM或SP杀虫剂的增效剂。增效剂将克服抗性机制，从而恢复这些杀虫剂的毒性作用。
[0004] 来自αEsterase基因簇的昆虫羧酸酯酶，例如来自澳大利亚绵羊绿头苍蝇铜绿蝇(Lucilia cuprina)(LcαE7)的αE7(也称为E3)，在脂质代谢中起重要的生理作用并且参与有机磷酸酯(OP)杀虫剂的解毒过程。绵羊绿头苍蝇铜绿蝇(Lucilia cuprina)是一种外寄生虫，其每年对澳大利亚的产业造成超过2.8亿美元的损失。它已成为研究杀虫剂抗性的典型系统：抗性在1966年首次被记录，已发现其主要由编码αE7羧酸酯酶的基因中的Gly137Asp突变产生。该抗性的等位基因现在绿头苍蝇主导着当代绿头苍蝇种群，并且已经在一些其他的抗OP的蝇种中观察到等同的突变。CBE介导的对OP杀虫剂的抗性的出现已经大大降低了化学控制的有效性。最近的研究表明，野生型(WT)αE7蛋白通过其螯合杀虫剂的能力也对OP具有一定的抗性。引起OP抗性的CBE(即αE7)的X射线晶体结构在一定程度上揭示了抗性的分子机制。与AChE的结构同源性是αE7与OP高亲和力结合(Cα均方根偏差为)的基础。两种酶均采用α/β-水解酶折叠，并在活性位点共享常见的Ser-His-Glu催化三联体和氧阴离子孔。有趣的是，虽然野生型αE7通过螯合作用对于接触OP的苍蝇具有一定的保护作用，但已确定由突变(Gly137Asp)引起“催化的”OP解毒作用。这种突变将新的一般的碱基引入酶的活性位点，使其能够活化水分子用于催化丝氨酸的去磷酸化。Gly137Asp突变的成功意味着它现在主导着当代绿头苍蝇种群。
[0005] 最近克服杀虫剂抗性的尝试集中于开发具有新型作用模式的新杀虫剂。尽管这些新靶标中许多都具有前景，但是生化靶标数量有限，并且新靶标无法避免靶位点不敏感性和代谢抗性的问题。增效剂在过去已经被使用过，其通过抑制参与杀虫剂解毒的酶来增强杀虫剂的功效；在为数不多的已确定的杀虫剂增效剂中一个突出的例子是胡椒基丁醚，这是细胞色素P450的一种非特异性抑制剂，用于增强氨基甲酸酯和拟除虫菊酯的活性。可以更深入地实施增效剂这一思路，以特异性地靶向已经进化成具有代谢抗性的酶，从而将杀虫剂的效果恢复到在抗性没有出现时的水平。因此，作为已被较好理解的解毒系统，CBE(例如αE7)是用于设计抑制剂以消除杀虫剂抗性的理想靶标(图1A-1C)。因此，昆虫CBE(例如αE7)是用于设计抑制剂的潜在靶标，所述抑制剂将与杀虫剂协同作用以消除抗性并增加效力，从而减少有效控制害虫所需的有毒性杀虫剂的量(图1A-1C)。传统方法通常通过通常针对新蛋白质开发新的杀虫剂来对抗抗性，而靶向CBE将允许持续(和减少)使用廉价且已经批准的杀虫剂。αE7的特异性的且有效的共价抑制剂可以作为OP杀虫剂的增效剂，以助于控制这种重要的农业害虫。
[0006] 引用文献
[0007] ·Ecobichon，D.J.Pesticide use in developing countries.Toxicology 160，27-33(2001).
[0008] ·Cooper，J.&Dobson，H.The benefits of pesticides to mankind and the environment.Crop Prot.26，1337-1348(2007).
[0009] ·世界卫生组织.Pesticides and their application for the control of vectors and pests of public health importance.世界卫生组织1，1-104(2006).[0010] ·Global pesticide resistance in arthropods.(Cabi International，2008).doi：10.1079/9781845933531.0000
[0011] ·Grube，A.，Donaldson，D.，Timothy Kiely，A.&Wu，L.Pesticides Industry Sales and Usage：2006and 2007 Market Estimates.U.S.Environ.Prot.Agency 41(2011).位于
[0012] ·Dvir，H.，Silman，I.，Harel，M.，Rosenberry，T.L.&Sussman，J .L .A ce ty lch ol in est er as e ：f ro m 3D st ru ctu re t o
function.Chem.Biol.Interact.187，10-22(2010).
function.Chem.Biol.Interact.187，10-22(2010).
[0013] ·Fukuto，T.R.Mechanism of action of organophosphorus and carbamate onsecticides.Environ.Health Perspect.87，245-254(1990).
[0014] ·Tafuri，J.&Roberts，J.Organophosphate poisoning.Ann.Emerg.Med.16，193-202(1987).
[0015] ·Roberts，D.M.&Aaron，C.K.Management of acute organophosphorus pesticide poisoning.BMJ 334，629-34(2007).
[0016] ·Soderlund DM，Bloomquist JR.Neurotoxic actions of pyrethroid insecticides Annu Rev Entomol.；34：77-96(1989).
[0017] ·Hemingway，J.&Ranson，H.Insecticide resistance in insect vectors of human disease.Annu.Rev.Entomol.43，371-391(2000).
[0018] ·Devonshire，A.L.&Field，L.M.Gene amplification and insecticide resistance.Annu.Rev.Entomol.(1991).
[0019] ·Field，L.M.&Devonshire，A.L.Evidence that the E4 and FE4 esterase genes responsible for insecticide resistance in the aphid Myzus persicae(Sulzer)are part of a gene family.Biochem.J.330(Pt 1，169-73(1998).
[0020] ·Mouches，C.等.Amplification of an esterase gene is responsible for insecticide resistance in a California culex mosquito.Science 233，295-297(1986).
[0021] ·Raymond，M.，Chevillon，C.，Guillemaud，T.，Lenormand，T.&Pasteur，N.An overview of the evolution of overproduced esterases in the mosquito Culex pipiens.Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.353，1707-11(1998).
[0022] ·Vaughan，A.，HAWKES，N.&HEMINGWAY，J.Co-amplification explains linkage disequilibrium of two mosquito esterase genes in insecticide-resistant Culex quinquefasciatus.Biochem.J.325，359LP-365(1997).
[0023] ·Newcomb，R.D.等.A single amino acid substitution converts a carboxylesterase to an organophosphorus hydrolase and confers insecticide resistance on a blowfly.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94，7464-7468(1997).
[0024] ·Devonshire，A.L.等.Kinetic efficiency of mutant carboxylesterases implicated in organophosphate insecticide resistance.Pestic.Biochem.Physiol.76，1-13(2003).
[0025] ·Newcomb，R.D.，Gleeson，D.M.，Yong，C.G.，Russell，R.J.&Oakeshott，J.G.Multiple mutations and gene duplications conferring organophosphorus insecticide resistance have been selected at the Rop-1 locus of the sheep blowfly，Lucilia cuprina.J.Mol.Evol.60，207-20(2005).
[0026] ·Claudianos，C.，Russell，R.J.&Oakeshott，J.G.The same amino acid substitution in orthologous esterases confers organophosphate resistance on the house fly and a blowfly.Insect Biochem.Mol.Biol.29，675-686(1999).
[0027] ·Sackett，D.，Holmes，P.，Abbott，K.，Jephcott，S.&Barber，M.Assessing the economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and sheep producers.Meat and Livestock Australia Limited 364，(2006).[0028] ·Levot，G.W.Resistance and the control of sheep ectoparasites.Int.J.Parasitol.25，1355-1362(1995).
[0029] ·Sandeman，R.M.等.Control of the sheep blowfly in Australia and New Zealand-are we there yet？Int.J.Parasitol.44，879-891(2014).
[0030] ·Hughes，P.B.&Devonshire，A.L.The biochemical basis of resistance to organophosphorus insecticides in the sheep blowfly，Lucilia cuprina.Pestic.Biochem.Physiol.18，289-297(1982).
[0031] ·Arnold，J.T.a.&Whitten，M.J.The genetic basis for organophosphorus resistance in the Australian sheep blowfly，Lucilia cuprina(Wiedemann)(Diptera，Calliphoridae).Bull.Entomol.Res.66，561(1976).
[0032] ·Jackson，C.J.等.Structure and function of an insect α-carboxylesterase(αEsterase7)associated with insecticide resistance.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110，10177-82(2013).
[0033] ·Mabbitt，P.D.等.Conformational disorganization within the active site of a recently evolved organophosphate hydrolase limits its catalytic efficiency.Biochemistry acs.biochem.5b01322(2016).doi：10.1021/acs.biochem.5b01322
[0034] ·McKenzie，J.a.Dieldrin and diazinon resistance in populations of the Australian sheep blowfly，Lucilia cuprina，from sheep-grazing areas and rubbish tips.Aust.J.Biol.Sci.37，367-374(1984).
[0035] ·Russell，R.J.等.The evolution of new enzyme function：lessons from xenobiotic metabolizing bacteria versus insecticide-resistant insects.Evol.Appl.4，225-48(2011).
[0036] ·Smyth，K.A.，Boyce，T.M.，Russell，R.J.&Oakeshott，J.G.MCE activities and malathion resistances in field populations of the Australian sheep blowfly(Lucilia cuprina).Heredity(Edinb).84，63-72(2000).
发明内容
[0037] 在多个实施方式中，本发明提供一种用于杀死害虫的杀虫剂组合物，其包括以下中的至少一种的协同有效组合：有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸酯(CM)、和合成拟除虫菊酯(SP)；和至少一种硼酸衍生物或其盐。
[0038] 在其他实施方式中，硼酸衍生物由式I的结构表示：
[0039]
[0040] 其中，
[0041] R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基(例如甲基)、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基(例如，-OiPr、-OtBu、-OCH2-Ph)、芳氧基(例如OPh)、R6R7、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基(例如OCF3)、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如，吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、4-甲基-哌嗪)，每一个可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、-NHCO-烷基、COOH、C(O)O-烷基、C(O)H；
[0042] 或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；
[0043] R6为O、(CH2)n、C(O)、C(O)O、OC(O)、C(O)NH、C(O)N(R)、NHC(O)、N(R)CO、NHSO2、N(R)SO2、SO2NH、SO2N(R)、S、SO、SO2、NH、N(R)、OCH2或CH2O；
[0044] R和R7各自独立地为C1-C5直链或支链烷基(例如t-Bu、i-Pr)、C1-C5直链或支链卤代烷基(例如CF3)、C1-C5直链或支链烷氧基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如吗啉)、苯基、芳基(例如，2-氯苯基、2-氟苯基)、萘基、苄基、或杂芳基，以上基团都可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；或两个偕(gem)R取代基连接在一起形成5元或6元杂环；并且
[0045] n是1到6之间的整数。
[0046] 在多个实施方式中，本发明涉及一种杀死害虫的方法，所述方法包括使害虫群与有效量的本发明组合物接触。
[0048] 在多个实施方式中，本发明提供了一种杀死害虫的方法，所述方法包括抑制害虫中由羧酸酯酶(CBE)介导的有机磷(OP)、氨基甲酸酯(CM)、和/或拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯(SP)抗性。所述方法包括使硼酸衍生物或其盐与OP、CM、和/或SP杀虫剂组合方式与所述害虫接触。在其他实施方式中，CBE是野生型CBE、CBE的同源物或突变的CBE。在其他实施方式中，CBE是αE7 CBE或其同源物的野生型或突变型。在其他实施方式中，CBE是LcαE7、野生型LcαE7、突变的LcαE7、其同源物，或其任何组合。
[0049] 在多个实施方式中，本发明提供了一种增强OP、CM和/或SP杀虫剂功效的方法，所述方法包括使硼酸衍生物或其盐与害虫接触，在此之前、之后、或与此同时将所述OP、CM和/或SP杀虫剂与所述害虫接触。
[0050] 在其他实施方式中，害虫是绿头苍蝇(例如，Calliphora stygia、铜绿蝇(Lucilia cuprina))、螺旋蝇(例如，螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax))、蟑螂、蜱、蚊子(例如，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus))、蟋蟀、家蝇(例如，Musca domestica)、沙蝇、螫蝇(例如，厩螫蝇(Stomoxys calcitrans))、蚂蚁、白蚁、跳蚤、蚜虫(例如绿桃蚜虫)、蛀虫(例如玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲米蛀虫))、甲壳虫(例如马铃薯甲虫(Leptinotarsa
decemlineata)(科罗拉多甲壳虫))、飞蛾，或其任何组合。
decemlineata)(科罗拉多甲壳虫))、飞蛾，或其任何组合。
[0051] 在其他实施方式中，硼酸衍生物是芳基硼酸或其盐，其中所述芳基任选地被1-5个取代基取代，其中每个取代基独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基(例如甲基)、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基(例如，-OiPr、-OtBu、-OCH2-Ph)、芳氧基(例如OPh)、O-CH2Ph、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、-C(O)NHR、-NHC(O)R、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基(例如OCF3)、C1-C5直链或支链烷氧烷基、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如，吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、4-甲基-哌嗪)，每一个可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、芳基、-CH2CN、NH2、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、O-CH2-芳基(例如，-OCH2Ph、OCH2-2-氟苯基)、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H，或C(O)NH2、C(O)N(R)2、-C(O)-吗啉，或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；并且其中，
[0052] R是C1-C5直链或支链烷基，C1-C5直链或支链烷氧基、苯基、芳基或杂芳基、它们可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代，或两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环(例如吗啉)。
[0053] 在其他实施方式中，硼酸衍生物由式I的结构表示：
[0054]
[0055] 其中，
[0056] R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基(例如甲基)、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基(例如，-OiPr、-OtBu、-OCH2-Ph)、芳氧基(例如OPh)、R6R7、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基(例如OCF3)、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如，吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、4-甲基-哌嗪)，每一个可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、-NHCO-烷基、COOH、C(O)O-烷基、C(O)H；
[0057] 或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；
[0058] R6为O、(CH2)n、C(O)、C(O)O、OC(O)、C(O)NH、C(O)N(R)、NHC(O)、N(R)CO、NHSO2、N(R)SO2、SO2NH、SO2N(R)、S、SO、SO2、NH、N(R)、OCH2或CH2O；
[0059] R和R7各自独立地为C1-C5直链或支链烷基(例如t-Bu、i-Pr)、C1-C5直链或支链卤代烷基(例如CF3)、C1-C5直链或支链烷氧基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如吗啉)、苯基、芳基(例如，2-氯苯基、2-氟苯基)、萘基、苄基、或杂芳基，以上基团都可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；或两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环；并且
[0060] n是1到6之间的整数。
[0061] 在其他实施方式中，硼酸衍生物选自：
[0062]
[0063]
[0064]
[0065]
[0066] 在其他实施方式中，该方法对动物和/或人类无毒。在其他实施方式中，害虫对OP、CM、和/或SP杀虫剂具有抗性。在其他实施方式中，OP是乙酰甲胺磷、丙硫特普、甲基谷硫磷、甲基吡噁磷、卡巴呋喃三硫磷、毒虫畏、毒死蜱、乙基毒死蜱(CPE)、蝇毒磷巴毒磷、育畜磷、内吸磷、二嗪农、敌敌畏、百治磷、乐果、敌噁磷、乙拌磷、二乙基-4-甲基伞形酮磷酸酯、乙基-4-硝基苯基苯基硫代磷酸酯、乙硫磷、丙线磷、伐灭磷、苯线磷、杀螟硫磷、丰索磷、倍硫磷、地虫磷、异丙胺磷、马拉硫磷、甲胺磷、杀扑磷、甲基对硫磷、速灭磷、久效磷、二溴磷、甲基异内吸磷亚砜、对硫磷、甲拌磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、硫甲双磷、四乙基焦磷酸酯、特丁硫磷、司替罗磷、敌百虫，或其任意组合。在其他实施方式中，OP是二嗪农、马拉硫磷、或乙基毒死蜱(CPE)。附图说明
[0068] 图1A-1C给出了有机磷酸酯杀虫剂的增效剂的概述。(图1A)有机磷酸酯杀虫剂抑制乙酰胆碱酯酶并防止乙酰胆碱水解。(图1B)CBE(如αE7)通过结合和水解有机磷酸酯杀虫剂来恢复乙酰胆碱酯酶活性。(图1C)一种在与CBE结合能力上比有机磷酸酯更强的抑制剂，其可用作恢复杀虫剂活性的增效剂。
[0069] 图2A-2J呈现了硼酸抑制剂1-5与野生型LcαE7结合的共价对接预测与其晶体结构的对比图。图2A、2B、2C、2D、2E分别是化合物1-5(深色棒)与LcαE7(Ser218)的催化丝氨酸形成的共价加合物。已省略的mFO-DFC差异电子密度被示出(网格轮廓为3σ)。对接预测覆盖在相应的共晶结构上。活性位点残基以荧光棒显示。图2F、2G、2H、2I、2J涉及LcαE7分别与化合物1-5的结合口表面表示，其以空间填充(白色球体)显示。
[0070] 图3描绘了硼酸抑制剂与有机磷酸酯杀虫剂二嗪农和马拉硫磷协同作用。仅以二嗪农(Dz)或马拉硫磷(Mal)进行处理，或者以1mg/ml的设定浓度的硼酸化合物补充的Dz/Mal进行处理。数据表示三次(Dz)或两次(Mal)重复实验的平均值±95％置信区间，每次实验在每个Dz/Mal浓度下使用50只幼虫。
[0071] 图4显示了硼酸化合物在与丝氨酸亲核试剂配位时怎样采用两种构型。三角形平面加合物具有单个配位的羟基，而配位第二个羟基将生成带负电荷的四面体加合物。
[0072] 图5显示，在不存在有机磷酸二嗪农或马拉硫磷的情况下，硼酸化合物对铜绿蝇(Lucilia cuprina)蛹化没有影响。对于实验室品种和田间品种两者，将在不存在硼酸的情况下回收的蛹的数量与在每次测定时有1mg硼酸存在的情况下回收的数量进行比较。数据表示3次重复实验的平均值±误差。
[0073] 图6显示易感(实验室)和抗性(田间)隔离群中αE7基因的测序。易感品种仅携带野生型αE7基因，而抗性品种携带等量的野生型αE7(Gly137)和αE7的Gly137Asp变体。图6还示出了αE7基因的相关区域的色谱图和相应的核苷酸。
[0074] 图7显示了抑制野生型αE7的剂量-反应曲线。测定苯基硼酸(PBA)和化合物1-5和3.1-3.12对4-硝基苯基水解的抑制作用。对每种硼酸浓度进行三次(技术上的)重复的酶活性测量。通过将S形剂量-反应曲线拟合至抑制百分比图来确定抑制50％活性所需的硼酸浓度(IC50)。曲线被限制为在0(底部)和100％(顶部)抑制之间，并具有可变的Hill斜率。以
95％置信区间取IC50值。
95％置信区间取IC50值。
[0075] 图8显示了抑制Gly137AspαE7的剂量-反应曲线。测定苯基硼酸(PBA)和化合物1-5和3.1-3.12对4-硝基苯基水解的抑制作用。对每种硼酸浓度进行三次(技术上的)重复的酶活性测量。通过将S形剂量-反应曲线拟合至抑制百分比图来确定抑制50％活性所需的硼酸浓度(IC50)。曲线被限制为在0(底部)和100％(顶部)抑制之间，并具有可变的Hill斜率。以95％置信区间取IC50值。
[0076] 图9显示了抑制电鳗(Electrophorus electricus)乙酰胆碱酯酶的剂量-反应曲线。测定苯基硼酸(PBA)和化合物1-5对乙酰硫代胆碱水解的抑制作用。对每种硼酸浓度进行三次(技术上的)重复的酶活性测量。测试化合物至其溶解度极限，仅3个显示出大于50％的抑制。如前所述测定IC50值，并以95％置信区间取值。
[0077] 图10显示了活性测定的动力学参数。用4-硝基苯酚丁酸酯(4-NPB)测定野生型和Gly137AspαE7，并用乙酰硫代胆碱(ATCh)测定电鳗乙酰胆碱酯酶(Ee AChE)。通过使用非线性回归将Michaelis-Menton方程拟合至8个底物浓度下的酶速度图来确定参数。对每种底物浓度进行六次(技术上的)重复的酶活性测量。Michalis常数(KM)表示为±标准误差。
[0078] 图11A-11D表明第二代硼酸是Gly137Asp LcαE7的有效抑制剂。图11A：化合物3类似物的化学结构。图11B：化合物3.10(深灰色棒)与Gly137AspLcαE7(PDB代码5TYM)的共晶结构。显示了省略mFO-DFC差异电子密度(网格轮廓为3σ)。活性位点残基显示为浅灰色棒。图11C：Gly137AspLcαE7与化合物3.10结合口的表面表示，以空间填充表示(浅灰色球体)。图
11D：抑制剂结合Gly137Asp LcαE7后活性位点的重排。将化合物3.10(深色/浅灰色棒)的共晶结构与apo Gly137Asp LcαE7晶体结构(浅灰色棒，PDB代码5C8V)对齐。氢键显示为黑色虚线。除了Gly136N与硼酸OH间的氢键之外 所有其他氢键均为 介导
Asp137侧链和硼酸之间的氢键的水分子显示为具有2mFO-DFC电子密度的黑色球体(网格轮廓为1σ)。
11D：抑制剂结合Gly137Asp LcαE7后活性位点的重排。将化合物3.10(深色/浅灰色棒)的共晶结构与apo Gly137Asp LcαE7晶体结构(浅灰色棒，PDB代码5C8V)对齐。氢键显示为黑色虚线。除了Gly136N与硼酸OH间的氢键之外 所有其他氢键均为 介导
Asp137侧链和硼酸之间的氢键的水分子显示为具有2mFO-DFC电子密度的黑色球体(网格轮廓为1σ)。
[0079] 图12显示了当与LcαE7的催化丝氨酸配位时硼酸所呈现的四面体和三角形平面几何形状。参照mFO-DFC差异电子密度图(显示轮廓为±3σ)中的正(绿色网格)负(红色网格)峰对几何形状进行指定，以四面体或三角平面建模。配体和选择的活性位点残基显示为白色棒，2mFO-DFC电子密度(蓝色网格)在配体和Ser218周围以1σ形成轮廓。3*表示包含结晶所需的两个表面突变(Asp83Ala、Lys530Glu)的LcαE7结构。
[0080] 图13示出了硼酸的细胞毒性很低。将化合物1-5以及3.9和3.10与两种不同的人细胞系HB-2和MDA-MB-231在最高达100μM的7种浓度下培养48小时。48小时后使用Cell Titer Glo测定法测量细胞活力。除了对HB-2显示出低毒性的化合物2和5之外，其他化合物即使在最高浓度下也没有显著地杀死细胞。
[0081] 图14A-14B显示了针对AChE的选择性的结构基础。图14A：将人AChE(灰色；PDB 4PQE)和Ee AChE(白色；PDB 1EEA)的结构叠加到LcαE7(浅灰)与化合物3(深灰)的共晶结构上。AChE的Phe288与化合物3的溴原子显著碰撞。图14B：LcαE7(白色)和hAChE(灰色)的表面表示说明了上述碰撞。
[0082] 图15显示了LcαE7-4a中存在的内部稳定化突变对硼酸结合没有影响。LcαE7-4a是LcαE7的变体，其含有8个突变以提高热稳定性并能够结晶。为了确定LcαE7-4a中存在的内部突变是否影响抑制剂结合，将LcαE7-4a表面突变引入WT背景并测试结晶。两个突变(Lys530Glu和Asp83Ala)足以允许结晶，这很可能是通过在晶格中的分子之间引入分子间盐桥(Lys530Glu)以及在晶体堆积界面(Asp83Ala)处去除电荷来实现的。硼酸3与LcαE7-4a(白色棒)和Asp83Ala+Lys530GluLcαE7(深灰色棒)的共晶结构之间的对比显示出Ile419Phe和Ala472Thr突变对抑制剂形态或结合口拓扑构型几乎没有影响。Ile419Phe将相邻Tyr420的χ2二面角移动大约30°。为清楚起见，仅显示了LcαE7-4a的主链(白色卡通图)。这证实了在共晶结构中捕获的结合形态对应于WTLcαE7中的结合形态。
[0083] 应当理解，为了简单且清地进行说明，附图中所示的元件不一定按比例绘制。例如，为了清楚起见，一些元件的尺寸可能相对于其他元件而被放大。此外，在认为适当的情况下，可以在附图中重复附图标记以指示对应或类似的元件。
[0084] 本发明的详细描述
[0085] 在以下详细描述中阐述了许多具体细节以便对本发明理解得更加透彻。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些具体细节的情况下实施本发明。在其他情况中，没有详细描述众所周知的方法、过程和组件，以免使本发明变得不清楚。
[0086] 定义：
[0087] 术语“有机磷酸酯”或“OP”是指作用于酶乙酰胆碱酯酶的一组杀虫剂或神经制剂。该术语通常用于描述几乎任何含有机磷(V)的化合物，在讨论神经毒性化合物时尤其如此。
而且，许多次磷酸衍生物被用作神经毒性有机磷酸酯。用作杀虫剂的有机磷酸酯的示例包括乙酰甲胺磷、丙硫特普、甲基谷硫磷、甲基吡噁磷、卡巴呋喃三硫磷、毒虫畏、毒死蜱、乙基毒死蜱(CPE)、蝇毒磷巴毒磷、育畜磷、内吸磷、二嗪农、敌敌畏、百治磷、乐果、敌噁磷、乙拌磷、二乙基-4-甲基伞形酮磷酸酯、乙基-4-硝基苯基苯基硫代磷酸酯、乙硫磷、丙线磷、伐灭磷、苯线磷、杀螟硫磷、丰索磷、倍硫磷、地虫磷、异丙胺磷、马拉硫磷、甲胺磷、杀扑磷、甲基对硫磷、速灭磷、久效磷、二溴磷、甲基异内吸磷亚砜、对硫磷、甲拌磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、硫甲双磷、四乙基焦磷酸酯、特丁硫磷、司替罗磷、敌百虫。
而且，许多次磷酸衍生物被用作神经毒性有机磷酸酯。用作杀虫剂的有机磷酸酯的示例包括乙酰甲胺磷、丙硫特普、甲基谷硫磷、甲基吡噁磷、卡巴呋喃三硫磷、毒虫畏、毒死蜱、乙基毒死蜱(CPE)、蝇毒磷巴毒磷、育畜磷、内吸磷、二嗪农、敌敌畏、百治磷、乐果、敌噁磷、乙拌磷、二乙基-4-甲基伞形酮磷酸酯、乙基-4-硝基苯基苯基硫代磷酸酯、乙硫磷、丙线磷、伐灭磷、苯线磷、杀螟硫磷、丰索磷、倍硫磷、地虫磷、异丙胺磷、马拉硫磷、甲胺磷、杀扑磷、甲基对硫磷、速灭磷、久效磷、二溴磷、甲基异内吸磷亚砜、对硫磷、甲拌磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、硫甲双磷、四乙基焦磷酸酯、特丁硫磷、司替罗磷、敌百虫。
[0088] 术语“氨基甲酸酯”或“CM”是指作用于酶乙酰胆碱酯酶的一组杀虫剂。该术语通常用于描述几乎任何氨基甲酸酯化合物，在讨论神经毒性化合物时尤其如此。用作杀虫剂的氨基甲酸酯的示例包括涕灭威、灭害威、噁虫威、甲萘威、克百威、丁硫克百威、敌蝇威、乙硫苯威、仲丁威、苯氧威、抗螨脒、胺甲威(formparanate)、甲硫威、灭多威、速灭威、杀线威、抗蚜威、残杀威、和久效威。
[0089] 术语“拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯”或“SP”是指作用于轴突膜中的电压门控钠通道的一组杀虫剂。该术语通常用于描述几乎任何羧酸酯化合物化学结构，其由除虫菊酯的化学结构改造而来并且以类似于除虫菊酯的方式起作用。用作杀虫剂的SP的实例包括丙烯菊酯、联苯菊酯、生物丙烯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、苯醚氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、高氰戊菊酯、依芬普司、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、氟氯苯氰菊酯、炔咪菊酯、氯氟氰菊酯、甲氧苄氟菊酯、二氯醚菊酯、丙炔菊酯、除虫菊酯、苄呋菊酯、氟硅菊酯、苯氧司林、氟胺氰戊菊酯、七氟菊酯、胺菊酯、四溴菊酸和四氟苯菊酯。
[0090] 在多个实施方式中，术语“硼酸”是指含有-B(OH)2部分的化合物。硼酸是路易斯酸。它们的独特之处在于它们可与糖、氨基酸、异羟肟酸等形成可逆的共价络合物。硼酸的pKa为～9，但它们可形成pKa～7的四面体硼酸盐络合物。在一些实施方式中，术语“硼酸衍生物”是指含有碳-硼键的烷基或芳基取代的硼酸。硼酸的一个突出特征是它们在水溶液中与二醇可逆地形成酯。因此，在一些实施方式中，术语“硼酸衍生物”包括“硼酸酯”，其包括环形、线形、单、和/或二酯。这种硼酸酯含有-B(Z1)(Z2)部分，其中Z1或Z2中的至少一个是烷氧基、芳烷氧基、或芳氧基；或Z1或Z2一起形成环。硼酸酯的示例包括但不限于：2-(羟甲基)苯基硼酸环单酯、3-吡啶硼酸-1，3-丙二醇酯、5-甲酰基-4-甲基噻吩-2-硼酸-1，3-丙二醇酯、4-异恶唑硼酸频哪醇酯、1H-吡唑-5-硼酸频哪醇酯、2-氰基苯硼酸-1，3-丙二醇酯，5-(5，5-二甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环己烷-2-基)-1-乙基-1H-吡唑、4-氰基吡啶-3-硼酸新戊二醇酯、5-溴-2-氟-3-吡啶硼酸频哪醇酯、5-氰基噻吩-2-硼酸频哪醇酯、5-(4，4，5，5-四甲基-
1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-呋喃-2-甲腈、[1，2，5]恶二唑并[3，4-b]吡啶-6-基硼酸频哪醇酯、2，4-二甲基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1，3-噻唑、(3-氰基苯基)硼酸、新戊基乙二醇酯、2，4-二氯苯硼酸频哪醇酯、苯并[c][1，2，5]噻二唑-
5-基硼酸频哪醇酯、1-甲基-5-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧硼戊环-2-基)-1H-吡啶-2-酮，及其类似物。在一些实施方式中，硼酸化合物可通过将硼酸部分脱水形成低聚酸酐。例如，Snyder等.，J.Am.Chem.Soc.80：3611(1958)，报道了低聚芳基硼酸。相应地，如本文所用，术语“硼酸衍生物”在一些实施方式中是指通过结合两个或更多个硼酸化合物分子同时失去一个或多个水分子形成的硼酸酐。当与水混合时，硼酸酐化合物被水合以释放游离硼酸或硼酸衍生物。在多个实施方式中，硼酸酐可包括两个、三个、四个或更多个硼酸单元，并且可具有环形或线形构型。
1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-呋喃-2-甲腈、[1，2，5]恶二唑并[3，4-b]吡啶-6-基硼酸频哪醇酯、2，4-二甲基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1，3-噻唑、(3-氰基苯基)硼酸、新戊基乙二醇酯、2，4-二氯苯硼酸频哪醇酯、苯并[c][1，2，5]噻二唑-
5-基硼酸频哪醇酯、1-甲基-5-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧硼戊环-2-基)-1H-吡啶-2-酮，及其类似物。在一些实施方式中，硼酸化合物可通过将硼酸部分脱水形成低聚酸酐。例如，Snyder等.，J.Am.Chem.Soc.80：3611(1958)，报道了低聚芳基硼酸。相应地，如本文所用，术语“硼酸衍生物”在一些实施方式中是指通过结合两个或更多个硼酸化合物分子同时失去一个或多个水分子形成的硼酸酐。当与水混合时，硼酸酐化合物被水合以释放游离硼酸或硼酸衍生物。在多个实施方式中，硼酸酐可包括两个、三个、四个或更多个硼酸单元，并且可具有环形或线形构型。
[0091] 术语“羧乙基酯酶”(CBE)是指来自α和β和非微粒体基因簇的昆虫羧酸酯酶，如Oakeshott，Claudianos，Campbell，Newcomb and Russell，“Biochemical Genetic and Genomics of Insect Esterases”，pp 309-381，Chapter 10，Volume 5，2005，Eds.Gilbert，Iatrou，Gill，出版-Elsevier中所定义，其通过引用并入本文。αE7CBE是α酯酶的一个例子，在绵羊绿头苍蝇(铜绿蝇(Lucilia cuprina))中发现，其同源基因存在于其他害虫中。野生型LcαE7 CBE的序列已经以登录号GenBank：AAB67728.1存储在GenBank序列数据库中，其通过引用并入本文。来自铜绿蝇(Lucilia cuprina)的LcαE7 CBE中的Gly137Asp突变引起对OP杀虫剂的抗性已在下文中证明：Newcomb，Campbell，Ollis，Cheah，Russell and Oakeshott，“A single amino acid substitution converts a carboxylesterase to an organophosphorus hydrolase and confers insecticide resistance on a blowfly”pp 7464-7468，Volume 94，1997，Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，该文献通过引用并入本文。在来自铜绿蝇的LcαE7 CBE同源物中相同位置的相同突变也会引起OP抗性。CBE在昆虫代谢的许多方面起着重要的生理作用，并参与有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸酯(CM)和拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯(SP)杀虫剂的解毒作用。在其他实施方式中，本发明的CBE是CBE的同源物或突变的CBE。
[0092] 在多个实施方式中，本发明提供羧乙基酯酶(CBE)的选择性抑制剂，其中所述抑制剂包括硼酸衍生物或其盐。在其他实施方式中，本发明的CBE是野生型CBE、CBE的同源物或突变的CBE。在其他实施方式中，本发明的CBE是野生型或突变型αE7 CBE或其同源物。在其他实施方式中，本发明的CBE是LcαE7、野生型LcαE7、突变的LcαE7、其同源物，或其任意组合。
[0093] 在多个实施方式中，本发明的硼酸衍生物及其用途是芳基硼酸衍生物或其盐，其中所述芳基(例如苯基、萘基、吲哚基)可选地被1-5个取代基取代，其中每个取代基独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基(例如甲基)、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基(例如，-OiPr、-OtBu、-OCH2-Ph)、芳氧基(例如OPh)、O-CH2Ph、O-CH2-芳基、CH2-O-芳基、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、-C(O)NHR、-NHC(O)R、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基(例如OCF3)、C1-C5直链或支链烷氧烷基、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如，吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、4-甲基-哌嗪)，每一个都可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、NHR、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、-O-CH2-芳基(例如-OCH2Ph，OCH2-2-氟苯基)、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H，或-C(O)NH2，、-C(O)N(R)2、-C(O)-吗啉，或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；并且其中，
[0094] R是C1-C5直链或支链烷基、C1-C5直链或支链烷氧基、苯基、芳基、或杂芳基，以上基团都可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；或两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环(例如吗啉)。
[0095] 在多个实施方式中，所述芳基硼酸的芳基是苯基。在其他实施方式中，芳基是被取代的苯基。在其他实施方式中，芳基是被取代或未被取代的萘基。在其他实施方式中，芳基是被取代或未被取代的吲哚基。在多个实施方式中，所述芳基被一个或多个选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、C1-C5直链或支链烷基、甲基、C1-C5直链或支链烷氧基、O-iPr、O-tBu、芳氧基、O-Ph、O-CH2Ph、O-CH2-芳基、CH2-O-芳基、-C(O)N(R)2、-C(O)NHR、C1-C5直链或支链卤代烷氧基、OCF3、C3-C8杂环、吡咯烷、吗啉、哌啶、4-甲基-哌嗪；每个取代基是根据本发明的单独的实施方式。在其他实施方式中，所述芳基硼酸选自下文所述的化合物1-5、PBA、3.12-3.12、C2，C10和C21。
[0096] 在多个实施方式中，本发明的硼酸衍生物由式I的结构表示：
[0097]
[0098] 其中
[0099] R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基(例如甲基)、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基(例如，-OiPr、-OtBu、-OCH2-Ph)、芳氧基(例如OPh)、R6R7、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基(例如OCF3)、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如，吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、4-甲基-哌嗪)，每一个都可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、-NHCO-烷基、COOH、C(O)O-烷基、C(O)H；
[0100] 或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；
[0101] R6为O、(CH2)n、C(O)、C(O)O、OC(O)、C(O)NH、C(O)N(R)、NHC(O)、N(R)CO、NHSO2、N(R)SO2、SO2NH、SO2N(R)、S、SO、SO2、NH、N(R)、OCH2或CH2O；
[0102] R和R7各自独立地为C1-C5直链或支链烷基(例如t-Bu、i-Pr)、C1-C5直链或支链卤代烷基(例如CF3)、C1-C5直链或支链烷氧基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如吗啉)、苯基、芳基(例如，2-氯苯基、2-氟苯基)、萘基、苄基、或杂芳基，以上基团都可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；或两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环；并且
[0103] n是1到6之间的整数。
[0104] 在多个实施方式中，硼酸衍生物由式II的结构表示：
[0105]
[0106] 其中，
[0107] A环是单或稠芳环系(例如苯基、萘基)或杂芳环系(例如吲哚、2，3-二氢苯并呋喃)、或单或稠C3-C10环烷基、或单或稠C3-C10杂环；
[0108] R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基(例如甲基)、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基(例如，-OiPr、-OtBu、-OCH2-Ph)、芳氧基(例如OPh)、R6R7、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基(例如OCF3)、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如，吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、4-甲基-哌嗪)，每一个都可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、-NHCO-烷基、COOH、C(O)O-烷基、C(O)H；
[0109] 或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；
[0110] R6为O、(CH2)n、C(O)、C(O)O、OC(O)、C(O)NH、C(O)N(R)、NHC(O)、N(R)CO、NHSO2、N(R)SO2、SO2NH、SO2N(R)、S、SO、SO2、NH、N(R)、OCH2或CH2O；
[0111] R和R7各自独立地为C1-C5直链或支链烷基(例如t-Bu、i-Pr)、C1-C5直链或支链卤代烷基(例如CF3)、C1-C5直链或支链烷氧基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如吗啉)、苯基、芳基(例如，2-氯苯基、2-氟苯基)、萘基、苄基、或杂芳基，以上基团都可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；或两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环；并且
[0112] n是1到6之间的整数。
[0113] 在多个实施方式中，式II的A是苯基。在其他实施方式中，A是吡啶基。在其他实施方式中，A是萘基。在其他实施方式中，A是吲哚基。在其他实施方式中，A是2，3-二氢苯并呋喃基。在多个实施方式中，A环是吡啶基。在多个实施方式中，A环是嘧啶基。在多个多个实施方式中，A环是哒嗪基。在多个实施方式中，A是吡嗪基。在多个实施方式中，A环是三嗪基。在多个实施方式中，A环是四嗪基。在多个实施方式中，A环是噻唑基。在多个实施方式中，A环是异噻唑基。在多个实施方式中，A环是恶唑基。在多个实施方式中，A环是异恶唑基。在多个实施方式中，A环是咪唑基。在多个实施方式中，A环是吡唑基。在多个实施方式中，A环是吡咯基。在多个实施方式中，A环是呋喃基。在多个实施方式中，A环是噻吩基。在多个实施方式中，A环是茚基。在多个实施方式中，A环是2，3-二氢茚基。在多个实施方式中，A环是四氢萘基。在多个实施方式中，A环是异吲哚基。在多个实施方式中，A环是萘基。在多个实施方式中，A环是蒽基。在多个实施方式中，A环是苯并咪唑基。在多个实施方式中，A环是吲唑基。在多个实施方式中，A环是嘌呤基。在多个实施方式中，A环是苯并恶唑基。在多个实施方式中，A环是苯并异恶唑基。在多个实施方式中，A环是苯并噻唑基。在多个实施方式中，A环是喹唑啉基。在多个实施方式中，A环是喹喔啉基。在多个实施方式中，A环是噌啉基(cinnolinyl)。在多个实施方式中，A环是酞嗪基。在多个实施方式中，A环是喹啉基。在多个实施方式中，A环是异喹啉基。在多个实施方式中，A环是3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚二烯。在多个实施方式中，A环是苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯。在多个实施方式中，A环是吖啶基。在多个实施方式中，A环是苯并呋喃基。在多个实施方式中，A环是异苯并呋喃基。在多个实施方式中，A环是苯并噻吩基。在多个实施方式中，A环是苯并[c]噻吩基。在多个实施方式中，A环是苯并二氧杂环戊烯基。在多个实施方式中，A环是噻二唑基。在多个实施方式中，A环是恶二唑基。在多个实施方式中，A环是7-氧代-6H，7H-[1，3]噻唑并[4，5-d]嘧啶。在多个实施方式中，A环是[1，3]噻唑并[5，4-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是噻吩并[3，2-d]嘧啶-4(3H)-酮。在多个实施方式中，A环是4-氧代-4H-噻吩并[3，2-d][1，3]噻嗪。在多个实施方式中，A环是吡啶并[2，3-b]吡嗪或吡啶并[2，3-b]吡嗪-3(4H)-酮。在多个实施方式中，A环是喹喔啉-2(1H)-酮。在多个实施方式中，A环是1H-吲哚。在多个实施方式中，A环是2H-吲唑。
在多个实施方式中，A环是4，5，6，7-四氢-2H-吲唑。在多个实施方式中，A环是3H-吲哚-3-酮。在多个实施方式中，A环是1，3-苯并恶唑基。在多个实施方式中，A环是1，3-苯并噻唑。在多个实施方式中，A环是4，5，6，7-四氢-1，3-苯并噻唑。在多个实施方式中，A环是1-苯并呋喃。在多个实施方式中，A环是[1，3]恶唑并[4，5-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑。在多个实施方式中，A环是4H，5H，6H-环戊烯并[d][1，3]噻唑。在多个实施方式中，A环是5H，6H，7H，8H-咪唑并[1，2-a]吡啶。在多个实施方式中，A环是2H，3H-咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑。在多个实施方式中，A环是咪唑并[1，2-a]吡啶。在多个实施方式中，A环是吡唑并[1，5-a]吡啶。在多个实施方式中，A环是咪唑并[1，2-a]吡嗪。在多个实施方式中，A环是咪唑并[1，2-a]嘧啶。在多个实施方式中，A环是4H-噻吩并[3，2-b]吡咯。在多个实施方式中，A环是1H-吡咯并[2，3-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是1H-吡咯并[3，2-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶。在多个实施方式中，A环是恶唑并[5，
4-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是噻唑并[5，4-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是三唑基。在多个实施方式中，A环是苯并恶二唑。在多个实施方式中，A环是苯并[c][1，2，5]恶二唑基。在多个实施方式中，A环是1H-咪唑并[4，5-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是3H-咪唑并[4，5-c]吡啶。在多个实施方式中，A环是C3-C8环烷基。在多个实施方式中，A环是C3-C8杂环。在多个实施方式中，A环是四氢吡喃。在多个实施方式中，A环是哌啶。在多个实施方式中，A环是1-(哌啶-1-基)乙酮。在多个实施方式中，A环是吗啉。在多个实施方式中，A环是噻吩并[3，2-c]吡啶。
在多个实施方式中，A环是4，5，6，7-四氢-2H-吲唑。在多个实施方式中，A环是3H-吲哚-3-酮。在多个实施方式中，A环是1，3-苯并恶唑基。在多个实施方式中，A环是1，3-苯并噻唑。在多个实施方式中，A环是4，5，6，7-四氢-1，3-苯并噻唑。在多个实施方式中，A环是1-苯并呋喃。在多个实施方式中，A环是[1，3]恶唑并[4，5-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑。在多个实施方式中，A环是4H，5H，6H-环戊烯并[d][1，3]噻唑。在多个实施方式中，A环是5H，6H，7H，8H-咪唑并[1，2-a]吡啶。在多个实施方式中，A环是2H，3H-咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑。在多个实施方式中，A环是咪唑并[1，2-a]吡啶。在多个实施方式中，A环是吡唑并[1，5-a]吡啶。在多个实施方式中，A环是咪唑并[1，2-a]吡嗪。在多个实施方式中，A环是咪唑并[1，2-a]嘧啶。在多个实施方式中，A环是4H-噻吩并[3，2-b]吡咯。在多个实施方式中，A环是1H-吡咯并[2，3-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是1H-吡咯并[3，2-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶。在多个实施方式中，A环是恶唑并[5，
4-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是噻唑并[5，4-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是三唑基。在多个实施方式中，A环是苯并恶二唑。在多个实施方式中，A环是苯并[c][1，2，5]恶二唑基。在多个实施方式中，A环是1H-咪唑并[4，5-b]吡啶。在多个实施方式中，A环是3H-咪唑并[4，5-c]吡啶。在多个实施方式中，A环是C3-C8环烷基。在多个实施方式中，A环是C3-C8杂环。在多个实施方式中，A环是四氢吡喃。在多个实施方式中，A环是哌啶。在多个实施方式中，A环是1-(哌啶-1-基)乙酮。在多个实施方式中，A环是吗啉。在多个实施方式中，A环是噻吩并[3，2-c]吡啶。
[0114] 在多个实施方式中，式I或II的R1是H。在其他实施方式中，R1是F。在其他实施方式中，R1是Cl。在其他实施方式中，R1是Br。在其他实施方式中，R1是I。在其他实施方式中，R1是C1-C5直链或支链烷基。在其他实施方式中，R1是甲基。在其他实施方式中，R1是C1-C5直链或支链卤代烷基。在其他实施方式中，R1是C1-C5直链或支链烷氧基。在其他实施方式中，R1是-OiPr。在其他实施方式中，R1是-OtBu。在其他实施方式中，R1是-OCH2-Ph。在其他实施方式中，R1是芳氧基。在其他实施方式中，R1是OPh。在其他实施方式中，R1是R6R7。在其他实施方式中，R1是-C(O)NH2。在其他实施方式中，R1是-C(O)N(R)2。在其他实施方式中，R1是C1-C5直链或支链硫代烷氧基。在其他实施方式中，R1是C1-C5直链或支链卤代烷氧基。在其他实施方式中，R1是OCF3。在其他实施方式中，R1是芳基。在其他实施方式中，R1是C3-C8环烷基。在其他实施方式中，R1是C3-C8杂环。在其他实施方式中，R1是吡咯烷。在其他实施方式中，R1是吗啉。在其他实施方式中，R1是哌啶。在其他实施方式中，R1是哌嗪。在其他实施方式中，R1是4-甲基-哌嗪；其中，前述基团均可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代。在其他实施方式中，R1是CF3。在其他实施方式中，R1是CN。在其他实施方式中，R1是NO2。在其他实施方式中，R1是-CH2CN。在其他实施方式中，R1是NH2。在其他实施方式中，R1是N(R)2。在其他实施方式中，R1是烷基-N(R)2。在其他实施方式中，R1是羟基。在其他实施方式中，R1是-OC(O)CF3。在其他实施方式中，R1是COOH。在其他实施方式中，R1是C(O)O-烷基。在其他实施方式中，R1是C(O)H。
[0115] 在多个实施方式中，式I或II的R2是H。在其他实施方式中，R2是F。在其他实施方式中，R2是Cl。在其他实施方式中，R2是Br。在其他实施方式中，R2是I。在其他实施方式中，R2是C1-C5直链或支链烷基。在其他实施方式中，R2是甲基。在其他实施方式中，R2是C1-C5直链或支链卤代烷基。在其他实施方式中，R2是C1-C5直链或支链烷氧基。在其他实施方式中，R2是-OiPr。在其他实施方式中，R2是-OtBu。在其他实施方式中，R2是-OCH2-Ph。在其他实施方式中，R2是芳氧基。在其他实施方式中，R2是OPh。在其他实施方式中，R2是R6R7。在其他实施方式中，R2是-C(O)NH2。在其他实施方式中，R2是-C(O)N(R)2。在其他实施方式中，R2是C1-C5直链或支链硫代烷氧基。在其他实施方式中，R2是C1-C5直链或支链卤代烷氧基。在其他实施方式中，R2是OCF3。在其他实施方式中，R2是芳基。在其他实施方式中，R2是C3-C8环烷基。在其他实施方式中，R2是C3-C8杂环。在其他实施方式中，R2是吡咯烷。在其他实施方式中，R2是吗啉。在其他实施方式中，R2是哌啶。在其他实施方式中，R2是哌嗪。在其他实施方式中，R2是4-甲基-哌嗪；其中，前述基团均可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代。在其他实施方式中，R2是CF3。在其他实施方式中，R2是CN。在其他实施方式中，R2是NO2。在其他实施方式中，R2是-CH2CN。在其他实施方式中，R2是NH2。在其他实施方式中，R2是N(R)2。在其他实施方式中，R2是烷基-N(R)2。在其他实施方式中，R2是羟基。在其他实施方式中，R2是-OC(O)CF3。在其他实施方式中，R2是COOH。在其他实施方式中，R2是C(O)O-烷基。在其他实施方式中，R2是C(O)H。
[0116] 在多个实施方式中，式I或II的R3是H。在其他实施方式中，R3是F。在其他实施方式中，R3是Cl。在其他实施方式中，R3是Br。在其他实施方式中，R3是I。在其他实施方式中，R3是C1-C5直链或支链烷基。在其他实施方式中，R3是甲基。在其他实施方式中，R3是C1-C5直链或支链卤代烷基。在其他实施方式中，R3是C1-C5直链或支链烷氧基。在其他实施方式中，R3是-OiPr。在其他实施方式中，R3是-OtBu。在其他实施方式中，R3是-OCH2-Ph。在其他实施方式中，R3是芳氧基。在其他实施方式中，R3是OPh。在其他实施方式中，R3是R6R7。在其他实施方式中，R3是-C(O)NH2。在其他实施方式中，R3是-C(O)N(R)2。在其他实施方式中，R3是C1-C5直链或支链硫代烷氧基。在其他实施方式中，R3是C1-C5直链或支链卤代烷氧基。在其他实施方式中，R3是OCF3。在其他实施方式中，R3是芳基。在其他实施方式中，R3是C3-C8环烷基。在其他实施方式中，R3是C3-C8杂环。在其他实施方式中，R3是吡咯烷。在其他实施方式中，R3是吗啉。在其他实施方式中，R3是哌啶。在其他实施方式中，R3是哌嗪。在其他实施方式中，R3是4-甲基-哌嗪；其中，前述基团均可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代。在其他实施方式中，R3是CF3。在其他实施方式中，R3是CN。在其他实施方式中，R3是NO2。在其他实施方式中，R3是-CH2CN。在其他实施方式中，R3是NH2。在其他实施方式中，R3是N(R)2。在其他实施方式中，R1是烷基-N(R)2。在其他实施方式中，R3是羟基。在其他实施方式中，R3是-OC(O)CF3。在其他实施方式中，R3是COOH。在其他实施方式中，R3是C(O)O-烷基。在其他实施方式中，R3是C(O)H。
[0117] 在多个实施方式中，式I或II的R4是H。在其他实施方式中，R4是F。在其他实施方式中，R4是Cl。在其他实施方式中，R4是Br。在其他实施方式中，R4是I。在其他实施方式中，R4是C1-C5直链或支链烷基。在其他实施方式中，R4是甲基。在其他实施方式中，R4是C1-C5直链或支链卤代烷基。在其他实施方式中，R4是C1-C5直链或支链烷氧基。在其他实施方式中，R4是-OiPr。在其他实施方式中，R4是-OtBu。在其他实施方式中，R4是-OCH2-Ph。在其他实施方式中，R4是芳氧基。在其他实施方式中，R4是OPh。在其他实施方式中，R4是R6R7。在其他实施方式中，R4是-C(O)NH2。在其他实施方式中，R4是-C(O)N(R)2。在其他实施方式中，R4是C1-C5直链或支链硫代烷氧基。在其他实施方式中，R4是C1-C5直链或支链卤代烷氧基。在其他实施方式中，R4是OCF3。在其他实施方式中，R4是芳基。在其他实施方式中，R4是C3-C8环烷基。在其他实施方式中，R4是C3-C8杂环。在其他实施方式中，R4是吡咯烷。在其他实施方式中，R4是吗啉。在其他实施方式中，R4是哌啶。在其他实施方式中，R4是哌嗪。在其他实施方式中，R4是4-甲基-哌嗪；其中，前述基团均可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代。在其他实施方式中，R4是CF3。在其他实施方式中，R4是CN。在其他实施方式中，R4是NO2。在其他实施方式中，R4是-CH2CN。在其他实施方式中，R4是NH2。在其他实施方式中，R4是N(R)2。在其他实施方式中，R4是烷基-N(R)2。在其他实施方式中，R4是羟基。在其他实施方式中，R4是-OC(O)CF3。在其他实施方式中，R4是COOH。在其他实施方式中，R4是C(O)O-烷基。在其他实施方式中，R4是C(O)H。
[0118] 在多个实施方式中，式I或II的R5是H。在其他实施方式中，R5是F。在其他实施方式中，R5是Cl。在其他实施方式中，R5是Br。在其他实施方式中，R5是I。在其他实施方式中，R5是C1-C5直链或支链烷基。在其他实施方式中，R5是甲基。在其他实施方式中，R5是C1-C5直链或支链卤代烷基。在其他实施方式中，R5是C1-C5直链或支链烷氧基。在其他实施方式中，R5是-OiPr。在其他实施方式中，R5是-OtBu。在其他实施方式中，R5是-OCH2-Ph。在其他实施方式中，R5是芳氧基。在其他实施方式中，R5是OPh。在其他实施方式中，R5是R6R7。在其他实施方式中，R5是-C(O)NH2。在其他实施方式中，R5是-C(O)N(R)2。在其他实施方式中，R5是C1-C5直链或支链硫代烷氧基。在其他实施方式中，R5是C1-C5直链或支链卤代烷氧基。在其他实施方式中，R5是OCF3。在其他实施方式中，R5是芳基。在其他实施方式中，R5是C3-C8环烷基。在其他实施方式中，R5是C3-C8杂环。在其他实施方式中，R5是吡咯烷。在其他实施方式中，R5是吗啉。在其他实施方式中，R5是哌啶。在其他实施方式中，R5是哌嗪。在其他实施方式中，R5是4-甲基-哌嗪；其中，前述基团均可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代。在其他实施方式中，R5是CF3。在其他实施方式中，R5是CN。在其他实施方式中，R5是NO2。在其他实施方式中，R5是-CH2CN。在其他实施方式中，R5是NH2。在其他实施方式中，R5是N(R)2。在其他实施方式中，R5是烷基-N(R)2。在其他实施方式中，R5是羟基。在其他实施方式中，R5是-OC(O)CF3。在其他实施方式中，R5是COOH。在其他实施方式中，R5是C(O)O-烷基。在其他实施方式中，R5是C(O)H。
[0119] 在多个实施方式中，式I或II的R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4(每对都是单独的实施方式)连接在一起以形成5元或6元碳环或杂环，其可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN和/或NO2取代。在其他实施方式中，R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4(每对都是单独的实施方式)连接在一起形成苯。R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4连接在一起形成呋喃。
[0120] 在多个实施方式中，式I或II的R6是O。在其他实施方式中，R6是(CH2)n，其中n是1、2、3、4、5或6(各自都是单独的实施方式)。在其他实施方式中，R6是C(O)。在其他实施方式中，R6是C(O)O。在其他实施方式中，R6是OC(O)。在其他实施方式中，R6是C(O)NH。在其他实施方式中，R6是C(O)N(R)。在其他实施方式中，R6是NHC(O)。在其他实施方式中，R6是N(R)CO。在其他实施方式中，R6是NHSO2。在其他实施方式中，R6是N(R)SO2。在其他实施方式中，R6是SO2NH。在其他实施方式中，R6是SO2N(R)。在其他实施方式中，R6是S。在其他实施方式中，R6是SO。在其他实施方式中，R6是SO2。在其他实施方式中，R6是NH。在其他实施方式中，R6是N(R)。
在其他实施方式中，R6是OCH2。在其他实施方式中，R6是CH2O。
在其他实施方式中，R6是OCH2。在其他实施方式中，R6是CH2O。
[0121] 在多个实施方式中，式I或II的R7是C1-C5直链或支链烷基。在其他实施方式中，R7是t-Bu。在其他实施方式中，R7是i-Pr。在其他实施方式中，R7是C1-C5直链或支链卤代烷基。在其他实施方式中，R7是CF3。在其他实施方式中，R7是C1-C5直链或支链烷氧基。在其他实施方式中，R7是C3-C8环烷基。在其他实施方式中，R7是C3-C8杂环。在其他实施方式中，R7是吗啉。在其他实施方式中，R7是苯基。在其他实施方式中，R7是芳基。在其他实施方式中，R7是2-氯苯基。在其他实施方式中，R7是2-氟苯基。在其他实施方式中，R7是萘基。在其他实施方式中，R7是苄基。在其他实施方式中，R7是杂芳基。在其他实施方式中，芳基、苄基、杂芳基或萘基可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN和/或NO2取代(每个都是单独的实施方式)。
[0122] 在多个实施方式中，式I或II的R为C1-C5直链或支链烷基。在其他实施方式中，R是t-Bu。在其他实施方式中，R是i-Pr。在其他实施方式中，R是C1-C5直链或支链卤代烷基。在其他实施方式中，R是CF3。在其他实施方式中，R是C1-C5直链或支链烷氧基。在其他实施方式中，R是C3-C8环烷基。在其他实施方式中，R是C3-C8杂环。在其他实施方式中，R是吗啉。在其他实施方式中，R是苯基。在其他实施方式中，R是芳基。在其他实施方式中，R是2-氯苯基。在其他实施方式中，R是2-氟苯基。在其他实施方式中，R是萘基。在其他实施方式中，R是苄基。在其他实施方式中，R是杂芳基。在其他实施方式中，芳基、杂芳基或萘基可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN和/或NO2取代(每个都是单独的实施方式)。在其他实施方式中，两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环。
[0123] 在多个实施方式中，式I或II的n为1。在其他实施方式中，n为2。在其他实施方式中，n为3。在其他实施方式中，n为4。在其他实施方式中，n为5。在其他实施方式中，n为5。在其他实施方式中，n为6。
[0124] 在多个实施方式中，硼酸衍生物选自：
[0125]
[0126]
[0127]
[0128] 在多个实施方式中，硼酸衍生物的盐包括任何酸性盐。羧酸无机盐的非限制性示例包括铵、碱金属(包括锂、钠、钾、铯)、碱土金属(包括钙、镁、铝)、锌、钡、氯、或季铵。有机盐的非限制性示例包括有机胺，其包括脂族有机胺、脂环族有机胺、芳族有机胺、苄星(benzathines)、叔丁胺、苄乙胺(N-苄基苯乙胺)(benethamines(N-benzylphenethylamine))、二环己胺、二甲胺、二乙醇胺、乙醇胺、乙二胺、海卓胺(hydrabamine)、咪唑类、赖氨酸、甲胺、葡甲胺(meglamine)、N-甲基-D-葡萄糖胺、N，N′-二苄基乙二胺、烟酰胺、有机胺、鸟氨酸、吡啶、皮考啉(picolies)、哌嗪、普鲁卡因、三(羟甲基)甲胺、三乙胺、三乙醇胺、三甲胺、氨丁三醇或脲类。
[0129] 除非另有说明，本文所用的术语“烷基”可以是含有至多约30个碳的任何直链或支链烷基。在多个实施方式中，烷基包括C1-C5碳。在其他实施方式中，烷基包括C1-C6碳。在其他实施方式中，烷基包括C1-C8碳。在其他实施方式中，烷基包括C1-C10碳。在其他实施方式中，烷基是C1-C12碳。在其他实施方式中，烷基是C1-C20碳。在其他实施方式中，支链烷基是被1至5个碳的烷基侧链取代的烷基。在多个实施方式中，烷基可以是未被取代的。在其他实施方式中，烷基可以被卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰氨基、烷基酰氨基、二烷基酰氨基、氰基、硝基、CO2H、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫代和/或硫代烷基取代。
[0130] 烷基可以是唯一的取代基，或者它可以是较大取代基的部分，例如烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷基、芳烷基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰氨基、烷基脲等。优选的烷基是甲基、乙基、和丙基，以及卤代甲基、二卤代甲基、三卤代甲基、卤代乙基、二卤代乙基、三卤代乙基、卤代丙基、二卤代丙基、三卤代丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、芳基甲基、芳基乙基、芳基丙基、甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲基酰氨基、乙酰氨基、丙酰氨基、卤代甲酰氨基、卤代乙酰氨基、卤代丙酰氨基、甲基脲、乙基脲、丙基脲等。
[0131] 如本文所用，术语“芳基”是指任意芳族或杂芳族单或稠环，其直接键合至另一基团并且可以是被取代的或被未取代的。芳基可以是唯一的取代基，或芳基可以是较大取代基的一部分，例如芳烷基、芳基氨基、芳基酰胺基等。示例性芳基包括但不限于苯基、甲苯基、二甲苯基、呋喃基、萘基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、噻唑基、恶唑基、异恶唑基、吡唑基、吲哚基、咪唑基、噻吩基、吡咯基、苯基甲基、苯基乙基、苯基氨基、苯基酰氨基等。前述基团包括但不限于被以下基团所取代：F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基、CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2，NH-烷基、N(烷基)2、羟基、-OC(O)CF3、-OCH2Ph、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H、或-C(O)NH2。
[0132] 如本文所用，术语“烷氧基”是指被如前文所定义的烷基取代的醚基。烷氧基指直链和支链烷氧基。烷氧基的非限制性示例是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、-OCH2-Ph。
[0133] 如本文所用，术语“硫代烷氧基”是指被如前文所定义的烷基取代的含硫基团。硫代烷氧基指直链和支链硫代烷氧基。硫代烷氧基的非限制性示例是硫代甲基、硫代乙基、硫代丙基、硫代异丙基、硫代叔丁基、-SCH2-Ph。
[0134] 如本文所用，术语“芳氧基”是指被如前文定义的芳基取代的醚基。芳氧基的非限制性示例是OPh。
[0135] 在其他实施方式中，“卤代烷基”是指如前文定义的被一个或多个卤原子(例如，F、Cl、Br或I)取代的烷基。卤代烷基的非限制性示例是CF3、CF2CF3、CH2CF3。
[0136] 在其他实施方式中，“卤代烷氧基”是指如前文定义的被一个或多个卤原子(例如，F、Cl、Br或I)取代的烷氧基。卤代烷氧基的非限制性示例是OCF3、OCF2CF3、OCH2CF3。
[0137] 在其他实施方式中，“烷氧基烷基”是指被如前文定义的烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基等)取代的如前文定义的烷基。烷氧基烷基的非限制性示例是-CH2-O-CH3、-CH2-O-CH(CH3)2、-CH2-O-C(CH3)3、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-O-CH(CH3)2、-CH2-CH2-O-C(CH3)3。
[0138] 在多个实施方式中，“环烷基”或“碳环”基团指包括碳原子作为环原子的环结构，其可以是饱和的或不饱和的，被取代的或未被取代的。在其他实施方式中，环烷基是3-12元环。在其他实施方式中，环烷基是6元环。在其他实施方式中，环烷基是5-7元环。在其他实施方式中，环烷基是3-8元环。在其他实施方式中，环烷基可以是未被取代的或被卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰氨基、烷基酰氨基、二烷基酰氨基、氰基、硝基、CO2H、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、含硫基和/或硫代烷基取代。在其他实施方式中，环烷基环可以稠合到另一个饱和或不饱和的3-8元的环烷基或杂环上。在其他实施方式中，环烷基环是饱和环。在其他实施方式中，环烷基环是不饱和环。环烷基的非限制性示例包括环己基、环己烯基、环丙基、环丙烯基、环戊基、环戊烯基、环丁基、环丁烯基、环辛基、环辛二烯基(COD)、环辛烯(COE)等。
[0139] 在多个实施方式中，“杂环”或“杂环的”基团是指除了碳原子之外还包括硫、氧、氮或其任意组合作为该环结构的一部分的环结构。在其他实施方式中，杂环是3-12元环。在其他实施方式中，杂环是6元环。在其他实施方式中，杂环是5-7元环。在其他实施方式中，杂环是3-8元环。在其他实施方式中，杂环基团可以是未被取代的或被卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰氨基、烷基酰氨基、二烷基酰氨基、氰基、硝基、CO2H、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、含硫基和/或硫代烷基取代。在其他实施方式中，杂环可以与另一个饱和或不饱和的3-8元的环烷基或杂环稠合。在其他实施方式中，杂环是饱和环。在其他实施方式中，杂环是不饱和环。杂环的非限制性示例包括吡啶、吡咯烷、哌啶、吗啉、哌嗪、噻吩、吡咯、苯并二氧杂环戊烯、或吲哚。
[0140] 在多个实施方式中，本发明提供了羧乙基酯酶(CBE)的选择性抑制剂，包括硼酸衍生物及其盐。在其他实施方式中，本发明的CBE是野生型CBE、CBE的同源物或突变的CBE。在其他实施方式中，本发明的CBE是αE7 CBE的野生型或突变型或其同源物。在其他实施方式中，本发明的CBE是LcαE7、野生型LcαE7、突变的LcαE7、其同源物，或其任意组合。在其他实施方式中，硼酸衍生物是如前文所述的芳基硼酸衍生物及其盐。
[0141] 在多个实施方式中，本发明提供羧乙基酯酶(CBE)的选择性抑制剂，其包括由式I的结构表示的硼酸衍生物或其盐：
[0142]
[0143] 其中，
[0144] R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为：H、F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基(例如甲基)、C1-C5直链或支链卤代烷基、C1-C5直链或支链烷氧基(例如，-OiPr、-OtBu、-OCH2-Ph)、芳氧基(例如OPh)、R6R7、-C(O)NH2、-C(O)N(R)2、C1-C5直链或支链硫代烷氧基、C1-C5直链或支链卤代烷氧基(例如OCF3)、芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如，吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、4-甲基-哌嗪)，每一个都可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、N(R)2、烷基-N(R)2、羟基、-OC(O)CF3、-NHCO-烷基、COOH、C(O)O-烷基、C(O)H；
[0145] 或两个相邻的取代基(即R2和R1、或R3和R1、或R4和R3、或R5和R4)连接在一起形成5元或6元碳环(例如，苯、呋喃)或杂环，其可以进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；并且
[0146] R6为O、(CH2)n、C(O)、C(O)O、OC(O)、C(O)NH、C(O)N(R)、NHC(O)、N(R)CO、NHSO2、N(R)SO2、SO2NH、SO2N(R)、S、SO、SO2、NH、N(R)、OCH2或CH2O；
[0147] R和R7各自独立地为C1-C5直链或支链烷基(例如t-Bu、i-Pr)、C1-C5直链或支链卤代烷基(例如CF3)、C1-C5直链或支链烷氧基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环(例如吗啉)、苯基、芳基(例如，2-氯苯基、2-氟苯基)、萘基、苄基、或杂芳基，每个基团都可进一步被F、Cl、Br、I、C1-C5直链或支链烷基、羟基、烷氧基、N(R)2、CF3、CN或NO2取代；或两个偕R取代基连接在一起形成5元或6元杂环；并且
[0148] n是1到6之间的整数。
[0149] 在其他实施方式中，本发明的CBE是野生型CBE、CBE的同源物或突变的CBE。在其他实施方式中，CBE是LcαE7。
[0150] 在多个实施方式中，本发明提供羧乙基酯酶(CBE)的选择性抑制剂，其包括选自以下的硼酸衍生物：
[0151]
[0152]
[0153]
[0154] 在其他实施方式中，抑制剂共价连接至CBE、CBE的同源物或突变的CBE。在其他实施方式中，CBE是野生型αE7。在其他实施方式中，CBE是αE7同系物。在其他实施方式中，CBE是突变的αE7。在其他实施方式中，αE7是LcαE7。在其他实施方式中，CBE是野生型或突变的CBE或其组合。在其他实施方式中，所述突变的CBE中的突变是αE7Gly137Asp。在其他实施方式中，CBE是αE7CBE的同源物中的等同突变。在其他实施方式中，抑制剂是纳摩尔抑制剂。在其他实施方式中，抑制剂是皮摩尔抑制剂。
[0155] 尽管出现了抗性以及与环境和人类污染有关的问题，杀虫剂仍是用于绿头苍蝇控制的主要措施。对绿头苍蝇的化学控制的主要手段(环虫腈和环丙嗪)的抗性的最近检测(Levot，G.等.，Survival advantage of cyromazine-resistant sheep blowfly larvae on dicyclanil-and cyromazine-treated Merinos.Aust.Vet.J.92，421-426(2014)and Levot，G.Cyromazine resistance detected in Australian sheep blowfly.Aust.Vet.J.90，433-437(2012).)突出体现了对绿头苍蝇控制措施持续创新的必要性。虽然正在研究新的杀虫剂靶标(Kotze，A.C.等.Histone deacetylase enzymes as drug targets for the control of the sheep blowfly，Lucilia
cuprina.Int.J.Parasitol.Drugs Drug Resist.5，201-208(2015).)，并受到最近出版的L.cuprina基因组的帮助(Anstead，C.a.等.Lucilia cuprina genome unlocks parasitic fly biology to underpin future interventions.Nat.Commun.6，7344(2015))，使用增强OP杀虫剂有效性的增效剂可能是一种可行的绿头苍蝇控制策略，特别是在如果目前的控制方法无效的情况下。
cuprina.Int.J.Parasitol.Drugs Drug Resist.5，201-208(2015).)，并受到最近出版的L.cuprina基因组的帮助(Anstead，C.a.等.Lucilia cuprina genome unlocks parasitic fly biology to underpin future interventions.Nat.Commun.6，7344(2015))，使用增强OP杀虫剂有效性的增效剂可能是一种可行的绿头苍蝇控制策略，特别是在如果目前的控制方法无效的情况下。
[0156] 在多个实施方式中，本发明提供用于杀死害虫的杀虫剂组合物，其包括至少一种有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸酯(CM)、和/或拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯(SP)的协同有效组合；和至少一种硼酸衍生物或其盐。在其他实施方式中，害虫对有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸盐(CM)和/或拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯(SP)杀虫剂具有抗性。在多个实施方式中，本发明提供用于杀死害虫的杀虫剂组合物，其包括有机磷酸酯(OP)和至少一种硼酸衍生物或其盐的协同有效组合。在其他实施方式中，害虫对有机磷(OP)杀虫剂具有抗性。
[0157] 在其他实施方式中，该组合物用于杀死害虫。在其他实施方式中，该组合物用于杀死昆虫。在其他实施方式中，硼酸衍生物是如上文所述的芳基硼酸衍生物或其盐。在其他实施方式中，硼酸衍生物由上文所述的式I或II表示。在其他实施方式中，硼酸衍生物选自上文所述的化合物1-8、PBA、3.1-3.12、C2、C10和C21；前述的每一个都是根据本发明的单独实施方式。在其他实施方式中，该组合物可用于杀死农作物害虫，农作物包括蔬菜作物、花卉栽培、观赏作物、药用和经济植物。在其他实施方式中，农作物是小蚕豆(Viciafaba)。在其他实施方式中，农作物是玉米(例如，Zea may)。在其他实施方式中，农作物是马铃薯。
[0158] 使这种协同有效组合物具有实用性的一个主要要求是安全性良好且环境友好。毒性方面的主要问题是对AChE的选择性。虽然LcαE7的整体结构类似于人AChE(PDB 4PQE；RMSD超过309个残基)的结构，但活性位点区域中的酶差别很大，这导致例如化合物
3对于LcαE7＞106倍的选择性(表1)。由于活性位点的构象差异，与LcαE7活性位点高度互补的溴取代基由于与Phe295的抵触而从AChE的活性位点被空间阻隔开(图14)。此外，本文证实了这些化合物不会显着抑制其他非靶蛋白，例如人丝氨酸和苏氨酸蛋白酶，它们通常对细胞也没有毒性。这也与其他文献所陈述的硼酸较为良性相一致。
3对于LcαE7＞106倍的选择性(表1)。由于活性位点的构象差异，与LcαE7活性位点高度互补的溴取代基由于与Phe295的抵触而从AChE的活性位点被空间阻隔开(图14)。此外，本文证实了这些化合物不会显着抑制其他非靶蛋白，例如人丝氨酸和苏氨酸蛋白酶，它们通常对细胞也没有毒性。这也与其他文献所陈述的硼酸较为良性相一致。
[0159] 因此，在多个实施方式中，如上文所述的组合物对植物无毒。在其他实施方式中，该组合物对哺乳动物无毒。在其他实施方式中，该组合物对鸟类无毒。在其他实施方式中，该组合物对动物无毒。在其他实施方式中，该组合物对人类无毒。
[0160] 在其他实施方式中，该组合物杀死害虫，害虫包括但不限于绿头苍蝇(例如，Calliphora stygia)、螺旋蝇(例如，螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax))、蟑螂、蜱、蚊子(例如，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus))、蟋蟀、家蝇(例如，Musca domestica)、沙蝇、螫蝇(例如，厩螫蝇(Stomoxys calcitrans))、蚂蚁、白蚁、跳蚤、蚜虫(例如绿桃蚜虫)、蛀虫(例如玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲米蛀虫))、甲壳虫(例如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多甲壳虫))、飞蛾，或其任何组合。害虫的示例包括但不限于：绿头苍蝇(例如，Calliphorastygia)、螺旋蝇(例如，螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax))、蚊子(例如，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus))、家蝇(例如，Musca domestica)、螫蝇(例如，厩螫蝇(Stomoxys calcitrans))、蚜虫(例如绿桃蚜虫)、蛀虫(例如玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲米蛀虫))、甲壳虫(例如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多甲壳虫))、飞蛾、若虫和蜚蠊目的成虫，包括姬蜚蠊科(例如东方蟑螂(Blatta orientalis Linnaeus)、亚洲蟑螂(Blatella asahinai Mizukubo)、德国蟑螂(Blattella germanica Linnaeus)、褐蟑螂(Supella longipalpa Fabricius)、美洲蟑螂(Periplaneta americana Linnaeus)、棕色蟑螂(Periplaneta brunnea Burmeister)、马德拉蟑螂(Leucophaea maderae
Fiabricius)、烟棕色蟑螂(Periplaneta fuliginosa Service)、澳大利亚蟑螂
(Periplaneta australasiae Fabr.)、龙虾蟑螂(Nauphoeta cinerea Olivier)和光滑蟑螂(Symploce pallens Stephens)家族的蟑螂；革翅(Dermaptera)目的成虫和幼虫，包括来自蠼螋科的蠼螋(例如欧洲蠼螋(Forficula auricularia Linnaeus))和黑蠼螋
(Chelisoches morio Fabricius))。其他的例子是蜱螨目(螨类)的成虫和幼虫，例如叶螨科中的蜘蛛螨和红螨(例如欧洲红螨(Panonychus ulmi Koch))、二斑蜘蛛螨(Tetranychus urticae Koch)和McDaniel螨(Tetranychus mcdanieli McGregor))；螨虫对人类和动物健康有重要影响(例如，表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的卵泡螨和食甜螨科(Glycyphagidae)的粮螨(grain mite))；硬蜱科的蜱(例如鹿蜱(Ixodes scapularis Say)、澳大利亚瘫蜱(Ixodes holocyclus Neumann)、美洲犬蜱(Dermacentor variabilis Say)和孤星蜱(Amblyomma americanum Linnaeus))；痒螨科(Psoroptidae)、脓螨科(Pyemotidae)、疥螨科(Sarcoptidae)的疮螨和疥螨；蟋蟀，诸如家蟋蟀(Acheta domesticus Linnaeus)、鼹鼠蟋蟀(例如，褐鼹鼠蟋蟀(Scapteriscus vicinus Scudder)和南方鼹鼠蟋蟀(Scapteriscus borellii Giglio-Tos))；苍蝇，包括家蝇(例如，Musca domestica Linnaeus)、较小的家蝇(例如，Fannia canicularis Linnaeus、F.femoralis Stein)、螫蝇(例如，Stomoxys calcitrans Linnaeus)、秋家蝇、角蝇、绿头苍蝇(例如，Stomoxys calcitrans Linnaeus)，以及其他的蝇类飞虫，马蝇(例如，Tabanus spp.)、肤蝇(例如，Gastrophilus spp.、Oestrus spp.)、牛皮蝇(例如，Hypoderma spp.)、鹿蝇(例如，Chrysops spp.)、虱蝇(例如，Melophagus ovinus Linnaeus)和其他短角亚目虫类；蚊子(例如，Aedes spp.、Anopheles spp.、Culex spp.)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(黄热病蚊)；白端按蚊(Anopheles albimanus)；尖音库蚊复合组(Culex pipiens complex)；跗斑库蚊(Culex tarsalis)；三带喙库蚊(Culex tritaenorhynchus)；黑蝇(例如，Prosimulium spp.、Simulium spp.)，Simulium damnosum；Simulium sanctipauli(黑蝇)；蠓(biting midge)、沙蝇，眼蕈蚊、和其他长角亚目(Nematocera)；膜翅目害虫，包括蚂蚁(例如，红木蚂蚁(Camponotus ferrugineus Fabricius)、黑木工蚁(Camponotus pennsylvanicus De Geer)、法老蚁(Monomorium pharaonis Linnaeus)、小火蚁(Wasmannia auropunctata Roger)、火蚁(Solenopsis geminata Fabricius)、红火蚁(Solenopsis invicta Buren)、阿根廷蚁(Iridomyrmex humilis Mayr)、家褐蚁(Paratrechina longicomis Latreille)、路面蚁(Tetramorium caespitum Linnaeus)、玉米田蚁(Lasius alienus Forster)、臭屋蚁(Tapinoma sessile Say))；蚁科的害虫，包括佛罗里达木蚁(Camponotus floridanus Buckley)、白足蚁(Technomyrmex albipes fr.Smith)、大头蚁(Pheidole spp.)、和鬼蚂蚁(Tapinoma melanocephalum Fabricius)；蜜蜂(包括木匠蜂)、大黄蜂、黄蜂、胡蜂、和锯蝇(Neodiprion spp.；Cephus spp.)；等翅目害虫，包括白蚁科(例如Macrotermes sp.)、木白蚁科(例如Cryptotermes sp.)和鼻白蚁科(例如Reticulitermes spp.、Coptotermes spp.)的白蚁，家族东部地下白蚁(Reticulitermes flavipes Kollar)、西部地下白蚁(Reticulitermes hesperus Banks)、台湾地下白蚁(Coptotermes formosanus Shiraki)、西印度干木白蚁(Incisitermes immigrans Snyder)、粉末白蚁(Cryptotermes brevis Walker)、干木白蚁(Incisitermes snyderi Light)、东南地下白蚁(Reticulitermes virginicus Banks)、西部干木白蚁(Incisitermes minor Hagen)、树栖白蚁诸如Nasutitermes sp.和其他具有经济重要性的白蚁；缨尾目的害虫，如蠹鱼(Lepisma saccharina Linnaeus)和家衣鱼(Thermobia domestica Packard)；食毛目的害虫，包括头虱(Pediculus humanus capitis De Geer)、体虱(Pediculus humanus humanus
Linnaeus)、鸡体虱(Menacanthus stramineus Nitszch)、狗咬虱(Trichodectes canis De Geer)、绒毛虱(Goniocotes gallinae De Geer)、绵羊体虱(Bovicola ovis Schrank)、短鼻牛虱(Haematopinus eurysternus Nitzsch)；长鼻牛虱(Linognathus vituli
Linnaeus)和其他攻击人和动物的吮吸和咀嚼寄生虱子；蚤目害虫的示例包括东方鼠蚤(Xenopsylla cheopis Rothschild)、猫蚤(Ctenocephalidesfelis Bouche)、狗蚤(Ctenocephalides canis Curtis)、母鸡跳蚤(Ceratophyllus gallinae Schrank)、吸着蚤(Echidnophaga gallinacea Westwood)、人类跳蚤(Pulex irritans Linnaeus)和其他折磨哺乳动物和鸟类的蚤。节肢动物害虫的示例还包括蜘蛛目的蜘蛛，诸如褐皮花蛛(Loxosceles reclusa Gertsch&Mulaik)和黑寡妇蜘蛛(Latrodectus mactans
Fabricius)，以及蚰蜒目的蜈蚣诸如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus)；西花蓟马(Frankliniella occidentalis)；桔实硬蓟马(Scirtothrips citri)；豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)；棉蚜(Aphis gossypii)；烟粉虱(Bemisia tabaci)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)(卷心菜蚜虫)；豆荚盲蝽(Lygus Hesperus)；桃蚜
(Myzuspersicae)(绿桃蚜虫)；Myzus nicotianaea(烟草蚜虫)；黑茶藨子长管蚜
(Nasonovia ribisnigri)(Currantlettuce aphid)；黑尾叶蝉(Nephotettix
cincticeps)；褐飞虱(Nilaparvata lugens)(糙米飞虱)；忽布疣额蚜(Phorodon humuli)(指头蚜)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)(绿蚜)；玉米根虫(Diabrotica virgifera)；
马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)；锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)(锯谷甲虫)；马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多甲虫)；飞蛾，诸如：苹果蠹蛾(Cydia pomonella)(苹果小卷蛾)；苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana)(浅棕苹果蛾)；绿棉铃虫(Heliothis virescens)；Platynota idaeusalis(簇生苹果芽蛾)；扰血蝇(Haematobia irritans)(水牛蝇)；丝光绿蝇(Lucilia sericata)(绿瓶蝇)；Amblyseius pontentillae；微小牛蜱(Boophilus microplus)；冥紫珠(Calliphora stygia)、螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)和神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)。
在其他实施方式中，该组合物杀死如上所列的害虫，但对动物无害。在其他实施方式中，该组合物对哺乳动物无害。在其他实施方式中，该组合物对鸟类无害。在其他实施方式中，该组合物对人类无害。在其他实施方式中，该组合物对植物无害。
Fiabricius)、烟棕色蟑螂(Periplaneta fuliginosa Service)、澳大利亚蟑螂
(Periplaneta australasiae Fabr.)、龙虾蟑螂(Nauphoeta cinerea Olivier)和光滑蟑螂(Symploce pallens Stephens)家族的蟑螂；革翅(Dermaptera)目的成虫和幼虫，包括来自蠼螋科的蠼螋(例如欧洲蠼螋(Forficula auricularia Linnaeus))和黑蠼螋
(Chelisoches morio Fabricius))。其他的例子是蜱螨目(螨类)的成虫和幼虫，例如叶螨科中的蜘蛛螨和红螨(例如欧洲红螨(Panonychus ulmi Koch))、二斑蜘蛛螨(Tetranychus urticae Koch)和McDaniel螨(Tetranychus mcdanieli McGregor))；螨虫对人类和动物健康有重要影响(例如，表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的卵泡螨和食甜螨科(Glycyphagidae)的粮螨(grain mite))；硬蜱科的蜱(例如鹿蜱(Ixodes scapularis Say)、澳大利亚瘫蜱(Ixodes holocyclus Neumann)、美洲犬蜱(Dermacentor variabilis Say)和孤星蜱(Amblyomma americanum Linnaeus))；痒螨科(Psoroptidae)、脓螨科(Pyemotidae)、疥螨科(Sarcoptidae)的疮螨和疥螨；蟋蟀，诸如家蟋蟀(Acheta domesticus Linnaeus)、鼹鼠蟋蟀(例如，褐鼹鼠蟋蟀(Scapteriscus vicinus Scudder)和南方鼹鼠蟋蟀(Scapteriscus borellii Giglio-Tos))；苍蝇，包括家蝇(例如，Musca domestica Linnaeus)、较小的家蝇(例如，Fannia canicularis Linnaeus、F.femoralis Stein)、螫蝇(例如，Stomoxys calcitrans Linnaeus)、秋家蝇、角蝇、绿头苍蝇(例如，Stomoxys calcitrans Linnaeus)，以及其他的蝇类飞虫，马蝇(例如，Tabanus spp.)、肤蝇(例如，Gastrophilus spp.、Oestrus spp.)、牛皮蝇(例如，Hypoderma spp.)、鹿蝇(例如，Chrysops spp.)、虱蝇(例如，Melophagus ovinus Linnaeus)和其他短角亚目虫类；蚊子(例如，Aedes spp.、Anopheles spp.、Culex spp.)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(黄热病蚊)；白端按蚊(Anopheles albimanus)；尖音库蚊复合组(Culex pipiens complex)；跗斑库蚊(Culex tarsalis)；三带喙库蚊(Culex tritaenorhynchus)；黑蝇(例如，Prosimulium spp.、Simulium spp.)，Simulium damnosum；Simulium sanctipauli(黑蝇)；蠓(biting midge)、沙蝇，眼蕈蚊、和其他长角亚目(Nematocera)；膜翅目害虫，包括蚂蚁(例如，红木蚂蚁(Camponotus ferrugineus Fabricius)、黑木工蚁(Camponotus pennsylvanicus De Geer)、法老蚁(Monomorium pharaonis Linnaeus)、小火蚁(Wasmannia auropunctata Roger)、火蚁(Solenopsis geminata Fabricius)、红火蚁(Solenopsis invicta Buren)、阿根廷蚁(Iridomyrmex humilis Mayr)、家褐蚁(Paratrechina longicomis Latreille)、路面蚁(Tetramorium caespitum Linnaeus)、玉米田蚁(Lasius alienus Forster)、臭屋蚁(Tapinoma sessile Say))；蚁科的害虫，包括佛罗里达木蚁(Camponotus floridanus Buckley)、白足蚁(Technomyrmex albipes fr.Smith)、大头蚁(Pheidole spp.)、和鬼蚂蚁(Tapinoma melanocephalum Fabricius)；蜜蜂(包括木匠蜂)、大黄蜂、黄蜂、胡蜂、和锯蝇(Neodiprion spp.；Cephus spp.)；等翅目害虫，包括白蚁科(例如Macrotermes sp.)、木白蚁科(例如Cryptotermes sp.)和鼻白蚁科(例如Reticulitermes spp.、Coptotermes spp.)的白蚁，家族东部地下白蚁(Reticulitermes flavipes Kollar)、西部地下白蚁(Reticulitermes hesperus Banks)、台湾地下白蚁(Coptotermes formosanus Shiraki)、西印度干木白蚁(Incisitermes immigrans Snyder)、粉末白蚁(Cryptotermes brevis Walker)、干木白蚁(Incisitermes snyderi Light)、东南地下白蚁(Reticulitermes virginicus Banks)、西部干木白蚁(Incisitermes minor Hagen)、树栖白蚁诸如Nasutitermes sp.和其他具有经济重要性的白蚁；缨尾目的害虫，如蠹鱼(Lepisma saccharina Linnaeus)和家衣鱼(Thermobia domestica Packard)；食毛目的害虫，包括头虱(Pediculus humanus capitis De Geer)、体虱(Pediculus humanus humanus
Linnaeus)、鸡体虱(Menacanthus stramineus Nitszch)、狗咬虱(Trichodectes canis De Geer)、绒毛虱(Goniocotes gallinae De Geer)、绵羊体虱(Bovicola ovis Schrank)、短鼻牛虱(Haematopinus eurysternus Nitzsch)；长鼻牛虱(Linognathus vituli
Linnaeus)和其他攻击人和动物的吮吸和咀嚼寄生虱子；蚤目害虫的示例包括东方鼠蚤(Xenopsylla cheopis Rothschild)、猫蚤(Ctenocephalidesfelis Bouche)、狗蚤(Ctenocephalides canis Curtis)、母鸡跳蚤(Ceratophyllus gallinae Schrank)、吸着蚤(Echidnophaga gallinacea Westwood)、人类跳蚤(Pulex irritans Linnaeus)和其他折磨哺乳动物和鸟类的蚤。节肢动物害虫的示例还包括蜘蛛目的蜘蛛，诸如褐皮花蛛(Loxosceles reclusa Gertsch&Mulaik)和黑寡妇蜘蛛(Latrodectus mactans
Fabricius)，以及蚰蜒目的蜈蚣诸如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus)；西花蓟马(Frankliniella occidentalis)；桔实硬蓟马(Scirtothrips citri)；豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)；棉蚜(Aphis gossypii)；烟粉虱(Bemisia tabaci)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)(卷心菜蚜虫)；豆荚盲蝽(Lygus Hesperus)；桃蚜
(Myzuspersicae)(绿桃蚜虫)；Myzus nicotianaea(烟草蚜虫)；黑茶藨子长管蚜
(Nasonovia ribisnigri)(Currantlettuce aphid)；黑尾叶蝉(Nephotettix
cincticeps)；褐飞虱(Nilaparvata lugens)(糙米飞虱)；忽布疣额蚜(Phorodon humuli)(指头蚜)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)(绿蚜)；玉米根虫(Diabrotica virgifera)；
马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)；锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)(锯谷甲虫)；马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多甲虫)；飞蛾，诸如：苹果蠹蛾(Cydia pomonella)(苹果小卷蛾)；苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana)(浅棕苹果蛾)；绿棉铃虫(Heliothis virescens)；Platynota idaeusalis(簇生苹果芽蛾)；扰血蝇(Haematobia irritans)(水牛蝇)；丝光绿蝇(Lucilia sericata)(绿瓶蝇)；Amblyseius pontentillae；微小牛蜱(Boophilus microplus)；冥紫珠(Calliphora stygia)、螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)和神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)。
在其他实施方式中，该组合物杀死如上所列的害虫，但对动物无害。在其他实施方式中，该组合物对哺乳动物无害。在其他实施方式中，该组合物对鸟类无害。在其他实施方式中，该组合物对人类无害。在其他实施方式中，该组合物对植物无害。
[0162] 在多个实施方式中，本发明提供了一种杀死携带疟疾病原体的昆虫群体的方法，其包括施用至少一种有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸酯(CM)、和/或拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯的组合(SP)；和至少一种硼酸衍生物或其盐。在其他实施方式中，将至少一种有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸酯(CM)、和/或拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯(SP)的组合组合物；以及至少一种硼酸衍生物或其盐灌注在网上。
[0163] 在其他实施方式中，携带疟疾病原体的昆虫群体包括蚊子(例如，Aedes spp.、Anopheles spp.、Culex spp.)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(黄热病蚊)；淡色按蚊(Anopheles albimanus)；尖音库蚊复合组(Culex pipiens complex)；跗斑库蚊(Culex tarsalis)；三带喙库蚊(Culex tritaenorhynchus)或其任意组合。
[0164] 在多个实施方式中，本发明提供了一种杀死害虫的方法，其包括使害虫群体与有效量的本发明的组合物接触。在其他实施方式中，害虫是昆虫。在其他实施方式中，昆虫是绿头苍蝇(例如，Calliphorastygia)、螺旋蝇(例如，螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax))、蟑螂、蜱、蚊子(例如，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus))、蟋蟀、家蝇(例如，Musca domestica)、沙蝇、螫蝇(例如，厩螫蝇(Stomoxys calcitrans))、蚂蚁、白蚁、跳蚤、蚜虫(例如绿桃蚜虫)、蛀虫(例如玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲米蛀虫))、甲壳虫(例如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多甲壳虫))、飞蛾，或其任何组合。在其他实施方式中，昆虫是绿头苍蝇。在其他实施方式中，昆虫是蚜虫。在其他实施方式中，昆虫是蛀虫。在其他实施方式中，昆虫是甲壳虫。在其他实施方式中，昆虫是飞蛾。在其他实施方式中，使害虫群体接触杀虫剂包括将群体暴露于杀虫剂，使得害虫摄取的组合物足以杀死至少25％、
30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的害虫群体，每个值都是根据本发明的单独的实施方式。在其他实施方式中，使害虫群体接触杀虫剂包括将害虫群体暴露于杀虫剂，使得害虫摄取的组合物足以杀死至少50％的害虫群体。在其他实施方式中，该方法对动物无毒。在其他实施方式中，该方法对人类无毒。在其他实施方式中，该方法对植物无毒。在其他实施方式中，该方法是环境安全的。
30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的害虫群体，每个值都是根据本发明的单独的实施方式。在其他实施方式中，使害虫群体接触杀虫剂包括将害虫群体暴露于杀虫剂，使得害虫摄取的组合物足以杀死至少50％的害虫群体。在其他实施方式中，该方法对动物无毒。在其他实施方式中，该方法对人类无毒。在其他实施方式中，该方法对植物无毒。在其他实施方式中，该方法是环境安全的。
[0165] 在多个实施方式中，本发明提供了一种用于杀死植物上的害虫的方法，其包括使植物与本发明的组合物接触，其中所述组合物对杀虫活性具有协同作用。在其他实施方式中，本发明提供了一种用于杀死动物上的害虫的方法，其包括使动物与本发明的组合物接触。在其他实施方式中，昆虫是绿头苍蝇(例如，Calliphora stygia)、螺旋蝇(例如，螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax))、蟑螂、蜱、蚊子(例如，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus))、蟋蟀、家蝇(例如，Musca domestica)、沙蝇、螫蝇(例如，厩螫蝇(Stomoxys calcitrans))、蚂蚁、白蚁、跳蚤、蚜虫(例如绿桃蚜虫)、蛀虫(例如玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲米蛀虫))、甲壳虫(例如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多甲壳虫))、飞蛾，或其任何组合，或本文所述的任何其他害虫。在其他实施方式中，昆虫是绿头苍蝇。在其他实施方式中，昆虫是蚜虫。在其他实施方式中，昆虫是蛀虫。在其他实施方式中，昆虫是甲壳虫。在其他实施方式中，昆虫是飞蛾。在其他实施方式中，该方法包括将组合物直接施用于昆虫。在其他实施方式中，该组合物可用于杀死农业动物(包括绵羊、牛、山羊)上的害虫和家养宠物(诸如猫、狗、鸟、猪和鱼)。在其他实施方式中，害虫对有机磷酸酯(OP)、氨基甲酸盐(CM)、和/或拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯(SP)杀虫剂具有抗性。在其他实施方式中，杀死如上所列的害虫的方法对植物无毒。在其他实施方式中，该方法对哺乳动物无毒。在其他实施方式中，该方法对鸟类无毒。在其他实施方式中，该方法对动物无毒。在其他实施方式中，该方法对人类无毒。在其他实施方式中，该方法是环境安全的。
[0166] 在多个实施方式中，本发明提供了一种杀死害虫的方法，包括抑制害虫的由羧酸酯酶(CBE)介导的对有机磷(OP)、氨基甲酸酯(CM)、和/或拟除虫菊酯/合成拟除虫菊酯(SP)的抗性，所述方法包括使根据本发明的硼酸衍生物与OP、CM、和/或SP组合与所述害虫接触。在其他实施方式中，CBE是α、β或非微粒体基因簇内的任何CBE，如Oakeshott，Claudianos，Campbell，Newcomb and Russell，“Biochemical Genetic and Genomics of Insect Esterases”，pp 309-381，Chapter 10，Volume 5，2005，Eds.Gilbert，Iatrou，Gill，published-Elsevier所述，其通过引用并入本文。在其他实施方式中，CBE是αE7同源物。在其他实施方式中，CBE是野生型或突变的CBE或其组合。在其他实施方式中，所述突变的CBE中的突变是αE7 Gly137Asp。在其他实施方式中，αE7是LcαE7。在其他实施方式中，CBE是CBE同源物中的等同突变。在其他实施方式中，硼酸衍生物是如上文所述的芳基硼酸衍生物。在其他实施方式中，硼酸是由上文所述的式I或II表示的苯基硼酸衍生物。在其他实施方式中，硼酸衍生物选自上文所述的化合物1-8、PBA、3.1-3.12、C2、C10和C21；前述每一个都是根据本发明的单独实施方式。
[0167] 在多个实施方式中，本发明提供一种增强OP、CM和/或SP杀虫剂的方法，其包括在使OP、CM和/或SP杀虫剂与害虫接触之前、之后或与此同时使根据本发明的硼酸衍生物与害虫接触。
[0168] CBE介导的抗性的最重要特征是高的OP结合亲和力。与OP相比，根据本发明的硼酸衍生物高出约100倍，从而可以克服昆虫对OP的抗性。
[0169] 在多个实施方式中，本发明提供一种杀死对有机磷(OP)、氨基甲酸酯(CM)和/或合成拟除虫菊酯(SP)杀虫剂具有抗性的害虫的方法，其包括通过在使OP、CM和/或SP杀虫剂与害虫接触之前、之后或与此同时使根据本发明的硼酸衍生物与昆虫接触在所述害虫中抑制CBE。在其他实施方式中，硼酸衍生物与CBE共价连接。在其他实施方式中，硼酸衍生物选自上文所述的化合物1-8、PBA、3.1-3.12、C2、C10和C21；前述每一个都是根据本发明的单独实施方式。在其他实施方式中，CBE是αE7。在其他实施方式中，CBE是αE7同源物。在其他实施方式中，αE7是野生型αE7(或其同源物)、突变的αE7(或其同源物)，或其组合。在其他实施方式中，所述突变的αE7中的突变是Gly137Asp或αE7同源物中的等同突变。在其他实施方式中，αE7是LcαE7。
[0170] 在其他实施方式中，上文描述的方法(每种方法都是单独的实施方式)，对植物无毒。在其他实施方式中，该方法对哺乳动物无毒。在其他实施方式中，该方法对啮齿动物无毒。在其他实施方式中，该方法对鸟类无毒。在其他实施方式中，该方法对动物无毒。在其他实施方式中，该方法对人类无毒。在其他实施方式中，该方法是环境安全的。
[0171] 根据本文所述的本发明，LcαE7的皮摩尔硼酸抑制剂被快速确定，获得了辅助抑制剂优化的结构-活性关系，并且表明了该化合物消除了在重要的农业害虫中对OP杀虫剂的抗性。CBE介导的抗性最重要的特征可能是高的OP结合亲和力。使用具有选择性和相对温和的硼酸支架，通过开发与OP相比亲和力高出约100倍的抑制剂克服了抗性。
[0172] 杀虫剂仍然是控制农业害虫(诸如绵羊绿头苍蝇)以及疾病载体(诸如蚊子)的主要措施。几乎在所有物种中的杀虫剂抗性的不断发展使得开发新方法来预防或消除抗性变得尤为重要。虽然有希望开发新的杀虫剂，但是生化靶标是有限的，并且使用增效剂来削弱抗性机制并恢复OP杀虫剂的有效性是一种可行的替代策略。在这项工作中，过去50年来与超过50个杀虫剂抗性案例相关的CBE被靶向。对在其他害虫中与137等同位置的Gly＞Asp突变的观察以及代谢昆虫CBE的相对高的序列保守性表明，如本文开发的增效剂可以对昆虫物种具有广谱活性。硼酸衍生物增效剂的另一个益处是可以存在潜在保护以免抗性进化。由于硼酸衍生物是对于OP杀虫剂将催化丝氨酸磷酸化的过渡态类似物，阻碍硼酸衍生物结合的突变也可能破坏OP螯合和/或水解。
[0173] 本文公开的有效且具有选择性的CBE抑制剂代表了在对抗杀虫剂抗性的背景下使用虚拟筛选来发现抑制剂的里程碑。确定了对关键抗性酶具有高亲和力的硼酸基抑制剂，并且发展了成为硼酸衍生物与丝氨酸水解酶的有效性的基础的一般结构-活性关系的理解，促进了抑制剂优化。本文证实了这些化合物有效地消除L.cuprina对OP杀虫剂的抗性，其自身没有显著的毒性或对人类酶的显著的抑制，这证明了这种以增效剂为关键的方法对对抗杀虫剂抗性并恢复现有的几类杀虫剂的有效性的可行性。杀虫剂功效的大幅增加将使杀虫剂的使用更加可持续，并减少非意图的环境和健康相关的杀虫剂影响。
[0174] 提供以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方式。然而，它们决不应被解释为限制本发明的广泛范围。实施例
[0175] 实施例1
[0176] 硼酸化合物的虚拟筛选
[0177] 使用DOCKovalent实施对αE7的有效的选择性共价抑制剂的计算设计。DOCKovalent是用于筛选大型虚拟库以发现特异性共价抑制剂的一般方法(London，N.等.Covalent docking of large libraries for the discovery of chemical
probes.Nat.Chem.Biol.10，1066-72(2014)and London，N.等.Covalent docking predicts substrates for haloalkanoate dehalogenase superfamily
phosphatases.Biochemistry 54，528-537(2015).)。DOCKovalent用于针对LcαE7的晶体结构对23,000个硼酸的库进行筛选(坐标对应于蛋白质数据库(www.rcsb.org；PDB)代码
4FNG)。将具有亲核残基的蛋白质靶标的结构模型和小分子亲电子配体的库作为输入，该方案针对与靶亲核试剂的共价键完全取样所有配体形态(pose)。使用基于物理学的评分函数对配体形态进行评分，该函数评估配体与蛋白质靶标的之间的范德华力和静电相互作用，并校正配体的去溶剂化作用(Mysinger，M.M.&Shoichet，B.K.Rapid context-dependent ligand desolvation in molecular docking.J.Chem.Inf.Model.50，1561-73(2010).)。
将DOCKovalent应用于LcαE7的晶体结构以寻找杀虫剂靶标的新的共价抑制剂。
probes.Nat.Chem.Biol.10，1066-72(2014)and London，N.等.Covalent docking predicts substrates for haloalkanoate dehalogenase superfamily
phosphatases.Biochemistry 54，528-537(2015).)。DOCKovalent用于针对LcαE7的晶体结构对23,000个硼酸的库进行筛选(坐标对应于蛋白质数据库(www.rcsb.org；PDB)代码
4FNG)。将具有亲核残基的蛋白质靶标的结构模型和小分子亲电子配体的库作为输入，该方案针对与靶亲核试剂的共价键完全取样所有配体形态(pose)。使用基于物理学的评分函数对配体形态进行评分，该函数评估配体与蛋白质靶标的之间的范德华力和静电相互作用，并校正配体的去溶剂化作用(Mysinger，M.M.&Shoichet，B.K.Rapid context-dependent ligand desolvation in molecular docking.J.Chem.Inf.Model.50，1561-73(2010).)。
将DOCKovalent应用于LcαE7的晶体结构以寻找杀虫剂靶标的新的共价抑制剂。
[0178] LcαE7通过经典丝氨酸水解酶机制催化脂肪酸底物的水解。已知硼酸与丝氨酸水解酶的催化丝氨酸形成可逆的共价加合物，其模仿羧酸酯水解的过渡态的几何形状因而以高亲和力与之结合。DOCKovalent是一种筛选共价抑制剂的算法，其用于针对LcαE7(PDB代码4FNG)的晶体结构筛选23,000个硼酸的库。
[0179] 当硼酸与催化丝氨酸配位时形成的四面体加合物是用于酯水解的推定的过渡态类似物。将每种硼酸模拟为与催化丝氨酸(Ser218)共价连接的四面体物质。在应用共价对接方案后，手动检查排名后的库的前2％，并且基于对接评分、配体效率、分子多样性、分子的正确表示和内部应力(配体内部能量不是评分函数的一部分)，选择5个排在8和478之间的化合物(图2A-J)用于测试(化合物1-5)。另外，选择其中硼酸的任一羟基被预测占据氧阴离子孔的形态。
[0180] 实验细节：
[0181] DOCKovalent是DOCK3.6的共价改造版。给定预先产生的一组配体形态和共价连接点，它对共价键周围的配体形态全部取样，并使用基于物理的能量函数选择最低能量形态，该函数评估范德华力和静电相互作用力并校准去溶剂化效应。对于在该工作中进行的对接，使用了23,000种市售化合物的硼酸库。
[0182] 受体制备：PDB代码4FNG被用于对接。将Ser218去质子化以适应共价加合物，并调节Oγ部分电荷以表示键合形式。His471以其双重质子化形式表示。
[0183] 用于虚拟筛选的硼酸的对接形态：硼酸共价连接至催化丝氨酸(Ser218)。催化组氨酸(His471)以其双质子化形式表示。B-Oγ键设定为 Cβ-Oγ-B键角设定为116.0±5°，Oγ-B-R键角设定为109.5±5°。在手动选择用于测试的化合物时，优选其中任一硼酸羟基占据氧阴离子孔(由Gly136、Gly137和Ala219的主链氮形成)的化合物。
[0184] 候选物选择：基于与对接评分函数正交的考虑因素(诸如，化合物的新颖性、多样性、商业可获得性、分子的正确呈现、内部应力(配体内部能量不是评分函数的一部分))按排除标准手动检查来自排序对接列表的按所计算的配体效率(对接评分除以重原子数)进行分类的前500个分子。另外，选择其中任一硼酸羟基被预测占据氧阴离子孔的形态。
[0185] 实施例2
[0186] 野生型αE7的有效的选择性的抑制剂
[0187] 在大肠杆菌中异源表达野生型LcαE7，并使用金属离子亲和力和尺寸排阻色谱法将其提纯。硼酸的效力通过重组LcαE7与模型羧酸酯底物4-硝基苯酚丁酸酯的酶测定来确定。所有五种硼酸化合物1-5表现出低于12nM的Ki值(表1)，其中最有效的化合物(3)表现出的Ki值为250pM。虽然这五种化合物是不同的，但它们都具有苯硼酸(PBA)亚结构，其抑制LcαE7的Ki值比设计的化合物的Ki值(210nM)低约2-3个数量级。与LcαE7的纳摩尔抑制相比，PBA表现出对其他丝氨酸水解酶的微摩尔至毫摩尔的抑制。(例如α-裂解蛋白酶，(Kettner，C.a，等.Kinetic properties of the binding of a-lytic protease to peptide boronic acids.Biochemistry 27，7682-7688(1988).)。对接化合物的Ki值低10到1000倍(以及配体效率更高)，表明通过虚拟筛选鉴定的苯硼酸取代基对于高亲和力结合很重要。虽然已知αE7是一种混杂的酶(Correy，G.J.等.Mapping the Accessible Conformational Landscape of an Insect Carboxylesterase Using Conformational Ensemble
Analysis and Kinetic Crystallography.Structure 24，1-11(2016))，但是从虚拟筛选中选择的所有化合物的效力表明αE7结合位点能够适应与酶的天然底物几乎没有相似性的结构多样的化合物。
Analysis and Kinetic Crystallography.Structure 24，1-11(2016))，但是从虚拟筛选中选择的所有化合物的效力表明αE7结合位点能够适应与酶的天然底物几乎没有相似性的结构多样的化合物。
[0188] 表1：对接排名，化合物1-5和苯基硼酸(PBA)的体外LcαE7抑制和选择性。
[0189]
[0190]
[0191] a括号中的值表示Ki值的95％置信区间。根据Cheng-Prusoff方程从剂量-反应曲线计算Ki，其中在每种化合物浓度下对酶活性进行三次(技术上的)重复测量。
[0192] b化合物被测试其溶解度极限。
[0193] c用化合物孵育48小时后使用Cell Titer Glo评估细胞活力。完整的剂量反应曲线见图13。
[0194] 为了表征硼酸1至5的选择性，针对AChE(OP和氨基甲酸酯杀虫剂的靶标)以及胰蛋白酶和细菌AmpCβ-内酰胺酶对它们进行测定(表1)。当测试达到其溶解度极限时，五种化合物中没有一种显示出对AChE的显著抑制(表1)，其中最有效的化合物3对显示出对LcαE7相对于AChE的＞106倍的选择性。针对一组26种人类丝氨酸或苏氨酸蛋白酶进一步测试化合物3(表2和3)。在化合物浓度为100μM时(比LcαE7的Ki高104倍)，26种蛋白酶中只有3种被抑制超过50％，这3种蛋白酶也具有至少30％的残留活性。进一步评估了这些化合物针对两种人细胞系的毒性。五种化合物中没有一种对MDA-MB-231细胞有超过100μM的毒性，只有化合物2和5在较高浓度下对HB-2细胞显示出有限的毒性(IC50分别为20.5μM和77.8μM；表1和图13)。总体而言，这些数据证实化合物对其靶标具有高选择性，并且具有最小的非意图影响。
[0195] 表2.增效剂对人类蛋白酶具有选择性。
[0196]
[0197]
[0198] a在100μM指定的硼酸化合物(n＝2)下蛋白酶的平均％抑制。抑制＞50％的以红色标记。
[0199] 为了表征硼酸1至5的选择性，针对AChE(OP杀虫剂的靶标)以及胰蛋白酶和细菌AmpCβ-内酰胺酶对它们进行测定(表1)。AChE和αE7是同源的，共享α/β-水解酶折叠和相同的催化机制，但它们的结合口拓扑构型不同(Jackson，C.J.等.Structure and function of an insect α-carboxylesterase(αEsterase7)associated with insecticide resistance.Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110，10177-82(2013)和Correy，G.J.等.Mapping the Accessible Conformational Landscape of an Insect Carboxylesterase Using Conformational Ensemble Analysis and Kinetic Crystallography.Structure 24，1-11(2016).)。胰蛋白酶和AmpCβ-内酰胺酶均含有活化的丝氨酸亲核试剂和氧阴离子孔，但胰蛋白酶含有丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸(Hedstrom，L.Serine protease mechanism and specificity.Chem.Rev.102，4501-4523(2002).)，而AmpCβ-内酰胺酶含有丝氨酸-酪氨酸-赖氨酸催化三联体(Dubus，A.，等.The roles of residues Tyr150，Glu272，and His314 in class Cβ-lactamases.Proteins Struct.Funct.Genet.25，473-485(1996).)。虽然硼酸是AChE和胰蛋白酶的弱抑制剂，但它们表现出对AmpCβ-内酰胺酶的纳摩尔抑制(表1)。与AChE和胰蛋白酶相比，这种相对高的亲和力结合可以反映AmpCβ-内酰胺酶催化三联体的暴露的性质，以及硼酸对活化的丝氨酸亲核试剂大体上的有效抑制。尽管存在这种交叉反应性，但化合物3显示出对αE7比对AmpEβ-内酰胺酶高240倍的选择性，以及比AChE或胰蛋白酶高106倍以上的选择性。
[0200] 实验细节：
[0201] 酶的表达和提纯
[0202] His6标记的蛋白质在BL21(DE3)大肠杆菌(Invitrogen)中于26℃表达18小时。通过离心操作收集细胞，重悬于裂解缓冲液(300mM NaCl、10mM咪唑、50mM HEPES，pH7.5)中并通过超声处理裂解。通过离心沉淀细胞碎片，并将可溶性级分加载到HisTrap-HP Ni-Sepharose柱(GE Healthcare)。用补充有300mM咪唑的裂解缓冲液洗脱结合的蛋白质。用30kDa分子量截止离心浓缩器(Amicon)浓缩含有洗脱蛋白质的级分，并加载到用150mM NaCl、20mM HEPES(pH 7.5)预平衡的HiLoad26/60Superdex-200尺寸排阻柱(GE
Healthcare)。合并含有单体蛋白质的洗脱级分用于酶抑制测定或结晶。通过使用Protparam在线服务器计算的消光系数测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度
(Gasteiger，E.等.Protein identification and analysis tools on the ExPASy server.Proteomics Protoc.Handb.571-607(2005).doi：10.1385/1-59259-890-0：571)。
Healthcare)。合并含有单体蛋白质的洗脱级分用于酶抑制测定或结晶。通过使用Protparam在线服务器计算的消光系数测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度
(Gasteiger，E.等.Protein identification and analysis tools on the ExPASy server.Proteomics Protoc.Handb.571-607(2005).doi：10.1385/1-59259-890-0：571)。
[0203] 酶抑制试验
[0204] 通过天然底物类似物4-硝基苯酚丁酸酯(Sigma)和硼酸化合物之间的竞争测定来确定野生型αE7和Gly137Asp αE7变体的抑制。最初，以4-硝基苯酚丁酸酯测量两种酶的Michalis常数(KM)以确定用于竞争测定的适当的底物浓度。在酶和八种不同浓度的底物存在下，在405nm监测水解的4-硝基苯酚产物的形成。在甲醇中制备4-硝基苯酚丁酸酯至100mM并以1∶2连续稀释以获得100mM至0.8mM的浓度。在4mg/ml牛血清白蛋白(Sigma)中制备酶原液以维持酶稳定性。通过将178μl测定缓冲液(100mM NaCl、20mM HEPES，pH 7.5)和2μl底物(最终终浓度为1000至8μM)移液至96孔板的300μl孔中来为反应做准备。通过加入20μl酶(对于野生型αE7最终浓度为2.5nM，对于Gly137Asp αE7最终浓度为4nM)引发反应。使用Epoch微孔板分光光度计(BioTek)在室温下监测产物形成4分钟，并使用GraphPad Prism通过线性回归确定酯水解的初始速率。通过将初始速率拟合到Michalis-Menton方程来确定Michalis常数(图10)。
[0205] 通过在纯DMSO或在DMSO中的硼酸化合物的存在下测定4-硝基苯酚丁酸酯水解的初始速率来确定硼酸化合物的酶抑制效果。通过将初始10mM原液以1∶3的比例连续稀释以获得10mM至2nM的浓度来制备化合物。通过移取178μl补充有底物的测定缓冲液至最终浓度等于酶的KM(野生型αE7为15μM，Gly137Asp αE7为250μM)至96孔板的孔中来为反应做准备。将2μl纯DMSO或2μl系列稀释的抑制剂(最终浓度为100μM至20μM)加入孔中。通过添加20μl酶(对于野生型αE7最终浓度为0.5nM，对于Gly137Asp αE7最终浓度为10nM)来引发反应。在室温下监测产物形成4分钟，并通过线性回归确定酯水解的初始速率。为了确定抑制50％酯酶活性所需的硼酸化合物浓度(IC50)，使用GraphPad Prism将四参数S形剂量-反应曲线拟合至抑制百分比(图7和8)。假设竞争性抑制，使用Cheng-Prusoff方程确定Ki值(Yung-Chi，C.&Prusoff，W.H.Relationship between the inhibition constant(KI)and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition(I50)of an enzymatic reaction.Biochem.Pharmacol.22，3099-3108(1973))。
[0206] AChE选择性
[0207] 使用Ellman等人描述的方法(A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity.Biochem.Pharmacol.7，88-95(1961))测定苯基硼酸和化合物1-5对Electrophorus electricus AChE(V-S型，Sigma)的抑制作用。最初，通过用5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm监测硫代胆碱的产生来确定具有底物乙酰硫代胆碱的AChE的KM。在测定缓冲液(100mM NaH2PO4pH 7.4)中制备乙酰硫代胆碱至10mM，并以1∶2连续稀释以获得10mM至0.08mM的浓度，而在补充有4mg/ml BSA的20mM NaH2PO4(pH
7.0)中制备AChE至0.4nM。通过将160ul测定缓冲液(用DTNB补充至最终浓度为300uM)和20μl乙酰硫代胆碱(1000至7.8μM最终浓度)移液至96孔板的孔中来为反应做准备。通过加入
20ulAChE(40μM最终浓度)引发反应。在室温下监测产物形成6分钟，并使用GraphPad Prism通过线性回归测定硫酯水解的初始速率。按如前所述的方法测定Michalis常数(图10)。
7.0)中制备AChE至0.4nM。通过将160ul测定缓冲液(用DTNB补充至最终浓度为300uM)和20μl乙酰硫代胆碱(1000至7.8μM最终浓度)移液至96孔板的孔中来为反应做准备。通过加入
20ulAChE(40μM最终浓度)引发反应。在室温下监测产物形成6分钟，并使用GraphPad Prism通过线性回归测定硫酯水解的初始速率。按如前所述的方法测定Michalis常数(图10)。
[0208] 通过在纯DMSO或在DMSO中的硼酸化合物的存在下测定乙酰硫代胆碱水解的初始速率来确定AChE抑制作用。通过1M储备液以1∶3连续稀释来制备化合物，以获得1M至627nM的浓度。通过将补充有乙酰硫代胆碱(至最终浓度100μM)和DTBN(至最终浓度300μM)的178μl测定缓冲液移液至96孔板的孔中来制备反应。将2μl纯DMSO或2μl连续稀释的抑制剂(最终浓度为100mM至6.27nM)加入孔中。通过加入20ul酶(终浓度40pM)引发反应。在室温下监测产物形成6分钟，并通过线性回归确定硫酯水解的初始速率。如前所述测定IC50和Ki值(图9)。
[0209] 蛋白酶选择性小组
[0210] 通过NanoSyn(Santa Clara，CA)，以100μM的单一浓度的重复样品测试化合物对一组26个Ser/Thr蛋白酶的抑制作用。有关测定条件请参见表3。将测试化合物溶解在100％DMSO中以制备10mM储备液。测定中的最终化合物浓度为100mM。在单一浓度的重复样品孔中测试化合物，并且在所有测定中DMSO的最终浓度保持在1％。以相同的方式以8个浓度点在5倍稀释下测试五种参考化合物(AEBSF、卡非佐米、颗粒酶B抑制剂II、Dec-RVKR-CMK、和特力利汀(Teneligliptin hydrobromide))。
[0211] 表3.蛋白酶选择性组。
[0212]
[0213]
[0214] a级联测定，其中酶首先被嗜热菌蛋白酶活化，然后被III因子活化。
[0215] b级联测定，其中酶被嗜热菌蛋白酶活化。
[0216] c级联测定，其中酶被赖氨酰内肽酶活化。
[0217] d级联测定，其中酶被0.04x的uPA活化。
[0218] 细胞毒性测定
[0219] 使用Echo 550液体处理器(Labcyte Inc.)在384孔板中产生七点、两倍剂量反应系列，100uM为剂量上限，并以纯DMSO为对照点。随后，在化合物的顶部使用多滴Combi(Thermo Fisher Scientific)接种人乳腺细胞系MDA-MB-231(致瘤性)和HB2(非致瘤性)(1000个细胞/孔)。然后将平板在37℃和5％CO2下温育48小时，通过向反应中加入CellTiter-Glo(Promega)评估细胞活力。在Pherastar FS多模板读数器(BMG Labtech)上测量发光信号。
[0220] 实施例3
[0221] 对接形态验证
[0222] 将硼酸1至5与LcαE7的共晶结构溶解，以评估DOCKovalent预测的结合形态(图2)。共晶结构用αE7-4a溶解，αE7-4a是结晶化的αE7变体(Jackson，C.J.等.Structure and function of an insect α-carboxylesterase(αEsterase7)associated with
insecticide resistance.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110，10177-82(2013)和Fraser，N.J.等.Evolution of Protein Quaternary Structure in Response to Selective Pressure for Increased Thermostability.J.Mol.Biol.428，2359-2371(2015).)。在配体放置之前计算出的活性位点的差异电子密度图显示硼酸化合物与催化丝氨酸共价结合(图2)。近端芳环的取向在所有五种化合物中是保守的，表明尽管化合物具有结构多样性，但结合口拓扑构型实施了保守结合模式。硼酸全部占据两个LcαE7结合口亚位点中较大的一个，其容纳预测的天然脂质底物的脂肪酸链27。化合物2、3和5的远端环朝向通向活性部位的漏斗投射。结合口和漏斗都与疏水残基对齐；较大的亚位点的拓扑构型由Trp251、Phe355、Tyr420、Phe421、Met308和Phe309限定。硼酸与结合口的配合随取代模式变化；化合物3的3，5-二取代是高度互补的，而剩余化合物的3，4-二取代排列形成由相对取代基大小决定的次优排列(图2)。
insecticide resistance.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110，10177-82(2013)和Fraser，N.J.等.Evolution of Protein Quaternary Structure in Response to Selective Pressure for Increased Thermostability.J.Mol.Biol.428，2359-2371(2015).)。在配体放置之前计算出的活性位点的差异电子密度图显示硼酸化合物与催化丝氨酸共价结合(图2)。近端芳环的取向在所有五种化合物中是保守的，表明尽管化合物具有结构多样性，但结合口拓扑构型实施了保守结合模式。硼酸全部占据两个LcαE7结合口亚位点中较大的一个，其容纳预测的天然脂质底物的脂肪酸链27。化合物2、3和5的远端环朝向通向活性部位的漏斗投射。结合口和漏斗都与疏水残基对齐；较大的亚位点的拓扑构型由Trp251、Phe355、Tyr420、Phe421、Met308和Phe309限定。硼酸与结合口的配合随取代模式变化；化合物3的3，5-二取代是高度互补的，而剩余化合物的3，4-二取代排列形成由相对取代基大小决定的次优排列(图2)。
[0223] 共晶体结构与apo LcαE7结构的对齐显示酶-抑制剂复合物中的微小结构重排。保留了氧阴离子孔的几何形状和催化三联体内的氢键。结构差异包括Tyr457侧链的方向的移动，其阻塞LcαE7结合口的较小亚位点，其以前已经被注意到这在OP结合时发生。(Correy，G.J.等.Mapping the Accessible Conformational Landscape of an Insect Carboxylesterase Using Conformational Ensemble Analysis andKinetic
Crystallography.Structure 24，1-11(2016))。Met308侧链的取向是不均一的，在化合物
2、3、4和5的共晶结构中模拟了替代构象。有趣的是，各种晶体复合物中硼酸的配位几何形状是四面体或三角形平面(图4和图12)。化合物2和5看起来是三角形平面的，而1和4被最佳模拟为四面体加合物。几何形状的差异反映了硼酸的两种可能的配位状态：具有两个氢氧化物的四面体或具有一个氢氧化物的三角形平面(图4)。三角形平面几何形状更利于与氧阴离子孔的氢键结合；平均而言，三角平面物质的氢键距离为 四面体物质的氢键距离为
Crystallography.Structure 24，1-11(2016))。Met308侧链的取向是不均一的，在化合物
2、3、4和5的共晶结构中模拟了替代构象。有趣的是，各种晶体复合物中硼酸的配位几何形状是四面体或三角形平面(图4和图12)。化合物2和5看起来是三角形平面的，而1和4被最佳模拟为四面体加合物。几何形状的差异反映了硼酸的两种可能的配位状态：具有两个氢氧化物的四面体或具有一个氢氧化物的三角形平面(图4)。三角形平面几何形状更利于与氧阴离子孔的氢键结合；平均而言，三角平面物质的氢键距离为 四面体物质的氢键距离为
[0224] 实施例4
[0225] 具有表面突变的LcαE7-4a的结晶
[0226] 为了确定用于结晶的αE7变体中存在的内部突变是否对抑制剂结合有影响，将LcαE7-4a表面突变引入野生型基因并测试结晶。两个突变(Lys530Glu和Asp83Ala)足够允许结晶的进行，这很可能是通过引入分子间盐桥(Lys530Glu)和在晶体堆积界面(Asp83Ala)去除电荷来达成的。对两种结构的比较表明内部突变对化合物3的结合作用没有起到可观察到的影响，结构变化限于由Ile419Phe突变导致的Tyr420和Phe421的堆积的小变化。这证实了在共晶结构中捕获的结合形态对应于野生型αE7中的结合形态。用三角形或四面体硼物质计算的差异电子密度图确认化合物3以三角形平面结构配位(图12)。
[0227] 实验细节：
[0228] 结晶和结构测定
[0229] 使用悬滴气相扩散法使化合物1-5与热稳定的LcαE7变体(LcαE7-4a)(PDB代码5TYP、5TYO、5TYN、5TYL和5TLK)的共晶(Jackson，C.J.等.Structure and function of an insect α-carboxylesterase(αEsterase7)associated with insecticide resistance.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110，10177-82(2013)and Fraser，N.J.等.Evolution of Protein Quaternary Structure in Response to Selective Pressure for Increased Thermostability.J.Mol.Biol.428，2359-2371(2015).)和化合物3.10与Gly137AspLcαE7-
4a(PDB代码5TYM)的共晶生长。储液含有100mM乙酸钠(pH 4.6-5.1)和15-26％PEG 2000单甲醚(MME)或PEG 550MME。将在DMSO中制备的抑制剂与蛋白质(7mg/ml，在75mM NaCl和10mM HEPES(pH 7.5)中)一起孵育，以达到5∶1的抑制剂与化合物的化学计量比。用2μl储液和1μl蛋白质提供悬滴，在19℃下过夜并形成晶体。为了冷冻保护，将晶体快速地浸入含有悬滴储液的溶液中，将PEG浓度增加至35％，然后在氮气气流中以100K玻璃化。
4a(PDB代码5TYM)的共晶生长。储液含有100mM乙酸钠(pH 4.6-5.1)和15-26％PEG 2000单甲醚(MME)或PEG 550MME。将在DMSO中制备的抑制剂与蛋白质(7mg/ml，在75mM NaCl和10mM HEPES(pH 7.5)中)一起孵育，以达到5∶1的抑制剂与化合物的化学计量比。用2μl储液和1μl蛋白质提供悬滴，在19℃下过夜并形成晶体。为了冷冻保护，将晶体快速地浸入含有悬滴储液的溶液中，将PEG浓度增加至35％，然后在氮气气流中以100K玻璃化。
[0230] 使用 的波长在Australian Synchrotron在MX1或MX2光线上在100K收集衍射数据。使用XDS对数据进行索引、整合和缩放(Kabsch，W.XDS.Acta
Crystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.66，125-132(2010).)。当最高分辨率壳的随机半数据集(CC1/2)之间的相关系数低于0.3时排除高分辨率数据(Karplus，P.A.&Diederichs，K.Linking crystallographic model and data quality.Science 336，1030-3(2012)and Diederichs，K.&Karplus，P.A.Better models by discarding data？Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.69，1215-22(2013).)。使用apo-LcαE7-4a的坐标(PDB代码5CH3)作为搜索模型，使用程序Phaser(McCoy，A.J.等.Phaser crystallographic
software.J.Appl.Crystallogr.40，658-674(2007))通过分子置换获得相。初始模型通过COOT的迭代模型构建进行改进(Emsley，P.，Lohkamp，B.，Scott，W.G.&Cowtan，K.Features and development of Coot.Acta Crystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.66，486-501(2070))并使用phenix.refine精修(Afonine，P.A.等.Towards automated
crystallographic structure refinement with phenix.refine.Acta
Crystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.68，352-367(2012))。用eLBOW产生抑制剂坐标和约束(Adams，P.D.等.PHENIX：A comprehensive Python-based system for
macromolecular structure solution.Acta Crystallogr.Sect.D
Biol.Crystallogr.66，213-221(2010).)。
Crystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.66，125-132(2010).)。当最高分辨率壳的随机半数据集(CC1/2)之间的相关系数低于0.3时排除高分辨率数据(Karplus，P.A.&Diederichs，K.Linking crystallographic model and data quality.Science 336，1030-3(2012)and Diederichs，K.&Karplus，P.A.Better models by discarding data？Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.69，1215-22(2013).)。使用apo-LcαE7-4a的坐标(PDB代码5CH3)作为搜索模型，使用程序Phaser(McCoy，A.J.等.Phaser crystallographic
software.J.Appl.Crystallogr.40，658-674(2007))通过分子置换获得相。初始模型通过COOT的迭代模型构建进行改进(Emsley，P.，Lohkamp，B.，Scott，W.G.&Cowtan，K.Features and development of Coot.Acta Crystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.66，486-501(2070))并使用phenix.refine精修(Afonine，P.A.等.Towards automated
crystallographic structure refinement with phenix.refine.Acta
Crystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.68，352-367(2012))。用eLBOW产生抑制剂坐标和约束(Adams，P.D.等.PHENIX：A comprehensive Python-based system for
macromolecular structure solution.Acta Crystallogr.Sect.D
Biol.Crystallogr.66，213-221(2010).)。
[0231] 为了确定热稳定的LcαE7-4a中存在的突变是否影响抑制剂结合的方向或模式，将LcαE7-4a中存在的表面突变(Asp83Ala和Lys530Glu)引入野生型背景中并测试蛋白质的结晶。两个突变(Lys530Glu和Asp83Ala)足够允许在与前述相同的条件下结晶(PDB代码5TYM)(图12和图15)。
[0232] 实施例5
[0233] Gly137AspαE7的有效抑制剂
[0234] 两种最常见的CBE介导的杀虫剂抗性机制涉及蛋白质表达增加或突变以获得新的催化(OP-水解酶)功能。针对LcαE717，27的抗性相关Gly137Asp变体测试化合物1至5(表1)。Gly137Asp突变位于氧阴离子孔中，并且将新的通用碱基定位在活性位点处以催化催化丝氨酸的去磷酸化。因此，抑制WT LcαE7以及该共同抗性相关Gly137Asp变体的化合物将通过靶向两种解毒途径来增加OP的功效。在硼酸化合物1至5的活性的促进下，针对LcαE7的Gly137Asp变体测试化合物(表1)。
[0235] 最有效的化合物是化合物2，显示出的Ki为29nM。野生型与Gly137Asp Ki值的比率(由PBA效力差异归一化)指示出Asp137侧链可耐受的结构特征(表1)。所有化合物对Gly137Asp LcαE7的亲和力降低表明Asp137侧链阻碍结合。这与OP和羧酸酯底物对野生型αE7的亲和力相对于Gly137AspLc LcαE7更高是一致的27。Gly137Asp αE7对化合物1和4的耐受性可以反映它们相对紧凑的性质，而连接化合物2和5的近端和远端环的柔性连接体可以使这些化合物避免与Asp137侧链的不利的相互作用。化合物3的吡啶基取代基的刚性可以解释为什么该化合物是Gly137Asp LcαE7的不良抑制剂。
[0236] 实施例6
[0237] 优化的Gly137Asp αE7抑制作用
[0238] 为了在保持良好WT效力的同时改善Gly137Asp抑制作用，重点在于精制化合物3，其为最有效的WT抑制剂。据预测，将Gly137Asp突变所耐受的结构特征(小的或柔性的取代基)与化合物3的3，5-二取代模式结合可以改善对Gly137Asp LcαE7的抑制作用。为了测试这一点，购买了12种具有化合物3的3，5二取代模式的3-溴苯基硼酸类似物(图11)，并测定了野生型和Gly137AspLcαE7的Ki值(表4)。
[0239] 表4.针对Gly137Asp LcαE7抑制作用优化的硼酸3.1-3.12的体外活性。
[0240]
[0241]
[0242] a括号中的值表示Ki值的95％置信区间。根据Cheng-Prusoff方程从剂量-反应曲线计算Ki，共中在每种化合物浓度下对酶活性进行三次(技术上的)重复测量。
[0243] 虽然未发现更有效的野生型LcαE7抑制剂，但12种类似物中的6种表现出皮摩尔Ki值(表2)。这在3，5二取代的苯基硼酸和高亲和力野生型LcαE7的结合之间建立了稳定的结构-活性关系。重要的是，与化合物3相比，具有3，5二取代模式和柔性连接体的类似物3.9和3.10分别对Gly137Asp LcαE7的抑制作用提高了4.4倍和6.1倍。结果表明所连接的苯基通过柔性连接体产生与Gly137AspαE7的最高亲和力结合，同时仍保持与野生型LcαE7的高亲和力结合。优化的化合物3.9和3.10二者都没有表现出高至100μM的任何细胞毒性(图13)，也没有显著抑制26种人类蛋白酶组(表2)。
[0244] 为了研究Gly137Asp LcαE7的最有效的抑制剂和化合物3.10的结合，将共晶体结构解析为 配体放置前的mFO-DFC差异密度显示硼酸与催化丝氨酸共价结合(图11)。与化合物3相对照，硼酸3.10的取向是保守的，其中3-溴取代基位于较大的结合口位点，而
5-甲氧基-苯酚朝向结合口漏斗取向(图11)。为了适应共价结合的抑制剂，Asp137和Met308的侧链采用新的替代构象。虽然新的Asp137构象能够与化合物3.10结合，但与邻近的Phe309产生的空间位阻迫使该侧链采用新的掩埋构象(图11)。Asp137和Phe309侧链的相对位置表明，在Asp137侧链采用新型旋转异构体之前，Phe309侧链必须转变为掩埋构象。因此，硼酸3.10的结合利用了αE7活性位点内预先存在的动态偶联残基网络。
5-甲氧基-苯酚朝向结合口漏斗取向(图11)。为了适应共价结合的抑制剂，Asp137和Met308的侧链采用新的替代构象。虽然新的Asp137构象能够与化合物3.10结合，但与邻近的Phe309产生的空间位阻迫使该侧链采用新的掩埋构象(图11)。Asp137和Phe309侧链的相对位置表明，在Asp137侧链采用新型旋转异构体之前，Phe309侧链必须转变为掩埋构象。因此，硼酸3.10的结合利用了αE7活性位点内预先存在的动态偶联残基网络。
[0245] 尽管Phe309和Met308侧链都远离氧阴离子孔旋转，但总体效果是308-309骨架转移靠近氧阴离子孔(图11)。在Asp137羧酸盐和Met308主链氧之间形成氢键(图11)，并且氢键网络通过水分子将硼酸的羟基之一连接到Asp137羧酸盐。活性位点的密度差异(图12)表明硼周围的几何形状是四面体，然而，不像化合物1和4的羟基与氧阴离子孔的三个主链氮基本上等距离，化合物3.10的羟基则不在Gly136骨架氮的氢键范围内
[0246] 实施例7
[0247] 体内筛选
[0248] 研究了硼酸化合物是否可以在体内抑制LcαE7的活性，从而充当增效剂以恢复OP杀虫剂的有效性。首先针对对OP杀虫剂二嗪农具有敏感性和抗性的L.cuprina群落测试化合物(图3和表5)。
[0249] 表5.硼酸抑制剂对绿头苍蝇幼虫对二嗪农敏感性的影响。
[0250]
[0251] a.在硼酸存在或不存在的情况下以每次测试1mg的恒定浓度检测一系列浓度的二嗪农(Dz)和马拉硫磷(Mal)
[0252] b.*表明，在绿头苍蝇群落中，Dz/Mal加硼酸的EC50与单独Dz/Mal的EC50显著不同(基于95％置信区间的重叠)
[0253] c.SR＝协同作用比率＝(在绿头苍蝇群落中单独Dz/Mal的EC50)/(在绿头苍蝇群落中Dz/Mal加硼酸的EC50)
[0254] d.RR＝电阻比率＝在田间群落中的单独Dz或Dz加硼酸的EC50/在实验室群落中的单独Dz的EC50；#表示田间群落值与实验室群落值显著不同(基于95％置信区间的重叠)。
[0255] 通过在一定浓度范围内，在恒定浓度的化合物存在或不存在的情况下用一系列浓度的二嗪农处理幼虫并比较化蛹率来确定抑制剂功效。基于对野生型和/或Gly137Asp LcαE7的高效力及其结构多样性，选择化合物2、3、3.9、3.10和5用于测试。在易感型群落的测定中，观察到化合物3、3.9和3.10的协同作用。化合物3.1是最有效的，与仅二嗪农对照相比，化蛹率减少50％(EC50值)所需的二嗪农的量减少5.7倍(图3)。这些皮摩尔抑制剂能够在LcαE7结合上超过二嗪农，从而恢复OP抗胆碱酯酶活性。这突出了野生型LcαE7对OP杀虫剂的保护作用。对化合物2和5没有观察到协同作用，说明尽管这些化合物纳摩尔抑制很低但不能在αE7结合上超过二嗪农。观察到的化合物3、3.9和3.10的协同作用水平的差异可能与化合物的生物利用度的差异有关，因为它们的体外效力非常相似。
[0256] 为了证实观察到的协同作用是由于LcαE7抑制作用导致而非硼酸化合物的毒副作用所致，在不存在二嗪农的情况下测试化合物(图5)。在硼酸化合物存在或不存在的情况下，蝇化蛹率之间没有显著差异。这与体外测试一致，表明这些化合物对AChE具有低(mM)亲和力(表1)，下文提供的低细胞毒性数据，以及硼酸的已知低毒性(Hall，D.G.in Boronic Acids(2005).)。
[0257] 已证实硼酸与OP杀虫剂之间具有协同作用，针对对二嗪农具有抗性的L.cuprina田间群落测试化合物。二嗪农抗性通常与Gly137Asp突变/抗性等位基因相关。确定了生物测定中使用的田间群落的基因型，并且发现尽管实验室群落仅携带WT易感等位基因(Gly137)，但是田间群落携带易感(Gly137)和抗性(Asp137)等位基因(图6)。这与先前示出含有αE7的染色体区域发生重复的结果相一致，这意味着抗性群落现在携带WT和Gly137Asp LcαE7的拷贝。在硼酸不存在的情况下，田间群落的二嗪农EC50比实验室群落高2.9倍(图3)。使用最有效的化合物(3.10)测试的所有硼酸均观察到协同作用，与仅二嗪农对照相比，EC50降低12倍(表5)。因此，与实验室群落(当仅用二嗪农处理时)相比，化合物3.10消除了L.cuprina的田间群落中的OP抗性，并使得田间群落对二嗪农的敏感性提高了4倍。
[0258] 基于体外酶抑制特征(表1)，在田间群落中的二嗪农与化合物3的协同作用比其与化合物2的协同作用高，这是令人惊讶的。为了研究这种差异，对每种L.cuprina群落的多个拷贝进行测序，并且发现尽管易感群落仅含有野生型αE7，但抗性菌株携带相同数量的野生型和gly137asp基因(图6)。这种差异与当代抗性群落含有野生型和Gly137Asp等位基因Lcα29
E7的观察结果一致 ；具体地，对两种LcαE7变体均能够有效抑制的化合物(例如3.10)将是针对抗性群落的最佳增效剂。因此，化合物3.10显示的协同作用是优化的Gly137Asp LcαE7抑制和保留WT LcαE7抑制的作用。这突出了LcαE7在OP抗性中的螯合(通过WT)和催化解毒(通过Gly137Asp)的重要性。
E7的观察结果一致 ；具体地，对两种LcαE7变体均能够有效抑制的化合物(例如3.10)将是针对抗性群落的最佳增效剂。因此，化合物3.10显示的协同作用是优化的Gly137Asp LcαE7抑制和保留WT LcαE7抑制的作用。这突出了LcαE7在OP抗性中的螯合(通过WT)和催化解毒(通过Gly137Asp)的重要性。
[0259] 测试了化合物3、3.9和3.10对实验室群落对OP杀虫剂马拉硫磷的敏感性的影响。对马拉硫磷和二嗪农的敏感性在质上是不同的；WT LcαE7通过高亲和力结合和缓慢水解提供对二嗪农的低水平抗性，然而WT LcαE7显示出显著的马拉硫磷水解活性。对于用马拉硫磷处理的实验室L.cuprina群落和用二嗪农处理的田间(抗性)L.cuprina群落，其相似EC50值具有明显的前述差异(图6)。对于所有测试的硼酸化合物，观察到与马拉硫磷的协同作用。化合物3.10是最有效的，与仅马拉硫磷对照相比，EC50降低16倍(图3和表5)。
[0260] OP抗性和来自其他害虫的LcαE7同源物之间的关联表明，此处研发的增效剂具有对抗CBE介导的OP抗性的广谱活性的潜力。
[0261] 有机磷酸酯杀虫剂在全世界使用；仅在美国，每年估计使用900万千克。本文呈现的体内结果表明，与这些或类似的增效剂结合施用可使OP的使用量减少超过一个数量级。在不影响效果的情况下，这种减少可能会产生巨大的健康环境效益和经济效益。
[0262] 总之，实施针对αE7的晶体结构的23,000个硼酸的初始筛选以确定LcαE7的抑制剂，其确定了WTαE7的皮摩尔至纳摩尔抑制剂。对相互作用的结构-活性关系的理解的提高使得抑制剂优化成为可能，从而产生对WT和与抗性相关的Gly137Asp酶的有效且具有选择性的抑制剂。绿头苍蝇生存的生物测定证实，优化的抑制剂与OP杀虫剂协同作用并消除抗性。这些化合物显示对苍蝇或人细胞系没有显著的内在毒性，以及对一组26种人丝氨酸/苏氨酸蛋白酶的非常高的选择性。它们可以克服对廉价且可获得的杀虫剂的抵抗力，同时将所需的杀虫剂总量降低一个数量级以上。这种增效剂可以带来巨大的经济和环境效益。这项工作中所用的一般方法应适用于其他以CBE抗击杀虫剂抗性的方法。
[0263] 实验细节：
[0264] 铜绿蝇(Lucilia cuprina)生物测定
[0265] 使用两种L.cuprina群落：1)实验室参考药物易感群落LS，其源自40多年前在澳大利亚首都地区的收集群落，没有接触杀虫剂的历史；和2)田间采集的群落Tara，对二嗪农和二氟脲具有抗性(Levot，G.W.&Sales，N.New high level resistance to diflubenzuron detected in the Australian sheep blowfly，Lucilia cuprina (Wiedemann)(Diptera：Calliphoridae).Gen.Appl.Entomol.31，43-46(2002))。在每种群落中对LcαE7基因进行测序。简而言之，使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒(Qiagen)从每个群落的20只成年雌性蝇制备基因组DNA。用对LcαE7基因特异的引物进行PCR，并将产物克隆到pGEM-T EASY载体(Promega)中。使用M13正向和反向引物对易感群落的8个克隆和抗性群落的10个克隆进行测序。
[0266] 使用生物测定系统评估化合物2、3、5、3.9和3.10对二嗪农/马拉硫磷存在下的蝇幼虫发育的影响，其中允许幼虫在浸渍有在恒定浓度的化合物存在或不存在的情况下的一系列浓度范围的二嗪农/马拉硫磷的脱脂棉从第一龄期发育至化蛹(Kotze，A.C.等.Histone deacetylase enzymes as drug targets for the control of the sheep blowfly，Lucilia cuprina.Int.J.Parasitol.Drugs Drug Resist.5.201-208(2015))。每个实验在每个二嗪农/马拉硫磷浓度下使用50只幼虫。对二嗪农实验重复三次，对马拉硫磷实验重复两次。通过测量化蛹率来定义杀虫效果。通过非线性回归(GraphPad Prism)分析化蛹率剂量-反应数据，以计算EC50值(具有95％置信区间)，其表示将化蛹率降低至对照测定中测量值的50％所需要的二嗪农/马拉硫磷浓度(单独或与化合物2、3、5、3.9或3.10组合)。化合物2、3、5、3.9和3.10的作用以两种方式定义：1)每种隔离群内的协同作用比＝仅二嗪农或马来硫磷的EC50/二嗪农或马来酸与化合物组合时的EC50；以及2)抵抗率＝对于Tara群落仅二嗪农或二嗪农与化合物的组合的EC50/对于LS群落仅二嗪农的EC50。基于95％置信区间的重叠评估EC50值之间的显著差异。化合物也在没有二嗪农或马拉硫磷的情况下每次以1mg进行测定。
[0267] OP抗性与来自其他害虫的LcαE7同源物20之间的关联表明本文所述的增效剂具有对抗CBE介导的OP抗性的广谱活性的潜力。
[0268] 实施例8
[0269] 与硼酸衍生物(BA)结合的乙基毒死蜱(CPE)用于在小蚕豆(Vicia faba)上的桃蚜(Myzus persicae)(绿桃蚜虫)的生物评估
[0270] 研究了硼酸衍生物提高(BA)乙基毒死蜱(CPE)有机磷酸酯用于小蚕豆(Vicia faba)上的桃蚜(Myzus persicae)(绿桃蚜虫)的效果的能力。
[0271] 结果：
[0272] 表6.乙基毒死蜱条件下的功效百分比。
[0273]
[0274] 表7.校准结果
[0275] 校准结果
[0276]
[0277] CPE：乙基毒死蜱(Pyrinex480EC；480ga.i./L)；化合物3.10：3-溴-5-苯氧基苯基硼酸98％；化合物5：3-氯-4(2′-氟苄氧基)苯基硼酸95％；化合物3.7：3-溴-5-异丙氧基苯硼酸95％。
[0278] 在化合物5单独和与所有剂量的CPE混合时观察到絮凝。
[0279] 没有观察到DMSO或衍生化合物3.10、5或3.7的显著毒性。(ANOVA随后是Newman-Keuls测试，阈值为5％)。
[0280] 如表6所示，通过加入化合物3.10、5和3.7增加了用量为2.8g a.i./ha(克活性成分/公顷)和5.6g a.i./ha的CPE的杀虫效力。
[0281] 实验细节：
[0282] 在受控条件下在BIOtransfer，France中进行实验。
[0283] 在4种施用率(360、180、90、45g a.i./ha)下用毒死蜱480EC(480g a.i./l)处理豆叶，毒死蜱单独使用或与3种硼酸(BA)衍生物(3.10、5和3.7)组合使用，每种硼酸衍生物的浓度为0.2mg/ml。在侵染后以农业喷嘴(每公顷300L)进行处理。还同时评估未处理的对照情形。然后进行数据的统计分析。当叶子完全干燥时，对3片叶子进行取样并用每片叶片的3个M.persicae的无翅成虫进行侵染。
[0284] 评估时间：
[0285] ·T+1(DAT 1)-一天后计数留在叶子上的成虫数。
[0286] ·T+3(DAT 3)-处理后3天估计蚜虫群落。
[0287] ·T+7(DAT 7)-处理后7天估计蚜虫群落的发展。
[0288] 操作方法：
[0289] 每个微箱3片豆叶片*每个条件4个微箱(1个条件是1个剂量下的1个制剂)*每个微箱9个成虫蚜虫*4种杀虫剂(3个毒死蜱衍生物+单独的毒死蜱)*4个速率+2个对照(1剂量下的且未处理的1个参考杀虫剂制剂)*3个评估时间(DAT+1、DAT+3和DAT+7)。
[0290] 实施例9
[0291] 与硼酸衍生物(BA)结合的乙基毒死蜱(CPE)用于在玉米叶(Zea may)上的玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲米蛀虫)的生物测定
[0292] 研究了硼酸衍生物(BA)提高乙基毒死蜱(CPE)有机磷酸酯用于玉米叶(Zea may)上的玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲米蛀虫)的效果的能力。
[0293] 实验细节：
[0294] 通过喷洒相当于2001/ha.的体积的混合物来实施处理，在每种条件下喷洒4盒。
[0295] 条件(测试的剂量)：CPE：乙基毒死蜱(Pyrinex 480EC；480g a.i./L)；化合物3.10：3-溴-5-苯氧基苯基硼酸98％；化合物5：3-氯-4(2′-氟苄氧基)苯基硼酸95％；化合物
3.7：3-溴-5-异丙氧基苯基硼酸95％；在稀释前将所有硼酸衍生物溶解在DMSO中，获得1％DMSO最终浓度。
3.7：3-溴-5-异丙氧基苯基硼酸95％；在稀释前将所有硼酸衍生物溶解在DMSO中，获得1％DMSO最终浓度。
[0296] 在20℃下干燥1小时；每盒保存三片叶片在水琼脂上(4盒/条件)；每个叶片用4个玉米螟(Ostrinia nubilalis)(12个幼虫/盒)进行感染；孵育18℃/28℃16h光周期；在处理后的1、2和6天(DAT)计数活幼虫。计算每个评估时间的死亡率百分比。使用 软件进行数据统计分析(ANOVA随后是Newman-Keuls测试，阈值为5％，参见下表)。
[0297] 表8.实验条件总结
[0298]
[0299] 结果：
[0300] 表9.BA+乙基毒死蜱处理的功效结果总结
[0301]
[0302]
[0303] N-K：Newman-Keuls测试结果。具有相同字母的两个条件彼此没有显著差异。
[0304] 表10.BA+CPE处理的功效结果百分比的总结
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
[0309]
[0310]
[0311] 结论：
[0312] DMSO 1％无毒性。化合物3.10、5和3.7没有显著毒性，尽管使用化合物3.10和3.7时在6DAT时有一些幼虫死亡。含有或不含BA化合物的CPE具有剂量依赖性，并且与对照条件相比，在6DAT时有效性显著提高，但下列情况除外：
[0313] 以2.5g a.i./ha单独使用CPE。
[0314] 以6.24g a.i./ha使用CPE+化合物5。
[0315] 以2.5和6.24g a.i./ha使用CPE+化合物3.7。
[0316] 在以下条件下，与单独使用CPE相比，化合物3.10的添加显著提高了效力：1DAT和3DAT，剂量为15.6g a.i./ha。
[0317] 在以下条件下，与单独使用CPE相比，化合物3.7的添加显著提高了效力：1DAT和3DAT，剂量为15.6g a.i./ha。
[0318] 实施例10
[0319] 与硼酸衍生物(BA)结合的乙基毒死蜱(CPE)用于马铃薯叶上的马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多甲壳虫)的生物测定
[0320] 研究了硼酸衍生物(BA)提高乙基毒死蜱(CPE)有机磷酸酯用于番薯叶上的马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(科罗拉多甲壳虫)的效果的能力。
[0321] 实验细节：
[0322] 在控制条件下在BIOtransfer，France中进行实验。
[0323] 在4种施用率(360、180、90、45g a.i./ha)下用毒死蜱480EC(480g a.i./1)处理马铃薯叶，毒死蜱单独使用或与3种硼酸(BA)衍生物(3.10、5和3.7)组合使用，每种硼酸衍生物的浓度为0.2mg/ml。在侵染后用农业喷嘴(每公顷300L)进行处理。还同时评估未处理的对照情形。然后进行数据的统计分析。当叶子完全干燥时，用6只科罗拉多甲虫的幼虫侵染叶片。1剂量(1-2g/ha)的Karate Zeon用量由甲壳虫在实验室条件下的高度敏感性来调整。然后将该剂量与所登记的田间剂量(7.5g/ha)对比。
[0324] 评估时间：
[0325] 三个观察时间、即处理后的1天、2天和3天使得能够评估活昆虫的数量。操作方法：
[0326] 每次测试马铃薯叶*6只幼虫*重复3次(1次重复是1剂量下的1种制剂)*4种杀虫剂(3个毒死蜱衍生物+仅毒死蜱)*4个速率+2个对照(1种杀虫剂：Karate Zeon*1个速率+未处理的条件)*3个评估时间(T+1、T+2和T+3)。
[0327] 在将叶片完全干燥后，用六只科罗拉多甲虫幼虫侵染叶片。三个观察时间(1天、2天和3天)允许评估活昆虫的数量。
[0328] 1剂量(1-2g/ha)的Karate Zeon由甲壳虫在实验室条件下的高度敏感性来调整。然后将该剂量与所登记的田间剂量(7.5g/ha)对比。
[0329] 实施例11
[0330] 本发明化合物对多种CBE的抑制作用
[0331] 为了证明本发明的方法和各种化合物(3.7、3、5和2、C21、C10和C2)的普适性，测定了它们对来自多种害虫的一组CBE的抑制常数。
[0332] 设计化合物3.7、3、5和2来抑制铜绿蝇(Lucilia cuprina)αE7。设计化合物C21、C10和C2来抑制致倦库蚊(Culix quinquefasciatus)B2。
[0333] 结果：
[0334] 表11.硼酸抑制剂对多种昆虫CBE的Ki值(以纳摩尔计)
[0335]
[0336]
[0337] 以4-NPB为底物进行测定。Ki值表示为平均值±SD，n＝3；低于1nM的值被记录为＜1，因为它们处于检测极限。
[0338] 一些化合物如化合物5显示出能够非常广谱而有效地抑制六种不同的CBE。其他硼酸对较小的CBE子集更具特异性。
[0339] 实施例12
[0340] 本发明化合物的选择性组
[0341] 为了进一步确定本发明化合物的安全性和细胞毒性，测定了它们在杀死广泛的人细胞系组(包括癌细胞系和非癌细胞系)中的IC50，并测试了它们的细胞毒性。
[0342] 结果：
[0343] 表12.针对七种细胞系的本发明的七种硼酸衍生物的细胞毒性数据
[0344]
[0345]
[0346] 除了对一些硼酸显示出一些敏感性的HeLa细胞外，所有其他细胞系显示对最高至100μM的任何化合物几乎没有反应。
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