一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基及其应用
阅读：372发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基，该培养基的化学成分明确，所述培养基为化学成分明确的液体培养基，所述培养基包括 基础 培养基RPMI‑1640；所述培养基还包括1～3mg/L的L‑肉毒 碱 、0.5～2mg/L的 乙醇 胺、10～20mg/L的腐胺、0.01～0.02mg/L的亚硒酸钠、0.5～2mg/L的亚油酸、3～6mg/L的转 铁 蛋白、50‑200mg/L的维生素C和/或维生素C 磷酸 镁盐、50‑500μM的N乙酰半胱 氨 酸。本发明还提供了本发明所述的培养基的制备方法和使用方法。本发明中培养基配方的各组分明确，成本低廉，非常有利于大规模的心肌细胞制备和临床应用。，下面是一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基及其应用专利的具体信息内容。
1.一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基的组合，其中所述培养基的组合包含培养基I、II、III和IV；所述培养基I、II、III和IV均为化学成分明确的液体培养基，均包括基础培养基RPMI-1640；
其中，所述培养基I、II、III和IV均包括1～3mg/L的L-肉毒碱、0.5～2mg/L的乙醇胺、10～20mg/L的腐胺、0.01～0.02mg/L的亚硒酸钠、0.5～2mg/L的亚油酸、3～6mg/L的转铁蛋白、50-200mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、以及50-500μM的N乙酰半胱氨酸；
所述培养基II还包括浓度为2～6mg/L的胰岛素；
所述培养基III还包括浓度为2-8μM的诱导小分子CHIR99021；和
所述培养基IV还包括浓度为2-8μM的Wnt受体抑制剂IWR1或浓度为1-5μM的Wnt抑制剂wnt-c59；
其中，所述基础培养基的渗透压值为295-305。
2.根据权利要求1所述的培养基的组合，其特征在于，所述培养基I、II、III和IV均包括
2mg/L的L-肉毒碱、1mg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、0.016mg/L的亚硒酸钠、1mg/L的亚油酸、
5mg/L的转铁蛋白、100mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、以及200μM的N乙酰半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的培养基的组合，其特征在于，所述基础培养基的渗透压值为
300。
4.根据权利要求1所述的培养基的组合，其特征在于，所述胰岛素在培养基II中的浓度为4mg/L。
5.根据权利要求1所述的培养基的组合，其特征在于，所述CHIR99021在培养基III中的浓度为4μM。
6.根据权利要求1所述的培养基的组合，其特征在于，所述IWR1在培养基IV中的浓度为
5μM。
7.根据权利要求1所述的培养基的组合，其特征在于，所述wnt-c59在培养基IV中的浓度为2μM。
8.根据权利要求1所述的培养基的组合，其特征在于，所述培养基I、II、III和IV均包括下表1所示的组分、100,000U/L的青霉素和200μM的N乙酰半胱氨酸；
表1
9.根据权利要求1～8中任一项所述的培养基的组合，其特征在于，所述胚胎干细胞为购自北京干细胞库的商业化的胚胎干细胞。
10.根据权利要求9所述的培养基的组合，其特征在于，所述胚胎干细胞是H7人胚胎干细胞。
11.如权利要求1～10中任一项所述的培养基的组合的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)根据待制备的培养基的总体积，计算所需基础培养基RPMI-1640干粉的量；
2)将RPMI-1640干粉溶于灭菌的去离子水中，搅拌均匀，每升加入2g碳酸氢钠，并调节pH为7.2，然后将渗透压值调至295-305，滤器过滤，4℃保存；
3)按照1～3mg/L的L-肉毒碱、0.5～2mg/L的乙醇胺、10～20mg/L的腐胺、0.01～
0.02mg/L的亚硒酸钠、0.5～2mg/L的亚油酸、3～6mg/L的转铁蛋白的比例制备50×的储液；
4)按照50-200mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、50-500μM的N乙酰半胱氨酸的比例制备1000×的储液；
5)将步骤3)制备的储液和步骤4)制备的储液按照所需的量加入到步骤2)制得的基础培养基中，即得培养基I；
其中，所述方法还包括添加胰岛素，得到培养基II的步骤；
其中，所述方法还包括添加诱导小分子，得到培养基III的步骤；
其中，所述方法还包括添加Wnt受体抑制剂IWR1或Wnt抑制剂wnt-c59，得到培养基IV的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，将渗透压值调至300。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，使用5M氯化钠储液调节所述渗透压值。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，使用0.22μm的滤器过滤。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述pH值使用浓盐酸调节。
16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，按照2mg/L的L-肉毒碱、1mg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、0.016mg/L的亚硒酸钠、1mg/L的亚油酸、5mg/L的转铁蛋白的比例制备50×的储液。
17.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤3)是通过包括以下步骤的方法实现的：
根据制备的储液的体积，计算所需L-肉毒碱、乙醇胺、腐胺、亚硒酸钠、亚油酸和转铁蛋白的量，溶于灭菌的去离子水中，搅拌，过滤。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述过滤使用0.22μm的滤器。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述搅拌使用磁力搅拌器。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在所述步骤3)中，将所述储液分装的步骤。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，将所述储液置于-20℃或者-80℃保存。
22.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤4)是通过包括以下步骤的方法实现的：
根据制备的储液的体积，计算所需维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、N乙酰半胱氨酸的量，溶于灭菌的去离子水中，搅拌，过滤。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述过滤使用0.22μm的滤器。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述搅拌使用磁力搅拌器。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在所述步骤4)中，将所述储液分装的步骤。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在所述步骤4)中，将所述储液置于-20℃或者-80℃保存。
27.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中还包括加入青链霉素并混合均匀的步骤；
其中，所述青链霉素中链霉素的工作浓度为100mg/L，青霉素的工作浓度为100,000U/L。
28.如权利要求11所述的方法，其特征在于，使用时，将所述培养基加热至37℃。
29.根据权利要求11-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述添加胰岛素的步骤是通过包括以下步骤的方法实现的：
将所述培养基的pH调节为3，加入所需量的胰岛素，充分溶解，直到溶液变清澈为止。
30.根据权利要求11-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述添加诱导小分子的步骤是通过包括以下步骤的方法实现的；
将诱导小分子溶于微量的DMSO中，然后制备为1000×的储液，将所述储液按照所需的量加入到所述培养基中。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，将所需量的诱导小分子溶于微量的DMSO中，然后溶于所需量的灭菌的去离子水中，搅拌，过滤，从而制得1000×的储液；
其中，使用的DMSO的量不超过所述储液总体积的0.5％。
32.一种将人胚胎干细胞诱导为心肌细胞的方法，所述方法包括使用如权利要求1～8中任一项所述的培养基的组合培养细胞的步骤，其中，所述胚胎干细胞为购自北京干细胞库的商业化的人胚胎干细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述胚胎干细胞为H7人胚胎干细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:
1)使用人胚胎干细胞制备单细胞悬液；
2)将步骤1)中的细胞使用E8培养基培养2-3天，然后使用如权利要求1～8中任一项所述的培养基III培养细胞，从而诱导细胞开始分化；
3)24小时后，吸走旧的培养基，添加新的如权利要求1～8中任一项所述的培养基I，并连续培养44-48小时，中间不换液；
4)44-48小时后，吸走旧的培养基，然后使用如权利要求1～8中任一项所述培养基IV培养细胞，并连续培养44-48小时中间不换液；
5)44-48小时后，吸走旧的培养基，然后使用如权利要求1～8中任一项所述的培养基I培养细胞，并连续培养72小时中间不换液；
6)72小时后，吸走旧的培养基，加入如权利要求1～8中任一项所述的培养基II，连续培养48-72小时，在第48小时换液，从而得到心肌细胞。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述单细胞悬液的密度为1～
5 2
1.5×10/cm。
36.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现的：
将培养5-6天的胚胎干细胞用Stempro Accutase酶，37℃消化10min，使干细胞克隆消化成单细胞，用DMEM/F12培养基洗一次，1000rpm离心5min；吸走上清，用添加10μM ROCK抑制剂Y27632的E8培养基重悬，然后以1～1.5×105/cm2的接种密度接种。
37.如权利要求34所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，将步骤1)中的细胞使用E8培养基培养2-3天，使细胞长到90％的饱和度。
38.如权利要求34所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述培养基II的使用量为每
2-3×105的单细胞加入1mL培养基。
39.如权利要求34所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述培养基III中GSK3β抑制剂CHIR99021的浓度为4μM。
40.如权利要求34所述的方法，其特征在于，在步骤6)中，得到心肌细胞后，每隔2-3天换一次新鲜的如权利要求1～8中任一项所述的培养基II。
41.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测心肌诱导效率的步骤。
42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述检测心肌的诱导效率在细胞分化的第14天进行。
43.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述检测使用流式细胞仪进行。
44.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述检测使用心肌特异的标记物cTNT染色。
一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基。具体地，本发明涉及使用化学成分完全明确的培养基，将人胚胎干细胞定向高效地诱导生成心肌细胞；本发明还涉及一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的方法及其应用。
背景技术
[0002] 近年来的研究调查表明，心脏疾病一直位于高致死疾病之首，而在心脏疾病中，心肌梗死又是最主要的死亡病因。近年来，随着人们物质生活水平的不断提高，特别是高热高脂食物的摄入以及缺乏足够的体育锻炼，心肌梗死的发病率呈逐年上升的趋势。心肌梗死主要是由于冠状动脉粥样硬化导致血管腔狭窄，血液供应不足，从而导致心肌细胞坏死。众所周知，心肌细胞，特别是成年人的心肌细胞不再具有增殖能力。因此，心肌梗死后梗死区域主要由纤维细胞和基质形成瘢痕组织，导致左室重构，后期出现心力衰竭。
[0003] 传统治疗心肌梗死的方法主要有以下几种：一、药物保守治疗；二、药物溶栓治疗；三、支架植入术；四、冠状旁路搭桥术。这些治疗手段只能缓解病情，改善病人的部分生活质量，并不能防止心室重构以及随后的心力衰竭。另外，在临床上，针对终末期的心脏疾病病人还可以进行心脏移植，但是心脏供体来源极为有限，同时心脏移植后会出现免疫排斥反应。因此，从严格意义上来讲，心肌梗死后通过这些治疗手段并不能真正的治愈。
[0004] 近年来，随着干细胞研究的深入，许多具有生成心肌细胞潜能的多能干细胞被作为细胞治疗的种子细胞，譬如骨髓来源的干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、心肌干细胞及内皮前体细胞等。但是，这些细胞移植后在体内生成心肌细胞的效率及疗效备受争议。人胚胎干细胞系(human embryonic stem cell，hESc)的建立开创了再生医学的新领域，与其它治疗性细胞相比，胚胎干细胞在体外可以无限自我更新增殖、在体外能够高效的分化为心肌细胞，这些特点使其在再生医学和组织工程领域具有广阔的应用前景。
[0005] 为了推进胚胎干细胞类产品的临床应用，人们一直在不断尝试改进优化人胚胎干细胞的培养系统。James Thomson实验室在这个领域一直处于研究的最前沿。从最初的含有20％胎牛血清(FBS)的培养基，到找到替代胎牛血清的血清替代品(KOSR)，以及包括含血清白蛋白的mTSeR培养基。而优化改良培养基最好的莫过于其实验室开发的无饲养层、无动物源、化学成分明确的E8-vitronectin培养系统。但是，目前由胚胎干细胞向心肌定向诱导分化系统不稳定，如分化所得细胞均一性差、分化批次间效率及不同细胞系间的差异性显著等。与人胚胎干细胞的培养系统的优化类似，将人胚胎干细胞分化为心肌细胞的分化培养系统也经历了组分成分由未知到确定、由复杂到简单、由动物源到人源或者化学成分明确的方向发展。早期分化得到心肌细胞主要是通过与小鼠的内脏中胚层样细胞(Mouse visceral endoderm-like cell，END-2)共培养，或者通过类胚体(Embryonic body，EB)的方法得到。但是这些方法得到的心肌细胞效率低。后来Charles Murry实验室开发了单层细胞分化体系，通过在传统1640和B27组成的基础分化液中添加促心肌分化因子Activin A和BMP4，这种方法可以使心肌的分化效率提高到50％左右。无血清添加剂虽然去除了血清成分，但其中仍含有大量的牛源或人源的血清白蛋白。2014年，Stanford大学Joseph Wu课题组仅仅用了三种组分：RPMI-1640、维生素C磷酸盐(L-Ascorbic acid 2-phosphate)和水稻重组的人血清白蛋白(rice-derived recombinant human albumin)，在此基础上再添加人工合成小分子CHIR99021和Wnt-C59就可以将分化效率提高到80％。但水稻重组的人血清白蛋白是必需的，且浓度高达0.5mg/mL，而血清白蛋白批次间的差异会导致分化体系的不稳定。
[0006] 综上所述，虽然很多实验室进行了心肌诱导分化培养体系的摸索，但是依然存在明显的不足。人心肌细胞具有较大的临床应用潜能，如细胞移植治疗心肌梗死、广谱药物筛选以及药物心肌毒理测试，而这些都需要大量的人心肌细胞。因此，当前存在着对能够提高心肌诱导分化效率、无动物源成分、化学成分明确的分化诱导培养基的需要。
发明内容
[0007] 因此，针对现有技术的不足，本发明首次对用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基进行了研究，并将其优化到化学成分明确的状态，在这种优化的培养基的诱导下，能够高效、稳定的获得心肌细胞。
[0008] 本发明的目的就是提供一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基，并且该培养基的化学成分明确，从而为心肌细胞的临床应用奠定良好的基础。
[0009] 一方面，本发明提供一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基，所述培养基为化学成分明确的液体培养基，所述培养基包括基础培养基R PMI-1640；
[0010] 进一步地，所述培养基还包括1～3mg/L的L-肉毒碱、0.5～2mg/L的乙醇胺、10～20mg/L的腐胺、0.01～0.02mg/L的亚硒酸钠、0.5～2mg/L的亚油酸、3～6mg/L的转铁蛋白、
50-200mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、以及50-500μM的N乙酰半胱氨酸；
50-200mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、以及50-500μM的N乙酰半胱氨酸；
[0011] 优选地，所述培养基还包括2mg/L的L-肉毒碱、1mg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、0.016mg/L的亚硒酸钠、1mg/L的亚油酸、5mg/L的转铁蛋白、100mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、以及200μM的N乙酰半胱氨酸；
[0012] 其中，所述基础培养基的渗透压值为295-305，优选为300；
[0013] 优选地，使用5M的氯化钠储液调节所述基础培养基RPMI-1640的渗透压值；
[0014] 优选地，所述培养基还包括胰岛素；
[0015] 优选地，所述胰岛素在培养基中的浓度为2～6mg/L，更优选为4mg/L。
[0016] 优选地，所述培养基还包括诱导小分子；
[0017] 优选地，所述诱导小分子为肝糖原合成激酶3β(GSK3β)受体的选择性抑制剂CHIR99021、Wnt受体抑制剂IWR1和/或Wnt抑制剂wnt-c59；
[0018] 更优选地，所述CHIR99021在培养基中的浓度为2-8μM，还优选地，为4μM；
[0019] 更优选地，所述IWR1在培养基中的浓度为2-8μM，还优选为5μM；更优选地，所述wnt-c59在培养基中的浓度为1-5μM，还优选为2μM。
[0020] 因此，在一个优选的实施方案中，所述培养基包括下表1所示的组分：
[0021] 表1
[0022]
[0023] 更优选地，所述培养基还包括下表2所示的组分中的一种或多种；
[0024] 表2
[0025]
[0026] 优选地，所述干细胞为购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)或H7人胚胎干细胞。
[0027] 另一方面，本发明还提供了本发明所述的培养基的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0028] 1)根据待制备的培养基的总体积，计算所需基础培养基RPMI-1640干粉的量；
[0030] 优选地，所述渗透压值为300；
[0031] 优选地，使用5M氯化钠储液调节所述渗透压值；
[0032] 优选地，使用0.22μm的滤器过滤；
[0033] 优选地，所述pH值使用浓盐酸调节；
[0034] 3)按照1～3mg/L的L-肉毒碱、0.5～2mg/L的乙醇胺、10～20mg/L的腐胺、0.01～0.02mg/L的亚硒酸钠、0.5～2mg/L的亚油酸、3～6mg/L的转铁蛋白的比例制备50×的储液；
[0035] 优选地，所述50×的储液的制备方法与制备50×B27储液的方法相同；
[0036] 更优选地，按照2mg/L的L-肉毒碱、1mg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、0.016mg/L的亚硒酸钠、1mg/L的亚油酸、5mg/L的转铁蛋白的比例制备50×的储液；
[0037] 4)按照50-200mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、50-500μM的N乙酰半胱氨酸的比例制备1000×的储液；
[0038] 5)将步骤3)制备的储液和步骤4)制备的储液按照所需的量加入到步骤2)制得的基础培养基中，既可。
[0040] 其中，所述青链霉素中链霉素的工作浓度为100mg/l，青霉素的工作浓度为100,000U/L；
[0041] 优选地，使用时，将所述培养基加热至37℃。
[0042] 优选地，所述步骤3)是通过包括以下步骤的方法实现的：
[0043] 根据待制备的储液的体积，计算所需L-肉毒碱、乙醇胺、腐胺、亚硒酸钠、亚油酸和转铁蛋白的量，溶于灭菌的去离子水中，搅拌，过滤；
[0044] 优选地，所述过滤使用0.22μm的滤器；
[0045] 优选地，所述搅拌使用磁力搅拌器；
[0046] 优选地，可以将所述储液分装；更优选地，将所述储液至于-20℃或者-80℃保存。
[0047] 优选地，所述步骤4)是通过包括以下步骤的方法实现的：
[0048] 根据制备的储液的体积，计算所需维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、N乙酰半胱氨酸的量，溶于灭菌的去离子水中，搅拌，过滤；
[0049] 优选地，所述过滤使用0.22μm的滤器；
[0050] 优选地，所述搅拌使用磁力搅拌器；
[0051] 优选地，可以将所述储液分装；更优选地，将所述储液至于-20℃或者-80℃保存。
[0052] 在一个优选的实施方案中，所述培养基是通过包括以下步骤的方法制备的：
[0053] 1)根据待制备的培养基的总体积，计算所需基础培养基RPMI-1640干粉的量；
[0054] 2)将RPMI-1640干粉直接溶于灭菌的去离子水中，搅拌均匀，得到基础培养基，然后每升基础培养基添加2g碳酸氢钠，使用浓盐酸调pH为7.2，再用5M氯化钠储液将基础培养基的渗透压值调至300，用0.22μm的滤器过滤，4度保存得到的基础培养基；
[0055] 3)根据制备的50×储液的体积，按照2mg/L的L-肉毒碱、1mg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、0.016mg/L的亚硒酸钠、1mg/L的亚油酸、5mg/L的转铁蛋白的比例，称重所述组分，并溶于灭菌的去离子水中，磁力搅拌器搅拌均匀，0.22μm的滤器过滤分装，-20℃或者-80℃保存；
[0056] 4)根据制备的1000×储液的体积，按照100mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、200μM的N乙酰半胱氨酸的比例，称量所述组分，并溶于灭菌的去离子水中，磁力搅拌器搅拌均匀，0.22μm的滤器过滤分装，-20℃或者-80℃保存；
[0057] 5)将步骤3)制备的储液和步骤4)制备的储液按照所需的量加入到步骤2)制备的基础培养基中，然后与青链霉素混合均匀，加热到37℃使用，
[0058] 其中，所述青链霉素中链霉素的工作浓度为100mg/l，青霉素的工作浓度为100,000U/L；
[0059] 优选地，所述方法还包括添加胰岛素的步骤；
[0060] 优选地，所述添加胰岛素的步骤是通过包括以下步骤的方法实现的：
[0061] 将所述培养基的pH调到3，加入所需量的胰岛素，充分溶解，直到溶液变清澈为止。
[0062] 优选地，所述方法还包括添加诱导小分子的步骤；
[0063] 优选地，所述添加诱导小分子的步骤是通过包括以下步骤的方法实现的；
[0064] 将诱导小分子溶于微量的DMSO中，然后制备为1000×的储液，将所述储液按照所需的量加入到基础培养基中；
[0065] 优选地，将所需量的诱导小分子溶于微量的DMSO中，然后溶于所需量的灭菌的去离子水中，搅拌，过滤，从而制得1000×的储液；
[0066] 其中，使用的DMSO的量不超过所述储液总体积的0.5％。
[0067] 再一方面，本发明还提供一种将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的方法，所述方法包括使用本发明所述的培养基培养细胞的步骤；
[0068] 其中，所述胚胎干细胞为购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)或H7人胚胎干细胞。
[0069] 优选地，所述方法包括以下步骤:
[0070] 1)使用胚胎干细胞制备单细胞悬液；
[0071] 优选地，所述单细胞悬液的密度为1～1.5×105/cm2；
[0072] 2)将步骤1)中的细胞使用E8培养基培养2-3天，优选地，使细胞长到90％左右的饱和度；然后使用本发明所述的添加2～8μM CHIR99021的培养基培养细胞，从而诱导细胞开始分化；
[0073] 优选地，所述培养基的使用量为每2-3×105的单细胞加入1mL培养基；
[0074] 优选地，所述培养基中GSK3β抑制剂CHIR99021的浓度为4μM；
[0075] 3)24小时后，吸走旧的培养基，添加新的培养基，并连续培养44-48小时，中间不换液；
[0076] 其中，所述培养基中不含诱导小分子和胰岛素；
[0077] 4)44-48小时后，吸走旧的培养基，然后使用本发明所述的含有Wnt抑制剂的培养基培养细胞，并连续培养44-48小时中间不换液；
[0078] 5)44-48小时后，吸走旧的培养基，然后使用本发明所述的培养基培养细胞，并连续培养72小时中间不换液；
[0079] 优选地，使用购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)来诱导心肌细胞时，所述培养基为含有Wnt抑制剂的培养基；
[0080] 优选地，使用H7人胚胎干细胞来诱导心肌细胞时，所述培养基为不含Wnt抑制剂的培养基；
[0081] 6)72小时后，吸走旧的培养基，加入本发明所述的含有胰岛素的培养基，连续培养48-72小时中间不换液，从而得到心肌细胞；
[0082] 优选地，使用购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)来诱导心肌细胞时，连续72小时不换液；
[0083] 优选地，使用H7人胚胎干细胞来诱导心肌细胞时，在第48小时换液。
[0084] 优选地，得到心肌细胞后，每隔2-3天换一次新鲜的含有胰岛素的本发明所述的培养基；
[0085] 优选地，所述方法还包括检测心肌诱导效率的步骤；
[0086] 进一步优选地，所述检测心肌的诱导效率在细胞开始分化的第14天进行；
[0087] 优选地，所述检测使用流式细胞仪进行；
[0088] 优选地，所述检测使用心肌特异的标记物cTNT染色。
[0089] 优选地，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现的：
[0090] 将培养5-6天的胚胎干细胞用Stempro Accutase酶，37℃消化10min，使干细胞克隆消化成单细胞，用DMEMF12培养基洗一次，1000rpm，离心5min；吸走上清，用添加10μM ROCK抑制剂Y27632的E8培养基重悬，然后以1～1.5×105/cm2的接种密度接种。
[0091] 优选地，所述检测心肌诱导效率是通过包括以下步骤的方法实现的：
[0092] 1)将得到心肌细胞用0.25％trypsin-EDTA37℃消化6-7min，加入100％FBS终止胰酶，用枪吹打至单个细胞；1000rpm离心5min，去上清；
[0093] 2)加入4mL buffer B/管，洗一次，1000rpm离心5min，弃buffer B；
[0094] 其中，所述buffer B的组分为1×PBS+0.5％BSA+0.05％NaN3；
[0095] 3)使用4％多聚甲醛4℃固定15min；
[0096] 4)加入buffer A 4mL/管，1000rpm离心两次，每次5min；
[0097] 其中，buffer A的组分为1×PBS+0.5％BSA+0.2％皂角苷+0.05％NaN3；
[0098] 5)留下约50μl的液体，加入同体积的buffer A稀释的cTNT抗体或者同型对照抗体，4℃孵育40min，cTNT抗体的终浓度为2μg/mL；
[0099] 6)再加入buffer A 4mL/管，1000rpm离心两次，每次5min；
[0100] 7)用buffer A(1：400)稀释山羊抗小鼠FITC或者PE，每管加入100μl，黑暗，4℃孵育40min；
[0101] 8)加入4mL buffer B，1000rpm离心两次，每次5min；
[0102] 9)去掉上清，加入200-400μl 4％多聚甲醛重悬；
[0103] 10)将重悬液置于流式细胞仪上检测，用同型对照抗体做阴性对照。
[0104] 再一方面，本发明还提供了一种心肌细胞，以及所述心肌细胞在药物筛选以及药物对心肌的毒理检测中的用途。
[0105] 优选地，本发明提供了本发明所述的心肌细胞在用于鉴定促进心肌细胞的发育或分化诱导、再生、生存等的新型因子或具有可能性的化疗药物的筛选中的用途。
[0106] 本发明还提供了本发明的心肌细胞在制备用于治疗出于心脏疾病状态的心脏的药物中的用途。
[0107] 与现有的培养基相比，本发明的培养基配方简单，成本较低，不涉及任何伦理问题，可以提高诱导效率，诱导的细胞具有更多的优势，而且该培养基临床应用的前景也非常好，所以不论是从基础研究还是市场推广，本发明都具有更广泛的前景。
[0108] 本发明的主要前景和意义包括：
[0109] 1)与传统的培养基相比，使用本发明的培养基诱导心肌细胞，不论从分化效率、最终的心肌细胞产量、还是批次与批次之间的稳定性，都有显著的提高。
[0110] 2)成功获得的人心肌细胞可以为药物筛选以及药物对心肌的毒理检测提供很好的研究平台。
[0111] 3)人心肌细胞的临床应用首先必须确保是临床级别的种子干细胞。这样才能将多能性干细胞相关产品应用于临床，传统饲养层分化法以及培养液中的动物源性成分都会限制其应用。
[0112] 本发明在化学成分完全明确的条件下将胚胎干细胞定向高效地诱导为心肌细胞，条件已相对成熟，所以可以更快的促进将来的临床转化。
[0113] 4)当有大量人心肌细胞的需求时，本发明可以按照上述所需量的要求按比例无限扩大，而且所得结果与小规模体系下得到结果无显著差异。大量的心肌细胞可以通过细胞移植治疗心肌梗死，观察其心脏功能的改善效果，可以为将来通过细胞移植治疗心梗病人提供可靠的依据。
[0115] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0116] 图1示出北京干细胞库建立的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)在无滋养层，无动物源，化学成分明确的E8-vitronectin人胚胎干细胞培养系统培养后，使用传统RPMI-1640+B27(xeno-free)分化诱导培养基中得到心肌细胞；其中：
[0117] A图为分化的大致流程方案；
[0118] B图为购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)在无滋养层，无动物源，化学成分明确的E8-vitronectin人胚胎干细胞培养系统培养状态；Bars＝200μm；
[0119] C图为分化第14天使用传统RPMI-1640+B27(xeno-free)分化诱导培养基中得到心肌细胞，Bars＝200μm；
[0120] D图为分化第14天在传统RPMI-1640+B27(xeno-free)分化诱导培养基中得到心肌细胞的比例，即心肌的分化效率(心肌特异marker cTNT阳性细胞占总细胞的百分比)；
[0121] E图为分化第14天在传统RPMI-1640+B27(xeno-free)分化诱导培养基中得到心肌5 2
细胞的实际数目为10/cm。
细胞的实际数目为10/cm。
[0122] 图2示出在使用本发明的化学成分完全明确的分化诱导培养基，通过调节诱导小分子的最佳诱导剂量以及诱导时间窗口，优化心肌细胞的分化效率以及产量；其中：
[0123] A图为CHIR99021(0-1天)，IWR1(3-5天)分化流程方案；
[0124] B图为在A图分化方案下，分化第14天，不同剂量CHIR99021(0-1天)诱导下的不同心肌分化效率，其中CHIR99021 4μM诱导下的心肌分化效率最高为21.4％；
[0125] C图为早期中胚层marker T在不同剂量CHIR99021诱导1天后的分化效率T％，其中CHIR99021大于等于4μM的剂量下，其T％不再增加；
[0126] D图为分化第14天，不同剂量CHIR99021(0-1天)诱导下的不同心肌分化效率，其中CHIR99021 4μM诱导下的心肌分化效率最高。
[0127] E图为CHIR99021(0-1天)，IWR1(3-5天，5-8天)分化流程方案；
[0128] F图为在E图分化方案下，分化第14天，不同剂量CHIR99021(0-1天)和不同剂量IWR1(3-5天，5-8天)诱导下的不同心肌分化效率，其中CHIR99021 4μM，IWR1 5μM诱导下的心肌分化效率最高为55.3％；
[0129] G图为在E图分化方案下，分化第14天，不同剂量CHIR99021(0-1天)和不同剂量IWR1(3-5天，5-8天)诱导下的不同心肌分化效率，其中CHIR99021 4μM，IWR1 5μM诱导下的心肌分化效率最高。
[0130] 图3示出在相同的小分子诱导条件下，使用本发明的化学成分完全明确的培养基与传统RPMI-1640+B27(xeno-free)诱导培养基，在心肌的分化效率以及最终产量上表现出差异；其中
[0131] A图为优化的最优小分子诱导分化流程方案；
[0132] B图为两种不同诱导培养基，在心肌分化效率上表现出差异，其中本发明的化学成分完全明确的分化诱导培养基最高诱导效率为67.6％，而传统RPMI-1640+B27(xeno-free)诱导培养基最高诱导效率为28.8％；
[0133] C图为两种不同诱导培养基，在心肌最终产量上表现出差异，其中本发明的培养基5 2 5
最高产量为2×10 /cm ，而传统RPMI-1640+B27(xeno-free)诱导培养基最高产量为10 /cm2。
最高产量为2×10 /cm ，而传统RPMI-1640+B27(xeno-free)诱导培养基最高产量为10 /cm2。
[0134] 图4示出在本发明的化学成分完全明确的分化诱导培养基中诱导分化得到心肌细胞经过percoll密度梯度离心后，心肌可以得到进一步纯化，而且可以按比例大规模扩大诱导分化培养；其中：
[0135] A图为24孔中分化得到的心肌细胞经过percoll密度梯度离心后，可分为非心肌细胞层和心肌细胞层，其中心肌细胞层心肌的纯度为95.0％，而非心肌细胞层心肌的纯度为29.7％；
[0136] B图为24孔中分化得到的心肌细胞经过percoll密度梯度离心后，可分为非心肌细胞层和心肌细胞层中心肌的最终产量；其中心肌细胞层心肌的最终产量大于2×105/cm2，而非心肌细胞层心肌的最终产量则小于0.5×105/cm2；
[0137] C图为T225瓶中大规模扩大诱导分化后，分化得到的心肌细胞经过percoll密度梯度离心后与24孔板的类似，3次独立的重复试验，其中心肌细胞层心肌的纯度都在90％以上。
[0138] D图为C图3次独立的重复试验，心肌细胞层的心肌纯度为92.8％+/-2.2％，心肌的最终产量为(2.2+/-0.3)×105/cm2。
[0140] A图为固定抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-Ac)为50μM，不同浓度的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐(V)的条件下，心肌细胞的诱导分化流程方案；
[0141] B图为在A图分化方案下，不同浓度的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐(V)的条件下，心肌的诱导分化效率表现出差异，其中不添加V的情况下则得不到心肌细胞，而V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为50μM(V200N50)的条件下，心肌的分化效率为81％；
[0142] C图为在A图分化方案下，不同浓度的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐(V)的条件下，心肌的诱导分化效率表现出差异，其中V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为50μM条件下，心肌的分化效率最高；
[0143] D图为在A图分化方案下，不同浓度的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐(V)的条件下，心肌的最终产量表现出差异，其中V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为50μM条件下，心肌的最终产量最高为3.3×105/cm2；
[0144] E图为固定抗氧化剂维生素C和/或维生素C磷酸镁盐(V)的浓度为200μg/mL，不同浓度的N-乙酰半胱氨酸条件下，心肌的诱导分化流程方案；
[0145] F图为在E图的分化方案下，在不同浓度的N-乙酰半胱氨酸下，心肌的诱导分化效率表现出差异，其中V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为100μM的条件下，心肌的分化效率最高为72％；
[0146] G图为在E图的分化方案下，不同浓度N-乙酰半胱氨酸条件下心肌的诱导分化效率表现出差异，其中V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为100μM的条件下，心肌的分化效率最高；
[0147] H图在E图的分化方案下，不同浓度N-乙酰半胱氨酸条件下心肌的最终产量上表现出差异，其中V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为100μM的条件下，心肌的最终产量最高为5 2
2.5×10/cm。
2.5×10/cm。
具体实施方式
[0148] 除非特别指明，本文中所用到的细胞，购自中国科学院动物研究所。
[0150] 实施例1本发明的培养基的制备
[0151] 1.根据表3提供的组分和配比制备本发明的液体培养基，所述培养基的步骤如下：
[0152] 1)根据制备的总体积，计算好所需基础培养基RPMI-1640干粉的量；
[0153] 2)将RPMI-1640粉末直接溶于灭菌的去离子水中，搅拌均匀；每升添加2g碳酸氢钠，用浓盐酸调pH为7.2。再用5M氯化钠储液将基础培养基的渗透压值调高至295，用0.22μm的滤器过滤，4℃保存。
[0154] 3)根据制备的50×储液的体积，按照1mg/L的L-肉毒碱、0.5mg/L的乙醇胺、10mg/L的腐胺、0.01mg/L的亚硒酸钠、0.5mg/L的亚油酸、3mg/L的转铁蛋白的比例，称重所述组分，并溶于灭菌的去离子水中，磁力搅拌器搅拌均匀，0.22μm的滤器过滤分装，-20℃或者-80℃保存；
[0155] 4)根据制备的1000×储液的体积，按照50mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、50μM的N乙酰半胱氨酸的比例，称重所述组分，并溶于灭菌的去离子水中，磁力搅拌器搅拌均匀，0.22μm的滤器过滤分装，-20℃或者-80℃保存；
[0156] 其中，表3示出制备50×储液和1000×储液所需的各组分的质量。
[0157] 5)将步骤3)制备的储液和步骤4)制备的储液按照所需的量加入到步骤2)制备的基础培养基中，然后与商品化的青链霉素混合均匀，加热到37℃使用。
[0158] 其中，所述青链霉素中链霉素的工作浓度为100mg/L，青霉素的工作浓度为100,000U/L。
[0159] 表3储液的组成和比例
[0160] 除非特别说明，表3中各组分的浓度单位为mg/l
[0161]
[0162] 2.分别制备含有2mg/L的胰岛素的培养基、含有2μM的CHIR99021的培养基以及含有2μM的IWR1或1μM的wnt-c59的培养基。
[0163] 按照表4所述的量，将诱导小分子分别溶于微量的DMSO中，然后溶于灭菌的去离子水中，搅拌，过滤，制备为1000×的储液，使用时，按照所需的量加入到基础培养基中；
[0164] 其中，使用的DMSO的量不超过所述总体积的0.5％。
[0165] 表4诱导小分子的组成和比例
[0166]
[0167] 实施例2本发明的培养基的制备
[0168] 1.根据表5提供的组分和配比制备本发明的液体培养基，所述培养基的步骤如下：
[0169] 1)根据制备的总体积，计算好所需基础培养基RPMI-1640干粉的量；
[0170] 2)将RPMI-1640粉末直接溶于灭菌的去离子水中，搅拌均匀；每升添加2g碳酸氢钠，用浓盐酸调pH为7.2。再用5M氯化钠储液将基础培养基的渗透压值调高至300，用0.22μm的滤器过滤，4度保存。
[0171] 3)根据制备的50×储液的体积，按照3mg/L的L-肉毒碱、2mg/L的乙醇胺、20mg/L的腐胺、0.02mg/L的亚硒酸钠、2mg/L的亚油酸、6mg/L的转铁蛋白的比例，称重所述组分，并溶于灭菌的去离子水中，磁力搅拌器搅拌均匀，0.22μm的滤器过滤分装，-20℃或者-80℃保存；
[0172] 4)根据制备的1000×储液的体积，按照200mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、500μM的N乙酰半胱氨酸的比例，称重所述组分，并溶于灭菌的去离子水中，磁力搅拌器搅拌均匀，0.22μm的滤器过滤分装，-20℃或者-80℃保存；
[0173] 表5示出制备50×储液和1000×储液所需的各组分的质量。
[0174] 5)将步骤3)制备的储液和步骤4)制备的储液按照所需的量加入到步骤2)制备的基础培养基中，然后与青链霉素混合均匀，加热到37℃使用。
[0175] 其中，所述青链霉素中链霉素的工作浓度为100mg/l，青霉素的工作浓度为100,000U/L。
[0176] 表5储液的组成和比例
[0177] 除非特别说明，表5中各组分的浓度单位为mg/l
[0178]
[0179] 2.分别制备含有6mg/L的胰岛素的培养基、含有8μM的CHIR99021的培养基以及含有8μM的IWR1或5μM的wnt-c59的培养基，
[0180] 按照表6所述的量，将诱导小分子分别溶于微量的DMSO中，然后溶于灭菌的去离子水中，搅拌，过滤，制备为1000×的储液，使用时，按照所需的量加入到基础培养基中；其中，使用的DMSO的量不超过所述总体积的0.5％。
[0181] 表6诱导小分子的组成和比例
[0182]
[0183] 实施例3本发明的培养基的制备
[0184] 1.根据表7提供的组分和配比制备本发明的液体培养基，所述培养基的步骤如下：
[0185] 1)根据制备的总体积，计算好所需基础培养基RPMI-1640干粉的量；
[0186] 2)将RPMI-1640粉末直接溶于灭菌的去离子水中，搅拌均匀；每升添加2g碳酸氢钠，用浓盐酸调pH为7.2。再用5M氯化钠储液将基础培养基的渗透压值调高至300，用0.22μm的滤器过滤，4度保存。
[0187] 3)根据制备的50×储液的体积，按照2mg/L的L-肉毒碱、1mg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、0.016mg/L的亚硒酸钠、1mg/L的亚油酸、5mg/L的转铁蛋白的比例，称重所述组分，并溶于灭菌的去离子水中，磁力搅拌器搅拌均匀，0.22μm的滤器过滤分装，-20℃或者-80℃保存；
[0188] 4)根据制备的1000×储液的体积，按照100mg/L的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐、250μM的N乙酰半胱氨酸的比例，称重所述组分，并溶于灭菌的去离子水中，磁力搅拌器搅拌均匀，0.22μm的滤器过滤分装，-20℃或者-80℃保存；
[0189] 表3示出制备50×储液和1000×储液所需的各组分的质量。
[0190] 5)将步骤3)制备的储液和步骤4)制备的储液按照所需的量加入到步骤2)制备的基础培养基中，然后与1％的商品化的青链霉素混合均匀，加热到37℃使用。
[0191] 其中，所述青链霉素中链霉素的工作浓度为100mg/L，青霉素的工作浓度为100,000U/L。
[0192] 表7储液的组成和比例
[0193] 除非特别说明，表7中各组分的浓度单位为mg/l
[0194]
[0195] 2.分别制备含有4mg/L的胰岛素的培养基、含有4μM的CHIR99021的培养基以及含有5μM的IWR1和4μM的wnt-c59的培养基，
[0196] 按照表8所述的量，将诱导小分子分别溶于微量的DMSO中，然后溶于灭菌的去离子水中，搅拌，过滤，制备为1000×的储液，使用时，按照所需的量加入到基础培养基中；其中，使用的DMSO的量不超过所述总体积的0.5％。
[0197] 表8诱导小分子的组成和比例
[0198]
[0199] 实施例4使用本发明实施例3的培养基将购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞(CTS-hES)诱导成心肌细胞
[0200] 具体实施步骤：
[0201] 1)将培养5-6天的购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞用Stempro Accμtase酶37℃消化10分钟左右，使干细胞克隆消化成单细胞，用DMEMF12培养基洗一次，1000rpm，离心5min。
[0202] 吸走上清，用添加10μM ROCK抑制剂Y27632的E8培养基重悬，计数器计数。以105-1.5×105/cm2的接种密度接种，以24孔板为例，一个24孔板中1个孔的面积接近2cm2，也就是说24孔板中的一个孔可以接种2-3×105/cm2的人胚胎干细胞，每孔1mL E8培养基。
[0203] 2)将步骤1)中接种好的细胞使用E8培养基培养2-3天；使细胞长到90％左右的饱和度；吸走旧的E8培养基，加入添加4μM GSK3β抑制剂CHIR99021(Wnt的激活剂)的培养基，每孔1mL培养基，记为第0天。
[0204] 对于购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)，4μM CHIR99021是一个最佳的作用浓度。
[0205] 3)24小时后，吸走旧的培养基，添加新的不含CHIR99021的培养基，每孔1mL培养基，记为day1。连续培养48小时中间不换液。
[0206] 4)48小时后，吸走旧的培养基，加入添加5μM IWR1或者2μM Wnt-C59的培养基，每孔1mL培养基，记为day3。连续培养48小时中间不换液。在第一天到第三天的这48小时中，可以提前3-4小时换液，但不要推迟换液。5)48小时后，吸走旧的培养基，继续加入添加5μM IWR1或者2μM Wnt-C59的培养基，每孔1mL培养基，记为第五天，连续培养72小时中间不换液。
[0207] Day5到day8这72小时对于购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)来说需要继续添加Wnt抑制剂来促进心肌细胞分化。
[0208] 6)72小时后，吸走旧的培养基，加入添加4mg/L胰岛素的培养基，每孔1mL培养基，记为day8。连续培养72小时中间不换液。
[0209] 第八天到第十一天这72小时对于购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)来说可以不换液。
[0210] 7)心肌细胞一般在day10左右的时间开始跳动，最早第八天的时候就有跳动，每隔2-3天换一次新鲜的含4mg/L胰岛素的培养基。一般情况下，第14天以后，几乎所有的心肌细胞都会跳动。
[0211] 这时就可以用心肌特异的marker cTNT来染色，通过流式细胞仪可以检测cTNT％，即心肌最终的诱导效率。
[0212] 其中，检测心肌诱导效率步骤如下：
[0213] 1)将得到心肌细胞用0.25％trypsin-EDTA 37℃消化6-7min，加入100％FBS终止胰酶，用枪吹打至单个细胞；1000rpm离心5min，去上清；
[0214] 2)加入4mL buffer B/管，洗一次，1000rpm离心5min，弃buffer B；
[0215] 其中，所述buffer B的组分为1×PBS+0.5％BSA+0.05％NaN3；
[0216] 3)使用4％多聚甲醛4℃固定15min；
[0217] 4)加入buffer A4mL/管，1000rpm离心两次，每次5min；
[0218] 其中，buffer A的组分为1×PBS+0.5％BSA+0.2％皂角苷+0.05％NaN3；
[0219] 5)留下约50μl的液体，加入同体积的buffer A稀释的cTNT抗体或者同型对照抗体，4℃孵育40min，cTNT抗体的终浓度为2μg/mL；
[0220] 6)再加入buffer A 4mL/管，1000rpm离心两次，每次5min；
[0221] 7)用buffer A(1：400)稀释山羊抗小鼠FITC或者PE，每管加入100μl，黑暗，4℃孵育40min；
[0222] 8)加入4mL buffer B，1000rpm离心两次，每次5min；
[0223] 9)去掉上清，加入200-400μl 4％多聚甲醛重悬；
[0224] 10)将重悬液置于流式细胞仪上检测，用同型对照抗体做阴性对照。
[0225] 实施例5使用本发明的根据实施例3制备的培养基和添加B27培养基诱导心肌细胞的比较
[0226] 分别使用实施例3中的培养基和添加B27的RPMI-1640培养基按照实施例4的方法诱导心肌细胞；并进行流式分析。
[0227] 其中，B27添加物为一种用于培养细胞的常规无血清添加物，本实施例中的B27无血清添加物购自Life Technology公司。
[0228] 结果如图1-3所示，其中；
[0229] 图1示出北京干细胞库建立的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)在无滋养层，无动物源，化学成分明确的E8-vitronectin人胚胎干细胞培养系统培养后，使用传统RPMI-1640+B27(xeno-free)分化诱导培养基中得到心肌细胞；其中：
[0230] A图为分化的大致流程方案；
[0231] B图为购自北京干细胞库的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)在无滋养层，无动物源，化学成分明确的E8-vitronectin人胚胎干细胞培养系统培养状态；Bars＝200μm；
[0232] C图为分化第14天使用传统RPMI-1640+B27(xeno-free)分化诱导培养基中得到心肌细胞，Bars＝200μm；
[0233] D图为分化第14天在传统RPMI-1640+B27(xeno-free)分化诱导培养基中得到心肌细胞的比例，即心肌的分化效率(心肌特异marker cTNT阳性细胞占总细胞的百分比)为41.2％；
[0234] E图为分化第14天在传统1640+B27(xeno-free)分化诱导培养基中得到心肌细胞的实际数目为105/cm2。
[0235] 图2示出在使用本发明化学成分完全明确的分化诱导培养基，通过调节诱导小分子的最佳诱导剂量以及诱导时间窗口，优化心肌细胞的分化效率以及产量；其中：
[0236] A图为CHIR99021(0-1天)，IWR1(3-5天)分化流程方案；
[0237] B图为在A图分化方案下，分化第14天，不同剂量CHIR99021(0-1天)诱导下的不同心肌分化效率，其中CHIR99021 4μM诱导下的心肌分化效率最高为21.4％；
[0238] C图为早期中胚层marker T在不同剂量CHIR99021诱导1天后的分化效率T％，其中CHIR99021大于等于4μM的剂量下，其T％不再增加；
[0239] D图为分化第14天，不同剂量CHIR99021(0-1天)诱导下的不同心肌分化效率，其中CHIR99021 4μM诱导下的心肌分化效率最高。
[0240] E图为CHIR99021(0-1天)，IWR1(3-5天，5-8天)分化流程方案；
[0241] F图为在E图分化方案下，分化第14天，不同剂量CHIR99021(0-1天)和不同剂量IWR1(3-5天，5-8天)诱导下的不同心肌分化效率，其中CHIR99021 4μM，IWR1 5μM诱导下的心肌分化效率最高为55.3％；
[0242] G图为在E图分化方案下，分化第14天，不同剂量CHIR99021(0-1天)和不同剂量IWR1(3-5天，5-8天)诱导下的不同心肌分化效率，其中CHIR99021 4μM，IWR1 5μM诱导下的心肌分化效率最高。
[0243] 图3示出在相同的小分子诱导条件下，使用本发明的化学成分完全明确的培养基与传统RPMI-1640+B27(xeno-free)诱导培养基，在心肌的分化效率以及最终产量上表现出差异；其中
[0244] A图为优化的最优小分子诱导分化流程方案；
[0245] B图为两种不同诱导培养基，在心肌分化效率上表现出差异，其中本发明的化学成分完全明确的分化诱导培养基最高诱导效率为67.6％，而传统1640+B27(xeno-free)诱导培养基最高诱导效率为28.8％；
[0246] C图为两种不同诱导培养基，在心肌最终产量上表现出差异，其中本发明的培养基最高产量为2×105/cm2，而传统RPMI-1640+B27(xeno-free)诱导培养基最高产量为105/2
cm。
cm。
[0247] 实施例6使用本发明的培养基大规模诱导人心肌细胞
[0248] 使用本发明的实施例1中的培养基诱导分化人胚胎干细胞为心肌细胞，方法和步骤见实施例4。
[0249] 其中，所述人胚胎干细胞为北京干细胞库建立的临床级人胚胎干细胞系(CTS-hES)。
[0250] 结果见图4，示出在本发明的化学成分完全明确的分化诱导培养基中诱导分化得到心肌细胞经过percoll密度梯度离心后，心肌可以得到进一步纯化，而且可以按比例大规模扩大诱导分化培养；其中：
[0251] A图为24孔中分化得到的心肌细胞经过percoll密度梯度离心后，可分为非心肌细胞层和心肌细胞层，其中心肌细胞层心肌的纯度为95.0％，而非心肌细胞层心肌的纯度为29.7％；
[0252] B图为24孔中分化得到的心肌细胞经过percoll密度梯度离心后，可分为非心肌细胞层和心肌细胞层中心肌的最终产量；其中心肌细胞层心肌的最终产量大于2×105/cm2，而非心肌细胞层心肌的最终产量则小于0.5×105/cm2；
[0253] C图为T225瓶中大规模扩大诱导分化后，分化得到的心肌细胞经过percoll密度梯度离心后与24孔板的类似，3次独立的重复试验，其中心肌细胞层心肌的纯度都在90％以上。
[0254] D图为C图3次独立的重复试验，心肌细胞层的心肌纯度为92.8％+/-2.2％，心肌的最终产量为(2.2+/-0.3)×105/cm2。
[0255] 实施例7最优化本发明的培养基的诱导效果
[0256] 使用本发明的实施例3中的培养基诱导分化人胚胎干细胞为心肌细胞，方法和步骤见实施例4。
[0257] 结果见图5，示出在相同的小分子诱导条件下，通过改变本发明的化学成分完全明确的分化诱导培养基中抗氧化剂的浓度来最优化心肌的分化效率和最终产量；其中：
[0258] A图为固定抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-Ac)为50μM，不同浓度的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐(V)的条件下，心肌细胞的诱导分化流程方案；
[0259] B图为在A图分化方案下，不同浓度的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐(V)的条件下，心肌的诱导分化效率表现出差异，其中不添加V的情况下则得不到心肌细胞，而V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为50μM(V200N50)的条件下，心肌的分化效率为81％；
[0260] C图为在A图分化方案下，不同浓度的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐(V)的条件下，心肌的诱导分化效率表现出差异，其中V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为50μM条件下，心肌的分化效率最高；
[0261] D图为在A图分化方案下，不同浓度的维生素C和/或维生素C磷酸镁盐(V)的条件下，心肌的最终产量表现出差异，其中V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为50μM条件下，心肌5 2
的最终产量最高为3.3×10/cm；
的最终产量最高为3.3×10/cm；
[0262] E图为固定抗氧化剂维生素C和/或维生素C磷酸镁盐(V)的浓度为200μg/mL，不同浓度的N-乙酰半胱氨酸条件下，心肌的诱导分化流程方案；
[0263] F图为在E图的分化方案下，在不同浓度的N-乙酰半胱氨酸下，心肌的诱导分化效率表现出差异，其中V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为100μM的条件下，心肌的分化效率最高为72％；
[0264] G图为在E图的分化方案下，不同浓度N-乙酰半胱氨酸条件下心肌的诱导分化效率表现出差异，其中V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为100μM的条件下，心肌的分化效率最高；
[0265] H图在E图的分化方案下，不同浓度N-乙酰半胱氨酸条件下心肌的最终产量上表现出差异，其中V的浓度为200μg/mL，N-Ac的浓度为100μM的条件下，心肌的最终产量最高为2.5×105/cm2。
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