一种木脂素化合物及其制备方法与应用
阅读：331发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种木脂素化合物及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种木脂素化合物及其制备方法与应用，该木脂素化合物命名为NoreucolA，具有如下结构式：本发明还提供了Noreucol A的制备方法，通过对杜仲树皮进行 水 回流提取分离，所得的萃取物进行富集和分离，依次通过大孔 树脂 HPD-100、两次 硅 胶柱层析和高效液相色谱，最终得到纯化的白色固体产物Noreucol A；本发明得到的木脂素化合物Noreucol A首次在杜仲中进行提取和分离，该化合物结构新颖，且具有神经保护活性，在 预防 和 治疗 神经损伤性 疾病 领域有良好的应用前景。，下面是一种木脂素化合物及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种木脂素化合物，其特征在于，所述化合物为Noreucol A，具有如下结构式：
2.根据权利要求1所述的木脂素化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取杜仲树皮进行提取，对提取物进行富集和分离，得到纯化的化合物Noreucol A。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述提取为使用水回流提取法。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述分离包括使用大孔树脂、硅胶柱层析和高效液相色谱方法进行。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述分离具体包括以下步骤：
S1、将所述提取物通过大孔树脂HPD-100用100％-5％的乙醇进行梯度洗脱，得到70％乙醇洗脱物；
S2、将上述70％乙醇洗脱物通过硅胶柱层析用(100：0～50：50)体积比的CH2Cl2：MeOH进行洗脱，收集CH2Cl2：MeOH体积比(100:5～100:10)范围之间的洗脱液，再次进行硅胶柱层析用(100：0～100：10)体积比的CH2Cl2：MeOH进行洗脱，收集得到CH2Cl2：MeOH体积比(100：4～
100：7)范围之间的洗脱液；
S3、取步骤S2得到的所述洗脱液用半制备高效液相色谱柱进行分离纯化，流动相为
28％的乙腈水溶液，收集17.4min左右出峰时间的产物即得。
6.根据权利要求1所述的Noreucol A在制备预防和/或治疗神经退行性疾病药物中的用途。
7.一种预防和/或治疗神经退行性疾病的药物，其特征在于，包含如权利要求1所述的Noreucol A。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森病、亨廷顿病、帕金斯病或肌萎缩性脊髓侧索硬化症中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂或混悬剂中的至少一种。
10.一种预防和/或治疗神经退行性疾病的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的Noreucol A。
一种木脂素化合物及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
[0002] 杜仲(学名Eucommia ulmoides Oliver)，又名胶木，为杜仲科杜仲属植物，其干燥树皮 为我国特有的名贵滋补中药材，对肝、肾、肌肉和骨骼具有滋补作用。杜仲具有中益精气、 强筋骨、安胎等功效，主要用于治疗肾虚腰痛、筋骨无力、妊娠漏血、胎动不安、高血压等 症。随着国内外学者大量的深入研究，杜仲已在医疗、保健、工业多领域进行开发和利用， 因此，对于杜仲的研究具有广阔的前景和应用价值。
[0003] 目前已知的杜仲的化学成分中主要有木脂素类(松脂醇二葡萄糖苷)、环烯醚萜类(京尼 平酸、京尼平苷、桃叶珊瑚苷)、苯丙素类(绿原酸、咖啡酸、阿魏酸)、黄酮类(槲皮素、 芦丁)、多糖类及杜仲扩真菌蛋白，此外富含多种氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素等。
[0004] 木脂素类化合物类由两分子苯丙素衍生物(即C6-C3单体)聚合而成的天然化合物，多 数呈游离状态，少数与糖结合成苷而存在于植物的木部和树脂中，故而得名。木脂素类化合 物多存在于植物中，属于一种植物雌激素，具有清除体内自由基，具有抗氧化的作用。亚麻 籽及芝麻中木脂素的含量较高，谷物类食物(如黑麦，小麦，燕麦，大麦等)，大豆和十字花 科植物(如西兰花)和一些水果(如草莓)中也含木脂素。前期研究发现杜仲中的木脂素具 有抗氧化、抗炎、抗纤维化作用，能缓解高血压引起的肾脏血管重构。最近研究还发现能够 显著提高MCAO大鼠的神经功能评分，减少梗死面积，提示其可能具有神经保护作用。因此， 从天然产物中提取和分离具有活性的新结构的木脂素类化合物具有重要意义。
[0005] 神经退行性疾病，以特异性神经元的大量丢失为主要特征，是一类进行性发展的致残， 严重可致死的复杂疾病。其可分为急性神经退行性病和慢性神经退行性病，前者主要包括中 风、脑损伤；后者主要包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病(HD)、帕金森病(PD)和 阿尔茨海默病(AD)等。虽然这类疾病的病变部位及病因各不相同，但神经细胞退行性病变 是它们的共同点。目前基于对神经退行性病变机理的研究，近年有人提出神经细胞保护的概 念。神经保护剂的研究对治疗神经退行性疾病具有重要意义。
发明内容
[0006] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种木脂素化 合物，具有新的化学结构和神经保护活性。
[0007] 本发明还提出上述化合物的制备方法。
[0008] 本发明还提出上述化合物的用途。
[0009] 本发明还提出了一种预防和/或治疗神经退行性疾病的药物。
[0010] 本发明还提出了一种预防和/或治疗神经退行性疾病的药物组合物。
[0011] 根据本发明的第一方面实施例的一种木脂素化合物，所述化合物为Noreucol A，具有如 下结构式：
[0012]
[0013] 根据本发明实施例的一种木脂素化合物，至少具有如下有益效果：本发明得到的木脂素 化合物Noreucol A是首次在杜仲中进行提取和分离的新的木脂素类化合物，该化合物结构新 颖，且具有神经保护活性，在预防和治疗神经损伤性疾病领域有良好的应用前景。
[0014] 根据本发明的第二方面实施例的制备方法，包括以下步骤：取杜仲树皮进行提取，对提 取物进行富集和分离，得到纯化的化合物Noreucol A。
[0015] 根据本发明的一些实施例，所述提取为使用水回流提取法。
[0017] 根据本发明的一些实施例，所述分离具体包括以下步骤：
[0018] S1、将所述提取物通过大孔树脂HPD-100用100％到5％的乙醇进行梯度洗脱，得到70％ 乙醇洗脱物；
[0019] S2、将上述70％乙醇洗脱物通过硅胶柱层析用(100：0～50：50)体积比的CH2Cl2：MeOH 进行洗脱，收集CH2Cl2：MeOH体积比(100:5～100:10)范围之间的洗脱液，再次进行硅 胶柱层析用(100：0～100：10)体积比的CH2Cl2：MeOH进行洗脱，收集得到CH2Cl2：MeOH 体积比(100：4～100：7)范围之间的洗脱液；
[0020] S3、取最后得到的上述洗脱液用半制备高效液相色谱柱进行分离纯化，流动相为28％的 乙腈水溶液，收集17.4min左右出峰时间的产物即得。
[0021] 根据本发明的第三方面实施例的用途，上述Noreucol A用于制备预防和/或治疗神经退行 性疾病药物。
[0022] 根据本发明的第四方面的实施例的一种预防和/或治疗神经退行性疾病的药物，包含如权 利要求1所述的Noreucol A。
[0023] 根据本发明的一些实施例，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森病、亨廷顿 病、帕金斯病或肌萎缩性脊髓侧索硬化症中的至少一种。
[0024] 根据本发明的一些实施例，所述药物的剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、 乳剂或混悬剂中的至少一种。
[0027] 图1为本发明实施例2中Noreucol A的电子圆二色谱实验的ECD谱图；
[0028] 图2为本发明实施例2中Noreucol A的质谱图(HRESIMS)；
[0029] 图3为本发明实施例2中Noreucol A的红外谱图；
[0030] 图4为本发明实施例2中Noreucol A的氢谱图；
[0032] 图6为本发明实施例2中Noreucol A的碳谱图的部分(105-180)；
[0033] 图7为本发明实施例2中Noreucol A的DEPT135谱图；
[0034] 图8为本发明实施例2中Noreucol A的1H-1H COSY谱图；
[0035] 图9为本发明实施例2中Noreucol A的HSQC谱图；
[0036] 图10为本发明实施例2中Noreucol A的HMBC谱图；
[0037] 图11为本发明实施例3中Noreucol A与阳性对照DMF和空白对照对HT-22细胞活力的 影响对照结果。
具体实施方式
[0038] 为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以 说明。
[0039] 常规实验和仪器：光学旋转使用仪器Jasco model 1020 polarimeter(Horiba，Tokyo，Japan) 测定；ECD光谱使用仪器Applied Photophysics spectrometer(Chirascan，New Haven，USA) 测量；HRESIMS数据由仪器Agilent 1290 UPLC-6545 accurate mass Q-TOF(Agilent Technologies，CA，USA)测定；核磁测定以四甲基硅烷(TMS)为内标物使用仪器Bruker AV-600 MHz spectrometer(Bruker，Karlsruhe，Germany)；分析高效液相色谱使用仪器Agilent 1200 unit equipped with a DAD detector，分离柱为YMC Pack ODS-ARP-18 column(5μm，250×4.6mm， YMC Co.Ltd.，Kyoto，Japan)；半制备高效液相色谱使用Agilent 1100 unit equipped with a VWD detector，分离柱为YMC Pack ODS-A RP-18 column(10μm，250×10mm，YMC Co.Ltd.， Kyoto，Japan)；薄层色谱分析使用硅胶为GF-254(青岛海洋化工厂，青岛，中国)；柱层析 采用大孔树脂HPD-100(中国河北沧州邦吸附技术有限公司)、硅胶(中国青岛海洋化工厂 23号200-300目)、Sephadex LH-20(TOYOPEARL TOSOH，日本东京)；所有溶剂均为分 析级(科隆化学试剂)；HT-2622细胞购自上海生物科学研究院(中国成都，股份有限公司)。
[0040] 植物材料：用于下述实施例提取分离使用的植物材料为杜仲树皮，采集于2017年中国湖 南省张家界市，植物标本(20170408)保存于中南大学湘雅医院，该植物由中南大学湘雅医 院刘韶教授鉴定。植物材料不限于此，其他产地的杜仲树皮均能作为材料。
[0041] 实施例1：化合物的提取和分离
[0042] 1)使用水回流提取方法提取杜仲干燥树皮10公斤两次，然后将水溶液在真空条件下进 行浓缩，得到萃取物(500g)；
[0043] 2)通过大孔树脂柱层析的方法分离纯化萃取物，用大孔树脂HPD-100充分吸附萃取物， 使用流动相为EtOH-H2O(体积比从100:0到5:95)进行梯度洗脱，梯度洗脱比例依 次为100％、85％、70％、50％、30％和10％浓度的乙醇水溶液，依次收集不同部分 洗脱液；
[0044] 3)收集70％乙醇部分进行浓缩后进一步通过硅胶柱层析分离，使用流动相为 CH2Cl2-MeOH(体积比从100:0到50:50)进行梯度洗脱，梯度洗脱比例依次为 CH2Cl2-MeOH的体积比100:0、100:5、100:10、100:15、100:20、100:25和50:50， 分段收集洗脱液，得到7个部分(按洗脱顺序依次为部分1-7)；
[0045] 4)取上述部分3通过硅胶柱层析进行分离，使用流动相为CH2Cl2-MeOH(体积比从100： 0到100：10)进行梯度洗脱，梯度洗脱比例依次为CH2Cl2-MeOH的体积比100:0、 100:2、
100:5、100:8和100:10，分段收集洗脱液，得到5个部分(按洗脱顺序依次 为部分3.1-3.5)；
100:5、100:8和100:10，分段收集洗脱液，得到5个部分(按洗脱顺序依次 为部分3.1-3.5)；
[0046] 5)取上述部分3.3通过半制备高效液相色谱(HPLC)进行分离，使用流动相为 CH3CN-H2O(0～20min，28％～28％)，得到目标化合物(5.6mg，tR＝17.4min)。 tR为目标化合物的出峰时间，收集主峰部分。
[0047] 实施例2：化合物的结构鉴定
[0048] 一、理化性质测定：
[0049] 目标化合物为一种白色固体，理化性质鉴定如下：
[0050] 1)旋光度：[α]25D–22.0(c 0.50，MeOH)；
[0051] 2)紫外：HPLC-UV(CH3CN-H2O)λmax:248nm，282nm；
[0052] 3)电子圆二色谱：ECD(c 0.21mM，MeOH)λmax(Δε):201(+2.24)，230(-0.99) nm；ECD的谱图如附图1所示，图中，Exptl.1表示化合物noreucol A圆二色谱的实 验测量曲线，Calcd.1(S)表示化合物noreucol A(绝对构型4S)的计算圆二色谱曲 线，Calcd.1(R)表示化合物noreucol A(绝对构型4R)的计算圆二色谱曲线。其中， 计算得到的绝对构型4S的对映体ECD曲线(蓝移21nm)与实验光谱吻合较好，说 明化合物的绝对构型为4S。
[0053] 4)质谱：HRESIMS m/z 367.1157[M+Na]+，calculated for C19H20O6Na，367.1158；质谱 图如附图2所示。
[0054] 5)红外：红外图谱如附图3所示。
[0055] 6)核磁：1H NMR和13C NMR数据(DMSO-d6)如下表1所示，其中氢谱1H NMR的 谱图如附图4所示，碳谱13C NMR谱图如附图5和图6所示，DEPT135谱图如附图 7所示；
[0056] 表1.目标化合物氢谱和碳谱数据
[0057]
[0058] aRecorded in DMSO-d6,600MHz for 1H and 150MHz for 13C,δin ppm。
[0059] 二、结构解析：
[0060] 1)核磁质谱结果分析：
[0061] 根据HRESIMS结果m/z 367.1157[M+Na]+，计算值为C19H20O6Na，367.1158。从上表1 看出，氢谱(附图4)显示共有20个H，包括两个羟基信号δH 8.78(1H,s,OH-4')和8.76(1H, s,OH-4”),两组1,3,4-三取代芳香环信号δH 6.90(1H,d,1.8,overlapped,H-2')，6.67(1H,d, 2.4,overlapped,H-5')，6.74(1H,td,2.4,7.8,overlapped,H-6')，6.89(1H,d,2.4,overlapped, H-2”)，6.67(1H,d,3.0,overlapped,H-5”)和6.72(1H,td,3.0,7.8,overlapped,H-6”)，两个 亚甲基信号δH 4.15(1H,dd,8.4,7.2,H-5a)，3.84(1H,dd,8.4,7.2,H-5b)，2.42(1H,m,H-3a) 和2.18(1H,m,H-3b)，两个次甲基信号δH 3.53(1H,m,H-4)和
3.69(1H,d,12.0,H-6),两 个甲氧基δH 3.75(6H,s,overlap,3'/3”-OCH3)；碳谱(附图5和6)和DEPT135谱图(附图7) 显示有19个C，包括一个羰基碳δC 177.3,12个芳香碳δC 112.2-
147.9，两个亚甲基碳δC 72.3和 34.1，两个次甲基碳δC 53.8和39.4，两个甲氧基碳δC 56.1(overlapped)。二维谱1H-1H COSY 相关性H-3/H-4/H-5以及HMBC中δH 2.42/2.18(H-3)和
4.15/3.84(H-5)的重叠峰对应δC 177.3 (C-2)，δH 2.42/2.18(H-3)对应δc 72.3(C-5)表明存在一个丁内酯基团。在HMBC谱图中， δH 3.69(H-6)和δC 112.2(C-2'/2”)，120.1(C-6')，
120.2(C-6”)，134.7(C-1')，135.3 (C-1”)的重叠峰证明两组1,3,4-三取代芳香环都连接在C-6上。在HMBC谱图中，δH 3.69 (H-6)和δC 34.1(C-3)，39.4(C-4)，72.3(C-5)的交叉峰表明二-(4-羟基-3甲氧基苯基) 亚甲基和丁内酯基团的连接方式是C-4～C-6。根据核磁的详细数据进行分析对比，目标化合 物与化合物uriticol(Wang et al.2008)相比，仅少了一个羟甲基。因此，可以判定目标化合 物的平面结构为4-[二-(4-羟基-3甲氧基苯基)亚甲基]丁内酯。
3.69(1H,d,12.0,H-6),两 个甲氧基δH 3.75(6H,s,overlap,3'/3”-OCH3)；碳谱(附图5和6)和DEPT135谱图(附图7) 显示有19个C，包括一个羰基碳δC 177.3,12个芳香碳δC 112.2-
147.9，两个亚甲基碳δC 72.3和 34.1，两个次甲基碳δC 53.8和39.4，两个甲氧基碳δC 56.1(overlapped)。二维谱1H-1H COSY 相关性H-3/H-4/H-5以及HMBC中δH 2.42/2.18(H-3)和
4.15/3.84(H-5)的重叠峰对应δC 177.3 (C-2)，δH 2.42/2.18(H-3)对应δc 72.3(C-5)表明存在一个丁内酯基团。在HMBC谱图中， δH 3.69(H-6)和δC 112.2(C-2'/2”)，120.1(C-6')，
120.2(C-6”)，134.7(C-1')，135.3 (C-1”)的重叠峰证明两组1,3,4-三取代芳香环都连接在C-6上。在HMBC谱图中，δH 3.69 (H-6)和δC 34.1(C-3)，39.4(C-4)，72.3(C-5)的交叉峰表明二-(4-羟基-3甲氧基苯基) 亚甲基和丁内酯基团的连接方式是C-4～C-6。根据核磁的详细数据进行分析对比，目标化合 物与化合物uriticol(Wang et al.2008)相比，仅少了一个羟甲基。因此，可以判定目标化合 物的平面结构为4-[二-(4-羟基-3甲氧基苯基)亚甲基]丁内酯。
[0062] 上述化合物1H-1H COSY的结果如附图8所示，HSQC的结果如附图9所示，HMBC的 结果如附图10所示。
[0063] 2)ECD计算分析：
[0064] 为了进一步确定化合物的绝对构型，在mPW1PW91/6-311G*(IEFPCM)理论水平上进 行了ECD计算(TDDFT)。根据吉布斯自由能计算出的ECD数据得出波尔曼兹平均值。使 用软件SpecDis v1.71模拟ECD曲线，sigma/gamma值为0.35eV(Bruhn et al.2013.Chirality. 25:243-249)。通过ECD曲线(蓝移21nm)计算得到的其绝对构型4S与试验光谱图(如附 图1所示)一致。所有DFT计算均使用Gaussian 09软件包完成(Frisch et al.2016)。
[0065] 3)目标化合物结构：
[0067]
[0068] 实施例3：生物活性测定
[0069] 使用目标化合物Noreucol A采用细胞活力检测试剂盒(CCK-8法)进行神经保护活性测 定，具体步骤如下：
[0070] 1)将H-22细胞以密度为1000细胞/平板接种至96孔板中，在5％CO2和37℃环境下， 于DMEM培养基中培养24小时。
[0071] 2)将目标化合物通过无血清培养基连续稀释为从50μM到1.25μM浓度的试验样品， 使其终浓度依次为50μM，25μM，10μM，5μM，2.5μM和1.25μM，DMF以同样 的方法制备成阳性对照样品。在每个孔中分别添加配好的不同浓度的测试化合物， 不添加测试化合物的为空白对照组。
[0072] 3)给药2h后，各孔加入L-谷氨酸单钠盐(5mM)进行处理，然后后培养24h。
[0073] 4)培养结束后，各孔加入10μL CCK-8溶液(Beyotime，China，0.5mg/mL in PBS)于 37℃处理2h，通过酶标仪(型号为BioTek,USA)测定在450nm波长处的吸光度， 得到的生物活性数据如下表2所示：
[0074] 表2.化合物生物活性数据
[0075]
[0076] #P<0.001与对照组(不加谷氨酸处理)进行比较(细胞活性为100％)；*P<0.05与谷 氨酸处理组(GLU)进行比较。
[0077] 神经保护活性实验结果：目标化合物测试表明其对谷氨酸诱导的H-22细胞损伤有保护作 用。附图11为Noreucol A与阳性对照DMF和空白对照对HT-22细胞活力的影响对照结果， 其中，所有数值均以均数±标准差(SD)表示(n＝3)，与空白对照组(GLU)比较，P<0.05， 说明存在显著差异。结合上表2的活性数据与附图11的统计结果可以看出，与阳性对照组 (DMF)和空白对照(GLU)相对比，Noreucol A具有中等程度的神经保护作用，因此可以 用于制备治疗神经损伤性疾病的药物制剂中，具有良好的应用前景。
[0078] 综上所述，本发明提供的目标化合物Noreucol A是首次在杜仲中进行提取和分离的新的 木脂素类化合物，该化合物结构新颖，且具有神经保护活性，在预防和治疗神经损伤性疾病 领域有良好的应用前景。
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