基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法及基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的应用
阅读：1026发布：2020-07-27
专利汇可以提供基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法及基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于天然蛋白 页岩 的纳米 给药 系统的制备方法，以无定型天然蛋白页岩为原材料，采用超声乳化 溶剂 挥发和梯度离心相结合的方法制备蛋白页岩纳米粒，蛋白页岩纳米粒基于疏 水 相互作用负载药物构成 肿瘤 靶向的纳米给药系统。以无定型天然蛋白页岩为 基础 材料制备纳米粒，相较于通常所采用的合成 二 氧 化 硅 而言，可以减少基于结晶型存在形式而产生的细胞毒性，而且本方法操作简单方便，同时，由于蛋白页岩储存量丰富，所以本发明获得的纳米给药系统具有较高的操作性和经济效益。，下面是基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法及基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的应用专利的具体信息内容。
1.基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）称取蛋白页岩极细粉分散于油相中，搅拌，形成混悬液；
（2）将所述混悬液在搅拌的条件下逐滴加入水相中，以形成水包油的乳剂；
（3）迅速将所述乳剂倒入挥发水相中，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味，形成纳米粒溶液；
（4）所述纳米粒溶液经过第一次离心获得上清液以去除较大的粒子，将所述上清液再经过第二次离心以获得沉淀的蛋白页岩纳米粒；
（5）将所述蛋白页岩纳米粒重悬于PBS 7.4溶液中，再加入药物，搅拌过夜以获得基于天然蛋白页岩的纳米给药系统。
2.根据权利要求1所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述蛋白页岩极细粉为天然的非结晶型的多孔蛋白页岩，所述蛋白页岩极细粉通过25目筛的筛选获得。
3.根据权利要求1所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述油相为乙酸乙酯或二氯甲烷，所述油相的量为1-2 mL。
4.根据权利要求1所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中所述水相为2.5%-5%的聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，所述水相的量为2-4 mL。
5.根据权利要求1所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，其特征在于：
步骤（3）中所述挥发水相为0.01%-0.3%的聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，所述挥发水相的量为50-100 mL。
6.根据权利要求1所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，其特征在于：
步骤（4）中所述第一次离心的离心速度为3000-8000 rpm，时间为10 min，第二次离心的离心速度为13000-28000 rpm，时间为20 min。
7.根据权利要求1所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，其特征在于：
步骤（5）中所述药物为阿霉素、IR780、紫杉醇中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，其特征在于:
所述阿霉素为三乙胺部分脱盐后的产物，在脱盐过程中盐酸阿霉素和三乙胺的摩尔比为1:
10-1:25，所述蛋白页岩纳米粒与阿霉素的投料量比为1:0.02-1:0.1，蛋白页岩纳米粒和IR780的投料量比为1:0.005-1:0.05。
9.根据权利要求1-8任意一种基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法所制备的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统，在制备靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞的制剂中的用途。
基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法及基于天然蛋
白页岩的纳米给药系统的应用
技术领域
[0001] 本发明属于纳米医药技术领域，具体涉及一种基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法及这种给药系统的应用。
背景技术
[0002] 从传统药剂到缓控释制剂，再到新型智能化药物传递系统，新材料的开发和新技术的应用已经成为药物传递系统研究最热门的切入点。其中，介孔材料由于其特殊的性质脱颖而出。比如，较大的比表面积，规则的孔道结构，较好的热稳定性，易于修饰的表面等，这就使得介孔材料成为了良好的药物传递载体。其中，介孔二氧化硅是研究的热点。但是，目前研究中的介孔二氧化硅药物载体大多为化学合成法制备，主要为结晶型存在形式，其在体内降解和毒性等一些问题限制了进一步的应用和转化。
[0003] 天然蛋白页岩主要成分为非结晶型的含水二氧化硅，主要产地为中国黑龙江嫩江地区。结构分析表明，蛋白页岩具有许多优良的性质，比如无定型的存在形式、介孔结构、较大的比表面积等，同时，其具有优良的吸附性能，因此具有成为药物传递系统的潜能。同时，由于其储存量较丰富，因此具有较高的经济效益。但是，蛋白页岩作为药物传递系统的可行性一直未被探索。
[0004] 化疗是目前治疗癌症常用的一种方式，如何通过药物传递系统提高化疗药在肿瘤部位的蓄积是研究热点。众所周知，药物传递系统在肿瘤部位的蓄积首先取决于实体肿瘤的渗透和滞留增强效应。通常而言，粒径为100-300纳米(nm)之间的纳米粒在肿瘤部位有较好的蓄积。
[0005] 选用蛋白页岩作为纳米给药系统载体的来源，利用超声乳化溶剂挥发和梯度离心相结合的技术制备纳米药物递送载体，有望克服合成二氧化硅本身的缺点，成为天然纳米给药系统。
[0006] 本项目发明的目的是针对现有的以合成介孔二氧化硅为载体的纳米给药系统存在的不足，如结晶型存在形式带来的细胞毒性，提出一种新颖的二氧化硅纳米给药系统及其制备方法，即基于无定型天然蛋白页岩的肿瘤靶向纳米给药系统及其制备方法。
发明内容
[0007] 本发明目的是提供一种基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法和该系统的应用，解决上述问题。
[0008] 本发明的技术方案是：基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，该方法包括如下步骤：
（1）称取蛋白页岩极细粉分散于油相中，搅拌，形成混悬液；
（2）将所述混悬液在搅拌的条件下逐滴加入水相中，以形成水包油的乳剂；
（3）迅速将所述乳剂倒入挥发水相中，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味，形成纳米粒溶液；
（4）所述纳米粒溶液经过第一次离心获得上清液以去除较大的粒子，将所述上清液再经过第二次离心以获得沉淀的蛋白页岩纳米粒；
（5）将所述蛋白页岩纳米粒重悬于PBS 7.4溶液中，再加入药物，搅拌过夜以获得基于天然蛋白页岩的纳米给药系统。
（1）称取蛋白页岩极细粉分散于油相中，搅拌，形成混悬液；
（2）将所述混悬液在搅拌的条件下逐滴加入水相中，以形成水包油的乳剂；
（3）迅速将所述乳剂倒入挥发水相中，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味，形成纳米粒溶液；
（4）所述纳米粒溶液经过第一次离心获得上清液以去除较大的粒子，将所述上清液再经过第二次离心以获得沉淀的蛋白页岩纳米粒；
（5）将所述蛋白页岩纳米粒重悬于PBS 7.4溶液中，再加入药物，搅拌过夜以获得基于天然蛋白页岩的纳米给药系统。
[0009] 进一步的，步骤（1）中所述蛋白页岩极细粉为天然的非结晶型的多孔蛋白页岩，所述蛋白页岩极细粉通过25目筛的筛选获得。
[0010] 进一步的，步骤（1）中所述油相为乙酸乙酯或二氯甲烷，所述油相的量为1-2 mL。
[0011] 进一步的，步骤（2）中所述水相为2.5%-5%的聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，所述水相的量为2-4 mL。
[0012] 进一步的，步骤（3）中所述挥发水相为0.01%-0.3%的聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，所述挥发水相的量为50-100 mL。
[0013] 进一步的，步骤（4）中所述第一次离心的离心速度为3000-8000 rpm，时间为10 min，第二次离心的离心速度为13000-28000 rpm，时间为20 min。
[0014] 进一步的，步骤（5）中所述药物为阿霉素、IR780、紫杉醇中的任意一种。
[0015] 进一步的，所述阿霉素为三乙胺部分脱盐后的产物，在脱盐过程中盐酸阿霉素和三乙胺的摩尔比为1:10-1:25，所述蛋白页岩纳米粒与阿霉素的投料量比为1:0.02-1:0.1，蛋白页岩纳米粒和IR780的投料量比为1:0.005-1:0.05。
[0016] 本发明还提供一种基于天然蛋白页岩的纳米给药系统在制备靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞的制剂中的用途。
[0017] 本发明提供了一种基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，其优点是：以无定型天然蛋白页岩为基础材料制备纳米粒，相较于通常所采用的合成二氧化硅而言，可以减少基于结晶型存在形式而产生的细胞毒性，而且本方法操作简单方便，同时，由于蛋白页岩储存量丰富，所以本发明获得的纳米给药系统具有较高的操作性和经济效益。附图说明
[0018] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，图1为X射线荧光光谱表征蛋白页岩的元素组成图；
图2为X射线荧光光谱表征蛋白页岩的化合物组成图；
图3为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法流程图；
图4为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法中通过动态光散射法表征不同离心速度下获得的蛋白页岩纳米粒的粒径图；
图5为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法所制备的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统通过透射电镜表征外观形态图；
图6为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法所制备的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统通过动态光散射法表征纳米给药载体的粒径图；
图7为通过透射电镜表征外观形态—合成介孔二氧化硅图；
图8为MTT实验表征蛋白页岩纳米粒和合成介孔二氧化硅的毒性区别图；
图9为小角散射表征蛋白页岩纳米粒和合成介孔二氧化硅的存在形式图；
图10为蛋白页岩载阿霉素的模式图及透射电镜表征载阿霉素蛋白页岩的外观形态图；
图11为荧光分光光度计表征载阿霉素蛋白页岩纳米粒的体外释放行为图；
图12为MTT实验表征蛋白页岩纳米粒和载阿霉素蛋白页岩纳米粒的毒性区别图；
图13为MTT实验表征游离阿霉素和载阿霉素蛋白页岩纳米粒的毒性区别图；
图14为流式细胞仪定量表征游离阿霉素和载阿霉素蛋白页岩纳米粒在肿瘤细胞上的摄取图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL；
图15为共聚焦荧光显微镜定性表征游离阿霉素和载阿霉素蛋白页岩纳米粒在肿瘤细胞上的摄取图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL，标尺：100 μm；
图16为共聚焦荧光显微镜考察纳米给药系统在肿瘤细胞内的定位情况图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL，标尺：25 μm；
图17为共聚焦荧光显微镜考察纳米给药系统进入肿瘤细胞的行为路线图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL，标尺：25 μm；
图18 为游离IR780和载IR780蛋白页岩纳米粒在正常小鼠体内24 h各器官的生物分布图，其中，IR780的剂量每kg小鼠0.75 mg。
图2为X射线荧光光谱表征蛋白页岩的化合物组成图；
图3为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法流程图；
图4为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法中通过动态光散射法表征不同离心速度下获得的蛋白页岩纳米粒的粒径图；
图5为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法所制备的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统通过透射电镜表征外观形态图；
图6为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法所制备的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统通过动态光散射法表征纳米给药载体的粒径图；
图7为通过透射电镜表征外观形态—合成介孔二氧化硅图；
图8为MTT实验表征蛋白页岩纳米粒和合成介孔二氧化硅的毒性区别图；
图9为小角散射表征蛋白页岩纳米粒和合成介孔二氧化硅的存在形式图；
图10为蛋白页岩载阿霉素的模式图及透射电镜表征载阿霉素蛋白页岩的外观形态图；
图11为荧光分光光度计表征载阿霉素蛋白页岩纳米粒的体外释放行为图；
图12为MTT实验表征蛋白页岩纳米粒和载阿霉素蛋白页岩纳米粒的毒性区别图；
图13为MTT实验表征游离阿霉素和载阿霉素蛋白页岩纳米粒的毒性区别图；
图14为流式细胞仪定量表征游离阿霉素和载阿霉素蛋白页岩纳米粒在肿瘤细胞上的摄取图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL；
图15为共聚焦荧光显微镜定性表征游离阿霉素和载阿霉素蛋白页岩纳米粒在肿瘤细胞上的摄取图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL，标尺：100 μm；
图16为共聚焦荧光显微镜考察纳米给药系统在肿瘤细胞内的定位情况图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL，标尺：25 μm；
图17为共聚焦荧光显微镜考察纳米给药系统进入肿瘤细胞的行为路线图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL，标尺：25 μm；
图18 为游离IR780和载IR780蛋白页岩纳米粒在正常小鼠体内24 h各器官的生物分布图，其中，IR780的剂量每kg小鼠0.75 mg。
具体实施方式
[0019] 本发明提供一种基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，以无定型天然蛋白页岩为原材料，采用超声乳化溶剂挥发和梯度离心相结合的方法制备蛋白页岩纳米粒，蛋白页岩纳米粒基于疏水相互作用负载药物构成纳米给药系统。其利用实体肿瘤的渗透和滞留增强效应，采用梯度离心的方法获得粒径大小符合100-300 nm之间的蛋白页岩纳米粒，从而达到使药物蓄积于肿瘤部位的目的，不仅可以克服基于合成二氧化硅产生的毒性，而且提供了一种更加具有经济效益的药物载体。
[0020] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。
[0021] 步骤一：称取蛋白页岩极细粉分散于油相中，搅拌，形成混悬液。
[0022] 具体的，以天然的非结晶型的多孔蛋白页岩为原料分散于1-2 mL的乙酸乙酯或二氯甲烷中。这种多孔蛋白页岩产于中国黑龙江省嫩江地区，通过机械粉碎获得极细粉，其主要成分为非结晶型的二氧化硅。
[0023] 步骤二：将所述混悬液在搅拌的条件下逐滴加入水相中，以形成水包油的乳剂。
[0024] 具体的，将所述混悬液在搅拌的条件下逐滴加入2-4 mL的2.5%-5%的聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液中，以形成水包油的乳剂。
[0025] 步骤三：迅速将所述乳剂倒入挥发水相中，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味，形成纳米粒溶液。
[0026] 具体的，迅速将所述乳剂倒入50-100 mL的0.01%-0.3%的聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液中，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味，形成纳米粒溶液。
[0027] 步骤四：所述纳米粒溶液经过第一次离心获得上清液以去除较大的粒子，将所述上清液再经过第二次离心以获得沉淀的蛋白页岩纳米粒。
[0028] 具体的，按梯度离心法，所述纳米粒溶液经过10 min的离心速度为3000-8000 rpm的离心后获得上清液以去除较大的粒子，将所述上清液再经过20 min的离心速度为13000-28000 rpm的离心以获得沉淀的蛋白页岩纳米粒。
[0029] 步骤五：将所述蛋白页岩纳米粒重悬于PBS 7.4溶液中，再加入药物，搅拌过夜以获得基于天然蛋白页岩的纳米给药系统。
[0030] 具体的，将所述蛋白页岩纳米粒重悬于PBS 7.4溶液中，再加入阿霉素、IR780、紫杉醇中的任意一种，搅拌过夜以获得基于天然蛋白页岩的纳米给药系统。如果选用阿霉素，则阿霉素为三乙胺部分脱盐后的产物，在脱盐过程中盐酸阿霉素和三乙胺的摩尔比为1:10-1:25，所述蛋白页岩纳米粒与阿霉素的投料量比为1:0.02-1:0.1，如果选用IR780，则蛋白页岩纳米粒和IR780的投料量比为1:0.005-1:0.05。
[0031] 综上，本申请以无定型天然蛋白页岩为原材料，蛋白页岩经机械粉碎获得极细粉，以乙酸乙酯为油相，以聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯为表面活性剂，利用超声乳化溶剂挥发和梯度离心相结合的方法获得纳米粒，纳米粒基于疏水相互作用负载药物，构成天然纳米给药系统。
[0032] 上述方法所制得的天然纳米给药系统或相关原料具有下面的特性：请参阅图1，图1为X射线荧光光谱表征蛋白页岩的元素组成图。如图1所示，蛋白页岩中含量最丰富的元素为硅和氧。
[0033] 请参阅图2，图2为X射线荧光光谱表征蛋白页岩的化合物组成图。如图2所示，蛋白页岩中含量最丰富的化合物为二氧化硅。
[0034] 请参阅图3，图3为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法流程图。如图3所示，通过超声乳化溶剂挥发和梯度离心相结合的方法制备获得蛋白页岩纳米粒。
[0035] 请参阅图4，图4为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法中通过动态光散射法表征不同离心速度下获得的蛋白页岩纳米粒的粒径图。如图4所示，获得的蛋白页岩纳米粒的水合粒径随着离心速度的增大而减小，且都均一性较好。
[0036] 请参阅图6，图6为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法所制备的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统通过动态光散射法表征纳米给药载体的粒径图。如图6所示，蛋白页岩纳米粒的水合粒径为256.1 nm，且均一性较好。
[0037] 请参阅图17，图17为共聚焦荧光显微镜考察纳米给药系统进入肿瘤细胞的行为路线图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL，标尺：25 μm。如图17所示，载蛋白页岩纳米粒与细胞核膜具有亲和性，其在细胞核的分布可以增强阿霉素促进细胞凋亡的作用。
[0038] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
[0039] 首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0040] 其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。
[0041] 实施例1本实施案例展示一种基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，包括：
称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于1 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入2 mL 2.5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；
迅速将此乳剂倒入50 mL 0.01% 聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于1 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入2 mL 2.5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；
迅速将此乳剂倒入50 mL 0.01% 聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0042] 实施例2本实施案例展示一种基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，包括：
称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于1 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入2 mL 2.5% 聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入50 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于1 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入2 mL 2.5% 聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入50 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0043] 实施例3本实施案例展示一种基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，包括：
称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于2 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入4 mL 2.5% 聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入100 mL 0.01%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于2 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入4 mL 2.5% 聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入100 mL 0.01%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0044] 实施例4称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于2 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入4 mL 2.5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；
迅速将此乳剂倒入100 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
迅速将此乳剂倒入100 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0045] 实施例5称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于1 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入2 mL2.5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；
迅速将此乳剂倒入50 mL 0.01%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
迅速将此乳剂倒入50 mL 0.01%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0046] 实施例6称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于1 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入2 mL 2.5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；
迅速将此乳剂倒入50 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
迅速将此乳剂倒入50 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0047] 实施例7称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于2 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入4 mL 2.5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；
迅速将此乳剂倒入100 mL 0.01%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
迅速将此乳剂倒入100 mL 0.01%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0048] 实施例8称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于2 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入4 mL 2.5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；
迅速将此乳剂倒入100 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
迅速将此乳剂倒入100 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0049] 实施例9称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于1 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入2 mL 5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入50 mL 0.01%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0050] 实施例10称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于1 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入2 mL 5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入50 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0051] 实施例11称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于2 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入4 mL 5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入100 mL 0.01%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0052] 实施例12称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于2 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入4 mL5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入100 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过13000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0053] 实施例13称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于1 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入2 mL 5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入50 mL 0.01%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0054] 实施例14称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于1 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入2 mL 5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入50 mL 0.3% 聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0055] 实施例15称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于2 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入4 mL 5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入100 mL 0.01%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0056] 实施例16称取100 mg蛋白页岩极细粉分散于2 mL乙酸乙酯中，搅拌6小时；将此混悬液在搅拌条件下逐滴加入4 mL 5%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，以形成水包油的乳剂；迅速将此乳剂倒入100 mL 0.3%聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味。前述的纳米粒溶液首先经过不同速度（3000，4000，5000，6000，8000 rpm）离心
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
10 min获得上清以去除较大的粒子；上清再经过28000 rpm离心20 min以获得蛋白页岩纳米粒沉淀。将蛋白页岩纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析，同时通过冻干进行产量的测定。
[0057] 实施例17将5 mg蛋白页岩纳米粒重悬于PBS7.4中，加入0.1 mg DOX和0.6 μL三乙胺，搅拌过夜。
经过13000 rpm离心20 min以去除未包封的阿霉素。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的阿霉素提取出来，通过荧光分光光度计测定蛋白页岩纳米粒对阿霉素的包封率和载药量。
经过13000 rpm离心20 min以去除未包封的阿霉素。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的阿霉素提取出来，通过荧光分光光度计测定蛋白页岩纳米粒对阿霉素的包封率和载药量。
[0058] 实施例18将5 mg蛋白页岩纳米粒重悬于PBS7.4中，加入0.1 mg DOX和0.1μL 三乙胺，搅拌过夜。
经过13000 rpm离心20 min以去除未包封的阿霉素。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的阿霉素提取出来，通过荧光分光光度计测定蛋白页岩纳米粒对阿霉素的包封率和载药量。
经过13000 rpm离心20 min以去除未包封的阿霉素。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的阿霉素提取出来，通过荧光分光光度计测定蛋白页岩纳米粒对阿霉素的包封率和载药量。
[0059] 实施例19将5 mg蛋白页岩纳米粒重悬于PBS7.4中，加入0.25 mg DOX和1.5 μL 三乙胺，搅拌过夜。经过13000 rpm离心20 min以去除未包封的阿霉素。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的阿霉素提取出来，通过荧光分光光度计测定蛋白页岩纳米粒对阿霉素的包封率和载药量。
[0060] 实施例20将5 mg蛋白页岩纳米粒重悬于PBS7.4中，加入0.25 mg DOX和0.5 μL 三乙胺，搅拌过夜。经过13000 rpm离心20 min以去除未包封的阿霉素。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的阿霉素提取出来，通过荧光分光光度计测定蛋白页岩纳米粒对阿霉素的包封率和载药量。
[0061] 实施例21将5 mg蛋白页岩纳米粒重悬于PBS7.4中，加入0.5 mg DOX和3 μL三乙胺，搅拌过夜。经过13000 rpm离心20 min以去除未包封的阿霉素。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的阿霉素提取出来，通过荧光分光光度计测定蛋白页岩纳米粒对阿霉素的包封率和载药量。
[0062] 实施例22将5 mg蛋白页岩纳米粒重悬于PBS 7.4中，加入0.5 mg DOX和1 μL 三乙胺，搅拌过夜。
经过13000 rpm离心20 min以去除未包封的阿霉素。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的阿霉素提取出来，通过荧光分光光度计测定蛋白页岩纳米粒对阿霉素的包封率和载药量。
经过13000 rpm离心20 min以去除未包封的阿霉素。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的阿霉素提取出来，通过荧光分光光度计测定蛋白页岩纳米粒对阿霉素的包封率和载药量。
[0063] 实施例23将10 mg蛋白页岩纳米粒重悬于PBS7.4中，加入0.05 mg IR780，搅拌4 h，以获得载IR780的蛋白页岩纳米粒。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的IR780提取出来，通过全波长酶标仪测定蛋白页岩纳米粒对IR780的包封率和载药量。
[0064] 实施例24将10 mg蛋白页岩纳米粒重悬于PBS 7.4中，加入0.1 mg IR780，搅拌4 h，以获得载IR780的蛋白页岩纳米粒。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的IR780提取出来，通过全波长酶标仪测定蛋白页岩纳米粒对IR780的包封率和载药量。
[0065] 实施例25将10 mg蛋白页岩纳米粒重悬于PBS 7.4中，加入0.5 mg IR780，搅拌4 h，以获得载IR780的蛋白页岩纳米粒。通过DMSO将负载进蛋白页岩纳米粒中的IR780提取出来，通过全波长酶标仪测定蛋白页岩纳米粒对IR780的包封率和载药量。
[0066] 实施例26将0.5 g十六烷基三甲基溴化铵和0.16 g三乙醇胺溶于20 mL去离子水中，95度油浴加热1 h，逐滴加入1.5 mL正硅酸乙酯，继续反应1 h。反应溶液冷却至室温，经过9000 rpm离心10 min，获得合成二氧化硅纳米粒沉淀。沉淀首先经过95%乙醇洗涤三次，再将沉淀重悬于37%盐酸和95%乙醇1:1的混合溶液中，冰浴超声30 min，冰浴过程重复三次。获得的沉淀再次用95%乙醇洗涤三次以获得纯化的合成二氧化硅纳米粒。该实施例结论为通过本合成方案成功合成介孔二氧化硅。
[0067] 实施例27采用透射电镜技术对基于天然蛋白页岩的纳米给药载体、基于化学合成法的合成介孔二氧化硅以及基于天然蛋白页岩的载阿霉素纳米给药系统的表面形态性质进行表征。该实施例结论请参阅图5、7和10，图5为本发明所述的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法所制备的基于天然蛋白页岩的纳米给药系统通过透射电镜表征外观形态图，图7为通过透射电镜表征外观形态—合成介孔二氧化硅图，图10为蛋白页岩载阿霉素的模式图及透射电镜表征载阿霉素蛋白页岩的外观形态图。如图5所示，蛋白页岩纳米粒的粒径在50 nm左右。如图7所示，合成介孔二氧化硅的粒径在50 nm左右。如图10所示，当阿霉素负载进蛋白页岩纳米粒后，阿霉素主要分布在蛋白页岩纳米的介孔结构中。
[0068] 实施例28为了评价基于天然蛋白页岩的载阿霉素纳米给药系统在体外生理条件下释放药物的能力，遂采用透析法考察药物释放。将新鲜制备的4.75 mg蛋白页岩纳米粒和0.285 mg盐酸阿霉素分散于PBS 7.4溶液中，在1.7 μL三乙胺存在的条件下搅拌过夜。然后将混悬液置于截留分子量为3500 D的透析袋中，以100 mL PBS为释放介质。在不同的时间点，以1 mL新鲜的PBS代替释放介质。采用荧光分光光度计进行释药行为的考察。同时以相同量的游离阿霉素置于截留分子量为3500 D的透析袋中，以100 mL PBS7.4为释放介质进行释药考察。该实施例结论请参阅图11，图11为荧光分光光度计表征载阿霉素蛋白页岩纳米粒的体外释放行为图。如图11所示，游离阿霉素在6 h左右完全释放，载阿霉素蛋白页岩纳米粒的阿霉素释放明显减缓，48 h时，阿霉素的释放达46.8%。
[0069] 实施例29为了评价空白蛋白页岩纳米粒对肿瘤细胞的毒性，采用Cell Counting Kit-8 (CCK-
8)评价细胞存活率。将MCF-7细胞7.5×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24 h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。细胞在不同浓度的蛋白页岩纳米粒存在的条件下孵育24 h，同时以相同浓度的合成介孔二氧化硅为对照。然后采用CCK-8评价细胞的存活率。该实施例结论请参阅图8，图8为MTT实验表征蛋白页岩纳米粒和合成介孔二氧化硅的毒性区别图。如图8所示，当蛋白页岩纳米粒浓度小于62.5 μg/mL时,细胞活性大于85%，当合成介孔介孔二氧化硅浓度为62.5 μg/mL，细胞活性约为25%，所以蛋白页岩纳米粒具有良好的生物相容性实施例30
采用小角散射技术对基于天然蛋白页岩的纳米给药载体和基于化学合成法的合成介孔二氧化硅的存在形式进行表征。该实施例结论请参阅图9，图9为小角散射表征蛋白页岩纳米粒和合成介孔二氧化硅的存在形式图。如图9所示，蛋白页岩纳米粒为无定型存在形式，合成介孔二氧化硅为结晶型存在形式。
8)评价细胞存活率。将MCF-7细胞7.5×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24 h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。细胞在不同浓度的蛋白页岩纳米粒存在的条件下孵育24 h，同时以相同浓度的合成介孔二氧化硅为对照。然后采用CCK-8评价细胞的存活率。该实施例结论请参阅图8，图8为MTT实验表征蛋白页岩纳米粒和合成介孔二氧化硅的毒性区别图。如图8所示，当蛋白页岩纳米粒浓度小于62.5 μg/mL时,细胞活性大于85%，当合成介孔介孔二氧化硅浓度为62.5 μg/mL，细胞活性约为25%，所以蛋白页岩纳米粒具有良好的生物相容性实施例30
采用小角散射技术对基于天然蛋白页岩的纳米给药载体和基于化学合成法的合成介孔二氧化硅的存在形式进行表征。该实施例结论请参阅图9，图9为小角散射表征蛋白页岩纳米粒和合成介孔二氧化硅的存在形式图。如图9所示，蛋白页岩纳米粒为无定型存在形式，合成介孔二氧化硅为结晶型存在形式。
[0070] 实施例31为了评价载阿霉素蛋白页岩纳米粒对肿瘤细胞的毒性，将MCF-7细胞以7.5×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24 h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。细胞在不同浓度的载阿霉素蛋白页岩纳米粒存在的条件下孵育24 h，同时以游离盐酸阿霉素和空白蛋白页岩纳米粒为对照，这二者的浓度分别与载阿霉素蛋白页岩纳米粒中的阿霉素和蛋白页岩纳米粒的浓度一致。然后采用CCK-8评价细胞的存活率。实施例结论为请参阅图12和图13，图12为MTT实验表征蛋白页岩纳米粒和载阿霉素的蛋白页岩纳米粒的毒性区别图，图13为MTT实验表征游离阿霉素和载阿霉素的蛋白页岩纳米粒的毒性区别图。如图12所示，载阿霉素蛋白页岩纳米粒的毒性显著性大于空白蛋白页岩纳米粒。如图13所示，载阿霉素蛋白页岩纳米粒的毒性显著性大于游离阿霉素。
[0071] 实施例32为了定量评价纳米给药系统在体外进入肿瘤细胞的能力，以盐酸阿霉素作为模式药物进行考察。将MCF-7细胞以1×105细胞/孔的密度培养在6孔板中，48 h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态，分别加入游离阿霉素和载阿霉素的蛋白页岩纳米粒，孵育2 h，剂量以阿霉素计，每孔12 μg，1 mL。采用流式细胞仪考察各组的摄取情况。实施例结论请参阅图
14，图14为流式细胞仪定量表征游离阿霉素和载阿霉素蛋白页岩纳米粒在肿瘤细胞上的摄取图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL。如图14所示，载阿霉素蛋白页岩纳米粒的细胞摄取强于游离阿霉素。
14，图14为流式细胞仪定量表征游离阿霉素和载阿霉素蛋白页岩纳米粒在肿瘤细胞上的摄取图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL。如图14所示，载阿霉素蛋白页岩纳米粒的细胞摄取强于游离阿霉素。
[0072] 实施例33为了定性评价纳米给药系统在体外进入肿瘤细胞的能力，以盐酸阿霉素作为模式药物进行考察。将MCF-7细胞接种于33-mmφ20mm玻底培养皿中，48h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态，分别加入游离阿霉素和载阿霉素的蛋白页岩纳米粒，孵育2 h，剂量以阿霉素计，每个玻底培养皿12 μg，1mL。采用共聚焦荧光显微镜观察各组的摄取情况。实施例结论请参阅图15，图15为共聚焦荧光显微镜定性表征游离阿霉素和载阿霉素蛋白页岩纳米粒在肿瘤细胞上的摄取图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL，标尺：100 μm。如图15所示，载阿霉素蛋白页岩纳米粒的细胞摄取强于游离阿霉素。
[0073] 实施例34为了评价纳米给药系统在肿瘤细胞的胞内行为，以盐酸阿霉素作为模式药物进行考察。将MCF-7细胞接种于33-mmφ20mm玻底培养皿，48 h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态，分别采用DiD、LysoTracker Green DND-26、Mito-Tracker Green和and Hoechst 33342来标记细胞膜、溶酶体、线粒体和细胞核。然后加入载阿霉素的蛋白页岩纳米粒，孵育2 h，剂量以盐酸阿霉素计，每个玻底培养皿12 μg，1mL。采用共聚焦荧光显微镜观察给药系统的胞内行为。实施例结论请参阅图16和图17，图16为共聚焦荧光显微镜考察纳米给药系统在肿瘤细胞内的定位情况图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL，标尺：25 μm；图17为共聚焦荧光显微镜考察纳米给药系统进入肿瘤细胞的行为路线图，其中，阿霉素的浓度为12 μg/mL，标尺：25 μm。如图16和图17所示，蛋白页岩纳米粒可与细胞膜结合，通过吸附介导的内吞进入细胞，通过溶酶体在细胞内进行递送，且不会进入线粒体。
[0074] 实施例35全波长酶标仪表征纳米给药系统在健康ICR小鼠的生物分布。分别尾静脉注射载IR780的纳米载药系统和游离IR780于健康ICR小鼠，剂量以IR780计，0.75 mg IR780每kg小鼠。24 h后，处死小鼠，取20毫克小鼠组织浸润180 μL DMSO提取IR780，采用全波长酶标仪表征纳米给药系统或游离药物的生物分布情况。请参阅图18，图18为游离IR780和载IR780蛋白页岩纳米粒在正常小鼠体内24 h各器官的生物分布图，其中，IR780的剂量每kg小鼠0.75 mg。
如图18所示，持续的肾排泄可以提高蛋白页岩纳米粒在肝脏中的浓度。
如图18所示，持续的肾排泄可以提高蛋白页岩纳米粒在肝脏中的浓度。
[0075] 综上所述，本发明公开了一种基于天然蛋白页岩的纳米给药系统的制备方法，以无定型天然蛋白页岩为基础材料制备纳米粒，相较于通常所采用的合成二氧化硅而言，可以减少基于结晶型存在形式而产生的细胞毒性，而且本方法操作简单方便，同时，由于蛋白页岩储存量丰富，所以本发明获得的纳米给药系统具有较高的操作性和经济效益。
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