单倍体诱导系 |
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| 申请号 | CN201580061712.7 | 申请日 | 2015-11-12 | 公开(公告)号 | CN107223155A | 公开(公告)日 | 2017-09-29 |
| 申请人 | KWS种子欧洲股份公司; | 发明人 | C·博尔杜安; M·克洛伊贝尔-迈茨; M·尼森; M·奥祖诺娃; F·韦尔特迈尔; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及提供技术工具例如核酸，其在 植物 中转录后或翻译后，适于介导单倍体诱导系的特性或适于增加单倍体诱导系的诱导能 力 ，还涉及用于产生和鉴定非转基因和转基因植物单倍体诱导系的方法和用途，以及涉及已有植物单倍体诱导系的改良。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种核酸，其在植物中转录后或翻译后，适于介导单倍体诱导系的特性或适于增加单倍体诱导系的诱导能力，特征在于所述核酸包含核苷酸序列，其 |
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| 说明书全文 | 单倍体诱导系发明领域 [0001] 本发明涉及通过分子生物学方法和标记技术和遗传工程修饰植物的领域。其涉及提供技术工具例如核酸和载体，以及涉及方法和用途，用于产生和鉴定非转基因和转基因植物单倍体诱导系(haploid inducer)，以及改良已有的植物单倍体诱导系。 [0002] 发明背景 [0003] 一般而言，在杂交植物生产中，作为亲本的两个育种系相互杂交，由于已知的杂种优势效应，其后代部分地产生相对于亲本系而言强烈增加的产量。所述育种系可以通过多个自交步骤获得，然而其需要进行多代并因此涉及巨大的时间成本。现代植物育种许多年以前已经越来越多地转变为经由单倍体诱导以及随后的染色体加倍在短得多的时间量内生成育种系。对此的一技术需求是有用的单倍体诱导系统，其同时也提供足够的高效以经济上可用。 [0004] 例如，对于玉米(Zea mays)，已知母体体内诱导系统，其中待诱导的植物用诱导系的花粉授粉。然后由此生成的后代的多达10％仅仅含有种子亲本的简单(单倍体)染色体组。现在可获得用于玉米杂交育种的少数几个这样的诱导系。然而，这些全部都归因于Coe,1959描述的单一系“Stock 6”。这样的已知的诱导系的一个实例是RWS( et al., 2005)系。在过去，在这些品系上进行了多项QTL研究以鉴别诱导系相关基因座。Deimling等在1997年已经鉴定到玉米种染色体1的主要QTL(bin 1.04)。Barret et al.2008更精确的定位于染色体1上66.96MB和68.11MB之间的范围，Prigge et al.2012更精确的定位于 62.9MB和70.8MB之间的范围，和随后Dong et al.2013更精确的定位于68.18MB和68.43MB之间的范围，其根据公开注释含有三个基因。全部位置信息指的是B73参考基因组，AGPv02版本。Dong et al.2014实现5％的诱导率似乎已经证明该基因座其自身的功能性。然而，不能排除错误的精细定位，因为由于缺乏轮回亲本中侧翼标记的信息，不可能明确地对所述QTL进行划界。 [0005] 此外，WO 2012/030893公开了玉米中染色体1上诱导系相关基因座，然而，其与前述基因座显著不同并且更具体地定位于端粒处。在所考虑的基因组区域中没有重叠。 [0006] 总的而言，从“Stock 6”获得的玉米品系中体内单倍体诱导的分子和发育特异性机制至今很大程度是未知的。例如可以考虑，发生受精，但是随后其导致染色体消除，然后允许产生单倍体后代。例如，Ravi&Chan(2010)已经描述了在具有组蛋白CenH3的系统中的此类机制。然而，在另一方面，受精也可失败，在三倍体胚乳中出现单倍体卵细胞的发育。如果不了解来自“Stock 6”的诱导系基因型背后的母体体内单倍体诱导基因和所负责的基因的知识，该玉米诱导系的定向改良或所述诱导基因向非诱导系基因型的转移，或在玉米非诱导系中体内单倍体诱导能力的定向处理实际上是不可能的。 [0007] 此外，对于一些栽培植物，根本没有已知的高效(且因此是经济的)可用的系统用于产生单倍体和双-单倍体植物，例如高粱、黑麦或向日葵。 [0008] 有需要提供遗传元件如基因或调控元件，其在转基因和/或非转基因方法中可用以允许通过体内诱导的单倍体开发，或改善单倍体开发的效率。 [0009] 发明概述 [0010] 针对上文所述的现有技术的背景获得本发明，其中本发明的目的是提供工具和方法，其可用于产生体内单倍体诱导系和/或提供单倍体植物。 [0011] 根据本发明，所述目的通过这样的核酸实现，所述核酸在植物中转录或表达后，适于介导单倍体诱导系的特性或适于增加单倍体诱导系的诱导能力。根据本发明的所述核酸可以作为转基因使用。在另一方面，与本发明的所述核酸之一相同的植物基因组中或植物单倍体诱导系基因组中的内源DNA序列也可以被修饰，使得在所述内源DNA序列转录或表达后，单倍体诱导系的特性被介导或单倍体诱导系的诱导能力被增加。本发明的核酸优选是分离的核酸，其提取自其天然或原始环境(遗传背景)。核酸可以是双链或单链的，且可以是线性或环状的。其因此可以是基因组DNA、合成的DNA、cDNA或RNA类型(如lncRNA、siRNA或miRNA)，其中RNA中存在核碱基尿嘧啶代替核碱基胸腺嘧啶。 [0012] 在本发明一优选实施方式中，本发明的核酸或所述核酸编码的RNA或所述核酸编码的蛋白或多肽，对植物中花粉管的生长、植物花粉的能量代谢和/或优选在生殖细胞(例如其发育成花粉)中的着丝粒的活性有影响。 [0013] 本发明的核酸的特征可在于，所述核酸或所述核酸编码的RNA或所述核酸编码的蛋白或多肽，适于或可用于与野生型植物的花粉相比加速或促进花粉管生长(例如，在植物花粉中)，其中本发明的核酸或所述核酸编码的RNA或所述核酸编码的蛋白或多肽如下文所描述使用。例如，本发明的核酸编码蛋白，其在植物花粉的花粉管中参与大分子的运输或影响该运输。属于这些的是例如SNAREv蛋白，其例如介导例如在花粉管顶端的果胶类或磷脂类的运输(Kato et al.,2010)。此外，磷脂酶类的酶——特别是磷脂酶A2或patatin磷脂酶——能够促进花粉管的生长(Kim et al.,2011)，而肌醇聚磷酸酯-5-磷酸酶类如肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶，可以抑制花粉管生长(Wang et al.,2012)。本发明的核酸可以用作转基因，用于加速花粉管生长的目的，其中其然后在植物或其部分中例如通过过表达方法，与野生型植物或其相应部分相比，增加花粉管生长促进基因的表达率或增加正调节(激活)花粉管生长促进基因或负调节(抑制)花粉管生长抑制基因的RNA如lncRNA的转录率，和/或在植物或其部分中通过RNAi方法或miRNA方法(Fire et al.,1998)，与野生型植物或其相应部分相比，减少花粉管生长抑制基因的表达率。在另一方面，植物基因组中或植物单倍体诱导系基因组中与本发明的核酸相同的内源DNA序列，或所述内源DNA序列的调控序列也可以被修饰，例如，通过诱变或“基因组编辑”。与未诱变的野生型植物相比，该修饰可以增加或减少植物中所述内源DNA序列的转录或表达率，或所述内源DNA序列编码的蛋白或多肽的活性或稳定性。例如，相比于未诱变的野生型植物或未经由“基因组编辑”修饰的野生型植物，植物中内源花粉管生长促进基因的表达率或正调节(激活)花粉管生长促进基因或负调节(抑制)花粉管生长抑制基因的内源RNA如lncRNA的转录率可以因此被增加，或者相比于未诱变的野生型植物或未经由“基因组编辑”修饰的野生型植物，植物中内源花粉管生长抑制基因的表达率或负调节(抑制)花粉管生长促进基因或正调节(激活)花粉管生长抑制基因的内源RNA如lncRNA的转录率可以因此被减少。此外，相比于未诱变的野生型植物或未经由“基因组编辑”修饰的野生型植物，植物中所述内源DNA序列编码的花粉管生长促进蛋白或多肽的活性或稳定性可以被增加，或者相比于未诱变的野生型植物或未经由“基因组编辑”修饰的野生型植物，植物中所述内源DNA序列编码的花粉管生长抑制蛋白或多肽的活性或稳定性可以被减少。 [0014] 在进一步的实例中，本发明的核酸可以表征为，通过使用所述核酸，或通过使用所述核酸编码的RNA，或通过使用所述核酸编码的蛋白或多肽，植物中花粉的能量代谢与野生型植物相比可以被负影响。例如，这可以通过磷酸甘油酸变位酶或线粒体转运蛋白或线粒体输入受体(mitochondrial import receptor)实现。出于该目的，本发明的核酸可以在过表达方法中、或在RNAi方法中、或在miRNA方法中用作转基因(Fire et al.,1998)。在另一方面，植物基因组中或植物单倍体诱导系基因组中与本发明的核酸相同的内源DNA序列，或所述内源DNA序列的调控序列也可以被修饰，例如，通过诱变或“基因组编辑”。与未诱变的野生型植物或未经由“基因组编辑”修饰的野生型植物相比，该修饰可以增加或减少植物中所述内源DNA序列的转录或表达率，或所述内源DNA序列编码的蛋白或多肽的活性或稳定性。 [0015] 在另一实例中，本发明的核酸还可以表征为，通过使用所述核酸或使用所述核酸编码的RNA或使用所述核酸编码的蛋白或多肽，植物中的着丝粒的活性与野生型相比被修饰(尤其是在早期胚胎发生中和优选在所述植物中发育成例如花粉的生殖细胞中)，其导致例如所述诱导系基因组的消除。着丝粒的活性可以通过DNA的染色质修饰或在组蛋白水平修饰，此外，还可以通过转录、RNA相互作用或RNA结合。例如，着丝粒的活性的改变可以通过甲基转移酶如RNA甲基转移酶实现。出于该目的，本发明的核酸用作转基因，其中它然后通过过表达方法相对于野生型植物增加植物中染色质修饰基因或正调节(激活)染色质修饰基因的RNA(如lncRNA)的表达率。在另一方面，植物基因组中或植物单倍体诱导系基因组中与本发明的核酸相同的内源DNA序列，或所述内源DNA序列的调控序列也可以被修饰，例如，通过诱变或“基因组编辑”。与未诱变的野生型植物或未经由“基因组编辑”修饰的野生型植物相比，该修饰可以增加或减少植物中所述内源DNA序列的转录或表达率，或所述内源DNA序列编码的蛋白或多肽的活性或稳定性。与未诱变的野生型植物或未经由“基因组编辑”修饰的野生型植物相比，植物中染色质修饰基因或正调节(激活)染色质修饰基因的RNA(如lncRNA)的表达率因此也可以被增加。此外，与未诱变的野生型植物或未经由“基因组编辑”修饰的野生型植物相比，植物中所述内源DNA序列编码的染色质修饰蛋白的活性或稳定性可以被增加。 [0016] 前面所述的本发明的核酸或所述核酸编码的RNA或所述核酸编码的蛋白或多肽的用途不是排他性的或限制性的，相反应该被理解为仅仅是示例。本领域技术人员从现有技术已知许多额外的技术手段和方法，通过所述技术手段和方法其可以实现上文所描述的本发明的核酸或相同的内源DNA序列的表达或转录率的改变，或上文所描述的有本发明的核酸或所述内源DNA序列编码的蛋白或多肽的稳定性和活性的改变。 [0017] 在本发明一特别优选的实施方案中，所述核酸，其在植物中转录后或翻译后，适于介导单倍体诱导系的特性或适于增加单倍体诱导系的诱导能力，所述核酸可以包含这样的核苷酸序列，其 [0018] (i)选自SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、42、43、46、47、49、50、52、53、55、56、57、58、59、60、61和/或62，或具有这些的功能性片段，或 [0019] (ii)与来自(i)的序列互补，或 [0020] (iii)与来自(i)的序列至少80％、82％、84％、86％、88％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，或特别优选地至少97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％相同，或 [0021] (iv)编码具有选自SEQ ID No:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、44、45、48、51、54、63、64和/或65的氨基酸序列的蛋白或所述蛋白的功能性部分，或 [0022] (v)编码根据(iv)的蛋白的同源物、类似物或直系同源物或其功能性部分，或 [0023] (vi)与来自(ii)的序列在严格条件下杂交。 [0024] 该核酸可以编码蛋白或其功能性部分，其中所述蛋白或其功能性部分具有SNARE蛋白(尤其SNAREv蛋白)、磷脂酶(尤其磷脂酶A2或patatin磷脂酶)、甲基转移酶(尤其RNA甲基转移酶)或线粒体输入受体的功能(见表1)。可以如上所述实现所述核酸的用途，即为了在植物中介导单倍体诱导系的特性或增加单倍体诱导系的诱导能力，例如，所述核酸的表达率或所编码的蛋白或所编码的蛋白部分的活性或稳定性被转基因地或内源地增加。由于该核酸或该核酸编码的RNA或该核酸编码的蛋白或多肽对植物的单倍体诱导能力有正作用，在下文中，此处所定义的核酸命名为诱导促进核酸。下文进一步公开所述诱导促进核酸以及包含所述诱导促进核酸的物质的额外的方法和用途。 [0025] 在本发明另一特别优选的实施方案中，所述核酸，其在植物中转录后或翻译后，适于介导单倍体诱导系的特性或适于增加单倍体诱导系的诱导能力，可以是包含这样的核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列 [0026] (i)具有选自SEQ ID No:26、27、28、29、30和/或31的序列或其功能性片段，或[0027] (ii)与来自(i)的序列互补，或 [0028] (iii)与来自(i)的序列至少80％、82％、84％、86％、88％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，或特别优选地至少97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％相同， [0029] (iv)编码具有选自SEQ ID No:32、33和/或34的氨基酸序列的蛋白或所述蛋白的功能性部分，或 [0030] (v)编码根据(iv)的蛋白的同源物、类似物或直系同源物或其功能性部分，或 [0031] (vi)与来自(ii)的序列在严格条件下杂交。 [0032] 这样的核酸可以编码蛋白或其功能性部分，其中所述蛋白或其功能性部分具有肌醇聚磷酸酯-5-磷酸酶(特别是肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶)或磷酸甘油酸变位酶的功能(见表1)。可以如上所述实现所述核酸的用途，即为了在植物中介导单倍体诱导系的特性或增加单倍体诱导系的诱导能力，例如，所述核酸的表达率或所编码的蛋白或所编码的蛋白部分的活性或稳定性被转基因地或内源地减少。由于该核酸或该核酸编码的RNA或该核酸编码的蛋白或多肽对植物的单倍体诱导能力有负作用，在下文中，此处所定义的核酸命名为诱导抑制核酸。下文进一步公开所述诱导抑制核酸以及包含所述诱导抑制核酸的物质的额外的方法和用途。 [0033] 在本发明另一特别优选的实施方案中，所述核酸，其在植物中转录后或翻译后，适于介导单倍体诱导系的特性或适于增加单倍体诱导系的诱导能力，其可以是这样的核酸，所述核酸编码具有双链部分的RNA，其中所述双链部分的至少一条链具有与以下核酸的编码序列中至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个，优选至少30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、或140个，和特别优选至少160、180、200、250、300、350、400、450、 500、600、700、800、900、或1000个连续核苷酸同源或相同的核苷酸序列： [0034] (i)具有有义或反义方向的选自SEQ ID No:26、27、28、29、30和/或31的序列或其功能性片段的核酸，或 [0035] (ii)与来自(i)的序列互补的核酸，或 [0036] (iii)与来自(i)的序列至少80％、82％、84％、86％、或88％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，或特别优选地至少97％、97.5％、98％、98.5％、99％或 99.5％相同的核酸，或 [0037] (iv)编码具有选自SEQ ID No:32、33和/或34的氨基酸序列的蛋白或所述蛋白的功能性部分的核酸，或 [0038] (v)编码根据(iv)的蛋白的同源物、类似物或直系同源物或其部分的核酸，或 [0039] (vi)与来自(ii)的序列在严格条件下杂交的核酸。在转录后基因沉默中，例如在RNAi方法和miRNA方法中所描述的(Fire et al.,1998)，这样的核酸可以用来抑制上文所述诱导抑制核酸的表达。dsRNA编码核酸也可以是编码长非编码RNA(lncRNA)的核酸。所述lncRNA核酸然后优选包含核苷酸序列，其 [0040] (a)具有选自SEQ ID No:35、36、37和/或38的序列或其片段，或 [0041] (b)与来自(a)的序列互补，或 [0042] (c)与来自(a)的序列至少80％、82％、84％、86％或88％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，或特别优选地至少97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％相同，或 [0043] (d)编码具有SEQ ID No:40或41的氨基酸序列的多肽或所述多肽的部分，或 [0044] (e)与来自(b)的序列在严格条件下杂交。该lncRNA，以下命名为lncRNA 1，可用于肌醇聚磷酸酯-5-磷酸酶例如肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶的表达或翻译调控。此外，所述lncRNA编码核酸可以优选包含核苷酸序列，其 [0045] (w)具有选自SEQ ID No:39的序列或其片段，或 [0046] (x)与来自(w)的序列互补，或 [0047] (y)与来自(w)的序列至少80％、82％、84％、86％或88％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，或特别优选地至少97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％相同，或 [0048] (z)与来自(x)的序列在严格条件下杂交。该lncRNA，以下命名为lncRNA 2，可用于磷脂酶尤其是磷脂酶A2或patatin磷脂酶的表达或翻译调控。 [0049] 在本发明另一特别优选的实施方案中，所述核酸，其在植物中转录后或翻译后，适于介导单倍体诱导系的特性或适于增加单倍体诱导系的诱导能力，其可以是这样的核酸，所述核酸编码具有双链部分的RNA，其中所述双链部分的至少一条链具有与以下核酸的内含子序列中至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个，优选至少30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、或140个，和特别优选至少160、180、200、250、300、350、400、450、 500、600、700、800、900、或1000个连续核苷酸同源或相同的核苷酸序列： [0050] (i)具有有义或反义方向的选自SEQ ID No:1、6、8、9、12、13、26、30、42、43、46、55、58和/或60的序列或其功能性片段的核酸，或 [0051] (ii)与来自(i)的序列互补的核酸，或 [0052] (iii)与来自(i)的序列至少80％、82％、84％、86％或88％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，或特别优选地至少97％、97.5％、98％、98.5％、99％或 99.5％相同的核酸，或 [0053] (iv)编码具有选自SEQ ID No:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、44、45、48、63、64和/或65，或选自SEQ ID No:32、33和/或34的氨基酸序列的蛋白或所述蛋白的部分的核酸，或 [0054] (v)编码根据(iv)的蛋白的同源物、类似物或直系同源物或其部分的核酸，或 [0055] (vi)与来自(ii)的序列在严格条件下杂交的核酸。在转录基因沉默中，例如在RdDM方法中(Shibuya et al.,2009)，这样的核酸可以用来激活上文所述的诱导促进核酸的表达，或用于抑制上文所述的诱导抑制核酸的表达。dsRNA编码核酸也可以是编码长非编码RNA(lncRNA)的核酸。所述lncRNA核酸然后优选包含核苷酸序列，其 [0056] (a)具有选自SEQ ID No:35、36、37和/或38的序列或其片段，或 [0057] (b)与来自(a)的序列互补，或 [0058] (c)与来自(a)的序列至少80％、82％、84％、86％或88％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，或特别优选地至少97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％相同，或 [0059] (d)编码具有SEQ ID No:40或41的氨基酸序列的多肽或所述多肽的部分，或 [0060] (e)与来自(b)的序列在严格条件下杂交。该lncRNA，以下命名为lncRNA 1，可用于肌醇聚磷酸酯-5-磷酸酶例如肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶的表达或翻译调控。此外，所述lncRNA编码核酸可以优选包含核苷酸序列，其 [0061] (w)具有选自SEQ ID No:39的序列或其片段，或 [0062] (x)与来自(w)的序列互补，或 [0063] (y)与来自(w)的序列至少80％、82％、84％、86％或88％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，或特别优选地至少97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％相同，或 [0064] (z)与来自(x)的序列在严格条件下杂交。该lncRNA，以下命名为lncRNA 2，可用于磷脂酶尤其是磷脂酶A2或patatin磷脂酶的表达或翻译调控。 [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] 在另一方面，本发明涉及包含本发明的核酸的载体。所述载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或表达载体、转化载体、穿梭载体或克隆载体；其可以是双链的或单链的，线性的或环状的；或其可以转化原核或真核宿主，通过整合进其基因组或在染色体外。本发明的核酸在载体中优选与一或多个调控序列可操作体连接，所述调控序列允许在原核或真核宿主细胞中的转录以及任选地允许表达。调控序列(优选DNA)可以与本发明的核酸同源或异源。例如，所述核酸在合适的启动子或终止子的控制下。合适的启动子可以是组成型诱导的启动子(实例：35S启动子，来自“花椰菜花叶病毒”(Odell et al.,1985)；那些组织特异性启动子是特别合适的(实例：花粉特异性启动子，Chen et al.(2010),Zhao et al.(2006),或Twell et al.(1991))，或者是发育特异性的(实例：开花特异性启动子)。合适的启动子也可以是合成的或嵌合的启动子，其在自然界中不存在，包含多个元件，且含有最小启动子，以及在所述最小启动子上游的至少一个顺式调控元件，其是特定转录因子的结合位点。嵌合启动子可以根据期望的特征设计，且由不同的因子诱导或抑制。这样的启动子的实例在Gurr&Rushton(2005)或Venter(2007)找到。例如，合适的终止子是nos终止子(Depicker et al.,1982)。 [0072] 除了上文描述的载体外，本发明还提供一种方法，包括将所描述的载体插入进宿主细胞。例如，可以通过接合、转移(mobilization)、基因枪转化、农杆菌介导的转化、转染、转导、真空渗滤或电穿孔导入所述载体。这样的方法，如同制备所描述的载体的方法，是本领域技术人员的常识(Sambrook et al.,2001)。 [0073] 在另一方面，本发明涉及包含本发明的核酸或本发明的载体的宿主细胞。本发明含义的宿主细胞可以是原核细胞(如细菌)或真核细胞(如植物细胞或酵母细胞)。所述宿主细胞优选是农杆菌，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，或植物细胞，其包含本发明的所述核酸或本发明的载体。对于本领域技术人员，已知可以用来将本发明的核酸或本发明的载体导入农杆菌的许多方法(如接合或电穿孔)，以及可以用来将本发明的核酸或本发明的载体导入植物细胞的方法如不同的转化方法(基因枪转化、农杆菌介导的转化)(Sambrook et al.,2001)。 [0074] 在另一方面，本发明涉及转基因植物细胞，其包含作为转基因的本发明的核酸或包含本发明的载体，并涉及转基因植物或其部分，其包含所述转基因植物细胞。例如，这样的植物细胞或植物是用本发明的核酸或本发明的载体转化(优选稳定转化)的植物细胞或植物。本发明的转基因植物优选适于用作单倍体诱导系。在所述转基因植物的一优选实施方案中，所述核酸与一或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列允许在植物细胞中的转录以及任选的表达。调控序列(优选DNA)可以与本发明的核酸同源或异源。由本发明的核酸和所述调控序列组成的总结构然后可以代表所述转基因。植物的部分可以是受精的或未受精的种子、胚、花粉、组织、器官、或植物细胞，其中所述受精的或未受精的种子、所述胚或所述花粉在所述转基因植物中产生，且本发明的核酸或所述载体整合进其基因组作为转基因。本发明而且还包括所述转基因植物的后代，其基因组中整合有本发明的核酸或载体作为转基因，且其适于用作单倍体诱导系。 [0075] 在另一方面，本发明涉及由本发明的核酸编码的蛋白或多肽。所述蛋白或多肽优选适于在植物中介导单倍体诱导系的特性，或适于增加单倍体诱导系的诱导能力。特别优选由所述诱导促进核酸编码的蛋白或多肽。本发明的蛋白或多肽优选包括选自SEQ ID No:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、44、45、48、51、54、63、64和/或65，或选自SEQ ID No:32、 33和/或34，或选自SEQ ID No:40和/或41的氨基酸序列。 [0076] 在另一方面，本发明描述了用于产生适于用作单倍体诱导系的植物的方法。所述方法可以包括以下步骤： [0077] A)诱变植物细胞且随后从所诱变的植物细胞再生植物或诱变植物，和 [0078] B)鉴定植物A)，其在与本发明的核酸相同的内源DNA序列中具有至少一个突变，或在所述内源DNA序列的调控序列(例如，启动子、增强子、终止子或内含子)中具有至少一个突变，所述突变导致与未诱变野生型植物相比所述内源DNA序列在所鉴定的植物中转录或表达率的变化，或者与未诱变野生型植物相比所述内源DNA序列编码的蛋白或多肽在所鉴定的植物中活性或稳定性的变化，其中所述至少一个突变在所鉴定的植物中导致要介导的单倍体诱导系特性或要增加的单倍体诱导系的诱导能力。所述转录率或表达率的改变，或所述活性或稳定性的改变，优选地至少在所鉴定的植物的花粉中或在所鉴定的植物的花粉组织中出现。 [0079] 来自步骤B)的内源DNA序列，或所述内源DNA序列编码的RNA或所述DNA序列编码的蛋白或多肽，优选对植物中花粉管的生长、植物花粉的能量代谢和/或优选在生殖细胞(例如其发育成花粉)中的着丝粒的活性有影响。 [0080] 所述用于产生适于用作单倍体诱导系的植物的方法的步骤B)的内源DNA序列特别优选地编码SNAREv蛋白；磷脂酶类的酶，特别是磷脂酶A2或patatin磷脂酶；肌醇聚磷酸酯-5-磷酸酶类的酶，例如肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶；磷酸甘油酸变位酶或甲基转移酶，特别是RNA甲基转移酶，其中，在SNARE蛋白、磷脂酶和甲基转移酶的情况下，所述转录率或表达率或所述活性或稳定性优选被改变至其被增加的程度，且其中，在肌醇聚磷酸酯-5-磷酸酶和磷酸甘油酸变位酶的情况下，所述转录率或表达率或所述活性或稳定性优选被改变至其被减少的程度。 [0081] 所述用于产生植物的方法的步骤B)非常优选地是从A)鉴定植物，其a)在与所述诱导促进核酸或编码所述lncRNA 1的核酸相同的内源DNA序列中，或在所述内源DNA序列的调控序列(如启动子、增强子、终止子或内含子)中具有至少一个突变，其中所述至少一个突变实现所述内源DNA序列的转录或表达的增加或由所述内源DNA序列编码的蛋白或多肽的活性或稳定性的增加；和/或b)在与所述诱导抑制核酸或编码所述lncRNA 2的核酸相同的内源DNA序列中，或在所述内源DNA序列的调控序列(如启动子、增强子、终止子或内含子)中具有至少一个突变，其中所述至少一个突变实现所述内源DNA序列的转录或表达的减少或由所述内源DNA序列编码的蛋白或多肽的活性或稳定性的减少，其中a)和b)的所述至少一个突变在所鉴定的植物中导致要介导的单倍体诱导系特性或要增加的单倍体诱导系的诱导能力。所述转录率或表达率的改变，或所述活性或稳定性的改变，优选地至少在所鉴定的植物的花粉中或在所鉴定的植物的花粉组织中出现。 [0082] 突变意指DNA水平的修饰，并因此是遗传学和/或表观遗传学的改变。例如，遗传学的改变可以是所述内源DNA序列中或所述内源DNA序列的调控序列中的至少一个核碱基的取代。如果这样的核碱基取代发生在例如启动子，这可以导致所述启动子改变的活性，由于例如顺式调控元件被修饰使得转录因子与所突变的顺式调控元件的亲和力相对于野生型启动子被改变，由此具有所述突变的顺数调控元件的启动子的活性被增加或减少，取决于所述转录因子是阻遏物还是诱导系，或所述转录因子与突变的顺式调控元件的亲和力被增强还是被弱化。如果这样的核碱基取代在例如所述内源DNA序列的编码区中发生，这可以导致所编码的蛋白的氨基酸取代，其可以导致所述蛋白的活性或稳定性与野生型蛋白相比的改变。遗传学改变的另一实例是在所述调控序列和/或所述内源DNA序列中的核苷酸缺失，以及在所述调控序列和/或所述内源DNA序列中的核苷酸添加。Das&Martienssen(1995)显示在玉米中通过转座子诱变插入核苷酸来调控基因。表观遗传学的改变可以通过DNA改变的甲基化模式发生。 [0083] 本领域技术人员已知本发明含义中的突变如何能够通过用于产生适于用作单倍体诱导系的植物的方法的步骤A)的诱变过程实现。此处所述诱变包括常规诱变以及位点特异性诱变或“基因组编辑”。在常规诱变中，DNA水平的修饰不是以靶向的方式产生的。植物细胞或植物被暴露至诱变条件如TILLING，通过UV光暴露或使用化学物质(Till et al.,2004)。随机诱变的另外的方法是借助转座子的诱变。UniformMU项目制备了大容量的可免费获得的突变体库。所述库和所述方法描述于McCarty et al.(2005)。位点特异性诱变使得可以以靶导向方式在DNA中的预定位置在DNA水平导入修饰。例如，TALENS(WO 2010/ 079430,WO 2011/072246)，大范围核酸酶(Silva et al.,2011)，归巢内切核酸酶 (Chevalier 2002)，锌指核酸酶(Lloyd et al.,2005)，或CRISPR/Cas系统(Gaj et al., 2013)可用于此。 [0084] 步骤B)中植物的鉴定可以借助例如分子标记或探针实现。例如，DNA探针是引物或引物对，其可用于PCR反应。例如，可以通过在Tilling群体中测序靶基因来验证或鉴别Tilling突变体，或者通过额外的验证DNA中错配的方法，例如熔解点分析或使用错配特异性核酸酶。对此，本发明同样包括可用于此的引物/引物对，例如，针对磷脂酶、磷酸甘油酸变位酶、甲基转移酶和磷脂酶的lncRNA的引物。通过转座子产生的突变体也可以通过在跨越整个群体的PCR中使用转座子特异性引物和靶基因特异性引物以及随后测序PCR产物来验证。本发明也涵盖这样的引物。例如，花粉中表达率的改变可以用RT-PCR确定；稳定性的改变例如可以通过检查泛素结合位点和预测三级结构的变化来确定。此外，野生型蛋白以及相应突变体蛋白的重组表达，和随后的生化活性测试也是合适的。可用于在步骤B)中鉴别植物的额外的手段和方法是本领域技术人员从现有技术中知晓的。 [0085] 本发明还涉及分子标记，其证明所述内源DNA序列中或所述内源DNA序列的内源DNA序列的突变的存在或不存在。例如，这样的标记基于SNP且对所述突变特异(实例：KASPar或TaqMan标记)。 [0086] 本发明还进一步涉及能够用前述方法产生或用前述方法产生的植物，或该植物的部分，其中所述植物的部分可以是受精的或未受精的种子、胚、花粉、组织、器官或植物细胞，其中所述受精的或未受精的种子、所述胚、或所述花粉在所述转基因植物产生，且所述至少一个突变存在于其基因组中。本发明同样还包括所述植物的后代，其具有所述至少一个突变且适于用作单倍体诱导系。已经用前述方法产生的植物的两个实例是这样的植物(优选玉米或向日葵)，其在内源DNA序列中，具有以下核酸，所述核酸(i)具有选自SEQ ID No:8、9和/或46的序列或其功能性片段；或(ii)与来自(i)的序列互补；或(iii)与来自(i)的序列至少80％相同；或(iv)编码具有选自SEQ ID No:21、22、23和/或48的氨基酸序列的蛋白或所述蛋白的功能性部分；或(v)编码根据(iv)的蛋白的同源物、类似物或直系同源物或其功能性部分；或(vi)与来自(ii)的序列在严格条件下杂交，或在所述内源DNA序列的调控序列中具有至少一个突变，所述突变导致与未诱变野生型植物相比所述内源DNA序列在所鉴定的植物中转录或表达率的变化，或者与未诱变野生型植物相比所述内源DNA序列编码的蛋白或多肽在所鉴定的植物中活性或稳定性的变化，其中所述至少一个突变在所鉴定的植物中导致要介导的单倍体诱导系特性或要增加的单倍体诱导系的诱导能力。所述突变优选地是在SEQ ID No:8或9的编码序列中的改变(例如，点突变)，其导致SEQ ID No:21、22或23中氨基酸位置74-78之间的氨基酸取代，或者所述突变导致SEQ ID No.46的编码序列中的修饰，其导致SEQ ID No:48相应编码序列中的氨基酸取代。这可以包含根据SEQ ID NO:49-54的突变。通过TILLING导致的在SEQ ID NO:49中的突变导致第74位处的编码的氨基酸的氨基酸取代,其中天冬氨酸被天冬酰胺取代(D74N)；在SEQ ID NO:52中的突变导致第78位处的编码的氨基酸的氨基酸取代，其中甘氨酸被精氨酸取代(G74R)。 [0087] 此外，本发明还涉及一种分离在植物中介导单倍体诱导系特性或增加单倍体诱导系的诱导能力的核酸的方法，包括以下步骤： [0088] A)根据本发明前面描述的方法产生植物，或提供能够用本发明前述的方法产生或用本发明前述的方法产生的植物；和B)从来自A)的植物的基因组分离核酸，所述核酸包含具有所述至少一个突变的内源DNA序列。步骤B)中所述核酸非分离可以通过CTAB提取或通过DNA结合柱实现；所述突变的验证可以通过测序或分子标记如基于SNP的KASPar或TaqMan标记实现，或例如对于插入或缺失突变，通过基于长度多态性的标记实现。 [0089] 本发明还包括通过或可通过前述用于分离的方法获得的核酸，以及包含所述分离的核酸的载体。 [0090] 在另一方面，本发明还涉及用于产生适于用作单倍体诱导系的转基因植物的方法。所述方法可以包括以下步骤： [0091] A)提供上文所述的核酸，其在植物中转录或表达后，适于介导单倍体诱导系的特性或适于增加单倍体诱导系的诱导能力；或提供上文所述的分离的核酸，所述核酸包含所述具有至少一个突变的内源DNA序列；或提供上述的载体之一， [0092] B)通过导入来自A)的核酸或载体转化(优选稳定转化)植物细胞， [0093] C)从来自B)的经转化的植物细胞再生转基因植物，和 [0094] D)通过优选地在所鉴定的植物的花粉中的或在所鉴定的植物的花粉组织中的改变的表达模式从C)鉴定转基因植物，其中单倍体诱导系的特性被介导或单倍体诱导系的诱导能力被增加。所述用于产生适于用作单倍体诱导系的转基因植物的方法还包括提供两种或更多种上文所述的核酸(或者本发明的核酸的不同的实施方式，且任选地在一或多种载体中)以及通过导入两种或多种核酸转化植物细胞。可选地或额外地，除了本发明的核酸之外，还可以提供或转化已知可用于产生单倍体诱导系的一或多种额外的核酸(例如，经操作的cenh3基因(Ravi&Chan,2010))。 [0095] 所述表达模式优选地被改变为实现 [0096] (I)与野生型植物(例如其再生自等基因未转化的植物细胞)相比，所鉴定的植物中所导入的诱导促进核酸或导入的编码lncRNA 1的核酸的转录或表达被增加，和/或 [0097] (II)与野生型植物(例如其再生自等基因未转化的植物细胞)相比，所鉴定的植物中所导入的诱导抑制核酸或导入的编码lncRNA 2的核酸的转录或表达被减少，和/或 [0098] (III)由于转录后基因沉默，与野生型植物(其例如再生自等基因、未转化的植物细胞)相比，在所鉴定的植物中具有与所述诱导抑制核酸相同的核苷酸序列的内源DNA序列的表达率通过所导入的核酸编码的双链RNA被降低，所述导入的核酸如上所述与转录后基因沉默相关，和/或 [0099] (IV)由于转录基因沉默，与野生型植物(其例如再生自等基因、未转化的植物细胞)相比，在所鉴定的植物中具有与所述诱导促进核酸相同的核苷酸序列的内源DNA序列或编码lncRNA 1的导入的核酸的转录率或表达率通过所导入的核酸(其在上文详细描述，与转录基因沉默相关)编码的双链RNA被增加；和/或与野生型植物(其例如再生自等基因、未转化的植物细胞)相比，在所鉴定的植物中具有与所述诱导抑制核酸相同的核苷酸序列的内源DNA序列或编码lncRNA 2的导入的核酸的转录率或表达率通过所导入的核酸(其在上文详细描述，与转录基因沉默相关)编码的双链RNA被减少。转录率的验证可以通过例如qRT-PCR实现。改变的蛋白稳定性可以通过例如蛋白印迹确定。 [0100] 本发明还进一步涉及能够用前述方法产生或用前述方法产生的转基因植物或该植物的部分，植物的部分可以是受精的或未受精的种子、胚、花粉、组织、器官、或植物细胞，其中所述受精的或未受精的种子、所述胚或所述花粉在所述转基因植物中产生，且本发明的核酸或所述载体整合进其基因组作为转基因。本发明同样还包括所述转基因植物的后代，其具所导入的核酸作为转基因且适于用作单倍体诱导系。 [0101] 在另一方面，本发明还涉及用于产生单倍体植物的方法，所述方法包括以下步骤： [0102] A)是本发明的适于用作单倍体诱导系的非转基因或转基因植物和相同属优选相同物种的植物杂交， [0103] B)选择受精的单倍体种子或胚，和 [0104] C)从来自B)的种子或胚再生单倍体植物。 [0105] 所述适于用作单倍体诱导系的植物优选用作花粉亲本且和相同属优选相同物种的种子亲本杂交。所述适于用作单倍体诱导系的植物还可以用作种子亲本且和相同属优选相同物种的花粉亲本杂交。因此，步骤A)中的两种杂交配对物，种子亲本和花粉亲本，还可以是相同个体。所述杂交步骤因此代表自交。 [0106] 所述单倍体受精的种子或胚的选择可以包括验证所述单倍性的步骤，已将所述单倍体受精的种子或胚与多倍体受精的种子或胚分开的步骤。所述受精的种子或胚的单倍性鉴定可以通过表型或基因型实现，例如，其中所述诱导系具有胚特异性可视标记，其在全部二倍体后代是可见的，但在诱导的单倍体后代则不可见。此外，所述倍性状态可以通过流式细胞术确定。此外，分子标记完整的、纯合的模式为单倍体植物提供指征。例如，所述分开可以自动地基于单倍性验证的数据实现。 [0107] 本发明还进一步涉及单倍体受精的种子或胚，其通过所述用于产生单倍体植物的方法的步骤A)中的杂交而产生，以及涉及单倍体植物，其能够用所述方法或用所述方法产生，或者该植物的部分，其中植物的部分可以是种子、胚、组织、器官或植物细胞。本发明同样还包括所述植物的后代。此外，本发明还包括双-单倍体(二倍体)植物或其部分，其中所述双-单倍体(二倍体)植物或其部分通过所述单倍体植物或其部分的染色体加倍而产生。 [0108] 在另一方面，本发明涉及本发明的核酸或本发明载体在植物中介导单倍体诱导系或增加单倍体诱导的诱导能力的用途，或本发明的核酸或本发明的载体用于产生适于用作单倍体诱导系的植物或转基因植物的用途。此外，本发明还包括本发明如上所述的植物的用途，其适于用作单倍体诱导系以产生单倍体的受精的种子或胚，或单倍体植物。之前针对本发明的主题和方法的解释也适用于所记载的用途。 [0109] 在另一方面，本发明还涉及用于外部施加至植物的工具。提供该工具用于外部施加至植物且适于在植物中介导单倍体诱导系的特性，或适于增加单倍体诱导系植物的诱导能力。施加优选在花药形成、花粉形成或受精的时间点进行。所述工具包含具有双链部分的RNA，其中所述双链部分的至少一条链具有与以下核酸的编码序列中至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个，优选至少30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120或140个，和特别优选至少160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸同源或相同的核苷酸序列 [0110] (i)具有有义或反义方向的选自SEQ ID No:26、27、28、29、30和/或31的序列或其功能性片段的核酸，或 [0111] (ii)与来自(i)的序列互补的核酸，或 [0112] (iii)与来自(i)的序列至少80％、82％、84％、86％或88％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，或特别优选地至少97％、97.5％、98％、98.5％、99％或 99.5％相同的核酸，或 [0113] (iv)编码具有选自SEQ ID No:32、33和/或34的氨基酸序列的蛋白或所述蛋白的功能性部分的核酸，或 [0114] (v)编码根据(iv)的蛋白的同源物、类似物或直系同源物或其部分的核酸，或 [0115] (vi)与来自(ii)的序列在严格条件下杂交的核酸。 [0116] 用于产生本发明所述工具的双链RNA可以通过本领域技术人员已知的方法体外产生。例如，可以合成产生所述双链RNA，其中所述RNA直接在体外形成。从双链DNA出发，所述双链RNA还可以通过例如形成mRNA转录物而合成，所述mRNA转录物然后形成发夹结构。所述工具可以用作在植物中诱导单倍体的触发器。例如，在植物开花前或后，可以通过以喷雾形式喷洒至植物组织上，或者通过本领域技术人员公知的额外的方式外部施加至植物组织上，或者通过喷雾或和其它添加剂混合来使用所述工具。例如，添加剂可以是润湿剂、载体物质或RNA稳定剂如脂质体。 [0117] 令人惊奇地，本发明人已经发现，影响花粉管生长、花粉的能量代谢和/或着丝粒活性(优选在发育成例如花粉的生殖细胞中)的基因或基因产物特别适于将非单倍体诱导系转换成单倍体诱导系。为此，可以鉴定具有显著重要性的多个基因家族/蛋白家族。它们用于产生单倍体诱导系的用途之前在现有技术中没有被描述或提示。因为花粉的产生以及受精过程(包括花粉管的生长)在单子叶和双子叶植物中遵循广泛适用的原理，在本发明的技术教导下，即使是对之前既不存在高效体内单倍体诱导系统或其它用于产生双-单倍体植物的基于细胞培养的方法的栽培植物，本领域技术人员也接受开发单倍体诱导系的可能性。为此，使用他从本发明获得的遗传学信息，他可以通过常规劳动发现所描述的基因产物的同源物、直系同源物或类似物，并如本文所描述对它们进行操作。然而，本发明的技术教导也适于进一步针对它们的效率(即单倍体诱导率)改良已经存在的诱导系，并因此第一次使得它们能够经济地应用。此外，本领域技术人员将该技术教导和单倍体诱导的其它已知机制组合，例如操作CENH3蛋白(Ravi&Chan,2010)，并因此进一步增加效率。 [0118] 本申请中使用的一些术语在下文详细解释： [0119] “B73”是玉米育种系，其在玉米遗传学中用作模型基因型且被用于产生第一个玉米参考序列。 [0120] “介导单倍体诱导系的特性”或“单倍体诱导系的特性的介导”或相当的短语意指，通过使用本发明的核酸，使得植物在与来自相同属(优选相同物种)的不具有单倍体诱导系特性的植物杂交时能够产生具有单一染色体组(单倍体)的受精的种子或胚。单倍体诱导系的特性，定义为绝对单倍体诱导率，指的是至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1％，优选至少1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、或5％，或特别优选6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％，或非常特别优选，至少 20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％的所述受精的种子或胚具有单倍体染色体组。 [0121] “表达率的增加”或“增加的表达率”或“表达的激活”或相当的表述意指核苷酸序列的表达率与指定的参照相比增加超过10％、15％、20％、25％、或30％，优选增加超过40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％，或特别优选增加超过150％、200％、250％、 300％、500％、或1000％。所述表达率的增加优选地导致其中表达率被增加的植物的表型变化。改变的表型可以是介导单倍体诱导系的特性，或单倍体诱导系诱导能力的增加。 [0122] “转录率的增加”或“增加的转录率”或相当的表述意指核苷酸序列的转录率与指定的参照相比增加超过10％、15％、20％、25％、或30％，优选增加超过40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％，或特别优选增加超过150％、200％、250％、300％、500％、或 1000％。所述转录率的增加优选地导致其中转录率被增加的植物的表型变化。改变的表型可以是介导单倍体诱导系的特性，或单倍体诱导系诱导能力的增加。 [0123] 核苷酸序列的“功能性”片段意指核苷酸序列的节段，其具有与所述功能性片段所源自的完整核苷酸序列相同或相当的功能。因此，所述功能性片段可以具有与所述完整核苷酸序列在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％96％、97％、98％、或99％的长度上相同或同源的核苷酸序列。此外，核苷酸序列的“功能性片段”还可以指核苷酸序列的节段，其改变总核苷酸序列的功能，例如在转录后或转录基因沉默中。因此，核苷酸序列的功能性片段可以包括完整核苷酸序列的至少14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、或25个，优选至少30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、或140个，或特别优选至少160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、或1000个连续的核苷酸。 [0124] 蛋白的“功能性部分”意指蛋白的节段，或编码所述蛋白的氨基酸序列的区段，其中所述节段可以在植物细胞中执行与完整蛋白相同或相当的功能。蛋白的功能性部分在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、97％、98％、或99％的长度上具有与所述功能性部分所源自的蛋白相同或类似(在保守性和半保守性氨基酸取代下)的氨基酸序列。 [0125] “单倍体诱导系”也意指体内单倍体诱导系。 [0126] 术语“异源(heterolog)”意指所导入的多核苷酸源自例如相同物种中具有不同遗传背景的细胞或器官或另一物种，或者对原核或真核宿主细胞是同源的但是然后位于不同的遗传环境且因此不同于可能的、天然存在的相应多核苷酸。除了相应的内源基因外，可以存在异源的多核苷酸。 [0127] 在本发明含义中，“同源物”应理解为具有相同系统发生起源的蛋白，“类似物”应理解为执行相同功能但具有不同系统发生起源的蛋白，而“直系同源物”是来自不同物种执行相同功能的蛋白。 [0128] “杂交(hybridizing)”或“杂交(hybridization)”应理解为这样的过程，其中单链核酸分子被添加至以最大可能程度互补的核酸链，即形成碱基配对。用于杂交的标准方法例如描述于Sambrook et al.2001。这应优选地被理解为所述核酸分子至少60％，更优选地，至少65％、70％、75％、80％、或85％，或特别优选地，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的碱基和以最大可能程度互补的核酸链形成碱基配对。这样的添加的可能性取决于杂交条件的严格性。术语“严格性”涉及杂交条件。当碱基配对更难实现时存在高严格性；如果碱基配对较容易实现则存在低严格性。例如，杂交条件的严格性取决于盐浓度或离子强度以及温度。一般而言，可以通过提高温度和/或降低盐含量来增加严格性。“严格杂交条件”应理解为其中杂交主要仅仅在同源核酸分子中发生的那些条件。术语“杂交条件”因此不仅仅涉及所述核酸实际添加时的条件，还涉及后续洗涤步骤的条件。严格杂交条件例如是这样的条件，在所述条件下主要仅仅那些具有至少70％，优选至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列相同性的核酸分子杂交。严格杂交条件例如是在4xSSC中在65℃杂交，以及随后在0.1x SSC中65℃重复洗涤共大约1小时。本文所用术语“严格杂交条件”还可以指在68℃在0.25M磷酸钠、pH 7.2、7％SDS、1mM EDTA和1％BSA中杂交16小时，以及随后用2x SSC和0.1％SDS在68℃洗涤两次。杂交优选在严格条件下发生。 [0129] “增加单倍体诱导系的诱导能力”或“单倍体诱导系的诱导能力的增加”意指具有单倍体诱导系的特性的植物的单倍体诱导率被增加。具有单倍体染色体组且获得自所述单倍体诱导系和不具有单倍体诱导系特性的相同属(优选相同物种)植物的杂交的受精种子的数目因此可以比不使用本发明的核酸获得的单倍体受精种子的数目高至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1％，优选至少1.5％、2％、 2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、或5％，以及特别优选至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、 20％、30％、或50％，即，单倍体诱导率可以相对于之前实现的单倍体诱导率增加至少 0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1％，优选至少1.5％、 2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、或5％，以及特别优选至少6％、7％、8％、9％、10％、 15％、20％、30％、或50％。 [0130] “可操作地连接”意指在同一核酸分子中连接，使得所连接的元件以这样的方式相互定位和朝向使得核酸分子的转录可以发生。与启动子可操作地连接的DNA在该启动子的转录控制下。 [0131] 植物“器官”指的是例如叶、枝条(shoot)、茎、根、营养芽、分生组织、胚、花药、胚珠或果实。植物“部分”指的是多个器官的组合，例如花或种子，或器官的部分，例如来自枝条的横切。植物“组织”例如是愈伤组织、贮藏组织、分生组织、叶组织、茎组织、根组织、植物瘤组织或繁殖组织。例如，植物“细胞”应该理解为，例如具有细胞壁的分离的细胞或其聚集物，或原生质体。 [0132] 在本发明含义中，如果不是另外指明，“植物”可以是来自双子叶植物、单子叶植物和裸子植物的任何物种。这些中的许多是，例如，大麦(Hordeum vulgare)、双色高粱(Sorghum bicolor)、黑麦(Secale cereale)、黑小麦(Triticale)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉米(Zea mays)、狗尾草(Setaria italic)、水稻(Oryza sativa)、小粒野生稻(Oryza minuta)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、球茎大麦(Hordeum bulbosum)、短柄草(Brachypodium distachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、甜菜(Beta vulgaris)、葵花(Helianthus annuus)、Daucus glochidiatus、Daucus pusillus、Daucus muricatus、胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、Erythranthe guttata、Genlisea aurea、棉属物种(Gossypium sp.)、芭蕉属物种(Musa sp.)、燕麦属物种(Avena sp.)、林烟草(Nicotiana sylvestris)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitis vinifera)、黄瓜(Cucumis sativus)、桑树(Morus notabilis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)、Arabidopsis arenosa、须弥芥 (Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠 (Cardamine flexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursa-pastoris)、小拟南芥(Olmarabidopsis pumila)、硬毛南芥(Arabis hirsuta)、欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、芫菁(Brassica rapa)、芸苔(Brassica juncacea)、Brassica nigra、萝卜(Raphanus sativus)、Eruca vesicaria sativa、甜橙(Citrus sinensis)、麻风树(Jatropha curcas)、大豆(Glycine max)、和毛果杨(Populus trichocarpa)。根据本发明的植物优选是玉蜀黍属(Zea)的植物，特别是物种玉米(Zea mays)，或者是高粱。 [0133] “减少表达率”或“表达率的减少”或“表达的抑制”或“减少的表达率”或相当的短语意指核苷酸序列的表达率与指定的参照相比减少超过10％、15％、20％、25％、或30％，优选增加超过40％、50％、45％、50％、55％、60％、或65％，或特别优选增加超过70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、或98％。然而，其还可以指核苷酸的表达率被减少 100％。所述表达率的减少优选地导致其中表达率被减少的植物的表型变化。改变的表型可以是介导单倍体诱导系的特性，或单倍体诱导系诱导能力的增加。 [0134] “转录率的减少”或“减少的转录率”或相当的表述意指核苷酸序列的转录率与指定的参照相比减少超过10％、15％、20％、25％、或30％，优选增加超过40％、50％、45％、50％、55％、60％、或65％，且特别优选增加超过70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、 96％、或98％。然而，其还可以指核苷酸的转录率被减少100％。所述转录率的减少优选地导致其中转录率被减少的植物的表型变化。改变的表型可以是介导单倍体诱导系的特性，或单倍体诱导系诱导能力的增加。 [0135] 与本发明相关，术语“调控序列”涉及影响表达特异性和/或强度的核苷酸序列，例如其中所述调控序列介导明确的组织特异性。这样的调控序列可以位于最小启动子的转录起始点上游，但也可以在其下游，例如在转录但不翻译的前导序列中或在内含子中。 [0136] “适于用作单倍体诱导系”意指与相同属(优选相同物种)的不具有单倍体诱导系特性的植物杂交时，植物能够产生具有单一染色体组(单倍体)的受精的种子。单倍体诱导系的特性，定义为绝对单倍体诱导率，指的是至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1％，优选至少1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、或 5％，或特别优选6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％，或非常特别优选，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％的所述受精的种子具有单倍体染色体组。 [0138] 图1：与B73(AGPv02)相比所鉴定的基因的基因组排列： [0139] SNAREv 1(GRMZM2G179789)：在RWS花粉中增加的表达； [0140] SNAREv 2(GRMZM2G412426)：在RWS花粉中增加的表达； [0141] ITP(肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶)(GRMZM2G106834)：在RWS花粉中减少的表达； [0142] PL(Patatin磷脂酶)(GRMZM2G471240)：编码序列中的多态性； [0143] MITO1(线粒体输入受体)：仅仅存在于RWS中； [0144] MITO2:与MITO1同源，但缩短。仅仅存在于RWS； [0145] PGM(磷酸甘油酸变位酶)(GRMZM2G062320)：在RWS中缺失； [0146] lncRNA：Pl的同源物:在RWS中缺失； [0147] AC213048：用于序列比较的锚定基因； [0148] MT(RNA甲基转移酶)(GRMZM2G347808)：在调控区域中的多态性。 [0149] GRMZM名字涉及AGPv02中的注释。 [0150] 图2：诱导系RWS和三个非诱导系对照(NI1、NI2、NI3)中基因SNAREv 1、RNA甲基转移酶和patatin磷脂酶的RT-PCR。 [0151] 图3：RWS花粉的RNASeq数据，投射到来自AGPv02的人工参照，其中SNARE和磷脂酶基因座被RWS BAC的基因座取代。(T1：转录物1，SNARE2的同源物，但具有改变的内含子结构。T2：SNARE1的同源物。编码133AA的蛋白；T3：SNARE1/2的同源物。来自图2的RT-PCR片段)。 [0152] QTL分析和候选基因的鉴定： [0153] 在玉米单倍体诱导系RWS(其被归因于诱导系Stock 6(Coe,1959))中，在染色体1(bin 1.04)鉴定到主要-QTL并精细定位。 基于这些工作，RWS中的该QTL应当进行验证以及分子 分析以鉴别和功能性验证其中的基因。测试来自RWS x对照1(母体诱导系x非诱导系)的QTL定位群体的诱导能力。由此可以显示已知的QTL很可能也存在于诱导系RWS。然而，也有可能发现强的等位基因迁移取代非-RWS(对照1)等位基因。 [0154] 为了分子描述所述基因座，选择了在DNA和RNA水平的多种测序方法。由于诱导系和参照基因组B73的结构差异，仅仅小比例的经典的、基于参照的测序方法获得成功。广泛的和复杂的生物信息学分析显示结构差异将然后需要通过其它技术进行检查(图1)。 [0155] 在序列捕获方法中，在三个Stock6衍生的诱导系，以及RWS和5个非诱导系对照中所鉴定的QTL周围的3兆碱基被测序，且分析诱导系特异性多态性例如存在-不存在变异、SNP和InDel。最初，由此鉴定到16个候选基因，其中3个基因通过测序和分析表达数据确认：一个基因编码花药特异性patatin磷脂酶A2，其具有RWS诱导系-特异性单倍型；磷酸甘油酸变位酶，其不存在于诱导系RWS；以及RNA甲基转移酶基因，其在调控序列具有突变(图2)。 [0156] 针对RWS、EMK(衍生自Stock6的另外的诱导系)和对照1开发了BAC文库，并用沿着所鉴定的QTL分布的探针筛选。针对大约150kB的靶范围(其由Dong et al.2013提及为在诱导系UH400中很可能是诱导系相关的)，提取RWS、对照1和EMK的BAC并测序。对BAC序列进行注释并与针对RWS、对照1、EMK和B73创建的全面的转录组数据进行比较。 [0157] 结果，此处确认了诱导系中的缺失。因此，所检查的母体诱导系缺少在染色体1上68.26至68.36MB之间(B73参照序列的AGP Version 2)的100kB的区域。此外，在诱导系的靶区域之外出现基因类似区域的倒位和无法和B73参照基因组以及对照1比较的大的重复性序列节段。 [0158] 尽管有缺失，已经鉴定的磷脂酶仍然存在于所述诱导系中，但显示强烈不同于对照的前述单倍型，以及在启动子区域的显著遗传变异。由于所述缺失，上文已经鉴定的磷酸甘油酸变位酶不再存在。 [0159] 此外，在所述100kB缺失中，也鉴定到非编码RNA(lncRNA)。如所述磷酯酶一样，其是花粉特异性表达，且显示与所鉴定的磷酯酶具有82％的同源性。所述序列自身互补，即所述lncRNA形成发夹结构。非常高的表达率、与所述磷酯酶显著的同源性以及通过Sanger测序确定的低SNP密度表明该lncRNA对所述磷酯酶的调控功能。理论上，从该转录物也可以翻译出88个氨基酸长的所述磷酯酶蛋白的截短版本。 [0160] 为了能够测量来自该区域的所鉴定的基因的表达水平差异，除了在DNA水平测量多态性，也实施了RT-PCR和RNASeq实验。除了作为诱导系的RWP(RWS的子系)，使用了三种遗传学上非常不同的对照品系。从这些植物收获花粉、没有花粉的花药和通过自交或杂交授粉后6-7天的胚。所述磷酯酶此处显示在来自RWP的花粉中轻微的表达增加。所述甲基转移酶在RWP的花粉中显示弱表达，而在对照的花粉中无表达。lncRNA花粉特异性表达，其也如期望的，在RWP中不存在。 [0161] 另外对相同材料的花粉进行RNASeq以进一步验证前述结果。 [0162] 将转录组数据(RWS的花粉RNA的RNA-Seq)投射到人工参照上，其中B73中所述QTL的区域被RWS-BAC置换。该分析显示所述磷酯酶在花粉中的表达。该基因的外显子-内含子结构对应于B73中的结构，但在5’端存在缺失，其导致终止密码子并因此导致缩短的蛋白。此外，在所述磷酯酶上游和下游检测到三种额外的RWS-特异性转录物。具有两种转录物的区域位于所述磷酯酶上游大约60kb。第一种转录物是非编码的；第二种转录物编码192个氨基酸长的蛋白，其显示与线粒体输入受体(MITO1)的同源性。在B73中，这仅仅在所述QTL(GRMZM2G174696)上游15兆碱基。所述磷酯酶下游大约90千碱基(kb)是另一转录物，其反过来显示和所述192个氨基酸长的转录物具有高度同源性。 [0163] 为了获得所述QTL外的诱导系-特异性表达，在基因组范围评估RNASeq数据。出乎意料地，在上文记载的精细定位的区域之外但接近所述区域鉴别到新的候选基因，其之前很可能由于SeqCapture方法的技术限制而无法被发现。来自所述精细定位区域的所鉴定的磷酯酶上游大约400kb是基因复合物，其在RWS的花粉中，与对照相比表达显著不同(至少系数为2)。该基因复合物含有三个基因：两个基因注释为SNAREv基因，其相互具有高度同源性且在RWP中过表达，而一个基因注释为肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶且其表达在RWP中被减少。这些基因的克隆的转录物与公共注释有部分不同，使得它们也可以编码具有不同功能的蛋白，或也可以作为lncRNA起功能。可以从该基因座分离来自RWS的BAC并测序。该序列被整合进人工参照以在AGPv02中重新分析RNASeq数据(图3)。除了转座酶外，两种RNA(T1(SEQ ID No:55、56、57和63)和T3(SEQ ID No:60、61、62和65))以及具有131个氨基酸的ORF的RNA在该基因座表达(T2(SEQ ID No:58、59和64))。除了所述转座酶，全部转录物位于所述两个SNAREv基因内或之间。尽管推测起来它们本身不具有SNARE功能，它们可以参与调控同源基因。该区域的序列捕获数据显示诱导系、对照和参照基因组之间存在显著的结构差异。BAC测序确认肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶基因在所述诱导系的基因组水平不存在，以及来自B73的lncRNA的不存在，所述lncRNA与所述肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶共享转录起始位点，但从相反链阅读。从所述SNARE基因之一(GRMZM2G179789)分离cDNA也表明所述诱导系中复杂的结构改变，由于所述cDNA的一部分对应于正链而一部分对应于参照的负链。 [0164] 基因功能 [0165] 总之，因此可以鉴定7个基因，其对于在玉米中的体内单倍体诱导或体内单倍体诱导能力可能是重要的。 [0166] 在这些对花粉管生长特别重要的四个基因中： [0167] 所述两个SNAREv基因编码已知参与泡囊运输的蛋白(文献)。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，SNAREv蛋白已经被证明在花粉管顶端，其中它们参与磷酯类和果胶类的运输(文献)。在所检查的玉米诱导系中观察到的SNAREv蛋白的过表达将导致增加的花粉管生长。 [0168] 模式植物烟草(Nicotiana tabacum)中能够显示磷脂酶A2也显著影响花粉管生长。因此，抑制磷脂酶A2导致花粉管生长的抑制(Kim et al.,2011)。在所检查的玉米诱导系种，所鉴定的与所述磷酯酶具有显著同源性的lncRNA的不存在可能导致所述磷酯酶基因减少的表达率或翻译率，其将促进花粉管的生长速度。 [0169] 在拟南芥中肌醇-聚磷酸酯-5-磷酸酶的敲除突变体中，显示花粉管不受抑制地生长。在所检查的玉米诱导系中，肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶的减少的表达水平因此同样可能导致加速的花粉管生长。此处所鉴定的与肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶相关的lncRNA对表达率有调控作用。 [0170] 因此与非诱导系相比，所检查的玉米诱导系显示所述四个基因被修饰的调控/表达率。该破坏导致显著更快的花粉管生长，其也被由于线粒体运输蛋白的表达或其调控导致的可能增加的能量代谢促进。这能够导致花粉管中的生殖细胞的运输和其生长相分离。结果是，可能出现不完全或不正确的授粉以及随后的染色体消除。 [0171] 已知活性着丝粒在染色体分布中起关键作用，且通过在DNA或组蛋白水平的染色质修饰(此外，通过转录、RNA相互作用和RNA结合)而表征和修饰。所述甲基转移酶基因调控的改变可以在早期胚胎发生期间影响诱导系着丝粒的活性，其最终导致诱导系基因组在早期种子发育阶段的消除。 [0172] 在所检查的诱导系中，其显示所述磷酸甘油酸变位酶基因不再存在。该基因的不存在可能负面影响花粉的能量代谢，并因此对授粉有影响。此外，所述能量代谢可以被线粒体膜蛋白影响。 [0173] 所述基因中任意基因单独地或任意组合可以负责单倍体诱导的效果。 [0174] 产生新的体内单倍体诱导系 [0175] 为了在其它作物类型或玉米非诱导系基因型中开发新的诱导系，或为了增加诱导系基因型的诱导能力，如下进行： [0176] 在其它作物类型或玉米非诱导系基因型中鉴别相应的基因：在单子叶植物例如玉米、水稻、小麦、黑麦或大麦中，所述花粉-特异性patatin磷脂酶强烈保守，因此这些的同源物容易鉴定。与此相反，调控性lncRNA在大多数单子叶植物不存在。然而，如果它们存在，它们同样可以使用显著的同源性被发现，正如它们也存在于所检查的玉米诱导系中。在双子叶植物中，其它磷酯酶类型执行相应的花粉管生长的任务。为了鉴定这些，创建花粉或花粉管的RNA文库并针对本发明的特定磷酯酶进行筛选。在花粉中强表达的patatin磷酯酶已经能够通过向日葵花粉的RNASeq鉴定(SEQ ID NO:46-48)。 [0177] 所述SNAREv基因和所述甲基转移酶基因不需要是花粉特异性的。例如，所鉴别的SNAREv基因之一(SNAREv 1)在玉米中也不是以花粉特异性方式表达的。SNAREv 1在野生型花粉中根本不表达。在注释的基因组中，可以通过BLASTP鉴定SNAREv蛋白的同源基因和功能性区域。在未注释的基因组中，将需要RNASeq数据来注释和选择SNARE基因。 [0178] 同源性肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶或磷酸甘油酸变位酶为了用作候选基因，必须在花粉中表达。可以如上所述进行鉴定，通过BLASTP和随后的花粉中的RT-PCR或通过花粉RNASeq数据的注释。 [0179] 候选基因的操作 [0180] 可能的诱导系或增加的诱导能力可以通过转基因表达上述的磷酯酶和/或SNARE和/或甲基转移酶和/或磷酸甘油酸变位酶和/或lncRNA和/或线粒体输入受体实现。为此，可以从诱导系RWS克隆相应的基因，包括它们的启动子。这些基因可以被克隆进合适的转化载体并被转化进期望的植物。 [0181] 花粉表达的肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶可以额外地或专一地通过例如RNAi减少它们的活性。例如，为此产生发夹结构，其然后包含合适的启动子和终止子，允许所述发夹结构在花粉形成的时间点或之前转录。这些发夹构建体可以被克隆进合适的转化载体并被转化进期望的植物。 [0182] 可选地或额外地，可以通过TILLING、转座子诱变或其它诱变方法或“基因组编辑”产生具有稳定所述磷酯酶和/或SNARE和/或甲基转移酶、增加表达或增加活性的突变(例如在所鉴定的基因中)的植物。突变的蛋白的二级和三级结构的结构分析对此可能有用，所述突变的蛋白显示例如较致密的结构，并因此较少蛋白酶的攻击点。此外，也可以考虑所述蛋白中在泛素相互作用中起作用的区域。在所述基因活性中心的突变体可以直接测试它们的活性。为了验证所述磷酯酶的功能，已经检查了多种Tilling突变体的诱导能力。取代D74N(第74位的天冬氨酸取代为天冬酰胺)或G78R(第78位的甘氨酸取代为精氨酸)导致0.2-0.4％的母体诱导率。为了可选地或额外地操作所述肌醇-1,4,5-三磷酸-5-磷酸酶或所述磷酸甘油酸变位酶,，必须搜索敲除突变体或搜索降低所述基因活性的额外的突变体。 [0183] 也可以改良Stock6衍生的诱导系。这是可能的，通过上述的转基因方法和通过导入所鉴定的候选基因中的突变。此外，有可能通过转基因或非转基因方法操作基因组中所述基因额外的拷贝，只要它们在花粉中表达。诱导能力的测试： [0184] 为了测试潜在诱导系的诱导能力，例如有如下可能： [0185] 1.向具有可见的隐性标记(例如对于玉米，有光泽的(Bordes et al.,1997)或无叶舌(Sylvester et al.,1990))的品系授粉。通过流式细胞术测试表达该特征的后代的单倍性。 [0186] 2.向与所述诱导系遗传学不同，最优通过多个标记不同的品系授粉。使用这些标记以鉴定纯合植物。通过流式细胞术测试这些植物的单倍性。 [0187] 采用两种可能来测试诱导能力。 [0188] 参考文献 [0189] Barret,P.,Brinkmann,M.,&Beckert,M.(2008).A major locus expressed in the male gametophyte with incomplete penetrance is responsible for in situ gynogenesis in maize.Theoretical and Applied Genetics,117(4),581-594. 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