用于肽合成的方法和用于实施肽固相合成方法的装置 |
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| 申请号 | CN201580063451.2 | 申请日 | 2015-09-29 | 公开(公告)号 | CN107207563A | 公开(公告)日 | 2017-09-26 |
| 申请人 | 苏尔福工具股份有限公司; | 发明人 | S·克瑙尔; T·M·L·勒泽; O·阿鲁狄那; H·科尔马; C·乌特; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及肽合成的方法，其中所述方法包括以下步骤：使第一 氨 基酸或第一肽与α‑胺保护的第二氨基酸在 溶剂 中反应，所述溶剂选自 水 、醇，和水与醇的混合物，和采用脱保护溶液除去α‑胺保护基。本发明还涉及保护剂、它们的用途和用于实施肽固相合成方法的装置。 | ||||||
| 权利要求 | 1.保护剂的用途，用于保护化学反应中的官能团， |
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| 说明书全文 | 用于肽合成的方法和用于实施肽固相合成方法的装置背景技术[0002] 肽是氨基酸的连接链，代表蛋白质的前体。肽和蛋白质是所有生命系统的基本组成部分，且涉及各种生命过程。在医学和生物科学中，它们有很多应用。因此，对人类生命来说，合成肽和蛋白质的能力非常重要。 [0003] 因此，肽的合成生产具有重要的意义。肽通过将一个氨基酸的羧基(C端)与另一个氨基酸的氨基或N端偶联来合成。在1963年，Merrifield等人介绍了肽固相合成法(SPPS)，旨在克服与溶液中肽组装相关的中间纯化问题(参见Stewart和Young的文章，Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Co.，2d ed，1984)；Chan和White的书籍，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach(Oxford University Press,2000))。在固相合成时，氨基酸连续偶联以产生具有所需序列的肽，而C-端锚定至不溶性的聚合物载体(固相)。一旦组装好所需的序列，就将肽从固体载体上裂解。 [0004] 该合成方案需要保护进入的氨基酸的α-氨基以避免自聚合。α-氨基官能团的标准保护基是酸不稳定的叔丁氧羰基(Boc)基团、碱不稳定的芴甲氧羰基(Fmoc)基团和烯丙氧羰基(Alloc)基团；在Pd催化的中性条件下，在作为烯丙基系的清除剂的PhSiH3存在下，α-氨基官能团的标准保护基被除去。 [0005] 根据上述三种α-氨基保护方案中的任一种肽固相合成法通常需要额外保护组成氨基酸的反应性侧链免于不想要的化学转化。因此，必要的是，这些保护基对偶联循环期间使用的试剂具有抗性。此外，对于α-氨基脱保护和链组装的条件，生长肽与固相载体的连接必须是稳定的。 [0006] 在基于Fmoc的α-氨基保护的情况下，侧链基团应该对用于除去Fmoc部分的碱性试剂具有抗性。在组装肽链后，通常采用温和的酸性试剂除去侧链保护基。在组装所需的肽链之后，通常采用无水HF、三氟甲磺酸或三氟乙酸(TFA)裂解这些侧链保护基。 [0007] 通常在极性非质子有机溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)和二氯甲烷(DCM)，或这些有机溶剂的混合物中进行肽组装程序，因为具有强疏水性的α-氨基保护基Fmoc和Boc不溶解于水并且经常用于SPPS中。此外，在SPPS中，通常使用的侧链保护基通常是疏水性的，并且使氨基酸不溶解于水中。 [0008] 应用Fmoc和Boc保护的SPPS方法得到了广泛使用，但需要上文提及的昂贵且有毒的有机溶剂。例如，DMF具有相当大的健康和环境隐患，它与人类的癌症有关，且它被怀疑会引起出生缺陷。因此，使用这些有毒溶剂需要特殊的技术设备和预防措施，例如，在通风橱下进行反应，和由高度专业化的人员进行处理。此外，处理使用过的溶剂是存在问题的且昂贵的。因此，使用有机溶剂的SPPS是昂贵的，且受限于具有用于有机化学合成的专用设备的专业化实验室。 [0009] 因此，为了避免上文提及的问题，基于水的肽合成方案，特别是SPPS，是非常令人满意的。 [0010] 为了尝试克 服这个问题 ，H ojo等人提出 了使用水溶性保 护基(Chem.Pharm.Bull.2004,52,422-427和Tetrahedron Lett.2004,45,9293)。为此目的，他们开发了几种保护基，其中有2-(苯基(甲基)磺酰基)乙氧基羰基四硫代硼酸酯(Pms)、乙磺酰基乙氧基羰基(Esc)和2-(4-磺基苯基磺酰基)乙氧基羰基(Sps)。在WO2013115813A1中，CEM公司声称了α，β-不饱和砜在水或水体系中的脱保护及它们在基于水的SPPS中的用途。 [0011] 然而，上文提及的保护基具有几个主要缺点：它们受限制的稳定性(例如对于Pms)，它们的中等溶解度(Esc)以及它们昂贵且复杂的合成和受限制的可用性，例如，因为它们的硫基团发生自动氧化(Sps)，排除了半胱氨酸和甲硫氨酸。作为第二考虑因素，这些α-胺保护基不显示出选择性吸收、UV或荧光信号，这些选择性吸收、UV或荧光信号可用于检测偶联氨基酸的量，或用于提供脱保护进行程度的指示。与传统的Fmoc基团不同，Pms和Esc在传统的UV监测中无法跟踪。Sps可以通过UV被监测，但是Sps的复杂和昂贵的合成往往会影响其使用。结果，这些化合物的水溶性增加不足以解决基于水的SPPS在整体上的问题。 [0012] 因此，本发明的目的是提供一种大体上用于肽合成的水相容性反应体系的改进方法和装置，特别是固相肽合成。 发明内容[0013] 在一个实施例中，本发明涉及在基于水的肽合成期间，适于在肽和/或氨基酸的官能团上形成保护基的保护剂，其中待保护的官能团优选选自胺、醇、巯基(thiol)和羧基，其中保护剂包含 [0014] I.一主链结构， [0015] II.至少一个水溶性增强官能团和 [0016] III.至少一个反应基团， [0018] -其中水溶性增强官能团选自由SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、CN、OSO3-酯、OPO32-酯及它们的组合组成的组，和 [0019] -其中水溶性增强官能团和反应基团通过至少一个共价键连接到主链结构上。 [0020] 本发明还涉及所述化合物的用途，用于在化学反应中保护官能团。在优选的实施例中，在基于水的肽合成期间，试剂用于在肽和/或氨基酸的官能团上形成保护基。优选地，待保护的官能团优选选自胺、醇、巯基和羧基。 [0021] 在优选的实施例中，水溶性增强官能团选自带电的官能团SO3-、PO32-、OSO3-酯、2- + OPO3 酯和N(CH3)3 。已证明了使用带电官能团作为水溶性增强官能团有益于提高水溶性，其比不带电的官能团更有效。保护剂可以包含一个或多个水溶性增强官能团，在优选的实施例中，保护剂包含不止一个水溶性增强官能团。在进一步优选的实施例中，保护剂包含至少两个水溶性增强官能团。在其它优选实施例中，保护剂包含1至8个、2至7个或3至4个水溶性增强官能团。发明人已经发现，由于水溶性增加到更大的程度，具有不止一个水溶性增强官能团的保护剂分子可能是有益的。在实施例中，主链结构是叔丁烷或苯基甲烷的一个水溶性增强官能团可能是足够的。 [0022] 在本发明的优选实施例中，保护剂包含全部是相同种类(特别是全部是SO3-类型)的水溶性增强官能团。在可选的实施例中，保护剂包含不同种类的水溶性增强官能团。只要水溶性增强官能团为SO3-，保护剂优选包含这些官能团中的至少2个。如果水溶性增强功能团全部都是相同的种类，保护剂的合成可以更高效和更容易。 [0023] 主链结构包含一部分，所述部分选自由9-甲基芴、叔丁烷和/或苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷组成的组。在优选的实施例中，主链结构选自9-甲基芴和叔丁烷。 [0024] 反应基团是合适的，即具有所需的化学反应性，以与待保护的官能团发生化学反应。其优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基氧基酯(oxycarbonyl Oxyma ester)、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、羟化物和巯基基团组成的组。当主链结构为9-甲基芴时，反应基团优选选自氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯和氧羰基O-琥珀酰亚胺。当主链结构为叔丁烷时，反应基团优选选自羟化物、卤化物、巯基、氧羰基O-琥珀酰亚胺和氧羰基酸酐。当主链结构选自苯基甲烷、二苯基甲烷和三苯基甲烷时，反应基团优选选自卤化物、氧甲基卤化物和氧羰基卤化物。 [0025] 本发明中，具有9-甲基芴主链结构的优选保护剂可以通过以下通式1来说明： [0026] [0027] 通式1 [0028] 其中，R1至R8独立地选自氢、SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯和CN，条件是，R1至R8中的至少一个(优选至少两个)选自SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯和CN。在优选的实施例中，R1至R8中不是SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯或CN的，全部都是氢。 [0029] R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基氧基酯、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、羟化物和巯基基团组成的组，其中R99优选选自氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯和氧羰基O-琥珀酰亚胺。 [0030] 在优选的实施例中，R2和R7选自SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯和CN，特别地，R2和R7是SO3-。优选地，R1、R3至R6和R8都是氢。 [0031] 在优选实施例中，R3和R6选自SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯和CN，特别地，R3和R6是SO3-。优选地，R1、R2、R4、R5、R7和R8都是氢。 [0032] 在优选的实施例中，R2和R6选自SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯和CN，特别地，R2和R6是SO3-。优选地，R1、R3、R4、R5、R7和R8都是氢。 [0033] 本发明中，具有9-甲基芴主链结构的优选保护剂如下表1所示。表中列出的化合物决不限制本发明的范围。根据本发明，它们构成说明性和优选的保护剂。 [0034] 表1 [0035] [0036] [0037] [0038] 本发明中，具有叔丁烷主链结构的优选保护剂可以用以下通式2来说明： [0039] [0040] 通式2 [0041] 其中R1选自SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯和CN。在优选实施例中，-R1是SO3。R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、羟化物和巯基基团组成的组，其中更优选地，R99选自羟化物、卤化物、巯基、氧羰基O-琥珀酰亚胺和氧羰基酸酐。 [0042] 本发明中，具有叔丁烷主链结构的优选保护剂如下表2所示。表中列出的化合物决不限制本发明的范围。根据本发明，它们构成说明性和优选的保护剂。 [0043] 表2 [0044] [0045] [0046] 本发明中，具有苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷主链结构的优选保护剂可以分别用以下通式3、4或5来说明： [0047] [0048] 通式3 [0049] 其中，R1至R5独立地选自氢、SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯和CN，条件是，R1至R5中的至少一个(优选至少两个)选自SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯和CN。在优选的实施例中，R1至R5中不是SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯或CN的，全部都是氢。 [0050] R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、羟化物和巯基组成的组，其中更优选地，R99选自卤化物、氧甲基卤化物和氧羰基卤化物。 [0051] 在优选的实施例中，R3选自SO3-、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+、OSO3-酯、OPO32-酯和CN，特别地，R3是SO3-。优选地，R1、R2、R4和R5都是氢。 [0052] [0053] 通式4 [0054] 其中，R1至R10独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R10中的至少一个(优选至少两个)选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R10中不是SO3-、PO32-、N(CH3)2、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0055] R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、羟化物和巯基基团组成的组，其中更优选地，R99选自卤化物、氧甲基卤化物和氧羰基卤化物。 [0056] 在优选的实施例中，R3和R8选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3和R8选自SO3-。优选地，R1、R2、R4至R7、R9和R10都是氢。 [0057] [0058] 通式5 [0059] 其中，R1至R15独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R15中的至少一个(优选至少两个、最优选的是至少三个)选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R15中不是SO3-、PO32-、N(CH3)2、- 2- +OSO3酯、OPO3 酯、N(CH3)3或CN的，全部都是氢。 [0060] R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、羟化物和巯基基团组成的组，其中更优选地，R99选自卤化物、氧甲基卤化物和氧羰基卤化物。在特别优选的实施例中，当R3、R8和R13是SO3-时，R99不是卤化-物。在另一个特别优选的实施例中，当R3、R8和R13是SO3时，R99不是氯化物。在优选的实施例中，R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基酸酐、氧甲基卤化物、羟化物和巯基基团组成的组。在特别优选的实施例中，R99不是卤化物，尤其不是氯化物。 [0061] 在优选的实施例中，R3、R8和R13选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3-。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15都是氢。 [0062] 本发明中，具有苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷主链结构的优选保护剂如下表3所示。表中列出的化合物决不限制本发明的范围。根据本发明，它们构成说明性和优选的保护剂。 [0063] 表3 [0064] [0065] [0066] 本发明还涉及用于保护化学反应中官能团的保护剂的用途。优选地，官能团存在于氨基酸、肽或蛋白质上，所述化学反应是在溶剂中的肽或蛋白质合成，所述溶剂选自水、醇，或水和醇的混合物。 [0067] 方法 [0068] 本发明涉及一种肽合成方法，其包括以下步骤：使第一氨基酸或第一肽与α-胺受保护的第二氨基酸或第二肽在溶剂中反应，所述溶剂选自由水、醇，和水与醇的混合物组成的组，并采用脱保护溶液除去α-胺保护基，其特征在于，α-胺保护基是本文所描述的其中一种保护剂与第二氨基酸或第二肽的α-胺官能团的反应产物。在优选的实施例中，α-胺保护基是以下式6至式10中的至少一种。在每种情况下，以下通式所示的氮属于受保护的氨基： [0069] [0070] 通式6 [0071] 其中，R1至R15独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选的是R1至R15中的至少三个选自SO3-、PO32-、N(CH3)2、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R15中不是SO3-、2- - 2- + PO3 、N(CH3)2、OSO3酯、OPO3 酯、N(CH3)3或CN的，全部都是氢。 [0072] 在优选的实施例中，R3、R8和R13选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3-。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。 [0073] [0074] 通式7 [0075] 其中R1至R8独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R8中的至少一个，优选至少两个，选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R8中不是SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0076] 在优选实施例中，R2和R7选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R2和R7是SO3-。优选地，R1、R3至R6和R8是氢。 [0077] 在优选实施例中，R3和R6选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3和R6是SO3-。优选地，R1、R2、R4、R5、R7和R8是氢。 [0078] 在优选实施例中，R2和R6选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R2和R6是SO3-。优选地，R1、R3、R4、R5、R7和R8是氢。 [0079] [0080] 通式8 [0081] 其中，R1至R5独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，- 2- - 2-条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3、PO3 、OSO3酯、OPO3 酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R5中不是SO3-、PO32-、N(CH3)2、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0082] 在优选的实施例中，R3选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特-别地，R3是SO3。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。 [0083] [0084] 通式9 [0085] 其中，R1至R10独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R10中的至少一个，优选至少两个，选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R10中不是SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N+(CH3)3或CN的，全部都是氢。 [0086] 在优选的实施例中，R3和R8选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3和R8选自SO3-。优选地，R1、R2、R4至R7、R9和R10是氢。 [0087] [0088] 通式10 [0089] 其中R1选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选实施例中，R1是SO3-。 [0090] 在特别优选的实施例中，α-胺保护基是9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基或叔丁基-(2-磺酸酯)氧羰基(Sboc)。如本文所使用的，术语“Smoc”表示9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基或9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基。 [0091] 与现有技术中的受保护的氨基酸或肽相比，根据本发明的受保护的氨基酸和肽，尤其是Smoc和Sboc保护的氨基酸，其结构更易溶解于水中，尤其是Fmoc和Boc保护的氨基酸。原因是，本发明将水溶性增强官能团加入到保护剂中，尤其是磺基(SO3-)基团。因此，本发明的其中一个优点是利用以其受保护形式溶解于水的氨基酸和/或肽，以及仅使用水、仅使用醇或仅使用水-醇混合物用于肽合成的能力，即不使用其它溶解增强添加剂且不需要使用有毒溶剂。在含溶剂的无毒的水和/或醇中进行的肽合成提供了用于制药和生物应用的各种优点。 [0092] 优选的溶剂是水，以及水-醇混合物，水是最优选的溶剂。优选的醇是甲醇、乙醇、异丙醇、2-丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇或其混合物。 [0093] 如本文所使用的，术语“以其受保护形式溶解于水”是指组合物具有在水性溶剂体系中进行所需反应所必需的溶解度的程度。如在任何组合物的情况下，术语“溶解”并不意味着任何或所有量的无限溶解度。 [0094] 适合使用于本发明的脱保护溶液优选包含酸或碱，优选是水溶性的酸或碱，即酸和/或碱优选是水溶性的。优选的酸是磷酸、盐酸或三氟乙酸。优选的碱是胺和氨。优选的脱保护溶液是胺和/或氨水溶液。碱的使用量达到使官能团脱保护所必需的程度。某些有机碱的溶解度可能会限制可以溶解于水、醇，或水与醇混合物中的量。合适的碱是具有一溶解度的碱，该溶解度允许溶解足够量以在所选择的溶剂中进行脱保护。 [0095] 用于脱保护Sboc基团的脱保护溶液优选包含水溶性酸，例如磷酸、盐酸或三氟乙酸。 [0096] 用于脱保护Smoc基团的脱保护溶液优选包含水溶性碱，例如胺或氨。水溶性碱的使用量达到使肽脱保护所必需的程度。某些有机碱的溶解度可能会限制可以溶解于水、醇，或水与醇混合物中的量。合适的碱是具有一溶解度的碱，该溶解度允许溶解足够量以在所选择的溶剂中进行脱保护。 [0097] 应当理解的是，在脱保护后，可以使用其它氨基酸或其它肽重复反应和脱保护步骤，其中所述其它氨基酸和/或其它肽的α-氨基优选采用根据本发明的保护基保护，尤其是Smoc基团或Sboc基团，直到获得所需的靶肽。 [0098] 在本发明的优选实施例中，采用侧链保护基保护所述第一氨基酸或第一肽和/或所述第二氨基酸或第二肽的任何反应性侧链官能团，其优选包含至少一个水溶性增强官能团。侧链保护基可以包含磺酸基或磺酸酯。该方法优选包含除去侧链保护基的步骤。侧链保护基的水溶性增强官能团为侧链保护的氨基酸或肽提供水溶性。合适的侧链保护基是上述其中一种保护剂与氨基酸或肽的相应侧链官能团的反应产物。 [0099] 关于侧链保护基，优选的胺保护基是以下式11至式15所示的那些胺保护基，其中氮属于受保护的氨基。 [0100] [0101] 通式11 [0102] 其中，R1至R15独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选的是R1至R15中至少三个，选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R15中不是SO3-、2- - 2- + PO3 、OSO3酯、OPO3 酯、N(CH3)2、N(CH3)3或CN的，全部都是氢。 [0103] 在优选的实施例中，R3、R8和R13选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3-。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。 [0104] [0105] 通式12 [0106] 其中R1至R8独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R8中的至少一个，优选至少两个，选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R8中不是SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0107] 在优选实施例中，R2和R7选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R2和R7是SO3-。优选地，R1、R3至R6和R8是氢。 [0108] 在优选的实施例中，R3和R6选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3和R6是SO3-。优选地，R1、R2、R4、R5、R7和R8是氢。 [0109] 在优选实施例中，R2和R6选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R2和R6是SO3-。优选地，R1、R3、R4、R5、R7和R8是氢。 [0110] [0111] 通式13 [0112] 其中R1至R5独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N+ - 2- - 2-(CH3)3 和CN。在优选的实施例中，R1至R5中不是SO3 、PO3 、OSO3 酯、OPO3 酯、N(CH3)2、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0113] 在优选的实施例中，R3选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3是SO3-。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。 [0114] [0115] 通式14 [0116] 其中R1至R10独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R10中的至少一个，优选至少两个，选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R10中不是SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0117] 在优选的实施例中，R3和R8选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3和R8选自SO3-。优选地，R1、R2、R4至R7、R9和R10是氢。 [0118] [0119] 通式15 [0120] 其中R1选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选实施例中，R1是SO3-。 [0121] 在特别优选的实施例中，侧链胺保护基选自9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基、三(4-磺苯基)甲基(SulfoTrt)、叔丁基-(2-磺酸基)氧羰基(Sboc)和4-磺基-苄氧羰基(SulfoCBz)。 [0122] 优选的醇保护基如以下式16至式19所示： [0123] [0124] 通式16 [0125] 其中，R1至R5独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R5中不是SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N+(CH3)3或CN的，全部都是氢。 [0126] 在优选的实施例中，R3选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3是SO3-。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。 [0127] [0128] 通式17 [0129] 其中，R1至R5独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R5中不是SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0130] 在优选的实施例中，R3选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3是SO3-。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。 [0131] [0132] 通式18 [0133] 其中R1选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选实施例中，R1是SO3-。 [0134] [0135] 通式19 [0136] 其中，R1至R15独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选的是R1至R15中的至少三个，选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R15中不是- 2- - 2- +SO3、PO3 、OSO3酯、OPO3 酯、N(CH3)2、N(CH3)3或CN的，全部都是氢。 [0137] 在优选的实施例中，R3、R8和R13选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3-。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。 [0138] 在特别优选的实施例中，醇保护基选自4-磺苄基(BzS)、4-磺基-苄氧基甲基(BOMS)、三(4-磺苯基)甲基(SulfoTrt)和叔丁基-1-磺酸酯基(tBuS)。 [0139] 优选的巯基保护基如式20和式21所示： [0140] [0141] 通式20 [0142] 其中，R1至R15独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选的是R1至R15中的至少三个，选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选实施例中，R1至R15中不是SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0143] 在优选的实施例中，R3、R8和R13选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3-。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。 [0144] [0145] 通式21 [0146] 其中R1选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选实施例中，R1是SO3-。 [0147] 在特别优选的实施例中，巯基保护基选自三(4-磺苯基)甲基(SulfoTrt)和1-磺基-2-甲基-2-丙硫醇基(StBuS)。 [0148] 优选的羧基保护基是下式22至式25所示的那些保护基： [0149] [0150] 通式22 [0151] 其中，R1至R15独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选的是R1至R15中的至少三个，选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R15中不是SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0152] 在优选的实施例中，R3、R8和R13选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3-。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。 [0153] [0154] 通式23 [0155] 其中R1选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选实施例中，R1是SO3-。 [0156] [0157] 通式24 [0158] 其中，R1至R5独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R5中不是SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0159] 在优选实施例中，R3选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3是SO3-。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。 [0160] [0161] 通式25 [0162] 其中，R1至R5独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R5中不是SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+或CN的，全部是氢。 [0163] 在优选实施例中，R3选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3是SO3-。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。 [0164] 在特别优选的实施例中，羧基保护基选自4-磺苄基(BzS)、4-磺基-苄氧基甲基(BOMS)、三(4-磺苯基)甲基(SulfoTrt)和叔丁基-1-磺酸酯基(tBuS)。 [0165] 以下是最优选的保护基的概览。 [0166] [0167] 在本发明的进一步优选实施例中，该方法是固相肽合成的改进，其中所述第一氨基酸或第一肽的C-端锚定于不溶性载体，其优选是聚合的。通过使用不溶性载体，将生长肽的中间纯化工作最小化。每个反应步骤之后，通过在溶剂中洗涤锚定的肽可以容易地进行纯化，所述溶剂优选选自水、醇，以及水与醇的混合物。 [0168] 在一个实施例中，所述方法还包含当肽完整时，采用裂解组合物从聚合物载体上裂解所得到的肽的步骤。 [0169] 合适的裂解组合物和方法是本领域技术人员公知的。通常，采用酸，如三氟乙酸和氢氟酸(HF)进行裂解步骤。优选地，适合用于从聚合物载体上裂解所需肽的酸会同时除去连接到靶肽的氨基酸上的侧链保护基。 [0172] 在本发明的特别优选的实施例中，α-胺保护基包含荧光结构，尤其是9-甲基芴主链结构，该方法还包含通过测量荧光来监测肽键形成程度和/或监测去除α-胺保护基的程度，所述荧光由与第一氨基酸或第一肽偶联的α-胺保护基产生。在优选的实施例中，包含9-甲基芴主链结构的保护基是9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基或9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基。 [0173] 在固相肽合成中，在采用UV光照射载体后，通过监测荧光强度的变化和测量由荧光保护基产生的荧光来监测肽键的形成程度和/或监测荧光保护基(例如Smoc)的去除程度，所述荧光保护基通过第一氨基酸或第一肽与不溶性载体材料偶联。 [0174] 令人惊奇地观察到，含有9-甲基芴的保护基，例如9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基和9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基，具有固有的荧光性质。这些保护基的荧光性质在脱保护和偶联反应中的任一个或两者完成之后提供了监测的机会。在本发明的一些优选实施例中，保护剂和相应的保护基含有两个或更多个连接到芳香族芴基环系上的磺基，所述芳香族芴基环系例如9-(3,6-二磺基)芴基甲氧基-羰基和9-(2,7-二磺基)芴基甲氧基-羰基。在这些化合物中，与在SPPS期间逐步组装肽期间使用的常用试剂相比，连接到芳香族芴基环系上的两个或多个磺基(SO3-)基团是独特的。这些化合物，例如Smoc，可以通过其固有的荧光来监测，以便确定在每个反应步骤的终点所存在的化合物的量。 [0175] 可以使用载体上的荧光基团(例如Smoc)的证据来确定荧光地受保护的氨基酸的成功偶联，以便决定是否必须重复偶联步骤以基本上完成肽键的形成。同样地，载体上的荧光基团的证据可用于确定在脱保护步骤的终点的荧光基团的不完全去除，以便确定是否必须重复脱保护步骤以基本上完成荧光保护基的去除。 [0176] 通常，第一氨基酸或第一肽与α-胺保护的第二氨基酸或第二肽反应的偶联步骤包含添加入偶联剂。 [0177] 本发明还涉及适合使用于本发明方法的偶联剂。典型的偶联剂选自由碳二亚胺和三唑组成的组。优选的碳二亚胺是二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、2-(((乙基亚氨基)亚甲基)氨基)-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(ESC)和2,2'-(亚甲基双(氮杂亚基))双(2-甲基丙烷-1-磺酸酯)(2,2’- (methanediylidenebis(azanylylidene))bis(2-methylpropane-1-suofonate))(DSC)。优选的三唑是O-苯并三唑基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1H-苯并三唑-]-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、Boc-组氨酸(甲苯磺酰)；B01'和B01'-Cl、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸酯(PyBOB)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。 [0178] 在本发明的优选实施例中，偶联剂包含磺酸基。磺酸基增加了偶联剂在含水的溶剂中的溶解度，并允许后续通过阴离子交换来分离偶联剂。 [0179] 优选的偶联剂是下式26至式30所示的偶联剂： [0180] [0181] 通式26 [0182] 其中R1优选选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R1是SO3-。R2优选选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R2是SO3-。R1和R2可以相同或不同。 [0183] [0184] 通式27 [0185] 其中R1选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R1是SO3-。R66优选选自短链烷基，优选的是C1至C8烷基，更优选的是C1至C4烷基。 [0186] [0187] 通式28 [0188] 其中R1选自SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R1是SO3-。 [0189] [0190] 通式29 [0191] 其中R1选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R1是SO3-。 [0192] [0193] 通式30 [0194] 其中，R1至R4独立地选自氢、SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，条件是，R1至R4中的至少一个，优选至少两个，选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN。在优选的实施例中，R1至R4中不是SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+或CN的，全部都是氢。 [0195] 在优选实施例中，R3选自SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-、N(CH3)2、N(CH3)3+和CN，特别地，R3是SO3-。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。 [0196] 在优选的实施例中，R50选自一个或多个羟基或下述式30.1至30.4中给出的其中一个取代基，其中B表示通式30的结构： [0197] [0198] 通式30.1 [0199] [0200] 通式30.2 [0201] [0202] 通式30.3 [0203] [0204] 通式30.4 [0205] 特别优选的偶联剂选自由2-(((乙基亚氨基)亚甲基)氨基)-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(ESC)、2,2'-(亚甲基双(氮杂亚基))双(2-甲基丙烷-1-磺酸酯)(DSC)和2-((((3-(二甲基氨基)丙基)亚氨基)亚甲基)氨基)-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(MPSC)组成的组，以及是N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和2-(2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酰氧基)-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(Cyms)。 [0206] [0207] 其中R选自C1至C8烷基，优选是C1至C4烷基。 [0208] 通式31(ESC) [0209] [0210] 通式32(DSC) [0211] [0212] 通式33(MPSC) [0213] [0214] 通式34(Cyms) [0215] 偶联步骤还可以包含加入封端剂。所描述的封端剂及其在肽合成方法中用于封端游离胺的用途形成本发明的独立部分。封端剂可用于本发明的方法中，但它们也可用于肽合成的其它方法中。封端剂有益于促进所得产品组合物的简单、安全和经济有效的纯化。封端剂允许在偶联步骤之后封端游离胺，以防止副产物的形成，其中封端剂包含 [0216] I.一主链结构， [0217] II.至少一个水溶性增强官能团和 [0218] III.至少一个反应基团， [0219] -其中主链结构包含一部分，所述部分选自短链烷基，优选是C1至C8烷基、环烷基链或芳香族化合物，更优选的是C1至C4烷基或苄基， [0220] -其中所述水溶性增强官能团选自由SO3-、PO32-、OSO3-酯、OPO32-酯、N(CH3)2、N(CH3)3+、CN及其组合组成的组，以及 [0221] -其中水溶性增强官能团和反应基团通过至少一个共价键连接到主链结构上。 [0222] 反应基团优选选自由羧酸、羧酸卤化物、羧酸O-琥珀酰亚胺、羧酸氧甲酯(carboxylic acid Oxyma ester)、羧酸酐、卤化物和巯基基团组成的组。 [0223] 在本发明的一个实施例中，根据本发明，在肽合成方法中添加入封端剂。在可选的实施例中，封端剂在肽合成的另一方法中加入，该另一方法包括以下步骤：使第一氨基酸或第一肽与α-胺受保护的第二氨基酸或第二肽在溶剂中反应，以及采用脱保护溶液去除α-胺保护基，其特征在于，将封端剂添加到反应混合物中，用于封端游离胺。封端剂选自上述的那些封端剂。反应完成后，使反应混合物通过亲和层析柱，以纯化反应混合物。亲和层析柱优选选自阴离子或阳离子交换柱。 [0224] 在偶联后，水溶性增强官能团使纯化容易。在本发明的优选实施例中，封端剂包含磺基。 [0225] 优选的封端剂是2-磺基乙酸或4-磺基苯甲酸。 [0226] [0227] 在本发明的另一个优选实施例中，所述方法还包括至少一个冲洗步骤，所述冲洗步骤使用选自由水、醇，和水与醇的混合物组成的组的溶剂，以及收集在冲洗步骤中获得的废液的步骤，将废液与亲和层析柱接触，优选固体阴离子和/或阳离子交换载体，从而保留废弃化合物中的水溶性增强官能团，尤其是带电官能团，例如SO3-、OSO3-酯、OPO32-酯、PO32-+和N(CH3)3 。使用阴离子交换载体除去含有至少一个磺基的化合物是特别有效的。随后，可以通过再生亲和层析柱，优选是固体阴离子和/或阳离子交换载体来收集废弃化合物，并处理。或者，可以处理亲和层析柱，优选是含有废弃化合物的阴离子和/或阳离子交换载体材料。 [0228] 冲洗步骤通常在偶联步骤之后和脱保护步骤之后进行。阴离子和/或阳离子交换步骤允许除去所有含磺基的化合物，例如未反应或裂解的保护基和试剂，例如，如本文所述的来自冲洗溶液的偶联剂和封端剂。废弃化合物保留在阴离子或阳离子交换柱上，得到纯化的溶剂。保留的化合物可以与阴离子交换材料或阳离子交换材料一起处理，也可以在洗脱之后处理，且只需处理最少量的化学废弃物。 [0229] 在本发明进一步优选的实施例中，所述方法还包括在裂解步骤之后的纯化步骤，其中将含有脱保护的和裂解的靶蛋白或肽的溶液与亲和层析柱接触，优选固体阴离子和/或阳离子交换载体，从而保留废弃化合物例如包含磺基的废弃化合物，并收集纯化的靶蛋白。在优选的实施例中，废弃化合物包含至少一个作为保护基和其它试剂的一部分的磺基。由于有含磺基保护基和含磺基试剂，可以通过亲和层析柱(优选是离子交换方法)基本上除去在溶剂中的偶联、脱保护和裂解反应期间产生的过量化学物质和副产物，所述溶剂选自水、醇，和水与醇的混合物组成的组。当然，这也适用于其它带电官能团。只有靶肽才能够穿过离子交换柱，而肽副产物、保护基残留物和过量的试剂保留在柱上。在柱再生后，仅有最- - 2- 2- 少量的化学废弃物必需处理。这是使用带电官能团，例如SO3 、OSO3酯、OPO3 酯、PO3 和N(CH3)3+的有益效果。但是，即使使用一个或多个不带电的官能团，该方法仍然可以在水中进行，从而减少废弃化学品的量(与现有技术的方法相比)。 [0230] 本发明的优选方面涉及保护剂，所述保护剂选自由9-(3,6-二磺基)芴基甲氧基-羰基卤化物(Smoc卤化物)、9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基N-羟基琥珀酰亚胺(Smoc-NHS)、9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基O-琥珀酰亚胺(Smoc OSu)、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基卤化物(Smoc卤化物)、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基N-羟基琥珀酰亚胺(Smoc-NHS)、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基O-琥珀酰亚胺(Smoc OSu)、三(4-磺苯基)甲基卤化物(SulfoTrt卤化物)、叔丁基-(2-磺酸酯)氧羰基酸酐(Sboc2O)、叔丁基-(2-磺酸酯)氧羰基O-琥珀酰亚胺(Sboc-OSu)、4-磺基-羰基苄氧基卤化物(SulfoCBz卤化物)、2-羟基-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(tBuS)、2-溴-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(tBuS)、2-巯基-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(StBuS)、4-磺基苄基卤化物(BzS卤化物)和4-磺基-苄氧基甲基卤化物(BOMS卤化物)组成的组。 [0231] 根据本发明，优选的卤化物是氯化物和溴化物。上述化合物是用于在有机化学的化学反应中保护官能团的有用试剂，例如，所述官能团是胺基、醇基、巯基或羧基。 [0232] 本发明的另一方面涉及修饰的氨基酸、肽及其盐，其包含保护基，所述保护基选自由上述通式6至通式25所示的那些保护基组成的组，更优地，选自由上述通式6至通式10所示的那些保护基组成的组。在特别优选的实施例中，这些保护基包括9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基、三(4-磺苯基)甲基(SulfoTrt)、叔丁基-(2-磺酸基)氧羰基(Sboc)、4-磺基-苄氧羰基(SulfoCBz)、叔丁基-1-磺酸酯基(tBuS)、1-磺基-2-甲基-2-丙硫醇基(StBuS)、4-磺苄基(BzS)和4-磺基-苄氧基甲基(BOMS)。 [0233] 本发明的另一方面涉及一种用于实施肽的固相合成方法的装置。所述装置包括反应器和荧光计，所述反应器用于接收不溶性(例如聚合物)载体材料，所述荧光计布置用于监测荧光强度变化，所述荧光强度变化由与不溶性载体材料偶联的保护基产生。由于本发明的保护剂(例如Smoc)的固有荧光，不溶性载体材料的荧光强度的定量分析提供了关于在上述提及的SPPS方法中的偶联反应或脱保护反应进度的信息。将荧光计集成到肽合成装置中可以使自动化合成加速。 [0234] 在本发明的优选实施例中，该装置还包括至少一个固体阴离子和/或阳离子交换载体，其设置用于分离废弃化合物。固体阴离子和/或阳离子交换载体可以设置在产物流内，以将靶蛋白与废弃化合物(例如，含磺基的肽副产物、保护基残留物和过量的试剂)分离。替代地或此外，可以在废物流内设置固体阴离子交换载体，以便在偶联和脱保护步骤后，将获得的冲洗溶液与废弃化合物(例如，过量的试剂和副产物)分离。 [0236] 图1示意性地示出了用于实施如上文所描述的优选方法的自动固相肽合成仪装置的整体布局。该装置包括含有锚定至不溶性聚合物载体的第一氨基酸或第一肽的反应器1，包括用于提供偶联剂、封端剂、裂解剂等的多个贮器的试剂容器2、溶剂容器3和包括用于提供受保护的氨基酸和/或肽的多个贮器的氨基酸和/或肽容器4。 [0238] 该装置包括荧光计5，其设置用于测量监测反应器1的内容物的荧光强度的变化。应当理解的是，或者，反应器1可以包括集成的荧光计5。 [0239] 反应器配备有用于在每个冲洗步骤之后除去废物流的废液出口6和用于在裂解步骤之后除去产物流的产物出口7。废液出口6通过废料管8连接至腔室9和第一离子交换柱10，在腔室9中，调节废物流的pH以用于后续分离。产物出口7通过产物管11连接到第二离子交换柱12。 [0240] 离子交换柱10、11设置用于保留随后必须处理的磺化废弃化合物，例如副产物、过量的试剂和保护基残留物。来自第一离子交换柱10的纯化溶剂流可以导入下水道系统或再循环。来自第二离子交换柱12的纯化产物流用于获得靶蛋白。 [0241] 采用以下实施例说明本发明，但不受限于以下实施例。实施例： [0242] 实施例1：9-(3，6-二磺基)芴甲氧基羰基氯(Smoc-Cl)的合成 [0243] 采用20mL浓硫酸处理2g(7.73mmol)Fmoc-氯。反应混合物停止反应后，得到2.96g(7.07mmol，91.4％)浅黄色固体状的粗Smoc-氯。 [0244] [0245] Smoc-氯的分析数据： [0246] 1H NMR(500MHz，D2O)δ＝7.80(s，2H)，7.69(d，J＝7.9Hz，2H)，7.48(d，J＝7.8Hz，2H)，3.84(d，J＝4.8Hz，2H)，3.45(t，J＝4.7Hz，1H). [0247] 13C NMR(126MHz，D2O)δ＝145.57，142.54，141.65，125.16，121.61，120.90，62.54，49.65. [0248] 实施例2：9-(2，7-二磺基)芴甲氧基羰基氯(Smoc-Cl)的合成 [0249] 采用20mL浓硫酸处理2g(7.73mmol)Fmoc-氯并加热至100℃。采用NaOH(pH9.5)中和硫酸，减压除去溶剂，采用NMR分析确认了目标中间体的形成。将中间体再次溶解于20％硫酸水溶液中，搅拌6小时，形成9-(2，7-二磺基)芴基甲醇。采用NaOH(pH6.7)中和硫酸，减压除去溶剂。将1.2eq.碳酰氯(phosgene)的溶液在25ml DCM中冷却至0℃，并在搅拌下缓慢加入9-(2，7-二磺基)芴基甲醇(Carpino and Han，The Journal of Organic Chemistry 1972，37，(22)，3404-3409)。将溶液在冰浴中搅拌1小时，然后在冰浴温度下静置4小时。减压除去溶剂和过量的碳酰氯，得到相应的产物。 [0250] [0251] NMR中间体： [0252] 1H NMR(300MHz，D2O)δ：6.09(s，2H)，7.23-7.40(m，2H)，7.72(s，2H)，7.95(d，J＝6.2Hz，2H). [0253] 13C NMR(75MHz，D2O)δ：142.61，132.99，131.74，130.23，129.28，127.22，125.57，124.69. [0254] 9-(2，7-二磺基)-芴甲氧基羰基氯的LC-APCI-MS： [0255] 采用LC-APCI-MS计算C15H9ClO22·m/z：256.03。测量的m/z：256.94[M-H-2xSO3]-。 [0256] 实施例3：Smoc-Gly-OH(Smoc-甘氨酸)的合成 [0257] 采用30mL浓硫酸处理2.5g(8.41mmol)Fmoc-甘氨酸。反应混合物停止反应后，得到3.7g(8.09mmol，96.2％)浅黄色粉末状的粗Smoc-甘氨酸。 [0258] [0259] Smoc-甘氨酸的分析数据： [0260] 采用LC-APCI-MS计算C17H14NO10S2-m/z：456.01。测量的m/z：455.85[M-H]-。 [0261] 1H NMR(500MHz，D2O)δ＝8.01(s，2H)，7.87(d，J＝7.gHz，2H)，7.79(d，J＝8.0Hz，2H)，5.95(s，NH)，4.41(d，J＝6.2Hz，2H)，4.01(t，J＝6.2Hz，1H)，3.67(s，2H).[0262] 13C NMR(126MHz，D2O)δ＝158.21，144.94，142.41，141.88，125.51，122.09， 121.09，65.75，46.95，44.39. [0263] 实施例4：Smoc-L-Ala-OH(Smoc-丙氨酸)的合成 [0264] 采用30mL浓硫酸处理2.5g(8.03mmol)Fmoc-L-丙氨酸。反应混合物停止反应后，得到3.8g(7.64mmol，95.1％)白色粉末状的粗Smoc-L-丙氨酸。 [0265] [0266] (dd，2H)，5.94(s，NH)，3.95(m，OH+2H)，3.85(q，J＝7.4Hz，1H)，2.93(t，J＝1.64Hz，1H)，1.01(d，J＝7.3Hz，3H). [0267] 13CNMR(126MHz，MeOD)δ＝175.11，158.10，146.21，145.89，145.44，143.54，。127.09，124.04，123.90，121.40，67.23，51.05，48.51，17.58. [0268] 实施例5：Smoc-L-Ile-OH(Smoc-异亮氨酸)的合成 [0269] 采用30mL浓硫酸处理2.5g(7.07mmol)Fmoc-L-异亮氨酸。反应混合物停止反应后，得到3.8g(6.82mmol，96.4％)白色粉末状的粗Smoc-L-异亮氨酸。 [0270] [0271] Smoc-异亮氨酸的分析数据： [0272] 采用LC-APCI-MS计算C21H22NO7S·m/z：432.11，测量的m/z：432.06[M-HSO3]-。 [0273] 1H NMR(500MHz，MeOD)δ＝7.79(d，J＝16.5Hz，2H)，7.57(d，J＝8.0Hz，2H)，7.55(dd，J＝8.0，1.5Hz，2H)，4.15-3.89(m，OH+2H)，3.77(d，J＝6.2Hz，1H)，2.93(t，J＝1.6Hz，1H)，1.50(dtd，J＝13.2，10.1，6.7Hz，1H)，1.20-1.05(m，1H)，0.97-0.81(m，1H)，0.55(d，J＝6.86Hz，3H)，0.54(t，J＝7.43Hz，3H). [0274] 13C NMR(126MHz，MeOD)δ＝173.98，158.49，146.15，145.45，143.48，127.09，124.02，123.95，121.38，67.33，60.30，48.55，38.31，26.30，15.98，11.66.[0275] 实施例6：Smoc-L-Leu-OH(Smoc-亮氨酸)的合成 [0276] 采用30mL浓硫酸处理2.5g(7.07mmol)Fmoc-L-亮氨酸。反应混合物停止反应后，得到3.6g(7.01mmol，99.1％)白色粉末状的粗Smoc-L-亮氨酸。 [0277] [0278] Smoc-亮氨酸的分析数据： [0279] 采用LC-APCI-MS计算C21H22NO7S·m/z：432.11。测量的m/z：432.06[M-HSO3]-。 [0280] 1H NMR(500MHz，，MeOD)δ＝7.80(d，J＝18.0Hz，2H)，7.58(d，J＝8.1Hz，2H)，7.57(dd，J＝8.3，4.1Hz 2H)，4.11-3.93(m，OH+2H)，3.86(dd，J＝9.9，5.3Hz，1H)，2.94(t，1H)，1.41-1.31(m，1H)，1.30-1.17(m，2H)，0.57(dd，J＝14.7，6.5Hz，6H). [0281] 13C NMR(126MHz，MeOD)δ＝175.08，158.41，146.18，145.95，145.38，143.52，127.10，124.07，123.97，121.40，67.27，53.99，48.54，41.47，25.86，23.27，21.78.[0282] 实施例7：Sulfo-Trt的合成 [0283] 在加热的圆底烧瓶中，在氮气氛下，将237mg(9.75mmol，3.0eq.)镁悬浮于10mL THF中。在剧烈搅拌(vicious steering)下，向该混合物中加入1/10的在15mL THF中的1.878g(9.75mmol，3eq.)4-氯苯磺酸溶液。为了开始格氏反应，将混合物加热回流并加入一滴溴。然后逐滴地加入剩余部分的4-氯苯磺酸溶液，并将混合物再回流30分钟，接着冷却至室温。 [0284] 第二步采用高知偶联法(Kochi’s coupling method)。为此，将三口烧瓶置于氮气气氛下，并采用在甲醇中的干冰悬浮液将其冷却至-78℃。然后添加入50mL THF，接着添加入0.361mL(3.25mmol，1eq.)四氯化碳和0.325ml(0.03mmol，0.01eq.，0.1mol/L在THF中的溶液)四氯合铜酸二锂(II)。向该溶液中逐滴加入预先制备好的格氏试剂。在-78℃下搅拌1小时，在0℃下搅拌6小时后，将混合物温热至室温并再搅拌18小时。通过加入20mL水将溶液淬灭(quenched)。在减压下除去挥发性成分，得到1.69g褐色固体形式的粗4，4′，4″-(羟基甲烷三基)三苯磺酸酯(Sulfo-Trt)。通过半制备型RP-HPLC将产物分离。采用亚硫酰氯(SOCl2)处理4，4′，4″-(羟基甲烷三基)三苯磺酸酯，形成三(4-磺苯基)甲基氯(Sulfo-Trt氯)。减压除去溶剂。 [0285] [0286] Sulfo-Trt的分析数据： [0287] 1H NMR(500MHz，D2O)δ＝7.68(d，J＝8.6Hz，6H)，7.44(d，J＝8.6Hz，6H).[0288] 13C NMR(126MHz，D2O)δ＝140.99，136.88，128.96，127.02，75.45. [0289] 实施例8：2-羟基-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(tBuS-OH)的合成。 [0290] 采用50ml水将6,00g 2-甲基-2-丙烯-1-磺酸钠盐稀释。加入10ml硫酸，在室温下搅拌反应过夜。通过CaCO3沉淀除去硫酸。减压除去溶剂。得到白色粉末状产物。采用LC-MS和NMR分析确认目标化合物。 [0291] [0292] tBuS-OH的分析数据： [0293] 采用ESI-MS计算C4H9O4S-m/z：153.18，测量的m/z：152.9[M-H]-。 [0294] 1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：1.18(s，6H)，2.67(S，2H)，5.20(S.1H).[0295] 13C NMR(126MHz，DMSO)δ：67.84，61.81，39.52，29.65. [0296] 实施例9：2-溴-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(tBuS-Br)的合成。 [0297] 采用20ml HBr(48％w/w)将6,00g 2-甲基-2-丙烯-1-磺酸钠盐稀释。减压除去溶剂。得到白棕色粉末产物。采用LC-MS和NMR分析确认目标化合物。 [0298] [0299] tBuS-Br的分析数据： [0300] 采用ESI-MS计算C4H8BrO3S-m/z：216，07，测量的m/z：216，8[M-H]-。 [0301] 实施例10：2-巯基-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(StBuS)的合成。 [0302] 采用25ml浓HCl将3,00g 2-甲基-2-丙烯-1-磺酸钠盐稀释，并将反应溶液搅拌过夜。然后用NaOH(pH＝6.8)将酸中和，减压除去溶剂。在加热的圆底烧瓶中，在氮气氛围下，将233，67mg镁悬浮在20mL THF中。在剧烈搅拌下加入1，5g在15mL THF中的tBuS-Cl悬浮液。为了开始格氏反应，将混合物加热至回流(70℃)，加入一滴溴，再将混合物回流90分钟，然后冷却至室温。将4eq.硫添加入格氏试剂中并搅拌8小时。然后加入200ml水。将混合物在室温下搅拌2小时。随后，减压除去溶剂，采用NMR分析所得白色粉末。 [0303] [0304] StBuS分析数据： [0305] 1H NMR(500MHz，Deuterium Oxide)δ：1.56(s，6H)，2.18(s，J＝1.3Hz，1H)，3.67(s，2H). [0306] 13C NMR(126MHz，D2O)δ：61.66，32.13，28.48. [0307] 实施例11：(9-BBN)-Lys(SBoc)的合成 [0308] 将1,68g赖氨酸悬浮于无水THF中，在惰性气体下，添加入在THF(0.5mol/L)中的24.28ml9-硼二环(3.3.1)壬烷(9-BBN)。将所得悬浮液在100℃回流18h。减压除去溶剂。采用20ml THF将(9-BBN)-Lys稀释，在惰性气体下，添加入1.97g 1，1′-羰基二咪唑和2.54g tBuS-OH。将所得溶液搅拌5小时。减压除去溶剂，采用DCM将所得粗产物洗涤3次以除去咪唑残基。 [0309] [0310] (9-BBN)-Lys(SBoc)的分析数据： [0311] 采用ESI-MS计算C19H33BN2O7S2-m/z：444.35，测量的m/z：443.2[M-H]-。 [0312] 实施例12：(9-BBN)-Tyr(tBus)的合成。 [0313] 将2.00g酪氨酸悬浮于无水THF中，在惰性气体下，添加入25ml在THF中的9-BBN(0.5mol/L)。将所得悬浮液在100℃下回流18h。减压除去溶剂。将(9-BBN)Tyr悬浮在20ml THF中，在惰性气体下加入2.39g tBuS-Br。将所得溶液搅拌2d。减压除去溶剂，采用THF将所得粗产物洗涤3次以除去溴化物残余物。 [0314] [0315] (9-BBN)-Tyr(tBuS)的分析数据： [0316] 采用ESI-MS计算C21H31BNO6S-m/z:436.35，测量的m/z:436.2[M+H]+，453.2[M+H2O]+。 [0317] 实施例13：Smoc-保护的氨基酸的稳定性试验 [0318] 为了确定Smoc-保护的氨基酸在水性环境中的稳定性，将Smoc-甘氨酸和Smoc-L-亮氨酸溶解于水中，并在环境温度下温育8天。采用分析型RP-HPLC在3、6和8天后检查氨基酸的状况。化合物必须在水性环境中稳定相当久的时间。为了证明这种稳定性，将Smoc-甘氨酸和Smoc-亮氨酸溶解于最少量的水中并保持在环境温度下。在3、6和8天后通过RP-HPLC监测实验结果。结果，没有观察到氨基酸组成的显著变化。 [0319] 实施例14：Smoc保护的氨基酸的N-端脱保护 [0320] 对于SPPS中的使用，保护基必须在安全条件下容易和有效地脱保护。为了确定Smoc保护的氨基酸的脱保护条件，通过将1mg Smoc-甘氨酸溶解在1mL的水或乙醇中进行一系列实验。将以下其中一种碱添加入此溶液中，并将混合物在室温下振荡温育5分钟： [0321] 氨(10％水溶液)， [0322] 乙醇胺(50％水溶液)， [0323] 乙二胺(50％水溶液)或 [0324] 哌啶(50％水溶液)。 [0325] 采用分析型RP-HPLC和ESI-MS分析结果。 [0326] 结果表明，在室温下，氨或胺在水中的溶液对于Smoc脱保护是足够的。 [0327] 除了哌啶(用作为Fmoc-SPPS脱保护的标准碱)外，还可以使用水溶性碱，例如氨水、乙醇胺和乙二胺等。与基于哌啶的脱保护相比，其允许获得显著更便宜和更容易的工艺。 [0328] 实施例15：通过亲和层析纯化 [0329] 将Smoc-丙氨酸与未保护的丙氨酸混合，作为人造杂质，并溶解在1M甲酸中并加载到DEAE Sephadex A-25离子交换柱中。采用另外的甲酸洗涤离子交换柱后，采用4M甲酸铵溶液洗脱Smoc-丙氨酸。采用RP-HPLC分析加载前的溶液、加载后的溶液和洗脱馏分。 [0330] 结果表明，未受保护的丙氨酸无阻碍地通过离子交换柱，而Smoc-保护的丙氨酸与离子交换柱结合。随着流动相变化为4M甲酸铵溶液，从柱上洗脱Smoc-丙氨酸而没有任何杂质残留。因此，已经表明，Smoc基团可以成功地用于亲和层析中用于纯化目的。 [0331] 实施例16：根据Smoc方法合成测试肽H-V-G-G-V-G-OH [0332] Smoc保护的氨基酸的偶联根据以下进行。因此，将3eq.相应的Smoc保护的氨基酸、2.8eq.活化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、3.0eq.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和6eq.碳酸氢钠作为一般碱溶解在最少量的水中并预活化3min。在环境温度下，进行典型偶联60min。肽树脂的N-端脱保护作为用10％的氨水溶液的双重脱保护步骤进行。从载体裂解后，通过RP-HPLC和ESI-MS分析测试肽。 [0333] 肽H-V-G-G-V-G-OH的分析数据： [0334] RP-HPLC，10→60％MeCN，tR＝19.1min。 [0335] 采用ESI-MS计算C16H29N5O6m/z:387.21测量的为387.0[M+H]+。 [0336] [0337] 在每个偶联步骤和后面的脱保护步骤后，测定水、固体载体(PEGA树脂)和PEGA树脂-肽的荧光。结果示于表1中。因此，在每个偶联步骤后，由于偶联了Smoc基团，荧光值上升，并且在每个脱保护步骤之后，荧光值再次降低，表明实时监测反应进程是可能的。 |
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