[0001] 本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及一种抗干扰能力强的抗人心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体及其应用。

[0002] 急性冠状动脉综合征是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵袭，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征，包括不稳定心绞痛和急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)。AMI是心血管疾病的主要类型，近十年来，我国AMI的发病率一直呈上升趋势，已接近国际平均水平。AMI起病突然，急性期死亡率约为30％，其诱发原因主要是为心脏供血的冠状动脉堵塞，导致由其供血的心肌细胞缺血发生变性坏死。目前，国际上治疗AMI的最佳方法是早期快速确诊并进行急性冠状动脉介入治疗。

[0003] 心电图的观察是诊断AMI的常用手段，但对于那些心电图正常的AMI患者，选择一种合适的生化指标来诊断AMI是十分必要的。目前常用的诊断标志物有肌红蛋白(myoglobin，Myo)、心肌肌钙蛋白I(caidiac troponin I，cTnI)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB)。但是Myo指标不能区分骨骼肌损伤和心肌损伤；而cTnI指标虽然特异性高，但在AMI发生6-8小时后浓度才明显上升；CK-MB指标也存在特异性差，对心肌微小损伤不敏感等缺点。心脏型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid binding protein，H-FABP)则克服了以上缺点，对于早期诊断AMI具有很好的特异性和敏感性，成为目前国内外研究较多的AMI早期诊断指标。

[0004] H-FABP是一种由132个氨基酸组成的可溶性胞质蛋白，分子量约为15kDa[1]。H-FABP特异地大量存在于心肌组织中，占心脏全部可溶性蛋白的4％-8％，在骨骼肌、肾小管、脑组织、乳腺、胎盘组织中也有少量分布。H-FABP能够与心肌中的长链脂肪酸结合，为心肌收缩提供能量[2]。正常人的血浆和尿中不含或含有极低含量的H-FABP，而当心肌细胞受到损伤后，H-FABP迅速释放至血液中，损伤后1-3小时就可以检测到其存在，6-8小时血液中的浓度达到峰值，12-24小时后又可以恢复正常[3,4]，其动力学与Myo一致，但特异性更高。因此，H-FABP可以作为AMI早期诊断和风险评估的一种优秀的生化指标[5,6]。

[0005] 释放到血液中的H-FABP大部分处于与长链脂肪酸结合的状态。但在制备诊断用单克隆抗体时，用来免疫动物和筛选抗体的抗原均为重组表达的H-FABP蛋白，因此所得单克隆抗体的识别位点可能位于脂肪酸结合区。由于血液中H-FABP分子上的抗体识别位点已被脂肪酸占据，无法被这些单克隆抗体所识别，因此基于这些单克隆抗体制备诊断试剂经常会得到假阴性的诊断结果。本领域迫切需要一种能够耐受脂肪酸干扰的抗H-FABP单克隆抗体，从而开发准确度高的诊断试剂。

[0006] 参考文献：

[0007] [1]Karthik Viswanathan,Alistair S Hall,Julian H Barth.An evidence-based approach to the assessment of heart-type fatty acid binding protein in acute coronary syndrome.Clin Biochem Rev Vol 33February 2012:3-11.[0008] [2]刘洪梅，黄体钢.心型脂肪酸结合蛋白在临床诊断中的研究进展[J].实用心脑肺血管病杂志，2006,14(5):417-418

[0009] [3]Hsu BG,Chen YC,Lee RP,Lee CC,Lee CJ,Wang JH.Fasting serum level of fatty acid binding protein 4positively correlates with metabolic syndrome in patients with coronary artery disease.Circulation Journal 2010；74:327-331.[0010] [4]Ozcan Ruzgar,Ahmet Kaya Bilge,Zehra Bugra,Sabahattin Umman,Ercument Yilmaz,Beste Ozben,Berrin Umman,Mehmet Meric.The use of human heart-type fatty acid-binding protein as an early diagnostic biochemical marker of myo-cardial necrosis in patients with acute coronary syndrome,and its comparison with troponin-T and creatine kinase-myocardial band.Heart Vessels 2006；21:309-314.

[0011] [5]Conor J.McCann,Ben M.Glover,Lan B.A.Menown,Michael J.Moore,Jane McEneny,Colum G.Owen,Bernie Smith,Peter C.Sharpe,Lan S.Young,Jennifer A.Adgey.Novel biomarkers in early diagnosis of acute myocardial infarction compared with cardiac troponin T.European Heart Journal(2008)29,2843-2850.[0012] [6]吕娇凤，谢爱民，姚全良.心脏型脂肪酸结合蛋白定性检测对急性心肌梗死早期诊断的价值[J].实用医学杂志,2012,28(4):647-649.

[0013] 针对上述现有技术存在的不足，本发明提供一种耐脂肪酸干扰的抗人H-FABP蛋白单克隆抗体，还提供了分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，及该单克隆抗体及其特异性抗原的应用。

[0014] 本发明的目的之一在于提供一株分泌抗人H-FABP蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株FP1，于2016年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C2016199。

[0015] 本发明目的之二在于提供由所述的杂交瘤细胞株FP1分泌的耐脂肪酸干扰的抗人H-FABP蛋白单克隆抗体FP1。

[0016] 本发明所述的单克隆抗体FP1属于IgG1亚型。

[0017] 本发明所述的单克隆抗体FP1结合位点位于H-FABP蛋白的脂肪酸结合区域之外。

[0018] 本发明所述的单克隆抗体FP1亲和力为1×10-10–1×10-13M。

[0019] 本发明目的之三在于提供一种组合物，包括本发明所述的抗体FP1，和药学上的常用辅料。

[0020] 本发明目的之四在于提供所述的单克隆抗体FP1在制备心肌梗死诊断或检测试剂中的应用。

[0021] 本发明还提供所述的单克隆抗体FP1在制备心肌梗死早期诊断或辅助诊断试剂中的应用。

[0022] 本发明目的之五在于提供包含所述的单克隆抗体FP1的H-FABP早期检测、心肌梗死诊断或检测试剂盒。

[0023] 所述的试剂盒是胶乳免疫比浊法的诊断试剂盒。

[0024] 本发明目的之六在于提供所述的单克隆抗体FP1在制备治疗心肌梗死的药物或抗心肌梗死研究生物制剂中的应用。

[0025] 本发明还提供所述的单克隆抗体FP1的特异性抗原作为靶点在制备治疗心肌梗死的药物或抗心肌梗死研究生物制剂中的应用。

[0026] 本发明的有益效果：

[0027] 本发明提供一株能稳定分泌高效价抗人H-FABP蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株FP1，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性，能够避免血液中脂肪酸所带来的干扰，可以作为H-FABP早期检测的关键原料。为建立快速、灵敏检测H-FABP的包括免疫金标、酶联免疫试剂、免疫比浊法等临床诊断试剂提供重要原料。

[0028] 本发明所提供的杂交瘤细胞株FP1是一株可稳定高效的产生耐脂肪酸干扰的抗人H-FABP蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

[0029] 本发明提供的由上述杂交瘤细胞株产生的耐脂肪酸干扰的抗人H-FABP蛋白单克隆抗体，其亚类属于IgG1，它具有以下特性：(a)特异性地与H-FABP蛋白结合，且结合位点位于H-FABP蛋白的脂肪酸结合区域之外，与脂肪酸结合状态和非脂肪酸结合状态的H-FABP蛋-10 -13白亲和力相同，并且(b)所述单克隆抗体亲和力为1×10 –1×10 M。它的制备方法包括以下步骤：

[0030] (a)用重组H-FABP蛋白免疫小鼠；

[0031] (b)将免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞；

[0032] (c)从步骤(b)中的杂交瘤细胞中选出能够分泌对重组H-FABP蛋白效价为1：106以上的单克隆抗体的杂交瘤细胞；

[0033] (d)从步骤(c)中的杂交瘤细胞中选出能够分泌对非脂肪酸结合状态和脂肪酸结合状态H-FABP蛋白具有相同亲和力的单克隆抗体的杂交瘤细胞；

[0034] (e)从步骤(d)的杂交瘤细胞中制得单克隆抗体。

[0035] 本发明所述抗体可检测血液中pg/ml级的H-FABP(如200pg/ml的H-FABP分子)蛋白，具有极高的检测灵敏度。

[0036] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0037] 1.本发明最终获得了能稳定分泌耐脂肪酸干扰的抗人H-FABP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株FP1，该细胞株分泌的单克隆抗体对血清中的天然H-FABP蛋白的效价高达1:106，对重组H-FABP蛋白的亲和力达到1×10-13M，且该单克隆抗体具有良好的特异性，能够有效识别脂肪酸结合状态和非脂肪酸结合状态的H-FABP蛋白。

[0038] 2.该单克隆抗体具有良好的温度稳定性，37℃保存长达8天效价不下降，可以作为准确检测血液中H-FABP含量的体外诊断试剂盒的关键原料。

[0039] 3.采用该H-FABP单克隆抗体作为原料制备的检测H-FABP抗原含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒能够更准确地检测血液中H-FABP的含量，灵敏度达到200pg/ml，且能够耐受血液中脂肪酸的干扰。为今后国内H-FABP定量快速检测试剂的发展的打下良好的基础，对我国心肌损伤疾病早期诊断试剂的研发具有重要意义。附图说明

[0040] 图1为重组H-FABP蛋白纯化后鉴定结果图，lane M：蛋白质相对分子质量标准品；lane 1：离心上清；lane 2：His-taq柱纯化后的蛋白；lane 3：分子筛层析纯化后的蛋白。

[0041] 图2为单克隆抗体FP1十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定结果图，lane M：蛋白质相对分子质量标准；lane 1：纯化前腹水(还原剂处理的样品)；lane 2：纯化后单克隆抗体(还原剂处理的样品)；lane 3：纯化前腹水(未加还原剂)；lane 4：纯化后单克隆抗体(未加还原剂)。

[0042] 图3为单克隆抗体FP1免疫特异性鉴定结果图，lane M：蛋白质相对分子质量标准；lane 1：重组H-FABP蛋白；lane 2：人血清。

[0043] 图4为间接ELISA法测定抗H-FABP单克隆抗体FP1的效价。

[0044] 图5为抗H-FABP单克隆抗体FP1的稳定性检测。

[0045] 图6为H-FABP胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的校准曲线。附图中各部件的标记如下：A图是实施例7中制备的H-FABP胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的校准曲线；B图是实施例8中制备的H-FABP胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的校准曲线.

[0046] 图7为H-FABP胶乳增强免疫比浊检测试剂盒抗干扰实验。附图中各部件的标记如下：A图是实施例7中制备的H-FABP胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的抗脂肪酸干扰实验；B图是实施例8中制备的H-FABP胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的抗脂肪酸干扰实验。

[0047] 下面结合附图通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定，但并不是对本发明的限制，仅作示例说明。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，如Sambrook等人，分子克隆实验指南(Cold spring  Harbor laboratory Press,2001)中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件执行。

[0048] 实施例1重组H-FABP蛋白的表达纯化和纯度鉴定

[0049] 将含有H-FABP基因序列的原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用LB平板培养。从平板上挑取单菌落接种LB培养基中，扩大培养后，在菌液OD600值达到0.6-0.8时加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达。4小时后离心收集菌体，超声破碎细菌后离心收集上清。上清用His-taq柱和分子筛层析柱纯化，收集样品并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定蛋白纯度。

[0050] 电泳后从凝胶上观察到分子量为15kDa左右的目的蛋白条带(图1)，H-FABP重组蛋白的纯度在95％以上，达到了制备单抗的纯度要求。

[0051] 实施例2动物免疫与血清效价检测

[0052] 将浓度为1mg/ml纯化的重组H-FABP蛋白与等量的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化，乳化方法采用双注射器互推法。将6-8周无特定病原体级雌性BALB/c小鼠以弗氏完全佐剂乳化的免疫抗原H-FABP对每只小鼠从跗关节处注射40μg抗原，2天后，用弗氏不完全佐剂乳化的免疫抗原H-FABP对每只小鼠再次从跗关节处注射40μg抗原。8天后，尾静脉采血，离心取上清，以免疫前血清为阴性对照用间接ELISA法检测血清效价，2次免疫后，百万倍稀释后血清效价已高达2.0以上(表1)。选取血清效价大于106的小鼠，颈椎脱臼处死后取小鼠淋巴细胞进行细胞融合实验。

[0053] 表1间接ELISA检测小鼠血清中抗体效价

[0054]

[0055] 实施例3细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆

[0056] 1.高效价杂交瘤细胞株的制备及筛选

[0057] 选择生长状态良好的sp2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的淋巴细胞以1:2-1:3比例混合，以37℃预热的PEG1500作为融合剂。融合细胞置于含20％FBS血清的HAT-1640培养基中培养。5-7天后观察融合效果并换液，换液3天后取细胞培养液。用临床确诊心肌梗死发生6-12小时内病人的血清包被ELISA板，该血清中含有高浓度的天然H-FABP蛋白，用间接ELISA方法筛选阳性克隆，选择阳性值与细胞数比值较高的细胞进行多次亚克隆，最终得到多株能够稳定分泌抗H-FABP蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞库。该杂交瘤细胞库分泌的单克隆抗体与血液中天然H-FABP蛋白有很高的亲和力。

[0058] 2.耐脂肪酸干扰的杂交瘤细胞株的筛选

[0059] 将浓度为1mg/ml纯化的重组H-FABP蛋白与浓度为0.1mg/ml的脂肪酸混合物(购自sigma)混匀孵育，制备脂肪酸结合状态的H-FABP蛋白。之后分别用纯化的重组H-FABP蛋白和上述脂肪酸结合状态的H-FABP蛋白分别包被ELISA板。用含20％FBS血清的HAT-1640培养基培养上述杂交瘤细胞库中的细胞，3天后取细胞培养液，用间接ELISA方法分别测定细胞培养液中的单克隆抗体与脂肪酸结合状态和非脂肪酸结合状态的H-FABP蛋白的相对亲和力。选取与脂肪酸结合状态和非脂肪酸结合状态的H-FABP蛋白亲和力相同，且亲和力最高的单克隆细胞，最终得到一株能够分泌耐脂肪酸干扰的抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为FP1。

[0060] 实施例4单克隆抗体的产生与纯化

[0061] 取成年BALB/c小鼠，腹腔注射无菌石蜡油0.5ml，7天后再向腹腔内注入FP1杂交瘤细胞，细胞密度调整为1×106-2×106/ml，每只小鼠注射0.5ml。10-14天后开始采集腹水。将采集好的腹水按1:1体积比缓慢加入饱和硫酸铵初步纯化，冰上搅拌30分钟后在4℃下12000g离心10分钟，弃上清。沉淀用一定体积PBS溶解后于20倍体积的Binding buffer(Protein A Sefinose Kit中提供)中透析，然后用Protein A亲和柱纯化，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化效果。

[0062] 将纯化前与纯化后的腹水抗体制备蛋白样品经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。纯化后的抗体在还原的胶上呈现分子量为50kDa和25kDa的重链和轻链，而在非还原胶上呈现分子量约为150kDa的单一条带(图2)。这说明经亲和层析后单克隆抗体达到了较高的纯度，可以用于进一步的研究。

[0063] 实施例5单克隆抗体亚型、特异性及效价鉴定

[0064] 1.单克隆抗体亚型鉴定

[0065] 采用Sino Biological公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鉴定单克隆抗体亚型，操作按说明书进行。经鉴定，制备的单克隆抗体为IgG1亚型。

[0066] 2.单克隆抗体的特异性鉴定

[0067] 用临床确诊心肌梗死发生6-12小时内病人的血清和纯化的重组H-FABP蛋白分别进行Western blotting实验鉴定FP1单克隆抗体的特异性。结果显示于病人血清中天然H-FABP蛋白及重组表达H-FABP蛋白处均可见抗H-FABP单克隆抗体FP1的特异结合条带，且在其它位置没有明显杂带(图3)，说明FP1单克隆抗体能够特异性识别血液中的H-FABP蛋白，与血液中的其他抗原没有非特异反应，适合用来检测病人血液中H-FABP蛋白的含量，具有良好的特异性。

[0068] 3.单克隆抗体效价鉴定

[0069] 用浓度为1μg/ml的重组H-FABP蛋白包被ELISA板，加入梯度稀释的抗H-FABP单克隆抗体FP1。之后加入HRP-羊抗鼠二抗，用450/630nm双波长检测，OD值大于0.2则认为该浓度的抗体能够识别H-FABP抗原，此浓度值越低，亲和力越高。结果表明抗H-FABP单克隆抗体FP1效价达到1:106以上(图4)。

[0070] 4.单克隆抗体亲和力测定

[0071] 用表面等离子体共振法(SPR)在Biacore 3000仪器上测定FP1单克隆抗体的亲和力。用10μg/ml的纯化的重组H-FABP抗原包被CM5芯片，偶联方式为EDC/NHS化学偶联抗原表面的伯氨基和芯片表面的羧基。加入梯度稀释的抗H-FABP单克隆抗体FP1，测定FP1单克隆抗体与重组H-FABP蛋白的结合常数和解离常数。经过仪器附带的软件计算，FP1单克隆抗体的亲和力达到0.1pM，即1×10-13M。结果表明，FP1单克隆抗体具有极高的亲和力，能够作为高灵敏度H-FABP检测试剂盒的原料。

[0072] 实施例6单抗稳定性的鉴定

[0073] 将纯化后的单抗FP1分别置于-20℃、4℃和37℃环境中，浓度为1mg/ml，每24小时取样一次，间接ELISA检测其免疫反应活性的变化。结果显示在-20℃、4℃和37℃孵育24小时后，效价无差别，超过8天后37℃组抗体的效价才开始有下降(图5)，说明单抗具有良好的温度稳定性。

[0074] 实施例7H-FABP含量检测试剂盒的制备(胶乳增强免疫比浊法)

[0075] 本试剂盒包含双试剂，试剂1为胶乳反应缓冲液，试剂2为包被上述抗H-FABP单克隆抗体的胶乳颗粒。

[0076] 制备试剂1时，称取60.57mg的Tris，116.88mg的NaCl，100mg的PEG6000，3.9mg的NaN3溶于8ml的蒸馏水中，调节pH至7.5，定容至10ml。搅拌混匀，经过0.22μm滤膜抽滤后，即得试剂1。

[0077] 制备试剂2时，取0.1ml浓度为10％粒径为300nm的聚苯乙烯胶乳(购自日本合成橡胶公司)于10mL离心管中，再向离心管中加入8.9ml 0.1M MES缓冲溶液(pH 5.0)，混合均匀，得到稀释胶乳溶液。准确称取0.51mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺用1mL 0.1M HEPES缓冲溶液(pH 7.0)溶解，并将此溶液加入稀释胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/分钟反应30分钟；将稀释胶乳均分成两份，分别加入0.5ml 1mg/ml抗H-FABP单克隆抗体FP1和另一株抗H-FABP单克隆抗体FP5(来自南京诺唯赞生物科技有限公司)，震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/分钟反应2小时。反应完成后，向两稀释胶乳中分别加入1ml 10％浓度的BSA溶液，混合均匀，并置于37℃恒温摇床上，200转/分钟，反应1小时。将上述体系于16000g，离心30分钟，弃上清，将沉淀分别用5ml含50mM Tris，pH 7.0，50mM NaCl，1‰NaN3的缓冲液重悬。将两胶乳溶液等体积混合后，超声分散，即得试剂2。

[0078] 实施例8H-FABP含量检测试剂盒的制备(胶乳增强免疫比浊法)

[0079] 本试剂盒包含双试剂，试剂1为胶乳反应缓冲液，试剂2为包被上述抗H-FABP单克隆抗体的胶乳颗粒。

[0080] 制备试剂1时，称取60.57mg的Tris，116.88mg的NaCl，100mg的PEG6000，3.9mg的NaN3溶于8ml的蒸馏水中，调节pH至7.5，定容至10ml。搅拌混匀，经过0.22μm滤膜抽滤后，即得试剂1。

[0081] 制备试剂2时，取0.1ml浓度为10％粒径为300nm的聚苯乙烯胶乳(购自日本合成橡胶公司)于10mL离心管中，再向离心管中加入9.9ml 50mM Tris缓冲溶液(pH 7.0)，混合均匀，得到稀释胶乳溶液。将稀释胶乳均分成两份，分别加入0.5ml 1mg/ml抗H-FABP单克隆抗体FP1和另一株抗H-FABP单克隆抗体FP5(来自南京诺唯赞生物科技有限公司)，震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/分钟反应2小时。反应完成后，向两稀释胶乳中分别加入1ml 10％浓度的BSA溶液，混合均匀，并置于37℃恒温摇床上，200转/分钟，反应1小时。将上述体系于16000g，离心30分钟，弃上清，将沉淀分别用5ml含50mM Tris，pH 7.0，50mM NaCl，
1‰NaN3的缓冲液重悬。将两胶乳溶液等体积混合后，超声分散，即得试剂2。

[0082] 实施例9H-FABP含量检测试剂盒灵敏度实验

[0083] 1.标准曲线的建立。称取60.57mg的Tris、87.66mg的NaCl、186.12mg的EDTA·Na2和100mg的BSA，溶于溶于8ml的蒸馏水中，调节pH值至7.5，定容至10ml，搅拌使其完全混匀，并经过0.22μm滤膜抽滤，得到标准品稀释液。用上述标准品稀释液溶解纯化的重组H-FABP蛋白，制备不同浓度的标准品(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、80ng/ml、160ng/ml)。用上述制备的两种H-FABP含量检测试剂盒测定不同浓度标准品中H-FABP的含量。该方法为两点终点法，采用日立7170生化分析仪测定，包括以下步骤：向10μl待检测样本(校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品)中加入100μl的试剂1充分混匀，于37℃孵育5分钟，再向混合体系中加入100μl试剂2，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长600nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。

[0084] 采用上述制备的试剂盒及测量方法，采用日立7170生化分析仪测得的上述6种不同含量的H-FABP标准品的曲线(图6)，每个点代表一个含量的参考标准品，其中X轴表示H-FABP含量(ng/ml)；Y轴表示吸光度。本发明中的试剂盒测定实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动、半自动或手动的生化分析仪。

[0085] 2.H-FABP检测试剂盒灵敏度测定

[0086] 本实施例中测定了上述H-FABP检测试剂盒的功能灵敏度，该指标是体外诊断试剂性能评估中常用的灵敏度指标，是指试剂能够准确检出的最低抗原浓度。用不含H-FABP的血清作为稀释液，配制成含不同浓度的重组H-FABP蛋白的标准溶液(0ng/ml，0.1ng/ml，0.2ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml)，按照上述的实验条件，每个浓度点测定20次，计算每个浓度点测定数据的变异系数(CV)，变异系数小于20％的浓度最低的点即为试剂的功能灵敏度。

[0087] 结果表明实施例7和8中制备的H-FABP检测试剂盒的功能灵敏度均达到200pg/ml，能够准确地检测出血液中微量的H-FABP蛋白，能够准确诊断出病人是否发生了心肌损伤。

[0088] 实施例10H-FABP含量检测试剂盒干扰性实验

[0089] 将浓度为1mg/ml纯化的重组H-FABP蛋白与浓度为0.1mg/ml的脂肪酸混合物(购自sigma)混匀孵育，制备脂肪酸结合状态的H-FABP蛋白。用不含H-FABP的血清作为稀释液，分别配制浓度为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、140ng/ml和160ng/ml的重组H-FABP蛋白和脂肪酸结合状态的H-FABP蛋白。按照实施例9中的实验条件，用实施例7和8中制备的H-FABP含量检测试剂盒分别测定各稀释样品的浓度。

[0090] 结果表明实施例7和8中制备的H-FABP含量检测试剂盒测定纯化的重组H-FABP蛋白和脂肪酸结合状态的H-FABP蛋白浓度的线性相关系数和回归直线斜率均达到了0.99以上(图7)，说明用FP1单克隆抗体制备的H-FABP检测试剂盒测定脂肪酸结合状态和非脂肪酸结合状态的H-FABP蛋白时没有差异，试剂盒能够耐受脂肪酸结合对H-FABP含量测定的干扰。