[0001] 本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体MbovP579蛋白及其应用。所述的蛋白可以作为抗原蛋白应用于制备牛支原体感染诊断试剂盒中。

[0002] 牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是一种主要引起任何月龄肉牛和奶牛呼吸系统疾病和关节炎的重要病原，主要临床症状为肺炎，还可导致乳腺炎、关节炎、生殖道炎症、结膜炎、中耳炎等多种症状，发病率为40％，死亡率为10％。牛支原体于1961年首次在美国从患乳房炎奶牛的牛奶中分离得到，1976年证实其是导致肺炎的重要病原体。2008年，湖北省从外地引进肉牛中流行呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重，华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒分室于2008年率先确定该病为“传染性牛支原体肺炎”。由于我国养牛业向规模化和集约化发展，牛养殖量大大增加，专门化程度大幅度提高，肉牛“异地育肥”已经成为重要的肉牛养殖模式。不同研究机构均证实该病在全国范围内流行，这与近些年的肉牛养殖模式不无关系。

[0003] 牛支原体是影响养牛业健康发展的重要疾病，大部分感染牛支原体的牛呈亚临床症状或隐形感染，在应激条件下可以引起临床症状。目前长距离运输是“异地育肥”的重要环节，作为一种重要的应激因素，这无疑将会给肉牛的健康养殖带来更大的困难。目前国内没有牛支原体的诊断试剂盒，实验室一般采取包被牛支原体的全菌蛋白检测临床血清样本，这种检测方法的特异性和灵敏性都不高。目前的诊断方法已经不能满足牛支原体防控的需求，因此迫切需要找到牛支原体诊断的特异性靶标，开发出特异性和敏感性高的检测试剂盒。本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室病毒分室通过双向电泳和免疫印迹技术发现牛支原体膜蛋白MbovP579蛋白具有很强的免疫原性，并成功地将MbovP579蛋白作为牛支原体血清抗体检测的分子靶标。

[0004] 本发明的目的在于提供一个可以诊断牛支原体感染与否的分子标识MbovP579蛋白。

[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种检测牛支原体MbovP579蛋白抗体的特异性检测方法，用于区分牛支原体感染与否及评价疫苗抗体反应。更进一步，本发明的目的还包括重组MbovP579蛋白(即：rMbovP579)在制备牛支原体感染诊断或疫苗抗体反应检测试剂盒中的应用。

[0006] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施和路线：

[0007] 申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801,于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010040。

[0008] 根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，本发明以牛支原体HB0801(基因组在GenBank上的登录号为CP002058)中Mbov_579基因为模板克隆该基因，同时根据大肠杆菌的密码子偏爱性，将Mbov_579基因进行克隆修饰，将牛支原体色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中的色氨酸密码子UGG进而在大肠杆菌中表达。

[0009] 经过人工突变后的牛支原体基因Mbov_579的核苷酸序列是序列表SEQ ID NO:13的1-2387位碱基所示的序列，其长度为2387bp；其中在该序列的：165位，690位，1455位和1674位发生等位基因突变。

[0010] 该牛支原体MbovP579蛋白的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:14所示，共编码728个氨基酸。

[0011] 将本发明的牛支原体Mbov_579基因的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-30-Mbov_579转化大肠杆菌DH5α得到重组的大肠杆菌菌株，申请人将该重组的大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌pET-30-Mbov-579；Escherichia coli pET-30-Mbov-579，于2015年12月18日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2015763。该菌株的IPTG诱导下，表达Mbov-579基因编码的重组蛋白rMbovP579。

[0012] 经过验证，本发明纯化的rMbovP579蛋白可以作为诊断抗原在制备牛支原体感染诊断试剂盒中的应用。

[0013] 本发明所述的牛支原体rMbovP579蛋白在区分牛支原体感染中的应用，包括下列步骤：

[0014] 使用间接ELISA方法诊断牛支原体野毒株感染，以rMbovP579蛋白作为抗原包被酶标板于4℃过夜，经PBST洗涤后加入5％脱脂乳，然后在37℃封闭1h，PBST洗涤后加入检测样本37℃孵育1h，血清样本稀释比例为体积比1：1600。PBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记羊抗牛二抗(1：5000，V/V)37℃孵育1h。经PBST洗涤后加入底物(TMB/H2O2)显色，测定OD630nm值，大于规定阈值时判断为抗体阳性，发生了牛支原体感染。

[0015] 本发明具有以下优点：

[0016] 1、本发明的抗原蛋白MbovP579是发明人从牛支原体全菌蛋白中筛选出来的新型免疫原性蛋白，目前功能未知。

[0017] 2、本发明的抗原蛋白MbovP579检测牛支原体的特异性是发明人首次确定的，利用该蛋白抗原建立的间接ELISA能有效区分牛支原体和其它病原体感染。

[0018] 3、目前国内市场上还没有商品化的牛支原体鉴别诊断试剂盒，与市场上国外商品化试剂盒比较，本发明的抗原蛋白rMbovP579的检测灵敏度与特异性显著高于同类产品，说明以本发明的蛋白制备的试剂盒更能适应基层单位检测的需求。

[0019] 更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。附图说明

[0020] 序列表SEQ ID NO:1是扩增Mbov_579基因片段的引物579a1的序列。

[0021] 序列表SEQ ID NO:2是扩增Mbov_579基因片段的引物579a2的序列。

[0022] 序列表SEQ ID NO:4是扩增Mbov_579基因片段的引物579b1的序列。

[0023] 序列表SEQ ID NO:5是扩增Mbov_579基因片段的引物579b2的序列。

[0024] 序列表SEQ ID NO:6是扩增Mbov_579基因片段的引物579c1的序列。

[0025] 序列表SEQ ID NO:7是扩增Mbov_579基因片段的引物579c2的序列。

[0026] 序列表SEQ ID NO:6是扩增Mbov_579基因片段的引物579d1的序列。

[0027] 序列表SEQ ID NO:9是扩增Mbov_579基因片段的引物579d2的序列。

[0028] 序列表SEQ ID NO:10是扩增Mbov_579基因片段的引物579e1的序列。

[0029] 序列表SEQ ID NO:11是扩增Mbov_579基因片段的引物579e2的序列。

[0030] 序列表SEQ ID NO:12是扩增Mbov_579基因片段的引物579M1的序列。

[0031] 序列表SEQ ID NO:13是扩增Mbov_579基因片段的引物579M2的序列。

[0032] 序列表SEQ ID NO:13是本发明人工突变牛支原体Mbov_579基因的核苷酸序列，序列长度为2187bp。其中在该序列的165位，690位，1455位和1674位发生等位基因突变。

[0033] 序列表SEQ ID NO:14是本发明的牛支原体MbovP579蛋白的蛋白质序列，编码728个氨基酸。

[0034] 图1：是本发明实施例涉及空质粒pET-30a的质粒图谱。pET-30a为商业化质粒，购自Novagen公司。

[0035] 图2：是本发明制备的重组质粒pET-30-Mbov_579的图谱。重组质粒pET-30-Mbov_579是由pET-30a质粒和突变后的Mbov_579基因全长经过限制性内切酶消化后连接重组而成。

[0036] 图3：是本发明纯化的牛支原体rMbovP579蛋白胶图。附图标记说明：泳道M：蛋白质marker；1：纯化的牛支原体rMbovP579重组蛋白。

[0037] 图4：包被rMbovP579蛋白通过间接ELISA诊断牛支原体感染的结果。牛支原体自然感染和疫苗株免疫检测及阈值的确定，当阈值为0.442时，临床样本检测的敏感性为90.2％，特异性为97.8％。

[0038] 实施例1：牛支原体Mbov579蛋白的表达

[0039] 1.1牛支原体Mbov_579基因克隆表达

[0040] 由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，在本发明中牛支原体中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体基因时，需要对支原体基因进行突变，使密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。

[0041] 申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到牛支原体地方分离株，将其命名牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801,于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010040。本发明利用自行设计的PCR引物对该基因进行了突变，具体步骤是：以牛支原体HB0801(基因组GenBank登录号为CP002058)中的Mbov_579基因为模板，利用如下设计的5对引物(编号分别为：579a1/579a2，579b1/579b2，579c1/579c2，579d1/579d2，579e1/579e2)分别扩增出突变后的Mbov_579基因的5个片段，然后，以突变后的5个片段为模板，利用
579M1/579M2引物对扩增得到突变后的Mbov_579基因的全序列，序列长度为2187bp(见序列表SEQ ID NO：13中1-2187位碱基所示的序列，其编码区也是1-2187位碱基对应的序列)。

[0042] 扩增Mbov_579基因的引物序列如下所示：

[0043] (1)579a1/579a2扩增片段在Mbov_579基因中的位置为683802-683980碱基处，PCR扩增产物长度为179bp。

[0044] 正向引物579a1:5’ATGAGTAAGAAAAATAAATTAATGATTGGGCTTTCATCTACTGCT 3’，(即序列表SEQ ID NO：1所示的序列)。

[0045] 反向引物579a2:5’GAAGCCATAGTATTCCATTGTGGCTGACCA 3’，(即序列表SEQ ID NO：2所示的序列；下划线部分为突变位点，即由T突变为C)

[0046] (2)579b1/579b2扩增片段在Mbov_579基因中的位置为683952-684510碱基处，PCR扩增产物长度为559bp。

[0047] 正向引物579b1:5’GGTCAGCCACAATGGAATACTATGGCTT 3’(其中：下划线部分为突变位点，即由A突变为G；即序列表SEQ ID NO：3所示的序列)。

[0048] 反向引物579b2:5’GTGAACTTTCAAATTCACCCCATAATTTTTGTACTTCACT3’(下划线部分为突变位点，即由T突变为C；即序列表SEQ ID NO：4所示的序列)。

[0049] (3)579c1/579c2扩增片段在Mbov_579基因中的位置为684472-685274碱基处，PCR扩增产物长度为803bp。

[0050] 正向引物579c1:5’GTGAAGTACAAAAATTATGGGGTGAATTTGAAAGTTCACA 3’(下划线部分为突变位点，即由A突变为G；即序列表SEQ ID NO：5所示的序列)。

[0051] 反向引物579c2:5’TTCTCTTAAGAATAATAGCCATTGTTTATTATCACTAGCTTC 3’(下划线部分为突变位点，即由T突变为C；即序列表SEQ ID NO：6所示的序列)。

[0052] (4)579d1/579d2扩增片段在Mbov_579基因中的位置为685235-685490碱基处，PCR扩增产物长度为256bp。

[0053] 正向引物579d1:5’AGCTAGTGATAATAAACAATGGCTATTATTCTTAAGAGAAGAT 3’(下划线部分为突变位点，即由A突变为G；即序列表SEQ ID NO：7所示的序列)。

[0054] 反向引物579d2:5’TTCATTAGATTTATTCCATTTACCAGGCACAGC 3’(下划线部分为突变位点，即由T突变为C；即序列表SEQ ID NO：8所示的序列)。

[0055] (5)579e1/579e2扩增片段在Mbov_579基因中的位置为685458-685988碱基处，PCR扩增产物长度为531bp：

[0056] 正向引物579e1:5’GCTGTGCCTGGTAAATGGAATAAATCTAATGA 3’，(下划线部分为突变位点，即由A突变为G；即序列表SEQ ID NO：9所示的序列)。

[0057] 反向引物579e2:5’TTATTTAAGAATTTGACTGCTTGATGCAATAATTGATCCAATA 3’，(即序列表SEQ ID NO：10所示的序列)。

[0058] (6)579M1/579M2扩增片段在Mbov_579基因中的位置为683802-685988碱基处，PCR扩增产物长度为2205bp

[0059] 正向引物579M1:5’ GGTACCATGAGTAAGAAAAATAAATTAATGATTGG 3’，(下划线部分为Kpn I酶切位点，波浪线部分为保护性碱基；即序列表SEQ ID NO：11所示的序列)。

[0060] 反向引物579M2:5’ GAATTCTTATTTAAGAATTTGACTGCTTGATGC 3’，(下划线部分为EcoR I酶切位点，波浪线部分为保护性碱基；即序列表SEQ ID NO：9所示的序列)。

[0061] 上述5个片段的PCR反应体系如下：

[0062] 模板DNA 2.5μL，pfu酶(Thermo)1.5μL，pfu buffer with MgSO4(Thermo)5μL，10倍dNTP mix(Thermo)1μL，引物各2μL，超纯水36μL。

[0063] 回收以上五个片段的PCR扩增产物，以此为模板，使用引物579M1/579M2扩增突变后的Mbov_579基因，其PCR反应体系如下：每个片段2.5μL，pfu酶(Thermo)1.5μL，pfu buffer with MgSO4(Thermo)5μL，10倍dNTP mix(Thermo)1μL，引物各2μL，超纯水36μL。上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0064] 回收Mbov_579基因的扩增产物，用Kpn I和EcoR I酶切，同时将pET-30a质粒(购自默克中国有限公司)用Kpn I和EcoR I进行双酶切。将酶切后的Mbov_579基因和pET-30a质粒用DNA连接酶(T4DNA ligase)连接，得到重组质粒pET-30-Mbov_579。用该重组质粒pET-30-Mbov_579转化大肠杆菌DH 5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒经过测序正确后转化大肠杆菌BL21，将该大肠杆菌在LB液体培养基中培养至OD＝0.6时取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，37℃摇床诱导表达3小时。取1mL菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清加入1mL磷酸盐缓冲液即PBS(配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，
1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30uL的PBS和30uL上样缓冲液【1M Tris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水】重悬。100℃沸水中煮沸10min。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。

[0065] 将本发明的蛋白的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-30-Mbov_579转化到大肠杆菌DH5α中得到重组大肠杆菌，申请人将该重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌pET-30-Mbov-579；Escherichia coli pET-30-Mbov-579，于2015年12月18日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2015763。

[0066] 1.2牛支原体rMbovP579重组蛋白的纯化

[0067] 将重组的大肠杆菌BL21按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL的PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL的PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自罗氏公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定rMbovP579蛋白大部分表达于上清中。

[0068] rMbovP579蛋白具体纯化步骤如下：

[0069] (1)向亲和层析柱中加入1mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自GE公司)；

[0070] (2)向亲和层析柱中加入12mL ddH2O洗涤；

[0071] (3)加入12mL的binding buffer(20mM Na3PO4，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

[0072] (4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

[0073] (5)加入50mL binding buffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

[0074] (6)加入50mL washing buffer缓冲液(20mM Na3PO4，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

[0075] (7)加入12mL elute buffer缓冲液(20mM Na3PO4，0.5M NaCl,1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

[0076] (8)将编号为1到4的管中各加入50μL上样缓冲液煮沸10min；

[0077] (9)配置SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120伏特)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。

[0078] 实施例2：牛支原体MbovP579蛋白在诊断牛支原体野毒株自然感染中的应用[0079] 2.1以牛支原体rMbovP579重组蛋白为抗原，通过间接ELISA方法诊断牛支原体野毒株自然感染

[0080] ELISA方法的具体操作程序：

[0081] (1)抗原包被：用包被液(Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加ddH2O至1000ml)稀释浓缩后rMbovP579蛋白，按每孔100ng的比例加入稀释rMbovP579蛋白后的包被液100μl每孔加入96孔酶标板，4℃包被过夜。弃去包被液，每孔加300μl PBST(PBS:NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaH2PO4 0.2g，加ddH2O至1000ml。PBST:加入0.05％比例的Tween-20到PBS中)洗涤3次，每次2分钟。

[0082] (2)封闭：每孔加入100μl 5％脱脂牛奶(5g脱脂牛奶加PBST至100ml)，置于37℃温箱中封闭1h，甩干封闭液，加入300μl PBST洗3次，每次2分钟。

[0083] (3)加样：用PBST按1:1600(V/V)比例稀释待检血清和对照血清,每孔加100μl稀释后的样本，37℃孵育1h。甩干孔中溶液，加入300μl PBST洗3次，每次2分钟。

[0084] (4)加酶标二抗：用PBST按(500μl吐温-20加入1000ml PBS(按V/V 1:5000的比例稀释酶标二抗(购自Southernbiotech公司)，每孔加入100μl稀释后的二抗，置于37℃温箱培养60分钟。甩干孔中溶液，加入300μl PBST洗5次，每次2分钟。

[0085] (5)加底物显色：每孔加入TMB底物显色液A液和TMB底物显色液B液(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)各50μl，避光显色10min，每孔加50μl终止液(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD630值。使用在线工具(http://epitools.ausvet.com.au/content.php？page＝ROC_curves)软件确定阈值。

[0086] 2.2基于rMbovP579蛋白抗原的间接ELISA与商品ELISA试剂盒的比较[0087] 选取123份通过牛肺脏组织分菌及分离培养确定为牛支原体感染的病牛阳性血清作为比较实验的阳性检测样本。商品化试剂盒(Mycoplasma bovis ELISA kit,References:BIO K 302；购自比利时Bio-X Diagnostics公司)。具体步骤如下：

[0088] rMbovP579蛋白的包被、检测方法及条件按3.1中所述进行，商品化试剂盒的操作按照试剂盒的说明书进行。检测结果见表1，用本发明的rMbovP579蛋白抗原对牛支原体感染样本的检出率为90.24％(111/123)，显著高于商品化试剂盒的31.7％(39/123)(p<0.01)。

[0089] 表1:商业化牛支原体抗体ELISA试剂盒和rMbovP579间接ELISA检测比较[0090]

[0091] 实施例3：牛支原体rMbovP579蛋白诊断牛支原体自然感染试剂盒的组装[0092] 本发明的试剂盒包括牛支原体rMbovisP579抗原包被板2块(96孔/块，100ng/孔)，牛支原体抗体ELISA阴性、阳性对照各1管(0.5ml/管)，样品稀释液1瓶(40ml/瓶)，羊抗牛酶标记二抗(IgG Fc-HRP)(购自southernbiotech公司)1管(200μl/管)，20倍浓缩洗涤液1瓶(30ml/瓶)，TMB底物显色液A液，TMB底物显色液B液各1瓶(10ml/瓶；购自武汉科前动物生物制品有限责任公司))，终止液1瓶(10ml/瓶，购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)。

[0093] (1)20倍浓缩洗涤液的配制：NaCl 160g、KCl 4g、Na2HPO4·12H2O 58g、KH2PO4 4g，Tween-20 10ml定容至1000ml纯化水中。

[0094] (2)羊抗牛(IgG Fc-HRP)酶标二抗(购自southernbiotech公司)的配制：用保护剂(含1％BSA的PBST溶液)稀释至(单位)1:500倍中间浓度。

[0095] (3)封闭液：含5％脱脂乳的磷酸盐缓冲液。

[0096] (4)样品稀释液：含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液。

[0097] (5)TMB底物显色液：包括

[0098] TMB底物显色液A液：Na2HPO4 14.6g，柠檬酸9.33g，过氧化氢脲0.52g，加纯化水至1000ml，调至pH值5.0～5.4；

[0099] TMB底物显色液B液：TMB20mg，无水乙醇10ml，加纯化水至1000ml。

[0100] (6)终止液：0.25％氢氟酸。

[0101] 名词术语说明：

[0102] 在本说明书中：

[0103] 牛支原体MbovP579重组蛋白以rMbovP579表示；

[0104] 牛支原体MbovP579蛋白基因以Mbov_579表示；

[0105] 牛支原体本地分离株，牛支原体野毒株，野毒株以牛支原体HB0801或M.bovis HB0801表示。