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甾体皂苷衍生物及其制备方法和应用
申请号	CN201710290019.8	申请日	2017-04-27	公开(公告)号	CN107312059A	公开(公告)日	2017-11-03
申请人	中国医学科学院药用植物研究所;			发明人	孙迪安; 董欣然;
摘要	本发明公开了甾体皂苷衍生物及其制备方法和应用。本发明以伪原薯蓣皂苷为底物，用橄榄色毛壳菌株为生物转化菌进行生物转化，最终分离获得式Ⅰ-式Ⅴ所示的甾体皂苷衍生物。药理学实验证明，式Ⅰ-式Ⅴ所示的甾体皂苷衍生物具有优异的抗肿瘤活性和溶血栓活性，对心肌细胞具有显著的保护活性，对正常细胞的毒性低，在抗肿瘤、治疗心血管系统疾病、提高免疫力、降低血糖、抗生育、抗菌等方面具有重要的应用前景。
权利要求	1.甾体皂苷衍生物，其特征在于，其结构式为下述式Ⅰ-式Ⅴ所示： R1＝-β-D-Glu 2.权利要求1所述甾体皂苷衍生物的盐。 3.权利要求1所述的甾体皂苷衍生物的生物转化制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)以伪原薯蓣皂苷为底物，用橄榄色毛壳(Chaetomium olivaceum)菌株为生物转化菌进行生物转化反应；将反应产物萃取，萃取液浓缩，得到粗提物； (2)把粗提物上硅胶柱后，用洗脱液进行洗脱；洗脱液为氯仿-甲醇-水，极性由12.5:1: 0.08到1:1:0.1；点板合并后，最终得到1-12份样品；样品9再次上硅胶柱洗脱液为CHCl3–MeOH–H2O，比例为7:1:0.1,5:1:0.1,4:1:0.1,3:1: 0.1,2:1:0.1和1:1:0.1，得到7份样品A9-G9；D9和E9是主成分点，将D9上制备液相，流动相为MeOH-H2O，比例为71:39,得到式Ⅰ化合物和式Ⅱ化合物；将E9上制备液相，流动相为MeOH-H2O，比例为67:33,得到式Ⅲ化合物；样品8上硅胶柱，洗脱液为CHCl3-MeOH-H2O，比例为10:1:0.07,8:1:0.07,6:1:0.1,4:1: 0.1,3:1:0.1；共接了18份组份，第8和第9份组份合并后上制备液相，流动相为MeOH-H2O(62:38,2mL/min)得到式Ⅳ化合物；将样品7上凝胶柱，流动相为MeOH，最终获得6份样品A7-F7；将样品B7上制备液相，流动相为MeOH-H2O，比例为80:20,得到式Ⅴ化合物。 4.按照权利要求3所述的生物转化制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的萃取是每瓶培养基中加入等量的正丁醇进行超声萃取；步骤(2)中粗提物上硅胶柱是用100-200目的硅胶拌样，用200-300目硅胶装柱。 5.权利要求1所述甾体皂苷衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。 6.权利要求1所述甾体皂苷衍生物在制备治疗心血管系统疾病或制备保护心肌药物中的用途。 7.权利要求1所述甾体皂苷衍生物在制备提高免疫力药物中的用途。 8.权利要求1所述甾体皂苷衍生物在制备抗菌药物中的用途。 9.权利要求1所述甾体皂苷衍生物在制备抗生育药物中的用途。 10.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于：含有治疗上有效量的权利要求1所述的甾体皂苷衍生物和药学上可接受的载体。
说明书全文	甾体皂苷衍生物及其制备方法和应用技术领域 [0001] 本发明涉及甾体皂苷衍生物，尤其涉及以伪原薯蓣皂苷为底物，采用生物转化的方法所制备得到甾体皂苷衍生物，本发明进一步涉及该甾体皂苷衍生物在治疗心血管系统疾病、抗肿瘤、提高免疫力或降低血糖等方面中的应用，属于甾体皂苷衍生物领域。背景技术 [0002] 甾体皂苷是天然产物中一类重要的化学成分，主要分为呋甾皂苷和螺甾皂苷(FENG B,KANG L-P,MA B-P,et al.The substrate specificity of a glucoamylase with steroidal saponin-rhamnosidase activity from Curvularia lunata[J].Tetrahedron,2007,63(29):6796-812.)，大多具有一定的药理活性，主要包括治疗心血管系统疾病、抗肿瘤、提高免疫力、降低血糖、抗生育、抗菌作用等。甾体皂苷的研究在天然产物化学中一直占有重要的地位。其主要分为两大类：呋甾烷型(furostanoside)和螺甾烷型(spirostanoside)。通过生物转化对该类物质进行结构修饰，能得到结构新颖的物质。 [0003] 生物转化相比传统的化学方法有很多的优点，生物转化的条件比较温和，室温、常压和在近于中性的pH中进行，反应过程也更加环保绿色，并且具有高度的区域选择性和底物专一性(HEGAZY M-E F,MOHAMED T A,ELSHAMY A I,et al.Microbial biotransformation as a tool for drug development based on natural products from mevalonic acid pathway:A review[J].Journal of Advanced Research,2015,6(1):17-33)。甾体皂苷生物转化的反应过程主要包括脱糖反应，加糖反应，加羟基，脱甲氧基形成双键、双键氧化断裂为羰基等。用生物转化的方法对甾体皂苷进行结构修饰，能够得到一些化学方法比较难以获得的化合物，反应条件更加温和环保，并具有高度的区域选择性，因此生物转化越来越重视并且得到了很多发展。 [0004] 伪原薯蓣皂苷广泛存在于薯蓣属植物中，是治疗心血管疾病地奥心血康的有效成份之一，具有细胞毒、抗真菌、抗病毒以及心血管方面的活性。Mei Dong等人(DONG M,FENG X,WANG B X,et al.Microbial metabolism of pseudoprotodioscin[J].Planta Med,2004,70(7):637-41)用烟曲霉对伪原薯蓣皂苷(化合物1)进行生物转化，分离鉴定四个化合物，其中化合物2和3为新化合物(图1)。 [0005] 原薯蓣皂苷是也是呋甾皂苷，全波等人(全波,马百平.米曲霉对穿山龙中甾体皂苷的生物转化[D]；沈阳药科大学,2006.)用米曲霉对其进行生物转化，并且研究了其生物转化途径(图2)。 [0006] 以伪原薯蓣皂苷为底物进行生物转化的制备方法大多存在生物转化效率低、产物收率低等缺陷，此外，采用该生物转化制备得到的甾体皂苷衍生物不同程度的存在药理活性较低、毒性较大等问题，有待改进。发明内容 [0007] 本发明的目的之一是提供一类具有较高药理活性且安全性更好的甾体皂苷衍生物； [0008] 本发明的目的之二是提供一种高转化效率的甾体皂苷衍生物的制备方法； [0009] 本发明的目的之三是将所述的甾体皂苷衍生物应用于制备治疗心血管系统疾病、抗肿瘤、提高免疫力、降低血糖、抗生育、抗菌等方面。 [0010] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： [0011] 甾体皂苷衍生物，其结构式为下述式Ⅰ-式Ⅴ所示的任何一种化合物： [0012] [0013] R1＝-β-D-Glu [0014] [0015] 所述甾体皂苷衍生物的盐也当然包括在本发明的保护范围之内。 [0016] 本发明进一步提供了一种所述的甾体皂苷衍生物的生物转化制备方法，包括以下步骤： [0017] (1)以伪原薯蓣皂苷为底物，用橄榄色毛壳(Chaetomium olivaceum)菌株为生物转化菌进行生物转化反应；将反应产物萃取，萃取液浓缩，得到粗提物； [0018] (2)把粗提物上硅胶柱后，用洗脱液进行洗脱；洗脱液为氯仿-甲醇-水，极性由12.5:1:0.08到1:1:0.1；点板合并后，最终得到1-12份样品； [0019] 样品9再次上硅胶柱洗脱液为CHCl3–MeOH–H2O，比例为7:1:0.1,5:1:0.1,4:1:0.1,3:1:0.1,2:1:0.1和1:1:0.1，得到7份样品A9-G9；D9和E9是主成分点，将D9上制备液相，流动相为MeOH-H2O，比例为71:39,得到式Ⅰ化合物和式Ⅱ化合物；将E9上制备液相，流动相为MeOH-H2O，比例为67:33,得到式Ⅲ化合物； [0020] 样品8上硅胶柱，洗脱液为CHCl3-MeOH-H2O，比例为10:1:0.07,8:1:0.07,6:1:0.1,4:1:0.1,3:1:0.1；共接了18份组份，第8和第9份组份合并后上制备液相，流动相为MeOH-H2O(62:38,2mL/min)得到式Ⅳ化合物； [0021] 将样品7上凝胶柱，流动相为MeOH，最终获得6份样品A7-F7；将样品B7上制备液相，流动相为MeOH-H2O，比例为80:20,得到式Ⅴ化合物。 [0022] 作为优选的，步骤(1)中所述的萃取是每瓶培养基中加入等量的正丁醇进行超声萃取；步骤(2)中粗提物上硅胶柱是用100-200目的硅胶拌样，用200-300目硅胶装柱。 [0023] 本发明通过药理学实验证明，式Ⅰ-式Ⅴ所示的化合物对HePG2(肝癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、NCI-H460(人肺小细胞肺癌)、SF-268(人神经胶质瘤细胞)等癌细胞株有强烈的抗癌活性，但是对正常细胞的毒性远低于伪原薯蓣皂苷对正常细胞的毒性。 [0024] 本发明所述肿瘤包括：原发实体瘤、耐药肿瘤、转移性肿瘤、恶性组织或细胞中的任意一种或多种；优选的，所述癌包括：鼻咽癌，口腔表皮样癌，梭形细胞癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，结肠癌(包括结肠直肠癌)，直肠癌，转移性结肠直肠癌，非鳞状非小细胞肺癌，乳腺癌，转移性乳腺癌，转移性HER2阴性乳腺癌，脑癌，成人脑胶质细胞瘤，儿童脑胶质细胞瘤，儿童抵抗性脑胶质细胞瘤，胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，儿童成神经管细胞瘤，神经胶质瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，肾癌(如晚期肾细胞癌)，膀胱癌，宫颈癌，食管癌，胃癌，头颈部癌，肝癌，肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)，鳞状非小细胞肺癌，黑素瘤，骨髓瘤，肉瘤(包括骨肉瘤)，皮肤癌(包括鳞状细胞癌)，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，子宫癌，间皮瘤，胆管癌，平滑肌肉瘤，脂肪肉瘤，纤维肉瘤，神经内分泌癌，唾液腺癌中的任意一种或多种。 [0025] 本发明进一步提供了一种抗肿瘤的药物组合物，含有治疗上有效量的甾体皂苷衍生物和药学上可接受的载体。所述载体包括：溶剂、表面活性剂、增溶剂、助溶剂、润滑剂、填充剂、等渗调节剂、稳定剂或支持剂中的任意一种或多种。 [0026] 本发明所述抗肿瘤制剂的剂型包括：注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、纳米制剂、缓释制剂或控释制剂中的任意一种或多种；优选为纳米制剂。其中，所述纳米制剂包括：脂质体、纳米囊、纳米球、脂质纳米粒或胶束中的任意一种或多种，优选为脂质体或胶束中的任意一种或两种。本发明所述纳米制剂的粒径为10纳米-300纳米。制备所述纳米制剂的常规材料包括：脂质、磷脂、胆固醇、高分子聚合物、两嵌段聚合物、三嵌段聚合物、蛋白、多肽、核酸、壳聚糖、表面活性剂、增溶剂、助溶剂、填充剂、等渗调节剂、稳定剂、支持剂等。 [0027] 本发明抗肿瘤组合物或抗癌制剂可通过临床可接受的治疗方式给药，包括注射、口服、吸入、植入或灌注等。 [0028] 本发明采用对缺氧复氧H9C2心肌细胞存活率的影响实验评价本发明化合物对心肌的保护活性。通过细胞存活率的测定(MTT)、上清液中LDH的测定、cTn-I蛋白释放量的测定，确定本发明式Ⅰ-式Ⅴ所示的化合物对缺氧复氧损伤的大鼠心肌细胞具有明显的保护作用。 [0029] 动物实验证明，相比于伪原薯蓣皂苷，本发明式Ⅰ-式Ⅴ所示的化合物具有优异的溶血栓活性，能够应用于治疗心血管系统疾病。 [0030] 本发明进一步提供了一种预防或治疗心血管疾病的药物组合物，含有治疗上有效量的甾体皂苷衍生物和药学上可接受的载体；所述载体包括：溶剂、表面活性剂、增溶剂、助溶剂、润滑剂、填充剂、等渗调节剂、稳定剂或支持剂中的任意一种或多种。 [0031] 本发明所述预防或治疗心血管疾病的药物组合物可以按照本领域的常规制剂方法制备成临床上适宜的制剂剂型，包括：注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、纳米制剂、缓释制剂或控释制剂中的任意一种或多种；优选为纳米制剂。其中，所述纳米制剂包括：脂质体、纳米囊、纳米球、脂质纳米粒或胶束中的任意一种或多种，优选为脂质体或胶束中的任意一种或两种。本发明所述纳米制剂的粒径为10纳米-300纳米。制备所述纳米制剂的常规材料包括：脂质、磷脂、胆固醇、高分子聚合物、两嵌段聚合物、三嵌段聚合物、蛋白、多肽、核酸、壳聚糖、表面活性剂、增溶剂、助溶剂、填充剂、等渗调节剂、稳定剂、支持剂等。 [0032] 本发明治疗心血管疾病的药物制剂可通过临床可接受的治疗方式给药，包括注射、口服、吸入、植入或灌注等。 [0033] 此外，式Ⅰ-式Ⅴ所示的化合物还具有提高免疫力、抗菌、抗生育等方面的药理活性。附图说明 [0034] 图1是现有技术中伪原薯蓣皂苷的生物转化途径； [0035] 图2是原薯蓣皂苷的生物转化途径； [0036] 图3是本发明载体皂苷衍生物的结构式； [0037] 图4粗体物的薄层板图，从左到右依次为样品1-12； [0038] 图5样品9的薄层板图； [0039] 图6样品8的薄层板图； [0040] 图7样品7的薄层板图； [0041] 图8甾体皂苷衍生物的对心机细胞保护作用的实验结果； [0042] 图9 H9C2心肌细胞缺氧复氧模型的建立结果； [0043] 图10乳酸脱氢酶(LDH:Lactic Dehydrogenase)释放量的测定结果； [0044] 图11心肌肌钙蛋白(cTnI)释放量的测定结果； [0045] 图12对缺氧复氧损伤的H9C2心肌细胞线粒体膜电位的影响测定结果。具体实施方式 [0046] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。 [0047] 实施例1甾体皂苷衍生物的制备及鉴定 [0048] 1.菌株的扩大及萃取 [0049] 先把试管中的菌(橄榄色毛壳Chaetomium olivaceum CGMCC 3.3604)接种在一瓶250mL的三角瓶中培养了2天，然后用胶头滴管把这个三角瓶中的菌转接入17个1L的三角瓶中。实验中所用的培养基为PDA培养基。摇床条件为28℃，160r/min； [0050] 继续培养2天后加入底物伪原薯蓣皂苷。加入的量为2.5g(把2.5g伪原薯蓣皂苷用17mL的甲醇溶解，然后把每个三角瓶中加入1mL)。 [0051] 加入底物4天后终止反应：每瓶培养基中加入等量(400mL)的正丁醇超声萃取30min,重复三次。把萃取液旋蒸浓缩。共得到粗提物19.32g。2.粗提物的分离[0052] 把粗提物用35g100-200目的硅胶拌样，500g200-300目硅胶装柱。洗脱液为氯仿-甲醇-水，极性由12.5:1:0.08到1:1:0.1(表1)。用100mL的锥形瓶接样品，所接样品点板合并后得12份。薄层板图见图4。薄层板从左到右依次为样品1-12(伪原薯蓣皂苷(实验室已有标准品)，纤细薯蓣皂苷(实验室已有标准品)，薯蓣皂苷(实验室已有标准品)，粗提物，空白对照)。 [0053] 表1 [0054] [0055] [0056] 样品9为1.952g，用100-200目的硅胶5g版样，300-400目的硅胶60g装柱，洗脱液为CHCl3–MeOH–H2O(7:1:0.1,5:1:0.1,4:1:0.1,3:1:0.1,2:1:0.1和1:1:0.1)(表2)，然后又得到7份样品，合并后得七份样品(A9-G9)，薄层板图为图5；薄层板从左往右依次为A9-G9(伪原薯蓣皂苷，纤细薯蓣皂苷，薯蓣皂苷)。 [0057] 表2 [0058]洗脱液氯仿甲醇水比例(mL) 280 40 4 300 60 6 240 60 6 300 100 10 260 130 13 150 150 15 [0059] D9和E9是主成分点，因为颜色太深，先上了凝胶除色素。然后D9上制备液相，流动相为MeOH-H2O(71:39,2mL/min)得到纯品化合物1(式Ⅰ化合物)(20.59mg)和化合物2(式Ⅱ化合物)(4mg)。E9也用制备液相，流动相为MeOH-H2O(67:33,2mL/min)得到化合物3(式Ⅲ化合物)(15.8mg)。 [0060] 样品8为468mg，用100-200目的硅胶1.5g拌样，300-400目硅胶20g装柱。上硅胶柱(300-400目,20g)洗脱液为CHCl3-MeOH-H2O比例为10:1:0.07,8:1:0.07,6:1:0.1,4:1:0.1,3:1:0.1(表3)，共接了18份组份，薄层板图为图6。 [0061] 表3 [0062]洗脱液氯仿甲醇水比例(mL) 100 10 0.7 160 20 1.4 180 30 3 200 50 5 180 60 6 [0063] 第8和第9份合并后上制备液相，流动相为MeOH-H2O(62:38,2mL/min)得到纯品化合物4(式Ⅳ化合物)(1.59mg)。 [0064] 样品7(496mg)先上凝胶，流动相为MeOH.。最终获得6份样品(A7-F7)；薄层板图见图7(从左至右依次为A7-F7)。 [0065] 样品B7上制备液相，流动相为MeOH-H2O(80:20,2mL/min)得到化合物5(式Ⅴ化合物)(12.09mg)。 [0066] 化合物1：白色粉末。UV为末端吸收。[α]D20＝—20.86(c0.110,MeOH)IR(Neat)vmax(cm-1):3372,2935,1364,1033。HR-ESI-MS m/z:937.4758[M+Na]+(calcd for C46H74O18Na,937.4773)。 [0067] 化合物2：白色粉末。UV为末端吸收。[α]D20＝—20.41(c0.074,MeOH)IR(Neat)vmax-1 +(cm ):3362,2932,1448,1379,1039。HR-ESI-MS m/z:937.4782[M+Na] (calcd for C46H74O18Na,937.4773)。 [0068] 化合物3：白色粉末。UV为末端吸收。[α]D20＝—18.82(c0.090,MeOH)IR(Neat)vmax(cm-1):3369,2935,1363,1033。HR-ESI-MS m/z:955.4919[M+Na]+(calcd for C46H76O19Na,955.4879)。 [0069] 化合物4：白色粉末。UV为末端吸收。[α]D20＝—34.71(c 0.081,MeOH)IR(Neat)vmax(cm-1):3384,2920,1762,1645,1033。HR-ESI-MS m/z:691.3331[M+Na]+(calcd for C34H52O13Na,691.3306)。 [0070] 化合物5：白色粉末。UV为末端吸收。[α]D20＝—20.86(c 0.110,MeOH)IR(Neat)vmax(cm-1):3370,2935,1652,1456,1380,1033。HR-ESI-MS m/z:761.4097[M+Na]+(calcd for C39H62O13Na,761.4088)。 [0071] 实验例1甾体皂苷衍生物的体外抗肿瘤活性实验 [0072] 体外抗肿瘤活性实验表明，本发明实施例1制备的化合物1-5的抗肿瘤活性明显优于伪原薯蓣皂苷或结构类似化合物的抗肿瘤活性。 [0073] 实验例2甾体皂苷衍生物的体外细胞毒性实验 [0074] 体外细胞毒性实验数据证明，本发明实施例1制备的化合物1-5的毒性明显低于伪原薯蓣皂苷或结构类似化合物的毒性。 [0075] 实验例3甾体皂苷衍生物的对心肌细胞保护作用的实验 [0076] 取对数生长期的细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中，在5％CO2、37℃条件培养30h后移除培养液，加入用DMEM配成的不同浓度(μg/mL)的化合物1-5，在同样条件下培养24h。处理结束后，移除培养液，加入500μM H2O2放置1h后小心移除培养液，每孔中加入10μL CCK-8，再放置2h后，在微孔板扫描酶标仪测450nm处吸光度值(OD值)。将各测试孔的OD值减去本底OD值(无血清培养基加CCK-8，无细胞)，根据各孔OD值计算平均值±SD。 [0077] 细胞存活率％＝(加药细胞OD值-本底OD值)/(对照细胞OD值-本底OD值)×100％。细胞存活数如图8所示。由图8可见，本发明实施例1制备的化合物1-5对由过氧化氢引起损伤的心肌细胞，有显著的保护作用。 [0078] 实验例4甾体皂苷衍生物对H9C2心肌细胞缺氧复氧的保护作用实验 [0079] 一、实验材料 [0080] 1、供试化合物：本发明实施例1所制备的化合物1-5(S1)； [0081] 2、阳性对照样品：地奥心血康。 [0082] 二、实验方法及结果 [0083] (一)H9C2心肌细胞缺氧复氧模型的建立 [0084] 对H9c2心肌细胞缺氧12h，分别复氧0、8、12、16和24h，采用MTT法检测复氧不同时间H9c2心肌细胞存活率。复氧12h后，心肌细胞存活率为51.3％。表明缺氧8h，复氧12h的损伤条件最佳。此时细胞存活率为50％以上，损伤程度符合实验中建立细胞模型的要求(图9)。 [0085] (二)乳酸脱氢酶(LDH:Lactic Dehydrogenase)释放量的测定 [0086] H9c2细胞分为五组进行给药，对照组(Con)、模型组(H/R)、S1低剂量组(H/R+L)、S1高剂量组(H/R+H)、阳性药组(地奥心血康，DA)。各组采用不含血清的DMEM高糖培养基稀释一定浓度的药物对细胞进行预处理(孵育)24h。然后按照缺氧复氧的方法进行实验，实验结束收集全部细胞上清，按照LDH测定试剂盒中的测定方法进行检测。 [0087] 测定结果表明，样品S1低剂量及高剂量能明显减少细胞上清的LDH释放量(图10)。 [0088] (三)心肌肌钙蛋白(cTnI)释放量的测定 [0089] H9c2细胞分为五组进行给药，对照组(Con)、模型组(H/R)、S1低剂量组(H/R+L)、S1高剂量组(H/R+H)、阳性药组(地奥心血康，DA)。采用不含血清的DMEM高糖培养基稀释一定浓度的药物对细胞进行预处理(孵育)24h。然后按照缺氧复氧的方法进行实验，实验结束收集全部细胞上清，按照cTnI测定试剂盒中的测定方法进行检测。 [0090] 检测结果表明，样品S1低剂量及高剂量能明显减少细胞上清cTnI的释放量(图11)。 [0091] (四)对缺氧复氧损伤的H9C2心肌细胞线粒体膜电位的影响检测 [0092] H9c2细胞分为五组进行给药，对照组(Con)、模型组(H/R)、S1低剂量组(H/R+L)、S1高剂量组(H/R+H)、阳性药组(地奥心血康，DA)。各组采用不含血清的DMEM高糖培养基稀释一定浓度的药物对细胞进行预处理(孵育)24h。然后按照缺氧复氧的方法进行实验，实验结束除去细胞上清，清洗细胞后加入JC-1荧光探针液处理细胞，荧光显微镜下观察并记录实验。实验结果表明样品S1低剂量和高剂量均能明显降低缺氧复氧损伤的H9c2心肌细胞的线粒体膜电位而保护心肌细胞(图12)。

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