一种黑种草皂苷A的制备方法及其用途 |
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| 申请号 | CN201510906691.6 | 申请日 | 2015-12-07 | 公开(公告)号 | CN105503993A | 公开(公告)日 | 2016-04-20 |
| 申请人 | 苏州求是本草健康科技有限公司; | 发明人 | 田景奎; 张琳; 李守信; 周生海; 刘江云; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种黑种草皂苷A的制备方法，其主要步骤如下：选取黑种草属 植物 种子 ，采用 乙醇 溶液进行提取，并进一步采用大孔 树脂 进行精制，浓缩，获得黑种草总皂苷浓缩液；所述浓缩液采用加压制备色谱系统，以20-120μm粒径范围的 碳 十八改性 硅 胶为填料，40-60％甲醇为流动相进行分离，收集含有黑种草皂苷A的流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90％的黑种草皂苷A成品。本发明制备产品纯度高，工艺简洁、可操作性强，易于实现产业化放大。本发明所述黑种草皂苷A具有明确抗结肠癌和抗炎作用，因而可应用于具有抗 肿瘤 和抗炎功能的相关药物或保健食品中。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种黑种草皂苷A的制备方法，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种黑种草皂苷A的制备方法及其用途技术领域[0002] 毛茛科黑种草属(Nigella)植物分布在地中海、西亚、中亚、中国新疆等地，黑种草子系维吾尔族(维语斯亚旦)和地中海地区习用药材，具有止咳平喘、抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤、保肝、降脂、降糖等多种药理活性，常用于胸闷气足，乳肿，乳汁减少，耳呜，热淋，石淋，闭经等症。黑种草子中含油30-35％，是维族常用的功能食品；此外，黑种草子中还富含黄酮、皂苷、生物碱等生物活性物质。近年来，黑种草子中含有的皂苷类成分具有一定的体外抗肿瘤活性，因而对其研究工作受到关注。 [0003] 黑种草子现有文献研究侧重于对该类皂苷类成分的分离和鉴定，一般采用醇提、大孔树脂精制、硅胶和反相硅胶多次柱层析纯化等复杂工艺，其分离制备工艺步骤复杂、得率低，主要局限于实验室制备规模。赵军等(中国专利号CN201010250936.1)公开了一种“黑种草子总苷提取物及其制备方法和应用”，所述工艺主要通过大孔树脂精制获得黑种草子总苷提取物，其中含有50％至80％的皂苷、3％至11％的黄酮。刘玉明等(中国专利申请号CN201310619087.6)公开了“一种从斯亚旦中提取异株五加甲苷的方法”，所述工艺主要通过乙醇提取、乙酸乙酯萃取除杂、萃取后水相经大孔树脂精制获得异株五加甲苷(即黑种草皂苷A)提取物(纯度范围57.5％至70.3％)。 [0004] 为进一步综合开发利用黑种草属植物资源，发明人对黑种草子中的化学成分进行深入研究，从中分离鉴定了生物碱、皂苷等成分[Lian-li Sun，Study on antitubercular constituents from the seeds of Nigella Glandulifera.Chem Pharm Bull，2013，61(8)：873-876]。黑种草皂苷A是其中的主要成分，又名异株五加甲苷，其化学名：常春藤皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯糖基]-28-O-[α-L-鼠李糖基(1→4)-β-D-葡糖基-(1→6)-β-D-葡糖苷]。采用优选的大孔树脂精制工艺，制备获得的黑种草总皂苷中，皂苷A含量约为50％[栾明，维药黑种草子中活性成分HE-III的大孔树脂纯化工艺研究，中国药学杂志，2014，49(12)：1014-1017]。 [0005] 通过深入研究，本发明首次研制出高纯度黑种草皂苷A(含量大于90％)的规模化制备工艺，从而完成了本发明。 发明内容[0006] 本发明的目的是提供一种易于实现产业化的高纯度黑种草苷A制备工艺。 [0007] 本发明提供的黑种草皂苷A的制备方法包括以下步骤： [0008] (1)选取黑种草属植物种子原料，采用水或醇-水混合溶剂进行提取，提取液浓缩，过滤，上大孔树脂进行吸附，依次用水、50-80％乙醇梯度洗脱，收集50-80％乙醇洗脱液，浓缩，获得黑种草总皂苷浓缩液； [0009] (2)由(1)所得黑种草总皂苷浓缩液，采用加压制备色谱系统，以20-120μm粒径范围的碳十八改性硅胶为填料，40-60％甲醇为流动相进行分离，收集含有黑种草皂苷A的流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90％的黑种草皂苷A成品。 [0010] 所述工艺步骤(1)中，所述黑种草属植物可选自腺毛黑种草(Nigella glandulifera)、黑种草(Nigella damascena)、果黑种草(Nigella sativa)等同属植物中的任意一种。黑种草皂苷A在黄花败酱、异株五加、野木瓜等其它科属植物中也有发现，但其含量在黑种草子中最高。提取溶剂为水、含水乙醇中的任意一种，其中优选60-80％乙醇。所述大孔树脂为苯乙烯系树脂，其中优选弱极性大孔树脂。大孔树脂洗脱优选60-80％乙醇洗脱液。根据需要，大孔树脂乙醇洗脱液经浓缩后，可进一步采用超滤透析和纳滤浓缩工序处理，获得黑种草总皂苷浓缩液。 [0011] 所述工艺步骤(2)中，所述加压制备色谱系统为低压或中压制备色谱，优选中压制备色谱系统。所述碳十八改性硅胶填料平均粒径范围20-120μm，优选40-80μm。所述流动相优选45-55％甲醇范围；洗脱方式可为等度或梯度洗脱，优选等度洗脱。所述含有黑种草皂苷A的流份采用在线紫外检测，检测波长为200-210nm。 [0012] 本发明通过系统工艺研究，所完成的黑种草皂苷A制备技术路线有以下特色：(1)采用优选的大孔树脂梯度洗脱工艺，结合超滤透析、纳滤浓缩工序，可有效除去黑种草总皂苷浓缩液中的低分子量黄酮、寡糖等杂质，同时对浓缩液进行过滤澄清，简化了后续纯化工艺负担；(2)创新性应用中压反相柱色谱工序，可通过一步制备柱层析获得高纯度黑种草皂苷A产品，成功实现了纯化工序的自动化和生产可行性。本发明产品纯度高，工艺简洁、可操作性强，易于实现产业化放大。 [0013] 本发明同时对所述黑种草皂苷A的抗肿瘤和抗炎作用进行了考察。研究结果表明，黑种草皂苷A(80、120mg/kg，i.p.)可显著抑制SW620人结肠癌裸鼠的瘤重；黑种草皂苷A(100、200mg/kg)对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症有显著抑制作用。结果表明所述黑种草皂苷A具有明确的抗结肠癌、抗炎等作用，因而可以应用于具有抗肿瘤和抗炎功能的相关药物或保健食品中。 [0015] 图1为采用本发明实施例1中提取的步骤(1)黑种草总皂苷样品HPLC色谱图。 [0016] 图2为采用本发明实施例1中提取的步骤(2)黑种草皂苷A样品HPLC色谱图。 [0017] 图1和图2中，色谱峰1为黑种草皂苷A。 具体实施方式[0019] 实施例1黑种草皂苷A的制备 [0020] 黑种草子药材购自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐(批号：NG20121025)，经鉴定为毛莨科植物腺毛黑种草(Nigella glandulifera Freyn et Sint)的干燥成熟种子。 [0021] 采用HPLC测定黑种草皂苷A含量，色谱条件：Agilent TC-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；ELSD检测；流动相为乙腈-水(32∶68)等度洗脱20min；流速1.0mL/min；柱温40℃；进样量20μL。大孔树脂制备工艺参考栾明报道进行[中国药学杂志，2014，49(12)：1014- 1017]。 [0022] (1)取榨油后的黑种草子药材10kg，加10倍量70％乙醇回流提取3次，每次1h；合并滤液，减压回收至无醇味，用水稀释至40L，过滤，上AB-8大孔树脂层析柱(柱体积30L/BV)，先用水洗脱6BV，再用70％乙醇洗脱4BV，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩至12L，其中4L备用；余下8L浓缩液经60℃真空干燥，得黑种草总皂苷143g，HPLC测定其中黑总草皂苷A含量为53.5％，HPLC色谱图参见附图1。 [0023] (2)取黑种草总皂苷浓缩液2L，加入甲醇500ml稀释，过滤，上Daisogel RP-18柱(40-60μm，柱体积4L)中压制备色谱，45％甲醇等度洗脱，洗脱流速300mL/min，检测波长210nm，HPLC检测合并高纯度黑种草皂苷A的流分，减压浓缩，50℃真空干燥，得黑种草皂苷A 28g(含量95.5％)。HPLC色谱图参见附图2。 [0024] 实施例2黑种草皂苷A的制备 [0025] 取实施例1(1)所得黑种草总皂苷浓缩液2L，加入甲醇500ml稀释，过滤，上Daisogel RP-18柱(80-120μm，柱体积4L)中压制备色谱，45％→55％甲醇梯度洗脱120min，洗脱流速300mL/min，检测波长210nm。HPLC检测合并黑种草皂苷A的流分，减压浓缩，50℃真空干燥，得黑种草皂苷A 31g(含量91.4％)。 [0026] 实施例3黑种草皂苷A的制备 [0027] (1)取榨油后的黑种草子药材10kg，加15倍量50％乙醇回流提取2次，每次1.5h；合并滤液，减压浓缩至无醇味，用水稀释至40L，过滤，上HPD450大孔树脂层析柱(柱体积30L/BV)，先用水洗脱6BV，再用60％乙醇洗脱4BV，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，用水稀释至50L，先用超滤陶瓷膜(0.05μm孔径)过滤，收集透过液40L，再用纳滤有机膜(截留分子量200Da)过滤，收集黑种草子总皂苷浓缩液5L。测定浓缩液中固含物为62g/L，其中黑种草皂苷A含量为76.7％。 [0028] (2)取黑种草子总皂苷浓缩液1L，加甲醇250ml稀释，上Daisogel RP-18柱(40-60μm，柱体积4L)中压制备色谱，55％甲醇等度洗脱，洗脱流速300mL/min，检测波长210nm，HPLC检测合并黑种草皂苷A的流分，减压浓缩，50℃真空干燥，得黑种草皂苷A 42g(含量98.7％)。 [0029] 实验例1：黑种草皂苷A对SW620肿瘤的抑制作用考察 [0030] 采用SW620人结肠癌裸鼠模型，考察黑种草皂苷A(NGA)的体内抗肿瘤作用。将接种SW620的裸鼠，随机分为模型组(空白对照)、阳性对照组(环磷酰胺30mg/kg，腹腔注射)、皂苷A剂量组(40、80、120mg/kg，灌胃)，连续给药4周，末次给药24小时后，处死动物，分离腋下肿瘤并称重，计算肿瘤体积、相对肿瘤增殖率T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％。(TRTV：治疗组相对肿瘤体积；CRTV：模型组相对肿瘤体积；相对肿瘤体积(RTV)＝Vt/V0，其中V0为分笼给药时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积)以及平均抑瘤率，公式如下：I＝(1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％。实验结果见表1。 [0031] 表1 黑种草皂苷A对SW620人结肠癌裸鼠的抑制作用(n＝6， ) [0032] [0033] 结果表明：黑种草皂苷A(80、120mg/kg，i.p.)可显著抑制小鼠的瘤重，T/C比范围为51.16％、38.74％，结果表明黑种草皂苷A具有明确抗SW620人结肠癌肿瘤作用。 [0034] 讨论：本发明曾采用MTT体外实验，测试黑种草皂苷A对A549人肺癌细胞株、Sk-ov-3人卵巢癌细胞株、HepG2人肝癌细胞株、PC3人前列腺癌细胞株、SW620人结肠癌细胞株等5种瘤株的抑制作用。结果表明该化合物在测试浓度(100μM)下对5种瘤株均无抑制作用，相应水解产物“常春藤皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯糖基]”均有效(IC50约15-25μM)。结合本次体内试验，本发明首次证实，黑种草皂苷A具有明确抗SW620人结肠癌肿瘤作用，推测可能作为其水解产物前药起效。 [0035] 实验例2：黑种草皂苷A的抗炎作用考察 [0036] 选用实施例1黑种草皂苷A进行抗炎实验。取20-25g小鼠80只，雌雄各半，分为皂苷A低/中/高剂量组(50、100、200mg/kg)、吲哚美辛对照组(20mg/kg)和模型组5组，预灌胃给药一周。最后一次灌药2小时后，用二甲苯25微升均匀涂于小鼠右耳，半小时后处死小鼠，用直径6mm打孔器，取小鼠的左右耳相同部位，用分析天平称重。取下的右耳减去左耳重量为肿胀度，计算对照组和给药组的均值与标准差，t检验比较组间差异显著性。按下式求出肿胀抑制率： [0037] 肿胀抑制率(％)＝[1-给药组平均肿胀度/模型组平均肿胀度]×100％[0038] 结果：黑种草皂苷A中/高剂量(100、200mg/kg)组对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症均有抑制作用，肿胀抑制率依次为61.3、76.5(％)。 |
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