[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从干燥的千金子中分离得到的一种具有治疗急性T淋巴细胞白血病作用的甾体类化合物及其制备方法。

[0002] 千金子亦称千两金、菩萨豆、续随子、联步、滩板救，为大戟科植物续随子Euphorbia lathyris L.的干燥成熟种子，是我国传统中药材之一。千金子性温，味辛，具有逐水消肿、破癥杀虫之功，用于水肿胀满、痰饮、宿滞、癥瘕积聚、妇女闭经、疥癣疮毒、蛇咬、疣赘。在我国主要生长于河北、河南、浙江,此外四川、辽宁、吉林、湖南、广西等地亦产。国外则主要广泛分布于中欧、南欧、俄国南部、南美、北美及澳大利亚。

[0003] 综合文献报道，千金子含有47％～50％的脂肪油，15％的蛋白质，还主要含有甾醇、二萜酯及游离的二萜醇、香豆素类及其他化合物。

[0004] 现在研究表明千金子具有抗肿瘤作用、抗菌作用、致泻作用、镇静催眠及镇痛抗炎作用、抑制黑色素生成作用等。

[0005] 本发明的目的是提供一种从干燥的千金子中分离得到的一种具有治疗急性T淋巴细胞白血病作用的甾体类化合物及其制备方法。

[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

[0007] 具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

[0008]

[0009] 所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将干燥的千金子粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用80％乙醇洗脱10个柱体积，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩得80％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中80％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、25:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

[0010] 进一步地，所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂。

[0011] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为75％。

[0012] 一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

[0013] 所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗急性T淋巴细胞白血病的药物中的应用。

[0014] 所述的药物组合物在制备治疗急性T淋巴细胞白血病的药物中的应用。

[0015] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。

[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。附图说明

[0018] 图1为化合物(Ⅰ)结构式；

[0019] 图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较。

[0020] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

[0021] 实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证

[0022] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。

[0023] 制备方法：(a)将干燥的千金子(10kg)粉碎，用75％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用
80％乙醇洗脱10个柱体积，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩得80％乙醇洗脱物浸膏(161g)；
(c)步骤(b)中80％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1(8个柱体积)、45:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(52g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为
20:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和8:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(26g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10-12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(237mg)。

[0024] 结构确证：白色无定形粉末；HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 431.2912，结合核磁特征可得分子式为C28H40O2，不饱和度为9。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，500MHz)：H-1(1.24，m)，H-1(1.76，m)，H-2(1.67，m)，H-2(1.98，m)，H-4(5.61，d，J＝1.8)，H-6(3.08，m)，H-6(3.19，m)，H-8(2.13，m)，H-9(1.15，m)，H-11(1.41，m)，H-11(1.66，m)，H-12(1.02，m)，H-12(1.93，m)，H-14(1.45，m)，H-15(1.67，m)，H-15(1.91，m)，H-16(1.32，m)，H-16(1.56，m)，H-17(2.01，m)，H-18(0.61，s)，H-19(1.07，s)，H-21(1.68，s)，H-22(5.24，m)，H-23(2.53，m)，H-23(2.65，m)，H-25(2.11，m)，H-26(0.93，d，J＝6.9)，H-27(0.92，d，J＝6.9)，H-28(4.54，br，d，J＝1.5)，H-28(4.59，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，125MHz)：35.8(CH2，1-C)，30.6(CH2，2-C)，201.7(C，3-C)，125.6(CH，4-C)，164.5(C，5-C)，46.1(CH2，6-C)，
203.6(C，7-C)，50.0(CH，8-C)，49.5(CH，9-C)，37.7(C，10-C)，20.8(CH2，11-C)，38.3(CH2，
12-C)，42.6(C，13-C)，49.5(CH，14-C)，25.8(CH2，15-C)，28.2(CH2，16-C)，54.3(CH，17-C)，
11.7(CH3，18-C)，17.1(CH3，19-C)，139.7(C，20-C)，21.8(CH3，21-C)，121.4(CH，22-C)，32.9(CH2，23-C)，157.3(C，24-C)，33.4(CH，25-C)，21.7(CH3，26-C)，21.7(CH3，27-C)，105.6(CH2，28-C)；碳原子标记参见图1。1H-NMR谱显示五个甲基信号[δH0.61(s，H3-18)，0.92(d，J＝6.9Hz，H3-27)，0.93(d，J＝6.9Hz，H3-26)，1.07(s，H3-19)和1.68(s，H3-21)]，一个烯属亚甲基[δH4.54(br，d，J＝1.5Hz，H-28)和4.59(s，H-28)]，两个烯属次甲基质子信号[δH5.24
13
(m，H-22)和5.61(d，J＝1.8Hz，H-4)]，表明该化合物为甾体化合物。C-NMR谱显示了28个碳信号，包括五个甲基，九个亚甲基(一个烯属亚甲基)，七个次甲基(两个烯属次甲基)，以及七个季碳(三个烯烃季碳，两个羰基季碳)。HMBC谱中Me-18(δH0.61)与C-12(δC38.3)，C-13(δC42.6)，C-14(δC49.5)和C-17(δC54.3)，以及Me-19(δH1.07)与C-1(δC35.8)，C-5(δC164.5)，C-9(δC49.5)和C-10(δC37.7)的相关性表明该化合物为四环结构。核磁数据表明该化合物含有一个α,β-不饱和酮羰基结构[δH5.61(d，J＝1.8Hz，H-4)；δC125.6(C-4)，
164.5(C-5)和201.7(C-3)]。两个低场碳信号[δC121.4(C-22)和139.7(C-20)]和质子共振信号[δH5.24(m，H-22)]，表明该化合物含有一个三取代双键。此外，该化合物还含有一个二取代双键[δH4.54(br，d，J＝1.5Hz，H-28)和4.59(s，H-28)；δC105.6(C-28)和157.3(C-
24)]。NOESY谱中，H-12α与H-17的相关性表明H-17为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。

[0025] 实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验

[0026] 一、材料和仪器

[0027] 急性T淋巴细胞白血病Molt4细胞由暨南大学血液病研究所惠赠；慢性粒细胞白血病细胞K562细胞由暨南大学由生物化学与分子生物学教研室惠赠。化合物(Ⅰ)为自制，HPLC归一化纯度大于98％，用DMSO分析纯溶解配制成5.5μg/mL溶液备用。DMEM/F12培养基粉、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、四苯基氮哇蓝试剂(MTT)购于美国Gibeo公司。新生牛血清(Newbom Calf Serum)购于中国杭州四季青公司。青霉素(Penicillin)、链霉素(Streptomycin)购于华北制药公司中国。碘化丙睫(PT)购于美国Sigma公司。PI-Annexin V双染试剂盒购于中国北京宝赛生物技术公司。ROS高质荧光测定试剂盒购于中国碧云天生物技术研究所。Rhodamine123购于美国Molecular Probes公司。

[0028] CO2培养箱(美国Thermo Forma)，超净工作台(中国苏州净化仪器厂)，压力蒸汽灭菌锅(LDZX40BI)(中国上海申安医疗器械厂)，TGL-16G型台式高速离心机(中国上海安亭科学仪器厂)，MA260S型电子分析天平(中国上海第二天平仪器厂)，自动双重纯水蒸馏器(中国上海玻璃仪器一厂)，Sterivex TM，0.22μm无菌针头式过滤器(美国Millipore公司)，XDS-1B光学倒置显微镜(中国重庆光学仪器厂)，全自动酶标仪(美国BIO-RID公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD FACSAria公司)。QL-901型旋涡混合器(江苏海门市麒麟医用仪器厂)。

[0029] 二、试验方法

[0030] 1、细胞培养

[0031] 人急性T淋巴细胞白血病细胞Molt4细胞培养体系：DMEM/F12培养液含10％新生牛血清，置37℃、体积分数为5％CO2培养箱，每2-3天传代培养。选用对数生长期、0.2％台盼蓝拒染率>95％的细胞进行实验。

[0032] 2、MTT法检测细胞增殖抑制率

[0033] 3×104mL Molt4细胞接种于96孔培养板，终体积为200μL/孔，每组设5复孔，化合物(Ⅰ)设五个浓度分别为2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg//mL，20μg//mL。置37℃、5％CO2培养箱中培养48h、72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL用PBS波长570nm，参比波长690nm)，计算各组增殖抑制率。每次实验重复3次，取其均值。增殖抑制率(％)＝(1-A实验组/A对照组)×100％。

[0034] 3、PI单染检测细胞周期

[0035] 2×l05/mL Molt4细胞接种于12孔培养板，每孔1800μL，化合物(Ⅰ)设三个浓度分别为5μg/mL，10μg/mL 15μg/mL，终体积2500μL，设3复孔。置37℃、5％CO2培养箱中培养48h后收集细胞，预冷的0.01mol/L PBS洗涤细胞2次，用体积分数为70％乙醇4℃固定过夜，离心去上清，加入PI染色液(含RNA酶)，终浓度50μg/mL，避光染色30min，300目尼龙网过滤后上流式细胞仪分析细胞DNA含量，每个样本随机分析12000个细胞，得各组细胞生长周期比例，美国BD FAC Sort Cell Quest软件分析处理结果。

[0036] 4、AnnexinV-PI双染测定细胞凋亡比例

[0037] 细胞处理及加药方法均同上，培养48h后，调整细胞浓度为5×106/mL，各组取lmL细胞，预冷0.01mol/L PBS洗涤3次，吸尽上清，加入200μL试剂盒提供的结合缓冲液，重悬细胞，分别加入10μLAnnexin V-FITC和5μL，轻轻混匀，4℃避光反应30min，再加入300μL结合缓冲液，上流式细胞仪检测。Annexin V-FITC+、PI-的细胞群(即LR细胞群)为早期凋亡细胞。

[0038] 5、统计分析

[0039] 以均数士标准差 表示，应用SPSS13.0统计软件处理，采用完全随机设计的单因素方差分析(one-wayANOVA)分析组间差异的显著性。

[0040] 三、结果及结论

[0041] 1、化合物(Ⅰ)对Molt4细胞的增殖抑制作用

[0042] 化合物(Ⅰ)在不同时间点对Molt4细胞均有明显的增殖抑制作用。DMSO(0.5％)组在48h、72h的增殖抑制率分别是5.2％±0.8％、6.40％±0.9％。不同浓度化合物(Ⅰ)处理组的增殖抑制率与DMSO组相比均有统计学意义(P<0.01)。相同浓度条件下，72h的增殖抑制率较48h高。化合物(Ⅰ)对Molt4细胞48h、72h的IC50分别是19.4±0.2μg/mL、15.7±0.1μg/mL。不同浓度的化合物(Ⅰ)均显示一定的增殖抑制效果，且具有时间、剂量赖关系。结果见表1(注：*标记与Control组比较，P<0.01)。

[0043] 2、化合物(Ⅰ)对Molt4细胞周期的影响

[0044] 化合物(Ⅰ)作用Molt4细胞48h后，空白对照组G1期细胞比例为37.5％±0.2％，S期细胞比例为50.6％±0.1％，G2期细胞比例为11.7％±0.1％，DMSO组G1期细胞比例为39.6％±0.1％，S期细胞比例为51.6％±0.2％，G2期细胞比例为8.7％±0.2％。化合物(Ⅰ)药物20μg/mL、25μg/mL处理组G1期所占细胞比例分别为4.1％±0.1％、65.8％±0.1％，S期细胞所占的比例增加分别为85.1％±0.3％、87.1％±0.25(P<0.01)，G2期细胞所占比例分别为10.7％±0.2％、7.0％±0.1％，结果显示G1期有明显差别(P<0.05)说明化合物(Ⅰ)阻滞Molt4细胞处于周期S期。结果见表2(注：*标记与Control组比较，P<0.01)。

[0045] 3、化合物(Ⅰ)作用Molt4细胞后的早期凋亡率

[0046] 化合物(Ⅰ)作用Molt4细胞48h后，Almexin V/PI双染流式细胞仪检测早期凋亡率。空白对照组细胞早期凋亡率6.6％±0.4％，DMSO对照组的早期凋亡率7.0％士0.3％，与空白对照相比无统计学意义(p>0.05)。化合物(Ⅰ)10μg/mL组、15μg/mL组早期凋亡率分别是
9.5％±0.3％、15.0％±0.5％，与空白对照相比有统计学意义(P<0.05)。结果见表3(注：*标记与Control组比较，P<0.05)。

[0047] 结论，在研究中我们发现化合物(Ⅰ)作用Molt4细胞后能够诱导其显著的周期阻滞和凋亡，并使细胞周期停留于S期，从而诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。化合物(Ⅰ)在治疗急性T淋巴细胞白血病方面具有潜在的应用价值。

[0048] 表1 化合物(Ⅰ)对Molt4细胞的增殖抑制作用(％， n＝3)

[0049]组别 48h抑制率(％) 72h抑制率(％)
DMSO 5.2±0.8 6.4±0.9
化合物(Ⅰ)2.5μg/mL 6.3±1.3 8.4±1.1
化合物(Ⅰ)5μg/mL 10.5±2.4 11.6±2.5
化合物(Ⅰ)10μg/mL 18.6±1.6* 26.9±2.7*
化合物(Ⅰ)15μg/mL 33.4±2.7* 49.4±2.2*
* *
化合物(Ⅰ)20μg/mL 53.2±4.4 65.4±1.6

[0050] 表2 各组细胞周期百分比(％， n＝3)

[0051]

[0052] 表3 化合物(Ⅰ)对Molt4细胞凋亡的影响(％， n＝3)

[0053]组别 细胞凋亡率
Control 6.6±0.2
DMSO 7.0±0.4
*
化合物(Ⅰ)10μg/mL 9.5±0.3
化合物(Ⅰ)15μg/mL 15.0±0.3*

[0054] 实施例3

[0055] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的比例加入赋形剂，制粒压片。

[0056] 实施例4

[0057] 口服液制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

[0058] 实施例5

[0059] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

[0060] 实施例6

[0061] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

[0062] 实施例7

[0063] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

[0064] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。