The novel compounds wf00144

【発明の詳細な説明】 新規化合物ＷＦ００１４４ 技術分野 本発明は、以下においてＷＦ００１４４物質と称される医薬として有用な新規生理活性化合物またはその塩に関するものである。 発明の開示 本発明は、新規生理活性化合物ＷＦ００１４４物質またはその塩に関するものである。 より詳しくは、糖新生に対する阻害活性を有する新規化合物ＷＦ００１４４物質またはその塩、それらの製造方法、それらを含有し、抗糖尿病薬として有用な医薬組成物、ならびにそれらの医薬としての使用に関するものである。 したがって、この発明の一つの目的は、糖尿病などの治療および予防に有用な新規化合物ＷＦ００１４４物質を提供することである。 この発明の他の目的は、栄養培地内でのＷＦ００１４４物質生産微生物の発酵によってＷＦ００１４４物質を製造する方法を提供することである。 この発明のさらに他の目的は、有効成分としてＷＦ００１４４物質を含有する医薬組成物を提供することである。 この発明のいま一つの目的は、糖尿病などの治療および予防のためのＷＦ００ １４４物質の用途を提供することである。 ＷＦ００１４４物質は、ＷＦ００１４４物質生産微生物、特にＰｈｏｍａ ｓ ｐ． Ｎｏ． ００１４４などのＰｈｏｍａ属に属する菌株の栄養培地内での発酵によって製造することが可能である。 この明細書に記載している特定の生物は、例示に過ぎず、ＷＦ００１４４物質の製造は、この生物を使用することに限定されるものではない。 自然変異株、およびＸ線照射、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリンによる遺伝子工学処理などの慣用の方法によって前記の生物から生成可能な人工変異株などの、ＷＦ００１４４物質を生産することができるいかなる変異株を使用することも、この発明は包含している。 生産菌株Ｎｏ． ００１４４の特性 真菌Ｎｏ． ００１４４は、日本国山梨県南都留群足和田村で採取した腐敗葉試料から、最初に分離された。 この生物は、種々の培地で限定的に成長し、オリーブ褐色ないし暗緑色のコロニーを形成した。 寒天培地の表面または内部で、菌株は、分生子殻状の分生子果を形成した。 分生子果は、球形ないし準球形、茶色で、内壁面にフラスコ型分生子形成細胞を形成した。 分生子は、無色、単細胞で、 球形ないし準球形であった。 菌株は完全世代を形成しなかった。 その菌学的特性は以下の通りであった。 種々の寒天培地での培養特性を表１に要約する。 ポテトデキストロース寒天での培養株は、抑制的に増殖し、２５℃で２週間後に直径２．０〜３．０ｃｍに達した。 このコロニー表面は、平坦ないし隆起状で、フェルト状ないし綿状で、緑色がかった灰色ないし暗緑色であった。 多くの分生子果が培地の表面または内部に形成された。 裏面の色は暗灰色ないし赤味がかった灰色であり、赤味がかった可溶色素を生じることがあった。 コーンミール寒天でのコロニーは、同一条件において、ポテトデキストロース寒天の場合よりも抑制的に広がり、直径１．５〜 ２．５ｃｍに達した。 表面は、平坦、フェルト状、浸出状態であり、中央部で茶色がかった灰色ないしオリーブ色がかった茶色、周縁部で暗灰色ないし暗緑色であった。 裏面は暗灰色ないし暗緑色であった。 分生子果は多量に形成された。 形態学的特性を、三浦のＬＣＡ平板(Miura,KおよびM.Kudo:Trans.Mycl.Soc.Ja pan,11:116-118,1970)上の培養に基づいて決定した。 分生子果は、分生子殻状で、表在性または液浸し、分離し、茶色ないし焦げ茶色であった。 それらの形状は、球形ないし準球形、時には乳頭状で、個別の開孔型で、単室構造で、大きさは６０〜９０（〜１１０）ｘ５５〜８５μｍであった。 孔口は、直径が１０ 〜３０（〜３５）μｍであった。 経時培養株の場合、数個の分生子殻が、孔口の周りに１〜３（〜５）個の剛毛を形成した。 これらの剛毛は、焦げ茶色、滑らか、厚膜状で、不分枝状で、少し屈曲し、先が尖り、１５〜２４ｘ４〜６μｍであった。 分生子殻壁は薄く、１〜２個の細胞膜から構成されていた。 分生子殻壁の細胞は、厚膜状で、茶色、不規則形状で、３．５〜８ｘ２．５〜６．５μｍであり、多角菌組織を形成した。 分生子殻の内壁は、分生子柄を有しない分生子形成細胞を直接形成した。 分生子生成細胞は、離散状、頂端生長性、無色、滑らか、 フラスコ状ないし壺状で、３．５〜８ｘ２．５〜６μｍであった。 分生子生成細胞の端部は、幅が１．５ないし２．５μｍであった。 分生子は、内生出芽型、フィアロ型、無色、滑らか、単細胞で、球形ないし準球形で、基部に小突起を有し、２．５〜３．５ｘ（２〜）２．５〜３μｍであった。 栄養菌糸は、滑らかで隔壁を有し、茶色で、分枝状であった。 菌糸細胞は、円筒状で、幅が１．５〜５μ ｍであった。 厚膜胞子は観察されなかった。 菌株Ｎｏ． ００１４４は、５〜３０℃の温度範囲で増殖可能であり、最適の増殖は２１〜２４℃であった。 これらの温度データは、ポテトデキストロース寒天（日水製）において決定した。 Arx(J．A．von Arx:The Genera of Fungi‐Sporulating in Pure Culture 3版，pp．315，J．Cramer，Vaduz，1974）およびSutton（B．C．Sutton:The Coelom ycetes‐Fungi Imperfecti with Pycnidia，AcervuliおよびStroma，pp．696，C ommonwealth Mycological Institute，Kew，1980）による菌類分類基準に照らし合わせて、菌株Ｎｏ． ００１４４が、分生子果不完全菌Ｐｈｏｍａ属Ｓａｃｃ． １８８０（スフェロプシス目）に属すると判断した。 したがって、我々は、この分離菌株をＰｈｏｍａ属の一つの菌株と同定し、それをＰｈｏｍａ ｓ ｐ． Ｎｏ． ００１４４と命名した。 ブダペスト条約に基づいて、この菌株を、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、 ＦＥＲＭ ＢＰ−６３６０として寄託した（受託日：１９９８年５月１９日）。 表１ 菌株Ｎｏ． ００１４４の培養特性

略記法：Ｇ：増殖（コロニーの大きさを直径で測定） Ｓ：コロニー表面 Ｒ：裏面

^* ：麦芽エキス寒天、ツザペク溶液寒天およびＭＹ２０寒天の組成は、ＪＣＭ菌株目録（Nakase，T.，6版，pp．617，Japan Collection of Microorganisms，理化学研究所，埼玉，1995）に基づいた。 これらの特性は、２５℃でのインキュベーションの１４日後に観察された。 色表現は、メシュエン色ハンドブック（Kornerup，A．およびJ．H．Wanscher，3版，pp．252，Methuen，London，1978）に基づいた。 ＷＦ００１４４物質の製造 ＷＦ００１４４物質は、Ｐｈｏｍａ属に属するＷＦ００１４４物質生産菌株が、好気条件（たとえば振盪培養、浸漬培養など）において、同化可能な炭素源および窒素源を含む栄養培地内で増殖するときに生産される。 栄養培地内の好ましい炭素源としては、炭水化物、たとえばブドウ糖、蔗糖、 澱粉、果糖、グリセリンなどを挙げることができる。 好ましい窒素源としては、落花生粉、酵母エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、大豆粉、大豆ミール、コーンスチープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽など、さらには無機または有機の窒素化合物、たとえばアンモニウム塩（たとえば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウムなど）、尿素またはアミノ酸などを挙げることができる。 炭素源および窒素源は、組み合わせて用いるのが有利であるが、微量の増殖因子およびかなりの量のミネラル栄養分を含んだ低純度物質も使用に適しているので、純粋な形で用いる必要はない。 所望するならば、培地に、炭酸ナトリウムまたはカルシウム、燐酸ナトリウムまたはカリウム、塩化ナトリウムまたはカリウム、ヨウ化ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩、銅塩、亜鉛塩、鉄塩またはコバルト塩などのミネラル塩を加えてもよい。 必要に応じて、特に培地が著しく発泡する場合、流動パラフィン、脂肪油、植物油、鉱油、シリコーンなどの消泡剤を加えてもよい。 培養混合物の攪拌と通気は、種々の方法で実施してもよく、たとえば、攪拌は、プロペラまたは同様の機械式攪拌装置を用いるか、発酵槽を回転または振盪するなどの方法を用いてもよい。 発酵は、発酵の条件および規模により変動することがあるが、通常、約１０℃ 〜４０℃、好ましくは２０℃〜３５℃の温度で約２４時間〜１２０時間実施する。 発酵終了時に、ＷＦ００１４４物質の回収のため、培養した培地は、生理活性物質の回収と精製に慣用的に用いられる種々の方法、たとえば適当な溶媒またはいくつかの溶媒の混合物を用いる溶媒抽出、クロマトグラフィー、または適当な溶媒または溶媒の混合物からの再結晶などに付される。 このようにして得られたＷＦ００１４４物質は、慣用の方法でその塩に変換可能である。 ＷＦ００１４４物質の塩としては、有機または無機の塩基との塩、たとえばアルカリ金属塩（たとえばナトリウム塩またはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（たとえばカルシウム塩またはマグネシウム塩）、有機アミン塩（たとえばエタノールアミン塩など）、アミノ酸塩（たとえばアルギニン塩、リシン塩、 ヒスチジン塩など）などを挙げることができる。 このようにして得られたＷＦ００１４４物質は、以下の物理化学的性質を有する。 (1) 外観 白色粉末(2) 分子式： C

₂₇ H

₄₀ O

₉

(3) 元素分析：C

₂₇ H

₄₀ O

₉・1/2H2O 計算値：C 62.65，H 7.98 実測値：C 62.22，H 7.97 (4) 分子量： ESI-MS(負)：m/z 507(M−H)

^-

（計算分子量：508.61） (5) 融点： 85-89℃（分解） (6) 比旋光度： [α]D(23℃)=-16゜（c=0.2，クロロホルム中） (7) 紫外吸収スペクトル： λmax(メタノール)：275nm（ε=8000） (8) 溶解性： 可溶：アセトニトリル、クロロホルム、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド わずかに可溶：ｎ−ヘキサン 不溶：水、 (9) 呈色反応： 陽性：硫酸セリウム反応、ヨウ素蒸気反応 陰性：モーリッシュ反応、ニンヒドリン反応、ドラーゲンドルフ反応 エールリッヒ反応(10) 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：

^* Ｅ． Ｍｅｒｃｋ製(11) 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)： 条件： カラム：YMC-Pack Pro C18 AS-302

^** （4.6mmφx150mmL） 移動相：0.05%トリフルオロ酢酸を含む50%アセトニトリル水溶液 流量：1ml/min 検出：UV、280nm 保持時間：7.9分

^** ：YMC株式会社製(12) 赤外吸収スペクトル： νmax(KBr):3480，2980，2930，1730，1710，1650，1620，1460，1380，116 0，1140cm

^-1 (15) 物質の性質： 両性物質ＷＦ００１４４物質の生物学的性質 ＷＦ００１４４物質は、糖新生に対する阻害活性などの薬理活性を有し、したがって、糖尿病などの治療および予防に有用である。 さらに、ＷＦ００１４４物質は、糖新生に対する阻害活性などの有用な薬理活性を有するので、種々の疾患に対して有用であろう。 ＷＦ００１４４物質の生物学的活性を示す例として、生物学的データを以下に説明する。 試験（ラット肝細胞糖新生に対するＷＦ００１４４物質の作用） ２４時間絶食させた雄性ウィスターラット（１５０〜２００ｇ）から、コラゲナーゼ潅流法によって肝細胞を調製した。 ５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清と０．１ ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含むウィリアムのＥ培地内で、９６穴の組織培養プレートを用いて、細胞を６時間培養した。 細胞を燐酸緩衝食塩水で洗浄し、ブドウ糖を含まず、２０ｍＭピルビン酸、１ｘ１０

^-7 Ｍグルカゴン、０．１ｍｇ／ｍｌ カナマイシンおよび１％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したダルベッコの改変イーグル培地でインキュベートした。 １５時間後、培地内に生成したブドウ糖を酵素的に測定した。 ピルビン酸から導いたブドウ糖値を糖新生率とした。 ラット肝細胞糖新生に対するＷＦ００１４４物質の５０％阻害濃度は０．０８μ ｇ／ｍｌであった。 この発明の医薬組成物は、ＷＦ００１４４物質またはその医薬として許容される塩を有効成分として、外用、経腸または非経口投与に適した有機または無機の担体または賦形剤と共に含有する医薬製剤の形態、たとえば固体、半固体または液体の形態で用いることができる。 前記有効成分を、たとえば、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射用剤、軟膏、リニメント剤、 点眼剤、ローション剤、ゲル剤、クリームおよび用途に適した他の形態の常用の無毒の医薬として許容される担体と共に調合してもよい。 使用可能な担体としては、水、ブドウ糖、乳糖、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、澱粉のり、三珪酸マグネシウム、タルク、トウモロコシ澱粉、ケラチン、コロイドシリカ、ポテト澱粉、尿素、および製造の際の用途に適した他の担体であって、固体、半固体または液体の形態のものを挙げることができ、さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、溶解補助剤、着色剤および香料を用いてもよい。 ヒトや動物などの糖尿病患者への前記医薬組成物の適用には、静脈内、筋肉内、局所または経口投与によって適用するのが好ましい。 ＷＦ００１４４物質の治療有効用量は、治療を受ける個々の患者の年令および症状により変化し、それらにも依存するが、糖尿病患者を治療するための最適用量は、患者の体重１ｋｇにつきＷＦ００１４４物質の０．０１〜５０ｍｇの範囲の量から選択すればよい。 以下の実施例は、本発明を説明するために示したものである。 実施例１： (1) ＷＦ００１４４物質を生産するためのＰｈｏｍａ ｓｐ． Ｎｏ． ００１４４ の発酵 蔗糖４％、ブドウ糖１％、可溶性澱粉２％、綿実粉３％、大豆粉１．５％、Ｋ Ｈ

₂ ＰＯ

₄ １％およびＣａＣＯ

₃ ０．２％を含む水性種培地（３０ｍｌ）を１００ ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れ、１２１℃で３０分間滅菌した。 Ｐｈｏ ｍａ ｓｐ． Ｎｏ． ００１４４の斜面培養株の一白金耳を種培地フラスコに植菌した。 植菌フラスコを回転振盪器（２２０ｒｐｍ、５．１ｃｍストローク）により２５℃で４日間振盪し、３．２ｍｌの種培養を、５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中の１６０ｍｌの同一滅菌種培地に移した。 フラスコを回転振盪器( ２２０ｒｐｍ、５．１ｃｍストローク)により２５℃で４日間振盪し、４８０ｍ ｌ（３本のフラスコ）の二度目の種培養を、３０リットルのジャーファーメンター中のブドウ糖１％、澱粉酸加水分解産物３％、小麦胚芽１％、ＫＨ

₂ ＰＯ

₄ １％ 、アデカノールＬＧ−１０９（消泡剤、旭電化工業株式会社）０．０５％およびシリコンＫＭ−７０（消泡剤、信越化学工業株式会社）０．０５％を含む２０リットルの滅菌生産用培地に植菌した。 ２０リットル／分の通気下に４００ｒｐｍ で攪拌しながら、発酵を２５℃で７日間実施した。 発酵ブイヨン中のＷＦ００１４４物質の産生を、以下に示すＨＰＬＣ分析によって監視した。 分析条件 カラム：YMC-Pack Pro C18 AS-302（4.6mmφx150mmL，YMC株式会社製） 移動相：0.05%トリフルオロ酢酸を含む50%アセトニトリル水溶液 流量：1ml/min 検出：UV、280nm 保持時間：7.9分(2) ＷＦ００１４４物質の分離 培養ブイヨン（２０Ｌ：１．８ｇのＷＦ００１４４物質を含む）を珪藻土で濾過した。 １時間断続的に混合することにより、濾過した菌糸体を２０Ｌのアセトンで抽出した。 アセトン抽出物を濾過し、２倍容量の脱イオン水で希釈した。 希釈濾液をダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学株式会社）のカラム（２Ｌ）に通した。 カラムを５０％メタノール水溶液で洗浄し、８０％メタノールで溶離した。 溶出液（４Ｌ）を真空濃縮して１リットルとし、３リットルの０．０７％トリフルオロ酢酸水溶液を加え、次に、０．０５％トリフルオロ酢酸を含む２５％アセトニトリル水溶液を充填したＹＭＣ ＧＥＬ ＯＤＳ−ＡＭ １２０−Ｓ−５０(Ｙ ＭＣ株式会社)のカラム（２Ｌ）に通した。 カラムを０．０５％トリフルオロ酢酸を含む３０％アセトニトリルと０．０５％トリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリルで洗浄し、０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルで溶離した。 ＷＦ００１４４物質を含む画分を合わせ、０．０５％トリフルオロ酢酸を含む２５％アセトニトリル水溶液を充填したＹＭＣ ＧＥＬ ＯＤＳ−ＡＭ １２０−Ｓ−５０（ＹＭＣ株式会社）のカラム（１Ｌ）に通した。 カラムを０ ． ０５％トリフルオロ酢酸を含む３０％アセトニトリルおよび０．０５％トリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリルで洗浄し、０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルで溶離した。 ＷＦ００１４４物質を含む画分を合わせ、真空濃縮して残留水を得た。 残留水を等容の酢酸エチルで２回抽出した。 抽出物を真空濃縮して小容量とし、数倍容量のｎ−ヘキサンを加え、真空濃縮して、８１０ｍｇの粗製ＷＦ００１４４物質を粉末として得た。 ６０ｍｇの粗製ＷＦ００１４４粉末をアセトニトリル（０．６ｍｌ）に溶解し、０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水溶液を移動相とし、流量を９．９ｍｌ／ｍｉｎとするＹＭＣパックカラム（ＯＤＳ−ＡＭ ＳＨ− ３４３−５ＡＭ Ｓ−５（２０ｍｍφｘ２５０ｍｍＬ：ＹＭＣ株式会社）を用いる分取ＨＰＬＣに付した。溶離を以下に示すＨＰＬＣ分析によって監視した。精製されたＷＦ００１４４物質に対応する部分を真空濃縮して残留水を得た。この残留物を等容の酢酸エチルで２回抽出し、真空濃縮して小容量とした。濃縮抽出物に数倍容量のｎ−ヘキサンを加え、真空乾燥して、３６ｍｇの精製ＷＦ００１ ４４物質を白色粉末として得た。 分析条件カラム：YMC-Pack Pro C18 AS-302（4.6mmφx150mmL） 移動相：0.05%トリフルオロ酢酸を含む50%アセトニトリル水溶液 流量：1ml/min 検出：UV、280nmにて 保持時間：7.9分

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁷識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ (Ｃ１２Ｐ 1/02 (Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 高瀬 茂弘 茨城県石岡市総社１―12―10 (72)発明者 日野 資弘 茨城県土浦市東崎町13―３―1003