一种灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法 |
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| 申请号 | CN201710580901.6 | 申请日 | 2017-07-17 | 公开(公告)号 | CN107354182A | 公开(公告)日 | 2017-11-17 |
| 申请人 | 湖南农业大学; | 发明人 | 丁文兵; 李叶; 李有志; 刘胜; | ||||
| 摘要 | 一种灰毛豆内生 真菌 发酵 制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷 酮 化合物的方法，是以保藏号为CCTCC NO：M 2017408的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)TPL04作为发酵菌株获得发酵液，将发酵液分离纯化得到化学合成中常用的多用途的不对称合成 手性 助剂(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物。本方法所得目标化合物纯度高、产率可观，并且分离纯化过程简单、所用 试剂 填料经济，为(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮的生产制备开创了新途径，并提供了菌种来源。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法，其特征在于，该方法步骤如下： |
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| 说明书全文 | 一种灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法 技术领域背景技术[0002] 4-苄基-2-噁唑烷酮，根据分子中3位手性碳构型的不同分为：(R)-型、(S)-型两个异构体，其中(S)-4-苄基-2-噁唑烷酮的旋光值为负值，而(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮对应的旋光值为正值。该化合物的两种异构体都是重要的手性辅剂，在不对称合成中有广泛的应用；同时也是重要的医药中间体，可用于合成HIV蛋白酶抑制剂等。如穆博帅等(2017)以(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮为手性助剂，不对称合成制备具有光学活性的2-甲氧基-4-氟苯基-1,5-苯并硫氮杂卓类化合物；Brimble等(1998)以(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮为手性助剂实现环戊二烯的Diels-Alder不对称加成反应。 [0003] 中国专利200510029672.6公开了一种4-取代手性恶唑垸酮类化合物的制备方法，介绍了有关4-苄基-2-噁唑烷酮的化学合成，均是从天然的L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸出发，先还原成氨基醇，再关环合成。在以上合成方法中，所用的还原剂(LiAlH4,NaBH4/I2,NaBH4/H2SO4,LiBH4/Me3SiCl,BH3·Me2S)有一定毒性、强腐蚀性，且具有价格昂贵、步骤复杂或反应时间较长等问题。 [0004] 另外，2014年裴晓丽等从灰毛豆植物叶片中也分离报道了(S)-4-苄基-2-噁唑烷酮，是首次发现该化合物的(S)-构型以植物次生代谢产物形式存在于自然界，但该报道没有涉及(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮。 [0005] 截至目前，通过化学合成或从灰毛豆叶片中分离，是获得4-苄基-2-噁唑烷酮已知的所有途径，而本发明所涉的一种通过对真菌发酵，从发酵产物中制备目标产物(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮的方法，与现有化学合成途径相比具有能耗小、避免使用毒性、腐蚀性试剂等优势，绿色环保；与从植物材料中分离纯化途径相比，其不受植物材料的生长期漫长、材料收集有限性的影响，可大规模室内发酵获取，可控性强等诸多优势。基于此，本发明筛选获得一株产自植物灰毛豆叶片的内生真菌淡紫拟青霉(Purpureocilliumlilacinum)TPL04，通过发酵可制备化合物(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法，该发明为重要手性助剂(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮的制备开创了菌种来源和方法。 发明内容[0006] 本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种操作简便的以灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法。 [0007] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法，该方法步骤如下： [0008] A、以保藏号为CCTCC NO：M 2017408的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)TPL04作为发酵菌株，制备该菌株的发酵液； [0009] B、于该发酵液中加入萃取溶剂，按体积比1:1利用萃取溶剂萃取发酵液3次，合并萃取液，减压浓缩，得浸膏； [0010] C、将浸膏上硅胶柱进行层析，以石油醚和丙酮的混合液作为洗脱剂，按石油醚：丙酮的体积比为9:1、8:2、7:3进行梯度洗脱，收集石油醚：丙酮的体积比为7:3的梯度洗脱下来的流份；将此流份再 上葡聚糖凝胶柱进行层析，以纯甲醇进行洗脱，收集并合并紫外和碘氧化均能显色的组份；将该组分进一步用YMC-ODS C18液相色谱柱进行纯化，即得白色固体状化合物(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮。 [0011] 上述步骤B中的萃取溶剂选用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮或正丁醇。 [0012] 上述提及的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉TPL04(Purpureocillium lilacinum strain)TPL04，已于2017年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2017408。 [0013] 本发明的菌株TPL04在PDA培养基上可生长，27±1℃恒温培养，菌落初为白色，后期变为淡紫色或酒红色，菌丝呈卷毛状，形成毡状的菌落；PDA平板背面通常为米白色，具有明显轮纹。电子显微镜形态特征：分生孢子梗呈指头状；分生孢子单孢串生，呈向两侧张开的链状，或缠绕在一起，呈纺锤形至椭圆形，孢子壁微粗糙至光滑；菌丝有隔且表面粗糙。 [0014] 提取该菌株TPL04的总DNA，以通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，获得的扩增基因序列产物经电泳检测后将目的片段送往生工测序，将所得序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行同源性比对分析，利用MEGA 5软件构建系统发育树，结果显示菌株与Purpureocillium lilacinum strain M3927KC157754.1聚在一枝上，序列相似性为99％，确定该菌株为淡紫拟青霉菌。 [0015] 将斜面保藏的本发明的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌TPL04转接至PDA平板上进行活化，15～30℃培养1～30天，再接种5％～10％至PDB液体培养基中于15～28℃进行摇瓶发酵培养1～30天，过滤，取滤液，即得发酵液，其中，摇瓶转速为100～300r/min。 [0016] 如此，本方法操作简便、条件可控性强、绿色环保；且使用的分离填料硅胶、ODS C-18、葡聚糖凝胶等都可以重复使用，成本低，污染小。本方法为重要手性助剂(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮的制备开创了菌种来源和方法。 具体实施方式[0017] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。 [0018] 实施例1灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌TPL04菌株的制备 [0019] 取湖南农业大学校园内的灰毛豆叶片，用无菌水将灰毛豆叶片冲洗干净进行叶片组织消毒，剪成0.5cm×0.5cm的小块；将叶片小块在超净台内进行表面消毒：体积分数75％的酒精漂洗3‐5min→1g/L升汞漂洗30s‐1min→无菌水冲洗5次；将消毒后的组织材料接种于已倒好的PDA平板培养基上，每皿3～4块，放置于28±1℃避光培养3～7天。待组织材料外沿切口处长出菌丝(菌落)，采用尖端菌丝挑取法，将菌丝转移至纯化PDA培养基平板上，直到获得单一菌株。 [0020] 实施例2从本发明菌株TPL04的发酵液中分离纯化目标产物(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮 [0021] 1.制备 [0022] 将本发明菌株TPL04转接至PDA平板上进行活化，26℃培养6天后接种8％至装有200mLPDB液体培养基的500mL摇瓶中(摇瓶转速为200r/min)，于26℃发酵培养10天，将培养液用四层纱布过滤，取滤液，即得发酵液。将滤液(发酵液)以等体积的乙酸乙酯萃取3遍，浓缩乙酸乙酯萃取液，得浸膏。 [0023] 将浸膏(10g)进行硅胶柱层析分离，用石油醚/丙酮作为洗脱剂，按石油醚：丙酮的体积比为9:1、8:2、7:3的混合液进行梯度洗脱， 收集石油醚：丙酮的体积比为7:3梯度洗脱下来的第14～32流份(每份50ml)合并成一个组份；将此组份上葡聚糖凝胶柱进行层析，以纯甲醇进行洗脱，收集能让紫外和碘氧化均能显色的第27～32流份(每份8ml)，合并成一个组份；将此物质用半制备高效液相色谱仪分离纯化(液相条件：分离柱型号YMC-ODS C18(10×25cm)、洗脱剂50％甲醇-水、流速3ml/min、保留时间11min、检测波长256nm)，得到白色粉末状固体17mg，光学纯度≥99％。 [0024] 2.(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮的结构鉴定 [0025] 上述白色粉末状固体，分子式C10H11NO2，核磁共振数据如下：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ7.30(2H,m),7.22(3H,m),4.36(1H,m),4.10～4.15(2H,m),2.80～2.88(2H,m)；13C 1 NMR(150MHz,CD3OD)δ160.8,136.3,129.0,128.3,126.5,69.3,53.5,40.5；其 HNMR和 13CNMR数据、熔点87～88℃、及旋光值 (c＝0.2,CH3OH)均与标准品(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮((R)-4-Benzyl-2-oxazolidinone，购自SIGMA)数据一致，所以进一步鉴定为(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮，其化学结构如下图所示。 [0026] |
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