抗肿瘤化合物及其医药用途 |
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| 申请号 | CN201410446415.1 | 申请日 | 2014-09-03 | 公开(公告)号 | CN104326937A | 公开(公告)日 | 2015-02-04 |
| 申请人 | 天津市肿瘤研究所; | 发明人 | 张宁; 王银松; 周平; 郭华; 罗艺; 郝希山; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一类如式I所示的化合物，其中，R1选自-H或C1-C6 烃 基，-NH2，-OH，-O(CH2)nCH3(n＝0、1或2)，-N(CH3)2，或-CH2N(CH3)2，R2选自α 氨 基酸或α羟基酸或-OH(R1、R2不同时为-CH3和-OH)，其中X、Y为-H,-CH3,-CH2OH,-CH(OH)CH3,-CH2SH,-CH(CH3)2,-CH2CH(CH3)2,-CH(CH3)CH2CH3，-CH2CH2SCH3，-CH2COOH,-CH2CONH2,-CH2CH2COOH,-CH2CH2CH2CH2NH2,或-CH2CH2CONH2，R3-R5为H或C1-C6烃基。该类化合物毒性极小，能显著抑制 肿瘤 细胞的体外迁移和侵袭，并且较低浓度即具有抑制小鼠体内肿瘤转移的作用，同时还表现出对紫杉醇等细胞毒类抗肿瘤药的显著增敏作用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种式I的化合物： |
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| 说明书全文 | 抗肿瘤化合物及其医药用途技术领域背景技术[0002] 扩散转移是恶性肿瘤的一个重要特征，也是导致恶性肿瘤患者治愈率低、死亡率高的重要原因。近年研究表明肿瘤细胞的转移是由趋化运动介导的。趋化运动是指细胞能够感受外界化学物质的浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向做定向运动。科学家们一直致力于探寻通过阻断肿瘤细胞趋化运动抑制肿瘤转移的方法。 [0003] 目前国际市场上还没有专门用于抑制肿瘤转移的药物，非细胞毒类抗肿瘤药中抑制肿瘤转移亚类仍然是一片空白。我国人口基数大，肿瘤患者众多，自主研发具有独立知识产权的抗肿瘤转移的新型药物具有极其重大的现实意义。 发明内容[0004] 为了解决肿瘤转移的问题，本发明基于(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-乙酸类化合物，合成并筛选出了一类水溶性好、抑制肿瘤转移活性高的新型化合物，并初步验证其被开发成为抑制肿瘤转移新药的可能性。 [0005] 我们课题组研究发现，(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-乙酸类化合物对多种肿瘤细胞的迁移和侵袭具有较强的抑制作用，并且与紫杉醇合用时具有显著增敏作用，是一种良好的候选药物分子。 [0006] 具体的，本发明涉及如下各项： [0007] 1.一种式I的化合物： [0008] [0009] 其中， [0011] R2选自α氨基酸 或α羟基酸 或-OH(R1、R2不同时为-CH3和-OH)，其中X、Y为 -H,-CH3,-CH2OH,-CH(OH)CH3,-CH2SH,-CH(CH3)2,-CH2CH(CH3)2,-CH(CH3)CH2CH3，-CH2CH2SCH3，-CH2COOH,-CH2CONH2,-CH2CH2COOH,-CH2CH2CH2CH2NH2,或-CH2CH2CONH2，R3-R5为H或C1-C6烃基。 [0012] 2.根据1所述的化合物，其中，R1为H或C1-C6烃基，R2为α-氨基酸，R3-R5为H。 [0013] 3.根据2所述的化合物，其中，R2为L-苯丙氨酸，即X为苄基，R1为-CH3，形成(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸。 [0014] 4.1-3任一项所述的化合物的制备方法，包括以2-R5-4-R1-5-R3-6-R4-3-硝基苯甲酸与氨基酸或羟基酸通过酰胺键连接的步骤，其中R1选自由-H或C1-C6烃基，-NH2，-OH，-O(CH2)nCH3(n＝0、1或2)，-N(CH3)2，-CH2N(CH3)2组成的组，R3-R5为H或C1-C6烃基。 [0015] 5.根据4所述的制备方法，其中，R1为-CH3，R3-R5为H，所述氨基酸为L-苯丙氨酸。 [0016] 6.药物组合物，其含有1-3任一项所述的化合物。 [0017] 7.1-3任一项所述的化合物用于制备治疗癌症药物的用途。 [0018] 8.1-3任一项所述的化合物用于制备抑制肿瘤转移药物的用途。 [0021] 本发明的化合物，尤其是(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸溶解性好，抑制肿瘤转移活性强，能有效抑制MDA-MB-231、A549等多种细胞系在体外的迁移、侵袭能力，较低浓度即可显著抑制小鼠黑色素瘤、原位乳癌、肺癌等模型的转移，并且毒性极小，安全性高，还表现出对紫杉醇等细胞毒类抗肿瘤药的显著增敏作用，是一个很好的肿瘤转移抑制剂的候选化合物，有望填充市场上肿瘤转移抑制类药物的空白。 [0022] 发明详述 [0023] 以下对本发明的技术方案做进一步详细阐述。应当指出，本发明的各实施方案可以根据需要以任何方式组合。 [0024] 本发明的一个方面，提供的一类新型抗肿瘤化合物，该化合物具有如下通式： [0025] [0026] 其 中，R1 选 自 由 -H 或 C1-C6 烃 基，-NH2，-OH，-O(CH2)nCH3(n ＝ 0、1 或2)，-N(CH3)2，-CH2N(CH3)2组成的组， [0027] R2选自α氨基酸 或α羟基酸 或-OH(R1、R2不同时为-CH3和-OH)，其中X、Y为 -H,-CH3,-CH2OH,-CHOHCH3,-CH2SH,-CH(CH3)2,-CH2CH(CH3)2,-CH(CH3) CH2CH3，-CH2CH2SCH3，-CH2COOH,-CH2CONH2,-CH2CH2COOH,-CH2CH2CH2CH2NH2, 或 -CH2CH2CONH2，R3-R5为H或C1-C6烃基。 [0029] 在一个更优选的实施方案中，R1为甲基，R2为氨基酸，R3-R5为H，在一个最优选的实施方案中，R2为苯丙氨酸，即X为苄基。此时活性最强，形成化学名称(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸的化合物，分子式为C17H16N2O5，分子量为328.11。 [0030] 本发明的化合物，尤其是(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸溶解性好，能溶于水，水中溶解度(25℃)：212±7mg，极易溶于无水乙醇，甲醇，氯仿，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜等；并能显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭；另外，肿瘤转移抑制活性强，尾静脉给药0.5mg/kg即可显著抑制B16小鼠黑色素瘤细胞在C57BL/6小鼠体内的转移。 [0031] 本发明的另一个方面提供所述化合物的合成方法。在一个实施方案中，所述合成方法包括以2-R5-4-R1-5-R3-6-R4-3-硝基苯甲酸与氨基酸或羟基酸通过酰胺键连接的步骤，其中R1选自由-CH3，-NH2，-OH，-O(CH2)nCH3(n＝0、1或2)，-N(CH3)2，-CH2N(CH3)2组成的组，R3-R5为H或C1-C6烃基。 [0032] 在一个优选的实施方案中，R1优选为-CH3，R3-R5为H，所述氨基酸优选为苯丙氨酸。在该优选的实施方案中，所述合成方法的步骤包括： [0033] 1)取适量L-苯丙氨酸甲酯，加适量四氢呋喃、二氧六环、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、无水乙醇或者甲醇溶解，溶解后加入适量碳酸钠，L-苯丙氨酸甲酯与碳酸钠摩尔比为3:4，加入催化量的二甲氨基吡啶； [0034] 2)取摩尔量0.5～10倍于L-苯丙氨酸甲酯的4-甲基-3-硝基苯甲酸，加入适量二氯亚砜，90℃加热回流1～5h，然后用旋转蒸发仪蒸发干燥，加入少量四氢呋喃、二氧六环、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、无水乙醇或者甲醇溶解产物，用恒压滴液漏斗逐滴滴加到1)所述溶液中。40～100℃加热反应5～48h，最佳反应条件为60℃加热反应16h； [0035] 3)反应结束后，抽滤除去碳酸钠。滤液用旋转蒸发仪浓缩，然后用饱和氢氧化锂溶液水解。加浓盐酸至出现大量黄色沉淀，抽滤弃滤液，沉淀加氯仿溶解，用硅胶层析色谱柱分离出(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸。 [0036] 本发明的另一个实施方案提供所述化合物尤其是(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸的纯化方法，其步骤包括： [0037] 1)将硅胶层析色谱柱分离出的化合物尤其是(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸溶于适量pH＝8～10的碳酸钠超纯水溶液，多次抽滤去除不溶性杂质，滤液滴加盐酸至出现大量沉淀，抽滤，沉淀真空干燥，即为产物。 [0038] 2)第二次滤液加到7～15倍体积的无水乙醇中，抽滤去除沉淀，乙醇相用旋转蒸发仪浓缩，然后滴加到5～10倍体积用盐酸调pH至4～5的水中，抽滤，沉淀真空干燥，即为产物。 [0039] 本发明的另一个方面提供药物组合物，其含有以上提到的化合物。所述药物组合物中可以包含药学可接受的佐剂、赋形剂、崩解剂等。在一个实施方案中，提供(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸用于体内、体外实验的配制方法： [0040] 1)细胞实验母液：精确称量5mg化合物尤其是(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸用1mL二甲基亚砜溶解，然后在搅拌的条件下逐滴滴加至40mL无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，最后用50mL容量瓶定容，药物的终浓度为100μg/mL，二甲基亚砜含量为2.0％； [0041] 2)静脉注射给药剂型母液Ⅰ：准确称取适量化合物尤其是(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸与0.5～10倍质量的普朗尼克F68混合，加入少许无水乙醇溶解，逐滴滴加至无菌水或生理盐水中，滴加100mg/mL碳酸钠溶液至溶液刚好澄清，加水定容，4 [0042] 3)静脉注射给药剂型母液Ⅱ：准确称取适量化合物尤其是(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸与无水碳酸钠按摩尔比1:1～3:1混合，最适比例为1.8:1，加无菌水或生理盐水充分搅拌溶解至澄清，4 [0044] 本发明的另一个方面提供所述化合物及含有所述化合物的药物组合物的制药用途。在一个实施方案中，所述化合物及含有所述化合物的药物组合物用于制备治疗癌症的药物的用途；在一个优选的实施方案中，所述癌症包括肺癌，乳腺癌，黑色素瘤等；在一个更优选的实施方案中，所述化合物及含有所述化合物的药物组合物通过抑制肿瘤细胞迁移治疗癌症。 [0045] 在一个具体的实施方案中，所述化合物尤其是(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸抑制肿瘤转移作用的研究方法包括如下步骤： [0046] 1)通过细胞划痕实验验证(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸抑制肿瘤细胞迁移能力的药效学活性； [0047] 2)通过Transwell侵袭实验验证(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸抑制肿瘤细胞侵袭能力的药效学活性； [0048] 3)采用C57BL/6小鼠通过尾静脉直接注射B16细胞的方法构建B16小鼠黑色素瘤人工转移模型，通过计数肺上转移瘤的数目判断药物抑制肿瘤转移能力的强弱。该模型模拟的是癌细胞从循环系统向靶器官转移的过程，与晚期癌症病人体内肿瘤细胞的转移方式更为接近。 [0049] 4)采用裸鼠原位接种稳转Luciferase的4T1细胞的方法构建原位乳癌模型，通过活体成像仪检测肺上转移肿瘤的多少。该模型模拟的是乳癌的发生和转移过程。 [0050] 5)采用C57BL/6小鼠通过皮下接种Lewis肺癌细胞建立小鼠肺癌模型，由于Lewis肺癌细胞特异性向肺转移的特性，可通过计数肺上肿瘤转移数判断药物抑制该肿瘤细胞转移能力的强弱。 [0051] 本发明的另一个方面提供所述化合物尤其是(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸和其它抗肿瘤药物在制备用于治疗癌症的药物或试剂盒中的用途。 [0052] 在一个实施方案中，所述其它抗肿瘤药物为细胞毒类抗肿瘤药物。 [0053] 在一个具体的实施例中，本发明提供所述化合物尤其是(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸和紫杉醇在制备用于治疗癌症的药物或试剂盒中的用途。在一个具体的实施方案中，通过MTT实验检测该化合物对紫杉醇抑制MDA-MB-231细胞增殖的增敏作用。附图说明 [0054] 图1、实施例1中产物(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸的核磁图谱。 [0055] 图2、实施例1中产物(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸的质谱图谱。 [0056] 图3、实施例2中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸的纯度检测。 [0057] 图4、实施例3中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对MDA-MB-231细胞迁移能力的抑制图。 [0058] 图5、实施例3中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对MDA-MB-231细胞迁移能力的抑制统计图。 [0059] 图6、实施例4中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对A549细胞迁移能力的抑制图。 [0060] 图7、实施例4中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对A549细胞迁移能力的抑制统计图。 [0061] 图8、实施例5中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对MDA-MB-231细胞侵袭能力的抑制图。 [0062] 图9、实施例5中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对MDA-MB-231细胞侵袭能力的抑制统计图。 [0063] 图10、实施例6中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对B16黑色素瘤细胞在C57BL/6小鼠体内转移的抑制图。 [0064] 图11、实施例6中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对B16黑色素瘤细胞在C57BL/6小鼠体内转移的抑制统计图。 [0065] 图12、实施例7中小鼠肿瘤整体转移图。 [0066] 图13、实施例7中小鼠肿瘤肺转移图。 [0067] 图14、实施例7中小鼠肿瘤肺转移统计图。 [0069] 图16、实施例8中小鼠肺转移瘤统计图。 [0070] 图17、实施例11中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对MDA-MB-231细胞增殖能力抑制图。 [0071] 图18、实施例12中(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对紫杉醇增敏图。 [0072] 图19、实施例14中TCI05、TCI06、TCI07、TCI08对MDA-MB-231细胞迁移能力的抑制图。 [0073] 图20、实施例14中TCI05、TCI06、TCI07、TCI08对MDA-MB-231细胞迁移能力的抑制统计图。 [0074] 图21、实施例15中4-羟基-3-硝基苯甲酸的红外图谱。 [0075] 图22、实施例15中4-羟基-3-硝基苯甲酸的核磁图谱。 [0076] 图23、实施例15中4-羟基-3-硝基苯甲酸的质谱图谱。 [0077] 图24、实施例15中4-氨基-3-硝基苯甲酸的红外图谱。 [0078] 图25、实施例15中4-氨基-3-硝基苯甲酸的核磁图谱。 [0079] 图26、实施例15中4-氨基-3-硝基苯甲酸的质谱图谱。 [0080] 图27、实施例16中4-羟基-3-硝基苯甲酸与4-氨基-3硝基苯甲酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的抑制图。 具体实施方式[0081] 主要试剂及材料来源： [0082] MDA-MB-231、A549 细 胞 系 购 自 American Type CultureCollection(Manassas,VA,USA)；B16细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；LLC细胞系购自中国典型培养物保藏中心细胞库；DMEM/HIGH GLUCOSE(1X)培养基、胎牛血清购自Thermo Scientific(货号分别为SH30022.01B和SV30087.02)； Transwell小室购自MILLIPORE(货号：PIEP12R48)，Matrigel基质胶购自美国BD公司； 24孔板、60mm培养皿均购自Corning；紫杉醇购自大连美仑生物技术有限公司；MTT购自SIGMA；色谱试剂及色谱柱购自DIKMA；泊洛沙姆188、聚氧乙烯35蓖麻油购自德国BASF SE；羧甲基纤维素钠购自天津市科密欧化学试剂公司；合成相关试剂购自北京百灵威科技有限公司；C57BL/6小鼠、裸鼠、昆明鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2012-0001)；小鼠活体成像系统，IVIS Spectrum FMT1000，PerkinElmer。 [0083] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只用于对本发明进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。 [0084] 实施例1：(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸的合成及结构表征。 [0085] 1)称取64g L-苯丙氨酸甲酯，加400mL四氢呋喃50℃加热溶解，溶解后加入42g碳酸钠，搅拌15min，然后加入2g二甲氨基吡啶； [0086] 2)称取163g4-甲基-3-硝基苯甲酸，加入450mL二氯亚砜，90℃加热回流3h。然后用旋转蒸发仪蒸发干燥，加入200mL四氢呋喃溶解产物，用恒压滴液漏斗逐滴滴加到1)所述溶液中。60℃加热反应16h； [0087] 3)反应结束后，抽滤除去沉淀。滤液用旋转蒸发仪浓缩至300mL左右，然后加到2.4L饱和氢氧化锂溶液中，室温搅拌3h。滴加浓盐酸至出现大量黄色沉淀，抽滤弃滤液。沉淀加1L氯仿溶解，用旋转蒸发仪浓缩，静置析出沉淀，抽滤弃去沉淀； [0088] 4)浓缩液用硅胶层析色谱柱分离。先用乙酸乙酯:石油醚＝1:2，加1.4％冰乙酸，过柱洗脱4-甲基-3-硝基苯甲酸，然后用甲醇:二氯甲烷＝1:1，加1.4％冰乙酸，过柱洗脱(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸； [0089] 5)含有(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸的流动相合并，用旋转蒸发仪旋至基本干燥，然后放入真空干燥箱于45℃干燥72h； [0090] 6)产物结构通过1H-NMR和质谱确证，产率为75.83％。核磁图见图1，质谱图见图2。 [0091] 实施例2：(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸的纯化及纯度检测。 [0092] 1)将硅胶层析色谱柱分离出的(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸溶于适量pH＝8～10的碳酸钠超纯水溶液，多次抽滤去除不溶性杂质，滤液滴加盐酸至出现大量沉淀，抽滤，沉淀真空干燥，即为产物。第二次滤液加到7～15倍体积的无水乙醇中，抽滤去除沉淀，乙醇相用旋转蒸发仪浓缩，然后滴加到5～10倍体积用盐酸调pH至4～5的水中，抽滤，沉淀真空干燥，即为残留在水相中的产物。 [0093] 2)精确称取纯化后的(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸用流动相配制成1mg/mL的标准液，按以下色谱条件进行分析：色谱柱：Vercopak C18(403091)，4.6mm×250mm，粒径5μm，ODS-2；柱温：30℃；流动相：乙腈:pH2.5磷酸缓冲液(含0.2％三乙胺，10mmol磷酸二氢钠)＝45:55(v/v)；流速：1mL/min；检测波长：λ＝230nm。检测结果：(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸保留时间为5.404min；通过仪器自带软件积分分析，纯度为99.91％。实验结果见图3。 [0094] 实施例3：通过划痕实验检测(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的抑制能力。 [0095] 取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以1×106个/3mL铺于6孔板中，12h后加药，每孔100μL。(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸(TCI04)终浓度分别为0.5，1，2，4μmol/L，阴性对照组为100μL含2％DMSO的无菌水，阳性对照组为1μmol/L的4-甲基-3-硝基苯甲酸(TCI01)。12h后吸去培养基，用PBS清洗3次，每孔加入3mL不含胎牛血清的培养基，100μL药液(浓度同上)。12h后，用10μL枪头做划痕，PBS清洗4次，每孔加入3mL不含胎牛血清的培养基。在倒置显微镜下每3h记录一次细胞移动距离，并拍摄0h及24h的照片。实验结果，实验组细胞愈合划痕的速率明显慢于阴性对照组，说明(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸明显抑制了MDA-MB-231细胞的迁移能力。实验结果见图4、图5。 [0096] 实施例4：通过划痕实验检测(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对人肺腺癌细胞A549迁移的抑制能力。 [0097] 取对数生长期的A549细胞，以5×105个/3mL铺于6孔板中，12h后加药，每孔100μL。(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸终浓度(TCI04)分别为4， 100μmol/L，阴性对照组为100μL含2％DMSO的无菌水，阳性对照组为4，100μmol/L的 4-甲基-3-硝基苯甲酸(TCI01)。36h后吸去培养基，用PBS清洗3次，每孔加入3mL不含胎牛血清的培养基，100μL药液(浓度同上)。6h后，用200μL枪头做划痕，PBS清洗4次，每孔加入3mL不含胎牛血清的培养基。在倒置显微镜下每3h记录一次细胞移动距离，并拍摄0h及36h的照片。实验结果，实验组细胞愈合划痕的速率明显慢于阴性对照组，说明(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸明显抑制了A549细胞的迁移能力。 实验结果见图6、图7。 [0098] 实施例5：通过Transwell侵袭实验检测(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭的抑制能力。 [0099] 1)Transwell小室铺胶：Matrigel 4℃冰浴过夜融化，用预冷的无血清DMEM培养基按1:3稀释。Transwell小室放于24孔板中，每个小室加50μL胶液，37℃放置1h，然后加200μL无血清的DMEM培养基静置15min使胶重构，最后吸去培养液待用； [0100] 2)取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以1×106个/3mL种植于6孔板中，12h后加药，每孔100μL。(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸终浓度分别为1，2，4μmol/L，阴性对照组为100μl含2％DMSO的无菌水，阳性对照组为1μmol/L的4-甲基-3-硝基苯甲酸。12h后吸去培养基，用PBS清洗3次，每孔加入3mL空培养基，100μL药液(浓度同上)。12h后，每组细胞用0.05％胰酶消化，不加胎牛血清的DMEM培养基重 5 悬，计数，以2×10 个/200μL种于已铺好Matrigel胶的Transwell小室中，小室下方加 600μL含有20％胎牛血清的DMEM培养基； [0101] 3)24h后，取出小室，用三步染色法对细胞染色，倒置显微镜下观察拍照，在400×下，每个小室选取5个细胞均匀的视野计数； [0102] 4)实验结果见图8、图9，实验组细胞数明显少于阴性对照组。据统计学分析，较阴性对照组，实验组3个浓度组均为P<0.01，具有非常显著性差异；较阳性对照组，实验组1μmol/L有显著性差异(P<0.05)，实验组2、4μmol/L无显著性差异(P>0.05)。结果表明(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸显著抑制了MDA-MB-231细胞侵袭穿过Matrigel胶的能力。 [0103] 实施例6：通过B16小鼠黑色素瘤人工转移模型检测(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸在体内抑制肿瘤转移的能力。 [0104] 1)小鼠分组：SPF级C57BL/6，5周龄，18～22g，每组8只，雌雄各半； [0105] 2)取(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸静脉注射给药剂型母液加无菌水稀释至0.8mg/mL，0.2mg/mL，0.05mg/mL。小鼠给药剂量为：高剂量组，8mg/kg；中剂量组，2mg/kg；低剂量组，0.5mg/kg。阴性对照组为0.8mg/mL的普朗尼克F68水溶液，含 0.25％乙醇；阳性对照组为3.2mg/mL的4-甲基-3-硝基苯甲酸水溶液，给药剂量为32mg/kg； [0106] 3)取对数生长期的B16细胞，用0.05％的胰酶消化1min，1000rpm离心5min，去上5 清，重悬计数，用生理盐水洗涤3次，并用生理盐水重悬调整浓度至2.5×10 个/mL。每只小鼠尾静脉注射0.2mL细胞悬液； [0107] 4)注射细胞悬液后立刻开始给药，给药方式尾静脉注射，每天两次，连续给药21天； [0108] 5)实验结束后，小鼠处死取肺脏，统计肺上黑色素瘤的个数，尺寸，并称量肺的重量； [0109] 6)实验结果见图10、图11，阴性对照组大部分老鼠整肺转移坏死，肺的形态失常；实验组肺上肿瘤少，体积小，肺的形态基本保持正常。对肺上肿瘤数、肺重进行统计学分析，实验组较阴性对照组，3个浓度组均有具有非常显著性差异(P<0.01)；实验组较阳性对照组，3个浓度组均有显著性差异(P<0.05)(整肺转移坏死的个体由于肿瘤数量太大无法统计，且数量远大于150，因此在做统计学分析时按最小值150计算)。说明(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸有效地抑制了B16细胞在小鼠体内的转移。 [0110] 实施例7：通过裸鼠原位乳癌模型检测(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸在体内抑制肿瘤转移的能力。 [0111] 1)小鼠分组：SPF级Nude雌鼠，5周龄，18-22g，每组8只； [0112] 2)取(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸(TCI04)静脉注射给药剂型母液加无菌水稀释至2mg/mL，0.1mg/mL。小鼠给药剂量为：高剂量组，20mg/kg；低剂量组，1mg/kg。阴性对照组为2mg/ml的普朗尼克F68水溶液，含0.25％乙醇；阳性对照组为5mg/mL的4-甲基-3-硝基苯甲酸(TCI01)水溶液，给药剂量为50mg/kg； [0113] 3)取对数生长期的4T1-luciferase细胞，用0.05％的胰酶消化1min，1000rpm离6 心5min，去上清，重悬计数，用生理盐水洗涤3次，并用生理盐水重悬调整浓度至5×10 个/mL。于每只小鼠右侧第二对乳房接种0.1mL细胞悬液； [0114] 4)接种一周后开始给药，给药方式尾静脉注射，每天两次，连续给药21天； [0115] 5)给药结束后，小鼠用活体成像仪检测整体肿瘤转移情况，然后迅速将小鼠处死，取肺单独用活体成像仪检测光强以判断肺上肿瘤转移数目。 [0116] 6)实验结果见图12、图13、图14，实验组及TCI01组整肺肺光强明显弱于阴性对照组，统计结果显示具有非常显著性差异(P<0.01)；实验组低剂量组较TCI01组，也具有显著性差异(P<0.05)。说明(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸有效地抑制了4T1细胞在小鼠体内的转移。 [0117] 实施例8：通过小鼠Lewis肺癌转移模型检测(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸在体内抑制肿瘤转移的能力。 [0118] 1)小鼠分组：SPF级C57BL/6，5周龄，18～22g，每组8只，雌雄各半； [0119] 2)取(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸经口给药剂型母液用1.5％的CMC-Na溶液稀释至5mg/mL，2.5mg/mL，0.5mg/mL。小鼠给药剂量为：高剂量组，50mg/kg；中剂量组，25mg/kg；低剂量组，5mg/kg。阴性对照组为1.5％的CMC-Na溶液；阳性对照组为10mg/mL的4-甲基-3-硝基苯甲酸口服给药剂型，给药剂量为100mg/kg； [0120] 3)取8～14天的Lewis肺癌荷瘤小鼠，在无菌条件下小心剥下肿瘤，剔去外层脂肪组织，剪成小块，加适量生理盐水，置于玻璃匀浆器内匀浆，用孔径40μМ的细胞筛过6 滤，计数，加生理盐水调整浓度至5×10 个/mL。于每只小鼠右侧腋下接种0.2mL细胞悬液。 [0121] 4)接种细胞悬液后一周开始给药，给药方式灌胃，每天两次，每次0.2mL，连续给药21天； [0122] 5)实验结束后，小鼠处死取肺脏做石蜡组织切片，HE染色，显微镜下计数肿瘤数； [0123] 6)实验结果见图15、图16，阴性对照组大部分老鼠肉眼可见肺表面有诸多凸起，肺的形态失常；实验组肺上肿瘤少，体积小，肺的形态基本保持正常。对肺上肿瘤数进行统计学分析，实验组较阴性对照组，3个浓度组均有具有非常显著性差异(P<0.01)；实验组较阳性对照组，3个浓度组均有显著性差异(P<0.05)。说明(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸有效地抑制了Lewis肺癌细胞在小鼠体内的转移。 [0124] 实施例9：通过小鼠急性毒性试验检测(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸静脉给药的半数致死剂量。 [0125] 1)小鼠分组：清洁级昆明鼠，10周龄，体重30～40g，每组10只，雌雄各半。 [0126] 2)共10组，组间距0.88，取静脉注射给药剂型母液Ⅱ加无菌水配制成所需浓度，每只小鼠静脉注射0.2mL，观察14天。每组给药剂量及死亡数记录如下： [0127] [0128] 根据Bliss法计算，LD50＝269.22mg/kg，95％的可信限＝249.2～290.78mg/kg。 [0129] 实施例10：通过小鼠急性毒性试验检测(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸经口给药的半数致死剂量。 [0130] 1)小鼠分组：清洁级昆明鼠，10周龄，体重30-40g，每组5只，全为雄鼠或雌鼠。 [0131] 2)取3.2g(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸于8mL3％羧甲基纤维素钠溶液中，用乳匀机30000rpm匀浆5min。每只小鼠灌胃给药0.5mL，给药剂量为5000mg/kg。观察记录14天，若死亡数小于等于2只，则认为LD50大于5000mg/kg，若死亡数大于等于3只，则进行主实验。该实验重复3次，记录结果如下： [0132]死亡数(只)第1次试验 第2次试验 第3次试验 雄鼠 2 1 1 雌鼠 2 2 1 [0133] 由于三次实验结果，雄鼠、雌鼠死亡数均不超过2只，因此认为(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸经口给药的LD50大于5000mg/kg。 [0134] 实施例11：通过MTT实验检测(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸对MDA-MB-231细胞的半数抑制浓度。3 [0135] 1)取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以4×10/0.2ml种于96孔板中，培养12h后每孔加药20ul，药物终浓度为0、50、100、200、400、600、800、1000、1200、1300、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000μM，继续培养48h。 [0136] 2)用无菌PBS配制5mg/mL的MTT溶液，用0.22μM膜过滤，然后用培养基稀释至1mg/mL。弃去96孔板中的培养基，加入100μL1mg/mL的MTT工作液，继续培养5h。 [0137] 3)弃去MTT工作液，每孔加入150μL DMSO(注意避光)，置于水平摇床170rpm震荡10min，然后用酶标仪检测波长490nm处的吸光度。 [0138] 4)不同浓度的(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸处理后MDA-MB-231细胞的增值率见图17。经计算，IC50＝2449.07μM。 [0139] 实施例12：通过MTT实验检测(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸与紫杉醇的协同作用。3 [0140] 1)取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以4×10 个/0.2mL种于96孔板中，培养12h后每孔加紫杉醇溶液10μL，紫杉醇终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10、50、100、200μM，每组半数孔加10μL(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸的PBS溶液，终浓度为20μM。继续培养24h或48h。 [0141] 2)用无菌PBS配制5mg/mL的MTT溶液，用0.22μM膜过滤，然后用培养基稀释至1mg/ml。弃去96孔板中的培养基，加入100μL1mg/mL的MTT工作液，继续培养5h。 [0142] 3)弃去MTT工作液，每孔加入150μL DMSO(注意避光)，置于水平摇床170rpm震荡10min，然后用酶标仪检测波长490nm处的吸光度。 [0143] 4)如图18，加入20μM(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸后显著增强了紫杉醇对癌细胞的杀伤作用，经计算，24h的IC50由3.972μM减小为0.395μM，48h的IC50由0.512μM减小为0.046μM，联合用药后的IC50约为原药IC50的十分之一。实验说明(S)2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-苯基丙酸与紫杉醇的具有较强的协同作用。 [0144] 实施例13：2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-吲哚基丙酸(TCI05)、2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-(4-羟基-苯基)丙酸(TCI06)、2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酯基)-3-苯基丙酸(TCI07)、2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酯基)-3-吲哚基丙酸(TCI08)的合成。 [0145] 1)称取0.01mol色氨酸、酪氨酸、2-羟基-3-苯基丙酸、2-羟基-3-吲哚基丙酸，加10mL四氢呋喃50℃加热溶解，溶解后加入0.05mol碳酸钠，搅拌15min，然后加入催化量二甲氨基吡啶； [0146] 2)称取0.03mol4-甲基-3-硝基苯甲酸，加入90mL二氯亚砜，90℃加热回流3h。然后用旋转蒸发仪蒸发干燥，加入2mL四氢呋喃溶解产物，用恒压滴液漏斗逐滴滴加到1)所述溶液中。60℃加热反应20h； [0147] 3)反应结束后，抽滤除去沉淀。滤液用旋转蒸发仪旋干，沉淀加100mL氯仿溶解，用旋转蒸发仪浓缩。 [0148] 4)浓缩液用硅胶层析色谱柱分离。先用乙酸乙酯:石油醚＝1:2(1.4％冰乙酸)，洗脱4-甲基-3-硝基苯甲酸，然后用甲醇:二氯甲烷＝1:1，加1.4％冰乙酸，洗脱目标产物； [0149] 5)含有目标产物的流动相合并，用旋转蒸发仪旋至基本干燥，然后放入真空干燥箱于45℃干燥72h； [0150] 6)产率为70-80％。 [0151] 实施例14：通过划痕实验检测2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-吲哚基丙酸(TCI05)、2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酰氨基)-3-(4-羟基-苯基)丙酸(TCI06)、2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酯基)-3-苯基丙酸(TCI07)、2-(4’-甲基-3’-硝基苯甲酯基)-3-吲哚基丙酸(TCI08)对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的抑制能力。 [0152] 取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以1×106个/3mL铺于6孔板中，12h后加药TCI05、TCI06、TCI07、TCI08(配制方法同TCI04)，每孔150μL，终浓度20μmol/L，阴性对照组为150μL含2％DMSO的无菌水。48h后，用200μL枪头做划痕，PBS清洗4次，每孔加入3mL不含胎牛血清的培养基。在倒置显微镜下每3h记录一次细胞移动距离，并拍摄0h及24h的照片。实验结果，实验组细胞愈合划痕的速率明显慢于阴性对照组，说明TCI05、TCI06、TCI07、TCI08明显抑制了MDA-MB-231细胞的迁移能力。实验结果见图19、图20。 [0153] 实施例15：4-羟基-3-硝基苯甲酸与4-氨基-3硝基苯甲酸的波谱学表征[0154] 4-羟基-3-硝基苯甲酸和4-氨基-3硝基苯甲酸购买自北京百灵威科技有限公司，分别通过红外、核磁、质谱对其结构进行确定(参见图21-26)。 [0155] 实施例16：通过划痕实验检测4-羟基-3-硝基苯甲酸与4-氨基-3硝基苯甲酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的抑制能力 [0156] 在六孔板底面用记号笔画三条线，取对数生长期的MDA-MB-231乳腺癌细胞，用0.7mL0.08％胰酶消化1min，用完全培养基终止消化，以1000r/min的转速离心3min、弃去上清，加入3mL完全培养基轻轻吹打使成单个细胞悬液，将此细胞悬液进行细胞计数， 5 调整细胞浓度，以5×10 个/孔的细胞密度铺六孔板，并分别加入6组含药的完全培养基(DMEM+10％FBS+1％双抗+药)于孵箱中培养12h至细胞贴壁。细胞贴壁后移除培养基，用 20μL枪头垂直板底的三条横线划痕得到6个计数距离，划完用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗三遍，再分别加入6组含药的空培养基(DMEM+药)，分别于0h、3h、6h、9h、12h和24h在倒置显微镜下观察并记录划痕宽度，每孔记录6个距离。其中，0h和24h时用倒置显微镜拍照记录。 [0157] 实验结果参见下表和图27，实验组细胞愈合划痕的速率明显慢于阴性对照组，说明4-羟基-3-硝基苯甲酸与4-氨基-3硝基苯甲酸明显抑制了MDA-MB-231细胞的迁移能力。 [0158] |
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