인테그린 길항물질과 20 번 위치에서 공액된 7-티-부톡시이미노메틸캄토테신{7-T-BUTOXYIMINOMETHYLCAMPTOTHECIN CONJUGATED IN POSITION 20 WITH INTEGRIN ANTAGONISTS}
본 발명은 RGD 서열을 함유하는 사이클로펩티드 및 캄토테신의 유도체로 이루어진, 세포독성 활성을 갖는 화합물, 그의 제조 방법, 약제로서 그의 용도 및 상기를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 개시된 화합물들은 마이크로몰 농도에서 인테그린 α v ß 3 및 α v ß 5 에 대한 높은 친화성과 인간 세포 주에 대한 선택적인 세포독성 활성을 모두 갖는다.
화학요법적 항암제는 가장 제한적인 치료 창을 갖는 약물이다. 실제로, 상기 약제의 세포독성 활성은 비 선택적이므로, 상기 약제는 상기와 접촉하게 되는 신체의 모든 세포들을 무차별 손상시킬 수 있다. 현재 세포독성제를 선택적으로 종양 세포를 향하게 하여, 상기 작용제가 주위의 건강한 조직 세포를 손상시키지 않거나 또는 상기 손상을 적어도 가능한 많이 제한하면서 그의 활성을 발휘하게 하는 것에 관한 문제가 존재한다. 문헌에는, 사이클로펜타펩티드 c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)로서 간주되는 기준 화합물인 선택적인 사이클로펩티드의 사용에 의해(JACS 1997, 119, 1328-35; 국제 특허 출원 WO 97/06791), 또는 단클론 항체의 사용에 의해(Cell, 1994, 79, 1157-64) 상기 인테그린 α v ß 3 및 α v ß 5 을 차단하는 것은 혈관형성의 차단 및 종양 성장의 감소를 도출함이 보고되어 있다. 또한, 전이 억제 효과가 또한 관찰되었다(J. Clin. Invest., 1995, 96, 1815). 브룩스 등(Brooks et al., Science 1994, 264, 569-71)은 종양 혈관계의 내피 세포 및 종양 세포 자체가 정상 조직의 침묵 세포에 비해 인테그린 α v ß 3 을 우선적으로 발현함을 보고하였다. 임상 개발이 진행된 단계의 상기 화합물들 중에 c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-MeVal) 또는 EMD 12197 또는 실렌지티드를 들 수 있다. 루오슬라티(Ruoslati)와 공동 연구자들은 종양 내피세포와 결합하는 RGD 동족체가 일단 세포독성제인 독소루비신과 공액 결합하면 독소루비신 단독보다 더 효율적이고 덜 독성인 화합물을 형성함을 보였다(Current Opinion in Oncology, 1998, 10, 560-5). 상기 저자들은 또한 어떠한 합리적인 의심의 여지도 없이, 상기 결합이 유리 펩티드 자체에 의해 길항되는 한 상기 효과가 RGD에의 공액에 기인할 수 있음을 입증하였다(Arap, Pasqualini and Ruoslati, Science, 1998, 279, 377-380). 나중에, 상기 동일 저자들은 세포자멸 전구 펩티드 서열을 RGD 동족체에 화학적으로 결합시키는 다른 실험들을 수행하였으며, 이는 상기 신규의 화합물들이 혈관형성 내피 세포에 대해 선택적으로 독성이고 마우스에서 항암 활성을 가 짐을 입증한다(Rouslati, Nature Medicine, 1999, 5, 1032-8). 마커스(Marcus) 등은 국제 특허 출원 WO 01/17563에서, 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 이격자에 의해 인테그린 α v ß 3 및 α v ß 5 의 비-펩티드 억제제 길항물질에 공액된 세포독성제, 예를 들어 캄토테신의 특이적인 항암 활성을 개시한다. 문헌[Aoki et al., Cancer Gene Therapy, 2001, 8, 783-787]에는 RGD 서열에 공액된 히스티딜화된 올리고리신의 특이적인 항암 활성이 개시되어 있으며, 이는 마우스에서 종양에 대한 귀소 효과를 나타낸다. 인테그린에 의해 매개된 세포 표면에서의 결합의 개념은 유전자 운반에 대해 제안되었다(Hart, et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 12468-12474). 7-3급-부톡시이미노메틸캄토테신(또는 CPT184 또는 ST 1481 또는 Gimatecan)은 경구 활성인 캄토테신의 유도체이며 유럽 특허 EP 1 044 977에 개시되어 있다. 본 발명에 이르러, 추정 상 적합한 이격자에 의해, RGD 서열을 함유하는 사이클로펩티드 유도체에 20 번 위치에서 공액된 7-t-부톡시이미노메틸캄토테신이 종양 치료용 약제의 제조에 유리하게 사용될 수 있는 높은 선택성 항암 활성이 부여된 화합물들을 생성시킴을 발견하였다. 본 발명에 따른 화합물은 그의 종양 세포에 대한 선택적인 세포독성 활성 덕분에 부작용이 더 적고 덜 심한 약제를 제공한다.
본 발명의 목적은 RGD 서열을 함유하는 사이클로펩티드 유도체에 공액된 7-t-부톡시이미노메틸캄토테신의 유도체이다. 생성된 분자는 변경되지 않은, 원래의 캄토테신의 세포독성 성질과 비 공액 사이클로펩티드에 대해 관찰되는 친화성에 필적할만한 친화성을 갖는 인테그린 결합 성질을 모두 갖는다. 이러한 조합의 결과는 α v ß 3 및 α v ß 5 유형의 인테그린을 가장 많이 발현하는 세포에서 세포독성제의 농축(귀소)을 촉진시키는 것이다. 상기 세포독성제는 효소작용 또는 가수분해 작용을 통해 공액되고/되거나 유리 형태로 그의 세포 내 활성을 발휘한다. 따라서 본 발명의 주목적은 하기 화학식 I의 화합물, 그의 N 1 -옥사이드, 라세미 혼합물, 단일 에난티오머, 단일 다이아스테레오아이소머, E 및 Z 형, 이들의 혼합물, 약학적으로 허용 가능한 염이다:
상기 식에서, R 1 은 UXY 그룹이고, 여기에서: U는 존재하지 않거나 또는 하기의 그룹들 -COCHR 10 NH- 및 CON[(CH 2 ) n2 NHR 7 ]-CH 2 - 중 하나이고, 이때 R 10 은 H이거나, 또는 C 6 -C 14 아릴로 임의로 치환된 선형 또는 분지된 C 1 -C 4 알킬 및 아미노-알킬 C 1 -C 4 로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; R 7 은 H 또는 선형 또는 분지된 C 1 -C 4 알킬이고; n 2 는 2 내지 6의 정수이고; X는 존재하지 않거나 또는 H이거나 또는 하기 -COCHR 3 NH-, -COCHR 6 (CH 2 ) n3 R 4 -, -R 4 -CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n4 OCH 2 R 4 -, -R 4 (Q)R 4 -, -R 5 [Arg-NH(CH 2 ) n5 CO] n6 R 5 -, -R 5 -[N-구아니디노프로필-Gly] n6 R 5 - 중에서 선택된 그룹이고, 이때 n 3 은 0 내지 5의 정수이고, n 4 는 0 내지 50의 정수이고, n 5 는 2 내지 6의 정수이고, n 6 은 2 내지 7의 정수이고; R 3 은 H, 또는 -COOH, -CONH 2 , -NH 2 또는 -OH에 의해 임의로 치환된 선형 또는 분지된 C 1 -C 4 알킬이고; R 4 는 -NH-, -CO-, -CONH-, -NHCO-로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; R 5 는 존재하지 않거나 그룹 -R 4 (Q)R 4 -이고; R 6 은 H 또는 NH 2 이고; Q는 선형 또는 분지된 C 1 -C 6 알킬렌; 선형 또는 분지된 C 3 -C 10 사이클로알킬렌; 선형 또는 분지된 C 2 -C 6 알케닐렌; 선형 또는 분지된 C 3 -C 10 사이클로-알케닐렌; C 6 -C 14 아릴렌; 아릴렌 (C 6 -C 14 )-알킬렌; (C 1 -C 6 ), 알킬렌 (C 1 -C 6 )-아릴렌 (C 6 -C 14 ); O, N, S로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 방향족 또는 비-방향족 헤테로사이클릴 (C 3 -C 14 )로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; Y는 존재하지 않거나 또는 H이거나, 또는 하기 그룹 c(Arg-Gly-Asp-AA 1 -AA 2 )이고, 여기에서: c는 사이클릭을 의미하고; AA 1 는 (D)-Phe, (D)-Trp, (D)-Tyr, (D)-2-나프틸Ala, (D)-4-터부틸-Phe, (D)-4,4'-바이페닐-Ala, (D)-4-CF 3 -Phe, (D)-4-아세틸아미노-Phe로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; AA 2 는 NW-CH[(CH 2 ) n7 -CO]-CO, NW-CH[(CH 2 ) n7 -NH]-CO, NW-[4-(CH 2 ) n7 -CO]-Phe, NW-[4-(CH 2 ) n7 -NH]-Phe, [NW]-Gly, NW-Val로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 이때 W는 H, 선형 또는 분지된 C 1 -C 6 알킬, -(CH 2 ) n7 -COOH(이때 n 7 은 0 내지 5의 정수이다), 4-카복시벤질, 4-아미노메틸벤질로 이루어진 그룹 중에서 선택되나; 단 X 및 Y가 모두 존재하지 않을 수는 없다. 본 발명은 국소이성화효소 I 억제제로서 유용한 약제의 유효 성분으로서 상기 언급한 화학식 I 화합물의 용도를 포함한다. 국소이성화효소 I 억제로부터 유도되는 치료 적응증들 중에 기생충 또는 바이러스 감염을 들 수 있다. 화학식 I의 화합물은 그의 특정한 약물학적 특성을 제공하였지만, 종양 및 그의 전이형의 치료를 위한 약제의 제조에도 또한 유용하다. 본 발명은 또한 유효 성분으로서 화학식 I의 화합물을 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 비히클 및/또는 부형제와의 혼합물로 함유하는 약학 조성물을 포함 한다. 본 발명에 따른 화합물은 20 번 위치에서 작용화된 7-t-부톡시이미노메틸캄토테신과 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 함유하는 사이클로펩티드와의 축합의 결과이다. 이러한 구조적 조합은 α v ß 3 및 α v ß 5 유형의 인테그린을 가장 많이 발현하는 세포에서 세포독성제의 농축을 촉진시키는 이점을 갖는다. 상기 세포독성제는 효소작용 또는 가수분해 작용을 통해 공액되고/되거나 유리 형태로 그의 활성을 발휘한다. 다양한 작용기 및 잔기의 정의뿐만 아니라 상기 언급한 화학식 I에서 나타낸 약학적으로 허용 가능한 염의 정의는 임의의 전문적인 화학자들에게는 상식이며 특별한 정의가 필요하지 않다. 그러나, 상기와 같은 그룹에 대해서 기술 및 특허 문헌, 예를 들어 국제 특허 출원 WO 00/53607, WO 03/101995 및 WO 03/101996을 참조할 수 있다. 바람직한 화합물의 하나의 초기 그룹은 U 및/또는 X가 존재하는 화학식 I의 화합물들로 이루어진다. 본 발명에 따른 바람직한 화합물은 하기와 같다: 화학식 I의 화합물을 본 발명에서 하기에 개시한 방법에 의해 제조하고 본 발명에 따른 바람직한 화합물들로 예시할 수 있다. 상기 방법은 본 발명의 추가의 목적을 구성한다. 근본적으로, 본 발명의 목적인 화학식 I의 화합물을, 추정 상 적합한 가교("U 1 -X 1 "로서 나타냄)를 통해 작용화된 7-t-부톡시이미노메틸캄토테신("7-t-but-CP"로서 나타냄)과 사이클로펩티드 유도체("Y 1 "로서 나타냄)와의 축합에 의해 제조한다. 상기 축합 반응들을 하기의 반응식들 중 하나에 따라 수행할 수 있다: 7-t-but-CP + U 1 -X 1 -Y 1 또는 7-t-but-CP - U 1 +X 1 -Y 1 또는 7-t-but-CP - U 1 -X 1 +Y 1 또는 7-t-but-CP + U 1 +X 1 +Y 1 또는 7-t-but-CP - U 1 +X 1 +Y 1 상기에서, 7-t-부트-CP는 7-t-부톡시이미노메틸캄토테신을 나타내고, U 1 , X 1 및 Y 1 은 각각 화학식 I에서 정의한 바와 같은 그룹 U, X 및 Y를 나타내며, 최종적으로는 화학식 I의 공액 화합물이 수득되도록 적합하게 작용화되고/되거나 보호된다. 상기 반응들을 통상적인 방법, 예를 들어 문헌[Journal of Controlled Release 2003, 91, 61-73; SS Dharap et al.; Journal of Medicinal Chem. 2003, 46, 190-3, R. Bhatt]에 개시된 방법을 사용하여 수행한다. 사이클로펩티드 Y 1 을 실시예 1 내지 6에 개시한 바와 같이, 통상적인 펩티드 합성 기법에 따라 제조할 수 있다. 상기 펩티드 합성을 고체상 또는 용액 중에서 수행할 수 있다. 일단 목적하는 사이클로펩티드가 수득되었으면, 상기를 보호된 형태로 상기 축합 반응에 사용할 것이며, 최종 화합물을 수득한 후에만 보호제 그룹을 제거할 것이다. 상기 탈보호는 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 순수한 트리플루오로아세트산의 사용에 의해 산 조건을 사용하거나 또는 염소화된 유기 용매의 존재 하 에서 수행한다. 본 발명에 개시된 화합물은 국소이성화효소 I 억제제이며 따라서 약제, 특히 상기 국소이성화효소의 억제가 이로운 질병의 치료를 위한 약제로서 유용하다. 특히, 본 발명에 따른 화합물은 증식 억제 활성을 나타내고, 따라서 그의 치료학적 성질이 이용되며, 상기 화합물을 약학 조성물의 제형화에 적합하게 만드는 물리화학적 성질을 갖는다. 상기 약학 조성물은 유효 성분으로서 하나 이상의 화학식 I의 화합물을 예를 들어 중요한 치료 효과를 생성시키는 양으로 함유한다. 본 발명에 포함되는 조성물들은 전적으로 통상적이며 제약 산업에서 통상적으로 실행되는 방법을 사용하여 수득된다. 선택된 투여 경로에 따라, 상기 조성물은 고체 또는 액체 형일 것이며, 경구, 비 경구 또는 정맥 내 투여에 적합할 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 유효 성분과 함께 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 비히클 또는 부형제를 함유한다. 제형화 보조제, 예를 들어 용해제, 분산제, 현탁제 또는 유화제가 특히 유용할 수 있다. 화학식 I의 화합물을 또한 다른 유효 성분들, 예를 들어 항암제, 또는 기생충 또는 바이러스 억제 활성을 갖는 다른 약물들과 함께 별도의 형태 및 단일 투여형 모두로 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 예를 들어 비-미소세포종 및 소 세포 폐암, 또는 결장직장 또는 전립선암, 아교모세포종 및 신경모세포종, 자궁경부암, 난소암, 위장 암종, 간 암종, 카포시 육종, 신장 암종, 육종 및 골육종, 고환 암종, 유방 암 종, 췌장 암종, 흑색종, 비뇨 방광 및 두경부 암종에서 항암 활성을 갖는 약제로서 유용하다. 본 발명에 따른 화합물에 의해 제공되는 이점들 중 하나는 상기 분자의 캄토테신 부분 고유의 국소이성화효소 억제 활성과 상기 분자의 사이클로펩티드 부분에 의해 제공되는 인테그린 억제 활성의 조합이다. 상기 결과는 본 발명에 따른 화합물들의 가능한 복합 작용이며, 이는 종양학 분야에 종사하는 전문가들에 의해 상기 분야에 유리하게 받아들여질 것이다. 실제로, Arg-Gly-Asp 서열을 함유하는 사이클로펩티드 부분은 상기 분자를 인테그린을 발현하는 종양을 향하게 할뿐만 아니라 일단 표적에 도달하였으면 상기 분자의 세포독성 부분의 내면화에서부터 인테그린 억제 활성에 이르는 다수의 작용을 발휘할 수 있게 하며, 그 결과 특히 종양 혈관형성 억제에 관하여 이점을 생성시킨다. 상기 사이클로펩티드 부분은 일단 상기 캄토테신 부분으로부터 분리되었으면 또한 종양 부위로부터 얼마간 떨어져서 그의 작용을 발휘할 수 있으며, 따라서 본 발명에 따른 화합물은 또한 전이 형태의 예방 또는 치료에도 유용함을 입증한다. 본 발명의 목적인 약제를 기생충 질병의 치료에 또한 사용할 수 있다. 하기의 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다. 사용되는 약어는 하기와 같다: Aad(아미노아디프산); Amb(아미노메틸벤질); Amp(아미노메틸페닐알라닌); Boc(3급-부톡시카보닐); CSA(캄포설폰산); CTH(촉매 전달 수소화); DCC(디사이클로헥실카보디이미드); DCM(디클로로메탄); DIEA(디이소프로필에틸아민); DMF(디메틸포름아미드); Dy(OTf) 3 (디스프로슘 트리플레이트); Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카보닐); HOBT(하이드록시벤조트리아졸); NMP(N-메틸-피롤리돈); Pht(프탈로일); Pmc(펜타메틸크로만-6-설포닐); ST1481(7-t-부톡시이미노메틸캄토테신, 또한 지마테칸으로 명명함); TBTU(테트라플루오로보레이트-O-벤조트리아졸-1-일-테트라메틸유로늄); TFA(트리플루오로아세트산).
실시예 1 c( Arg ( Pmc )- Gly - Asp ( OtBu )-D- Phe - Amp )·(보호된 ST2581 )의 합성 1.587 몰의 Fmoc-Gly-Res(Res = Sasrin Resin(등록상표), Bachem)를 교반 하 에서 DMF 75 ㎖에 30 분간 현탁시키고, 그 후에 피페리딘 18 ㎖을 가하고, 추가로 30 분간 계속 교반하였다. 여과 및 DMF로 세척한 수지를 NMP(N-메틸-피롤리돈) 50 ㎖에 15 분간 현탁하고, 그 후에 Fmoc-Arg(Pmc)-OH, HOBT, TBTU 및 DIEA를 가하고(각각 3.174 밀리몰); 2 시간 교반 후에, 상기 현탁액을 여과하고 DMF로 세척하였다. 피페리딘으로 탈보호시킨 후에, 상기 커플링을 다른 아미노산, 즉: Fmoc-Amp(Cbz)-OH, Fmoc-D-Phe-OH 및 Fmoc-Asp(OtBu)-OH를 차례로 사용하여 매번 상술한 바와 같이 반복 수행하였다. 상기 Fmoc-N-말단의 최종 탈보호 후에, 선형 펜타펩티드를 DCM 중의 1% TFA 45 ㎖에 의해 상기 수지로부터 방출시켰다. 이를 대략 1 ℓ의 CH 3 CN에 용해시키고, 4.761 밀리몰의 HOBT 및 TBTU, 및 10 ㎖의 DIEA를 가하고; 상기 용액을 30 분간 계속 교반하였으며, 용매를 작은 부피로 증발시키고 물을 사용하여 생성물의 침전을 완료시켰다. 여과된 조 생성물을 MeOH와 DMF의 1:1 혼합물 27 ㎖에 용해시키고, 5 밀리몰의 암모늄 포미에이트 및 10% Pd/C 0.55 g을 가하고, 실온에서 30 분간 교반 하에서 방치하였다. 상기 현탁액을 셀라이트 상에서 여과하고 건조시켰다. 잔사를 예비 RP-HPLC(컬럼: Alltima(등록상표) C-18, Alltech; 이동 상: 수 중 50% CH 3 CN + 0.1% TFA; 체류 시간(Rt) = 9.13 분)에 의해 정제시켰다. 백색 분말 483 ㎎을 수득하였다. 분자 질량(Maldi-Tof): 973 실시예 2 c( Arg ( Pmc )- Gly - Asp ( OtBu )-D- Phe - Aad )(보호된 ST2650 )의 합성 0.69 밀리몰의 Fmoc-Gly-Res를 실시예 1에 개시된 바와 똑같이 처리하였으나, 단 이 경우 세 번째 및 네 번째 아미노산을 디펩티드 Fmoc-D-Phe-Aad(OBzl)-OH의 형태로 가하였다. CTH에 의해 탈보호하고 조 생성물을 예비 RP-HPLC(이동 상: 수 중 66% CH 3 CN + 0.1% TFA; Rt = 17.29 분)에 의해 정제시킨 후에, 순수한 펩티드 187 ㎎을 수득하였다. 분자 질량(Maldi-Tof): 940 실시예 3 c( Arg ( Pmc )- Gly - Asp ( OtBu )-D- Phe -N- Me - Amp )(보호된 ST2700 )의 합성 환류시킨 무수 톨루엔 중의 Fmoc-Phe(4-Pht-N-CH 2 )-COOH의 현탁액에 2 당량의 CSA 및 20 당량의 파라포름알데히드를 가하고, 15 분 간격으로 4 회 분취량으로 나누었다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 톨루엔 120 ㎖로 희석하고 5% NaHCO 3 및 물로 세척하였다. 용매를 증발시킨 후에, 잔사를 CHCl 3 15 ㎖ + TFA 15 ㎖ + Et 3 SiH 700 ㎕에 용해시키고; 상기 혼합물을 암실에서 42 시간 동안 교반 방치하였다. 용매를 증발시킨 후에, 상기 잔사를 실리카겔 상에서 여과에 의해 정제시켰다. 전체 수율: 90%. 선형 펩티드를 상술한 바와 같이 제조된, 세 번째 아미노산으로서 Fmoc-N-Me-Phe-(4-Pht-N-CH 2 )-COOH를 삽입하여, 실시예 1에 개시된 바와 같이 고체상으로 합성하였다. 이 경우에, 수지상의 N-Fmoc-말단의 탈보호를 DMF 중의 용액 중의 30% 디이소프로필아민(30 당량)으로 수행하였다(프탈이미드의 존재로 인해). 환화 후에, 펩티드 500 ㎎을 절대 EtOH 10 ㎖에 고온 용해시키고, 여기에 에탄올 중의 1M NH 2 -NH 2 ·H 2 O 용액 0.9 ㎖을 가하였다. 2 시간 동안 환류 하에서 가열한 후에, 상기 용매를 증발시키고 잔사를 DCM 10 ㎖ + Na 2 CO 3 10 ㎖의 용액에 격렬히 진탕하면서 용해시켰다. 조악한 최종 생성물을 증발 후에 유기 상으로부터 회수하고 예비 RP-HPLC(이동 상: 수 중 52% CH 3 CN + 0.1% TFA; Rt = 10 분)에 의해 정제시켰다. 분자 질량(Maldi-Tof): 987 실시예 4 c[ Arg ( Pmc )- Gly - Asp ( OtBu )-D- Phe -Amp( CO -( CH 2 ) 2 - COOH )](보호된 ST2649 )의 합성 사이클로펩티드 c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp]·TFA(실시예 1에 개시된 바와 같이 제조됨) 120 ㎎을 DCM-DMF 2:1의 혼합물 3.6 ㎖에 화학량론적 양의 TEA 및 숙신산 무수물과 함께 용해시켰다. 1 시간 후에 반응 혼합물을 DCM 30 ㎖로 희석하고 물로 세척하였다. 유기 상을 건조 및 농축시켜 순수한 생성물 100 ㎎의 잔사를 수득하였다. 분석학적 RP-HPLC: 컬럼: Purosphere STAR(등록상표), Merck; 이동 상: 수 중 45% CH 3 CN + 0.1% TFA; Rt = 13.17 분. 분자 질량(Maldi-Tof): 1073 실시예 5 c( Arg ( Pmc )- Gly - Asp ( OtBu )-D- Phe -N- Amb - Gly )(보호된 ST2701 )의 합성 THF 6 ㎖ 중의 Boc-일보호된 p-자일릴렌디아민의 1 내지 22 밀리몰 용액에 TEA 1.83 밀리몰을 가하고, THF 2 ㎖ 중의 벤질 브로모아세테이트 1.22 밀리몰의 용액을 적가하였다. 상기 혼합물을 밤새 교반 하에 방치시키고, 그 후에 용매를 증발시키고 잔사를 플래시 컬럼(CHCl 3 -EtOAc, 9:1) 상에서 정제시켰다. 0.69 밀리몰의 N-(4-Boc-NH-CH 2 -벤질)-글리신 벤질에스테르를 수득하였다. Fmoc-D-Phe-OH 250 ㎎을 DCM 27 ㎖에 용해시키고 디포스젠 40 ㎕ 및 sym-콜리딘 230 ㎕를 가하고; 15 분 후에 앞서 제조된 에스테르 190 ㎎을 가하고, DCM 3 ㎖에 용해시켰다. 3 시간 후에, 80 ㎕의 N-Me-피페라진을 반응 혼합물에 가하고 10 분간 교반하고, 그 후에 상기 혼합물을 DCM 10 ㎖로 희석하고, 물, 0.5N HCl, 물, 5% NaHCO 3 및 물로 추출을 수행하였다. 용매를 증발시킨 후에, 잔사를 실리카겔 상에서 플래시 크로마토그래피(DCM-EtOAc, 9:1)에 의해 정제시켰다. 수율: 80%. MeOH 6 ㎖에 용해시킨, 상기와 같이 수득된 생성물 100 ㎎에 AcOH 76 ㎕ 및HCOONH 4 42 ㎎을 가하고, 상기 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고, 10% Pd/C 50 ㎎을 가하였다. 30 분 후에, 반응 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하였다. 여액을 건조시키고 플래시 컬럼(CHCl 3 -MeOH 9:1) 상에서 정제시켰다. 수율: 90%. 상기와 같이 수득된 생성물 190 ㎎을 TFA 1.2 ㎖에 용해시키고 건조시키고(Boc의 탈보호); 잔사를 0 ℃로 냉각시킨 10% Na 2 CO 3 9 ㎖ + 디옥산 6 ㎖에 재 용해시키고 디옥산 3 ㎖로 희석시킨 벤질옥시카보닐 클로라이드 120 ㎕의 용액을 적가하였다. 실온에서 1 시간 교반 후에, 증발을 진공 하에서 작은 부피로 수행하였으며, 그 후에 상기 혼합물을 물로 희석하고, pH를 HCl로 1로 감소시키고 EtOAc로 추출을 수행하였다. 상기 용매의 증발 후에, 잔사를 CHCl 3 -MeOH(8:2)로 세척하면서 실리카겔 상에서 여과에 의해 정제시켰다. 순수한 디펩티드 수율: 82%. Fmoc-Gly-Res 0.69 밀리몰을 실시예 1에 개시된 바와 같이 처리하였다. Arg 후에, 앞서 제조된 디펩티드 Fmoc-D-Phe-N(4-Cbz-NH-CH 2 -벤질)-G1을 차례로 가하였다. CTH에 의해 Cbz를 탈보호시킨 후에, 조 생성물 c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-N-Amp-Gly)를 예비 RP-HPLC(이동 상: 수 중 50% CH 3 CN + 0.1% TFA; Rt = 10.5 분)에 의해 정제시켰다. 분자 질량(Maldi-Tof): 973 실시예 6 c( Arg ( Pmc )- Gly - Asp ( OtBu )-D- Phe -N- Amp ( CO - CH 2 -( OCH 2 CH 2 ) n -O- CH 2 - COOH ))의 합성 3:1 DCM-DMF 혼합물 4 ㎖ 중의 c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp)·TFA(실시예 1에 개시된 바와 같이 수득됨) 200 ㎎ 용액에 실질적으로 과잉의 글리콜 이산을 가하였다. DIEA(3 당량) 및 DCC(2 당량)를 상기 동일 용액에 가하였다. 상기 혼합물을 밤새 교반 하에서 방치하고, 그 후에 상기를 DCM으로 희석하고 물로 세척하였다. 조 생성물을 유기상을 증발시킴으로써 회수하고 플래시 크로마토그래피(이동 상: CHCl 3 -MeOH 7:3 + 1% AcOH)에 의해 정제시키고; 생성물을 함유하는 분획들을 모으고, 물로 세척하고, 탈수시키고 건조시켜, 순수한 생성물 157 ㎎의 잔사를 수득하였다. 분석학적 RP-HPLC: (컬럼: Purosphere STAR(등록상표), Merck; 이동 상: 수 중 50% CH 3 CN + 0.1% TFA; Rt = 10.96 분) 분자 질량(Maldi-Tof): 사용된 다양한 분자량의 상이한 글리콜들에 상응함. 지마테칸 유도체의 합성 실시예 7 20-O- Val - 지마테칸 - ST2678 의 합성 특허 EP 1 044 977의 실시예 2에 개시된 바와 같이 제조된 ST1481 1 밀리몰, Dy(OTf) 3 0.6 밀리몰, 디메틸아미노피리딘 3 밀리몰 및 Boc-Val-OH 3 밀리몰을 무수 CH 2 Cl 2 15 ㎖에 현탁시키고 -10 ℃로 만들고; 30 분 후에 3.1 밀리몰의 DCC를 가하고 -10 ℃에서 추가로 30 분 후에 반응 혼합물을 실온으로 가열하였다. 2 시간 후에 반응물을 추가로 20 ㎖의 CH 2 Cl 2 로 희석하고, 1N HCl, NaHCO 3 로 세척하고 Na 2 SO 4 상에서 건조시켰다. 조 생성물을 CH 2 Cl 2 /MeOH 97:3으로 SiO 2 상에서 크로마토그래피에 의해 정제시켜 황색 고체로서 92%의 수율로 생성물을 제공하였다. Rf = CH 2 Cl 2 /MeOH 96:4 중의 0.72 분석학적 RP-HPLC: (컬럼: Luna C18, Phenomenex(등록상표); 이동 상: 수 중 45% CH 3 CN; Rt = 23.0) 분자 질량(ESI): 646 중간 생성물 ST2678[N-Boc]을 0 ℃에서 정량적인 수율로 DCM/TFA(75/25)에서 탈보호시킨다. 상기와 같이 수득된 ST2678을 사용하여 RGD 유도체를 직접 결합시 키거나 또는 추가의 중간체로서, 이를 사용하여 두 번째 잔기를 결합시킬 수 있다(실시예 8 내지 9를 참조하시오). 실시예 8 20-O- Val - Asp - 지마테칸 - ST2676 [N- Boc ]의 합성 1 밀리몰의 ST2678 및 3.7 밀리몰의 DIPEA를 상기 순서대로 0 ℃에서 DMF 중의 적합하게 보호된 아스파트산 1.2 밀리몰, HOBt 1.8 밀리몰 및 EDC 1.4 밀리몰의 용액에 가하였다. 반응 혼합물은 실온에서 밤새 정치 후에 물과 디클로로메탄 사이로 분배되었으며, 상기와 같이 수득된 조 생성물을 CH 2 Cl 2 /MeOH 96:4로 SiO 2 상에서 크로마토그래피에 의해 정제시켜 황색 고체로서 66%의 수율로 생성물을 제공하였다. Rf = CH 2 Cl 2 /MeOH 96:4 중의 0.5 분석학적 RP-HPLC: (컬럼: Luna C18, Phenomenex(등록상표); 이동 상: 수 중 45% CH 3 CN; Rt = 23.3) 분자 질량(ESI): 851 카복실 그룹의 탈보호 벤질에스테르를 20 psi에서 H 2 /10% Pd-C로 가수소분해시키고 CH 2 Cl 2 /MeOH 94:6으로 정제시킨 후에 70%의 수율이 산출되었다. Rf = CH 2 Cl 2 /MeOH 92:8 중의 0.52 분석학적 RP-HPLC: (컬럼: Luna C18, Phenomenex(등록상표); 이동 상: 수 중 45% CH 3 CN; Rt = 22.9) 분자 질량(ESI): 761 실시예 9 화합물[ ST2677 ]의 합성 1 밀리몰의 탈보호된 ST2678-[N-Boc]를 무수 피리딘 10 ㎖에 용해시키고 상기 용액을 0 ℃로 만든 후에, 2.5 밀리몰의 숙신산 무수물을 가하였다: 상기 혼합물을 1 시간 동안 실온으로 복원시켰다. 용매를 제거하고, 잔사를 CH 2 Cl 2 에 용해시키고, 유기 상을 0.5N HCl로 세척하였다. 조 생성물을 CH 2 Cl 2 /MeOH 95:5로 SiO 2 상에서 크로마토그래피에 의해 정제시켜 황색 고체로서 90%의 수율로 예상된 생성물을 제공하였다. Rf = CH 2 Cl 2 /MeOH 92:8 중의 0.41. 분석학적 RP-HPLC: (컬럼: Luna C18, Phenomenex(등록상표); 이동 상: 수 중 45% CH 3 CN; Rt = 17.0) 분자 질량(ESI): 646 공액 유도체의 합성 실시예 10 화합물 ST2670 (또는 ST2671 )의 합성 동일한 합성 공정을 상기 둘 모두에 대해 사용하였다. 0 ℃로 냉각시킨 무수 DMF 중의 ST2676[N-Boc](또는 ST2677)의 1.2 밀리몰의 용액에 2.1 밀리몰의 HOBt 및 1.4 밀리몰의 EDC를 가하고 생성 혼합물을 30 분간 교반한 후에 1 밀리몰의 ST2581 및 DIPEA를 차례대로 가하였다. 밤새 정치시킨 후에 상기 혼합물은 물과 디클로로메탄 사이로 분배되었으며, 이어서 유기 상을 Na 2 SO 4 상에서 건조시키고 조 생성물을 CH 2 Cl 2 /MeOH 92:8로 SiO 2 상에서 크로마토그래피에 의해 정제시켜 예상된 생성물인 보호된 ST2670(또는 보호된 ST2671)을 55% 내지 65% 범위의 수율로 제공하였다. 분석학적 RP-HPLC: (컬럼: Luna C18, Phenomenex(등록상표); 이동 상: 수 중 45% CH 3 CN; 보호된 ST2670의 경우 Rt = 20.1, 및 보호된 ST2671의 경우 Rt = 23.2) 분자 질량(ESI): 보호된 ST2671의 경우 1718 분자 질량(ESI): 보호된 ST2670의 경우 1601 공액 생성물의 탈보호 2 개의 화합물 ST2670 및 ST2671을 수득하기 위한 최종 탈보호를 상기 두 화합물 모두에 대해 CH 2 Cl 2 /TFA 1:1을 사용하여 2 시간 동안, 상기 혼합물을 0 ℃에서 실온으로 만들어 수행하였으며; 이러한 공정에 이어서 이온 교환 수지 단계를 수행하여 하이드로클로라이드로서 생성물을 제공하였다. 분석학적 RP-HPLC: (컬럼: Luna C18, Phenomenex(등록상표); 이동 상: 수 중 35% CH 3 CN; ST2670의 경우 Rt = 14.5, 및 ST2671의 경우 Rt = 14.3) 분자 질량(ESI): ST2671의 경우 1294 분자 질량(ESI): ST2670의 경우 1279 생물학적 결과 인테그린 α v ß 3 수용체에의 결합 정제된 α v ß 3 수용체(Chemicon, cat. CC1020)를 0.5 ㎍/㎖의 농도로 완충액(20 mM 트리스, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 1 mM MnCl 2 )에서 희석하였다. 100 ㎕의 분액을 96-웰 플레이트에 가하고 +4 ℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 완충액(50 mM 트리스, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 1 mM MnCl 2 , 1% 소 혈청 알부민)으로 1 회 세척하고 이어서 실온에서 추가로 2 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 동일 완충액으로 2 회 세척하고 실온에서 3 시간 동안 경쟁 리간드의 존재 하에서 0.05 nM의 방사성 리간드 [ 125 I]에키스타틴(Amersham Pharmacia Biotech)과 배양하였다. 배양의 끝에서, 웰들을 세척하고 감마 계수기(Packard)를 사용하여 방사능을 측정하였다. 상기 리간드의 비-특이적인 결합을 과잉의 저온 에키스타틴(1 μM)의 존재 하에서 측정하였다. 인테그린 α v ß 5 수용체에의 결합 정제된 α v ß 5 수용체(Chemicon, cat. CC1020)를 1 ㎍/㎖의 농도로 완충액(20 mM 트리스, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 1 mM MnCl 2 )에서 희석하였다. 100 ㎕의 분액을 96-웰 플레이트에 가하고 +4 ℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 완충액(50 mM 트리스, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 1 mM MnCl 2 , 1% 소 혈청 알부민)으로 1 회 세척하고 이어서 실온에서 추가로 2 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 동일 완충액으로 2 회 세척하고 실온에서 3 시간 동안 경쟁 리간드의 존재 하에서 0.15 nM의 방사성 리간드 [ 125 I]에키스타틴(Amersham Pharmacia Biotech)과 배양하였다. 배양의 끝에서, 웰들을 세척하고 감마 계수기(Packard)를 사용하여 방사능을 측정하였다. 비-특이적인 리간드 결합을 과잉의 저온 에키스타틴(1 μM)의 존재 하에서 측정하였다. IC 50 매개변수의 평가 비트로넥틴 수용체에 대한 상기 생성물의 친화성을 IC 50 값 ± SD로서, 즉 특이적인 방사성리간드-수용체 결합의 50%를 억제할 수 있는 농도로서 나타내었다. 상기 IC 50 매개변수를 "ALLFIT" 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 결과 하기의 표들은 캄토테신-RGD 공액물 및 RGD 펩티드의 비트로넥틴 α v ß 3 및 α v ß 5 수용체에 대한 친화성의 결과를 제공한다. 상기 공액물은 RGD 펩티드의 경우 관찰된 친화성에 필적할만한 상기 두 인테그린 수용체 모두에 대해 강력한 친화성을 나타내었다. [표 1] 비트로넥틴 α v ß 3 및 α v ß 5 수용체에 대한 캄토테신 - RGD 공액물의 친화성 [표 2] 비트로넥틴 α v ß 3 및 α v ß 5 수용체에 대한 RGD 펩티드의 친화성 상이한 종양 세포 주에 대한 상기 공액물들의 세포독성 살아있는 세포들에 대한 상기 화합물의 효과를 평가하기 위해서, 설포로다민 B 시험을 사용하였다. 세포 성장에 대한 상기 화합물의 효과를 시험하기 위해서, PC3 인간 전립선 암종, A498 인간 신장 암종, A2780 인간 난소 암종 세포 및 NCI- H460 비-소 세포 폐암종을 사용하였다. A2780, NCI-H460 및 PC3 종양 세포를 10% 소 태아 혈청(GIBCO)을 함유하는 RPMI 1640에서 증식시킨 반면, A498 종양 세포는 10% 소 태아 혈청(GIBCO)을 함유하는 EMEM에서 증식시켰다. 종양 세포들을 대략 10% 합류율로 96-웰 조직 배양 플레이트(Corning)에 시딩하고 부착시키고 24 시간 이상 회복시켰다. 이어서 다양한 농도의 약물을 각각의 웰에 가하여 그들의 IC50 값(세포 생존의 50%를 억제하는 농도)을 계산하였다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 72 시간 또는 2 시간 배양 후에 72 시간 회복시켰다. 상기 처리의 끝에서, 상기 플레이트를 상등액의 제거 및 3 회의 PBS 첨가에 의해 세척하였다. PBS 200 ㎕ 및 저온 80% TCA 50 ㎕를 가하였다. 상기 플레이트를 얼음 상에서 1 시간 이상 배양시켰다. TCA를 제거하고, 상기 플레이트를 증류 수 중에서 3 회 침지 세척하고 페이퍼 상에서 40 ℃에서 5 분 동안 건조시켰다. 1% 아세트산 중의 0.4% 설포로다민 B 200 ㎕를 가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 추가로 30 분간 배양시켰다. 설포로다민 B를 제거하고, 상기 플레이트를 1% 아세트산 중에서 3 회 침지 세척하고, 이어서 상기를 페이퍼 상에서 40 ℃에서 5 분간 건조시켰다. 이어서 10 mM 트리스 200 ㎕를 가하고, 상기 플레이트를 교반 하에서 20 분간 유지시켰다. 생존 세포를 540 ㎚에서 멀티스캔 분광형광계에 의해 흡광도로서 측정하였다. 죽은 세포의 양을 대조용 배양물에 대한 설포로다민 B 결합의 감소율로서 계산하였다. IC 50 값을 "ALLFIT" 프로그램을 사용하여 계산하였다. 공액물 ST2670은 A2780 난소 종양 세포에 대해 0.4 μM의 IC50 값으로 가장 효능 있는 세포독성 활성을 나타내었다. 더욱이, 상기 공액물 ST2670은 종양 세포에 대해 ST2677(유리 캄토테신)의 경우 관찰되는 것에 필적할만한 세포독성을 나타내었다. 상기 공액물 ST2671은 또한 유리 캄토테신 ST2676의 경우 발견되는 세포독성에 필적할만한 PC3 종양 세포에 대한 효능 있는 세포독성을 나타내었다. [표 3] PC3 , A498 및 A2780 종양 세포에 대한 공액물 ST2670 및 ST2671 , 및 유리 캄토테신( ST2676 및 ST2677 )의 세포독성(72 시간 처리) (nd=측정 안 됨) [표 4] H460 비소 세포 폐암종 세포에 대한 유리 캄토테신 20-O 유도체( ST2676 , ST2677 , ST2678)의 세포독성(2 시간 처리) |
