应用于癌症治疗的免疫修饰纳米管

申请号 CN201280010837.3 申请日 2012-02-28 公开(公告)号 CN103841978A 公开(公告)日 2014-06-04
申请人 俄克拉荷马州立中央大学; 发明人 陈伟;
摘要 一种构建免疫修饰 纳米管 的方法,以及使用该化合物将免疫佐剂输送至 肿瘤 细胞和产生靶向、协同光物理和免疫学反应的方法,用于癌症的 治疗 。为了制备免疫修饰的纳米管,将 碳 纳米管溶解于 糖化 壳聚糖(一种免疫刺激物)的一种溶液中,从而,将糖化壳聚糖作为一种 表面活性剂 使用,使纳米管的 水 溶液稳定。该化合物能用于癌症的治疗。本方法包括皮下注射免疫修饰纳米管和对目标肿瘤进行激光照射的步骤。纳米管作为一种载体使用,用于将免疫佐剂运输至肿瘤细胞中,以及作为受者中一个肿瘤细胞团 块 中的一种光吸收剂作用。在激光照射目标肿瘤细胞下,肿瘤细胞内的免疫修饰纳米管能产生空间和时间的协同光热和免疫反应,用于癌症的治疗。
权利要求

1.一种用于引起肿瘤细胞的破坏和抗肿瘤免疫反应的光免疫疗法,其包括:
内化纳米结构,将其作为一种光吸收剂,用于宿主肿瘤细胞团中。
将上述细胞团块暴露于连续的近红外光或射频照射中,以提供外源性的细胞热损坏或压,从而导致肿瘤细胞的死亡,并将上述肿瘤细胞暴露于肿瘤抗原中。
2.根据权利要求1的方法,其中:
上述的纳米结构用一种免疫刺激物修饰。
3.根据权利要求2的方法,其中:
上述的免疫刺激物为糖化壳聚糖。
4.根据权利要求1的方法,进一步包括:
皮下给药至上述肿瘤细胞,与上述纳米结构结合的免疫刺激物,上述从一个包含短棒状杆菌、卡介苗或其它免疫佐剂的组中选择的免疫刺激物;
其中,上述的纳米结构为单壁纳米管
5.根据权利要求1的方法,进一步包括:
皮下给药至上述的肿瘤细胞,免疫刺激物与上述从一个包含纳米颗粒、纳米簇和纳米棒的组中选择的纳米结构结合,上述免疫刺激物从一个包含短棒状杆菌、卡介苗或其它免疫佐剂的组中选择。
6.根据权利要求5的方法,其中:
上述的纳米颗粒、纳米簇和纳米棒由黄金组成。
7.根据权利要求1的方法,其中:
上述的纳米结构在700-1500nm的范围内有一个强吸收峰。
8.根据权利要求7的方法,其中:
上述的纳米结构有一个强吸收峰,其波长范围为800-1200nm。
9.根据权利要求1的方法,其中:
上述的近红外光由一台980-nm的激光器产生。
10.根据权利要求9的方法,其中:
2
上述的近红外光由一个激光功率密度在0.1到5W/cm 的激光器产生,以5-60分钟的照射时间进行照射。
11.根据权利要求10的方法,其中:
2
上述的近红外光由一台功率密度在0.75到2W/cm 的激光器产生。
12.根据权利要求10的方法,其中:
上述的近红外光以10-30分钟的照射时间进行照射。
13.一种化合物,包含:
溶解于一种糖化壳聚糖溶液的纳米结构;
由此,上述的糖化壳聚糖是使上述水溶液稳定的一种表面活性剂
其中上述的糖化壳聚糖是一种免疫刺激物。
14.根据权利要求13的化合物,其中:
其中,上述的纳米结构为单壁碳纳米管
15.根据权利要求13的化合物,其中:
上述的纳米结构由一种免疫刺激物修饰。
16.根据权利要求13的化合物,其中:
上述的纳米结构在800-1200nm的范围内有一个强吸收峰。
17.一种免疫活性化合物,包含:
一种由糖化壳聚糖分子包覆的纳米结构。
18.根据权利要求17的免疫活性化合物,其中:
其中,上述的纳米结构为单壁碳纳米管
19.根据权利要求17的免疫活性化合物,其中:
上述的纳米结构由一种免疫刺激物修饰。
20.根据权利要求17的免疫活性化合物,其中:
上述的纳米结构在800-1200nm的范围内有一个强吸收峰。
21.一种将免疫刺激物转移至一个细胞团块,以及产生靶向、协同光物理和免疫学反应的方法,包含:
用糖化壳聚糖包覆一个纳米结构;
用上述纳米结构穿透一个细胞团块的细胞膜。
22.根据权利要求21的免疫活性化合物,其中:
其中,上述的纳米结构为单壁碳纳米管。
23.根据权利要求21的方法,包含以下步骤:
在上述穿透步骤后照射上述的纳米结构。
24.根据权利要求23的方法,其中:
上述的照射步骤,包括将上述细胞团块暴露于近红外光中,以促发协同的、同步发生的光热和免疫反应。
25.根据权利要求24的方法,其中:
上述的近红外光由一台980-nm的激光器产生。
26.根据权利要求25的方法,其中:
上述的激光器有0.75到2W/cm的激光功率密度;
上述的照射步骤包含用一个10到30分钟的照射时间进行照射。
27.根据权利要求23的方法,其中:
上述的照射步骤,包括将上述细胞团块暴露于射频照射中,以促发协同的、同步发生的光热和免疫反应。
29.根据权利要求21的方法,进一步包含以下步骤:
用一种免疫刺激物修饰上述纳米结构。
30.根据权利要求21的方法,其中:
上述的纳米结构在800-1200nm的范围内有一个强吸收峰。
31.一种制作单壁碳纳米管/糖化壳聚糖化合物的方法,包含:
制备一种糖化壳聚糖的水溶液
将单壁碳纳米管混合到上述的水溶液中,形成一种混合物;
超声处理上述的混合物来分散上述的单壁碳纳米管;
离心上述混合物;
将上述混合物的吸光度与一个已知浓度的校准化合物的吸光度进行比较,来测定上述的单壁碳纳米管在上述混合物中的浓度。
32.根据权利要求31的方法,其中:
上述的单壁碳纳米管是通过在双金属钴-钼催化剂上进行Co的催化分解来生产。
33.根据权利要求31的方法,其中:
上述的混合步骤将大约2.5到2.7mg的上述单壁碳纳米管与大约7ml的上述糖化壳聚糖水溶液混合。

说明书全文

应用于癌症治疗的免疫修饰纳米管

[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请宣称具有美国专利申请(13/037,171)的所有权益。该美国专利,发明名称为“应用于癌症治疗的免疫修饰碳纳米管”,于2011年2月28日提交,在此以其全部目的完整的作为本申请的参考。
[0003] 发明的领域
[0004] 本发明涉及纳米技术生物医学应用领域。更为特别地,本发明涉及一种新型的免疫修饰碳纳米管化合物,以及用该化合物将免疫佐剂运送至癌细胞,产生靶向、协同光物理和免疫学反应,用于癌症的治疗。
[0005] 发明的背景
[0006] 纳米技术已被用于生物医学领域中。尤其是,单壁碳纳米管(SWNTs)已经被用于各种生物系统中。单壁碳纳米管(SWNTs)的一个固有特性是,它们能穿过细胞膜而不会诱发细胞毒性。单壁碳纳米管(SWNTs)的其它固有特性是,它们在近红外(NIR)区有很强的光吸收能。曾有报告称,在近红外激光照射和射频照射期间,单壁碳纳米管(SWNTs)能提高细胞的热破坏。由于在700—1100nm的范围内,生物组织比较透光,所以用于光热疗法的理想单壁碳纳米管(SWNTs)在近红外区内应该有一个吸收谱带。此外,尺寸均一的纳米管更为适宜,这样一个窄吸收峰就能用于有效的光照射。在“通过在双金属钴-钼催化剂上进行的CO催化分解来控制单壁碳纳米管的生产”(Kitiyanan B,Alvarez We,Harwell JH,Resasco DE(2000)in Chem.Phys.Lett.317:497—503)中讨论的CoMoCAT方法,通过引用成为本发明中的一部分,用于生产具有一个980nm左右的强烈吸收窄谱带的单壁碳纳米管(SWNTs)。
[0007] 对于生物应用,单壁碳纳米管(SWNTs)应该在一种悬液中制备;稳定溶解需要表面活性剂,以避免纳米管的聚集。十二烷基苯磺酸钠(NaDDBS)、羧甲基纤维素钠(NaCMC)和胆酸钠(NaCholate)通常作为纳米管的表面活性剂使用。
[0008] 单壁碳纳米管(SWNTs)的电子结构易受周围静电环境中变化的影响。例如,通过表面电荷转移或通过分子的吸收,能极大地改变它们的光反应。因此,具有合适光学性质的SWNT溶液对于生物医学的应用来说至关重要。
[0009] 由于肿瘤细胞对温度升高具有敏感性,光热疗法对于局部癌症治疗有效。激光免疫疗法的开发是将免疫刺激的光热反应结合来治疗转移瘤。使用一种近红外激光照射和一种光吸收染料的结合方法,其选择性的光热作用可作为肿瘤的一线攻击使用。可以联合使用一种免疫刺激物来诱发免疫反应。一种新型的化合物,糖化壳聚糖(glycated chitosan,GC)作为这样的一种免疫刺激物已被研发。在预临床研究中,使用糖化壳聚糖(GC)和光吸收染料的激光免疫疗法已被证实对转移瘤的治疗很有效。此方法也已经用于治疗晚期乳腺癌患者,并具有令人满意的治疗结果。发明概要
[0010] 局部干预诱发的抗肿瘤免疫反应对于转移瘤的治疗来说是最理想的。一种新型的免疫修饰纳米管系统通过糖化壳聚糖(GC)构建,GC作为单壁碳纳米管(SWNTs)的一种有效表面活性剂,也是一种有效的免疫佐剂。这种新型的SWNT-GC系统有长期的稳定性,并且保持了SWNT的吸收特性和GC的免疫佐剂功能。SWNT-GC的局部给药和近红外光的照射在肿瘤细胞的治疗中产生了同步协同光热免疫反应,无论在体外还是体内。激光+SWNT-GC在动物肿瘤模型中产生了非常有效的肿瘤抑制作用,并在很多病例中出现完全的肿瘤消退和长期存活。用激光+SWNT—G成功治疗的荷肿瘤动物建立了对随后肿瘤激发的完全抗性。将从激光+SWNT-G治愈的动物中获得的脾细胞作为免疫细胞使用的被动继承性免疫转移,在初治受者中提供了100%的免疫性。激光+SWNT-GC可被证实为一种有希望的选择性局部疗法,可诱发系统性抗肿瘤反应,同时将副作用降到最低。
[0011] 为了利用CoMoCAT SWNTs的特殊吸收特性,并在免疫学上提高光热作用,我们设计了一种新型的SWNT-GC系统,其中GC可同时作为一种有效的表面活性剂和一种有效的免疫刺激物使用,从而为该新型系统提供了两个重要的功能。SWNT-GC悬液是稳定的,它能完全保持SWNTs的光吸收特性和GC的免疫功能。在动物肿瘤模型中,使用局部激光+SWNT-GC疗法能获得显著的肿瘤消退和抗肿瘤免疫反应。
[0012] 此外,纳米管能进入细胞中,这要归功于其尺寸和电特性。纳米管可作为药物载体使用。在本发明的方法中,纳米管将免疫佐剂GC载入肿瘤细胞内。因此,在具有适当波长的一种激光照射下,SWNT—GC能在目标肿瘤细胞中产生时间和空间的协同光热和免疫反应。SWNT—GC联合疗法也有将其它治疗剂载入肿瘤的潜力,这样就能用所需药剂的联合疗法来治疗癌症。
[0013] 图的简要描述
[0014] 图1A.免疫修饰纳米管系统SWNT-GC的图解。
[0015] 图1B.不同SWNT-GC浓度(顶部曲线,SWNT-GC浓度:135μg/ml-0.73Wt%;SWNT-GC浓度连续50%降低,下曲线)的SWNT-GC悬液的吸收图谱。
[0016] 图1C.SWNT-GC的Raman光谱
[0017] 图2A.使用SWNT-GC和激光照射的选择性光热作用(热电偶测量)。在一个980nm的激光照射期间,用热电偶测量凝胶模型(带或不带纳米管增强)内的温度。激光功率密2
度为1.13W/cm,并且照射时间为5分钟。热电偶置于样品表面下4mm。
[0018] 图2B.使用SWNT-GC和激光照射的选择性光热作用(红外热感摄像机测量)。在激光照射期间,用一个红外热感摄像机进行测量凝胶模型(带或不带纳米管增强)表面的2
温度升高。激光功率密度为1.13W/cm,并且照射时间为5分钟。
[0019] 图3A.激光照射前,不带纳米管增强的凝胶模型中的温度分布(磁共振温度测量法测量)。
[0020] 图3B.激光照射后,不带纳米管增强的凝胶模型中的温度分布(磁共振温度测量2
法测量)。用一个980nm的激光从底部开始照射样品。激光功率密度为0.212W/cm,光束直径为3.0cm。该图显示了激光照射后7分钟的温度分布。
[0021] 图3C.激光照射前,带纳米管增强的凝胶模型中的温度分布(磁共振温度测量法测量)。一个纳米管增强球形凝胶包埋在表面下1mm。
[0022] 图3D.激光照射后,带纳米管增强的凝胶模型中的温度分布(磁共振温度测量法测量)。一个纳米管增强球形凝胶包埋在表面下1mm。用一个980nm的激光从底部开始照2
射样品。激光功率密度为0.212W/cm,光束直径为3.0cm。该图显示了激光照射后7分钟的温度分布。
[0023] 图4.SWNT载入并转移至肿瘤细胞内的GC的亚细胞分布。SWNT-GC-FITC(SWNT-GC结合荧光染料FITC)和GC-FITC(GC结合一种荧光染料FITC)在EMT6细胞中的荧光图像。细胞用SWNT-GC-FITC和GC-FITC培养2小时,用激光扫描显微镜检测来自细胞的FITC荧光。注意,GC只有在附着于SWNT时才能进入细胞。Bar=10μm。
[0024] 图5.不同条件的治疗下,体内肿瘤细胞的存活能力。用GC(50μg/ml)、2
SWNT-GC(2.5μg-50μg/ml)、仅用激光(60,120或150J/cm)、或激光+SWNT-GC(60,120
2
或150J/cm ;1.251μg-25μg/ml或2.5μg-50μg/ml)治疗肿瘤细胞。评估细胞存活能力之前,治疗的细胞在完全培养基中培养12小时。柱,平均值±标准偏差SD(n=4)。
[0025] 图6A.SWNT-GC的体内免疫作用。小鼠巨噬细胞分泌的TNFα用GC或SWNT-GC悬液培养,用ELISA检测。用不同浓度(25,50和90μg/ml,灰色柱)的GC溶液或用不同浓度(2.5μg-25μg,2.5μg-50μg和2.5μg-90μg/ml,黑色柱)的SWNT-GC溶液培养巨噬细胞24小时。培养后,收集上层清液用于测定TNFα。柱,平均值±标准偏差SD(n=4)。
[0026] 图6B.SWNT-GC的体内免疫作用:由治疗的EMT6细胞刺激巨噬细胞分泌的2
TNFα。用GC(50μg/ml)、SWNT-GC(2.5μg-50μg/ml)、激光(60—150J/cm)或激光
2
+SWNT-GC(60—150J/cm,2.5μg-50μg/ml)治疗的肿瘤细胞(1:1)培养巨噬细胞24小时。没有治疗的细胞与巨噬细胞共培养作为对照组。培养后,收集上层清液用于测定TNFα。
柱,平均值±标准偏差SD(n=4)。
[0027] 图7A.SWNT-GC的不同成分在瘤内注射对肿瘤负荷的作用:(i)对照,(ii)SWNT(1mg/kg),(iii)GC(25mg/kg),或(iv)SWNT-GC(1mg-25mg/kg);12只小鼠/组。3
将EMT6细胞皮下注射到Balb/c雌性小鼠的胁腹中,当肿瘤达到一个大约300nm 的大小时,进行治疗。
[0028] 图7B.激光照射(第0天以0.75W/cm2照射10分钟)后,不同成分的瘤内注射对肿瘤负荷的作用:(i)对照,(ii)激光,(iii)激光+GC(25mg/kg),(iv)激光+SWNT(1mg/kg),或(v)激光+SWNT-GC(1mg-25mg/kg);12只小鼠/组。将EMT6细胞皮下注射到3
Balb/c雌性小鼠的胁腹中,当肿瘤达到一个大约300mm 的大小时,进行治疗。与其它组相比,激光+SWNT-GC和激光+SWNT对肿瘤的消退更为有效。
[0029] 图8A。不带激光照射的SWNT和GC的体内作用:动物存活。通过不同成分的皮下注射治疗(第0天)的荷肿瘤小鼠存活率:(i)SWNT-GC(1mg-25mg/kg);(ii)GC(25mg/kg),(iii)SWNT(1mg/kg),或(iv)对照:12只小鼠/组。将EMT6细胞皮下注射到Balb/3
c雌性小鼠的胁腹中,当肿瘤达到一个大约300mm 的大小时,进行治疗。
[0030] 图8B.带激光照射的SWNT和GC的体内作用:动物存活。激光照射(第0天以2
0.75W/cm 照射10分钟)后,通过不同成分的皮下注射治疗的荷肿瘤小鼠存活率:(i)激光+SWNT-GC(1mg-25mg/kg);(ii)激光+SWNT(1mg/kg),(iii)激光+GC(25mg/kg),(iv)激光或(v)对照;12只小鼠/组。将EMT6细胞皮下注射到Balb/c雌性小鼠的胁腹中,当
3
肿瘤达到一个大约300mm 的大小时,进行治疗。与其它组相比,激光+SWNT-GC和激光+SWNT对肿瘤的消退更为有效。
[0031] 图9.成功治疗的小鼠的肿瘤再激发。在初次接种后的100天,用2×106的存活肿瘤细胞激发由激光+SWNT-GC或激光+SWNT治疗治愈的荷肿瘤小鼠。相同年龄的健康小6
鼠也接种2×10 的肿瘤细胞作为对照。用激光+SWNT-GC治愈的所有小鼠都显示出对再激发的完全抗性;然而,由激光+SWNT治愈的小鼠,虽然其平均存活时间得到了延长,但是不能完全对抗肿瘤的再激发。
[0032] 图10.使用脾细胞作为免疫细胞的继承性免疫。从激光+SWNT-GC或激光+SWNT成功治愈的小鼠中获得的脾细胞作为免疫细胞收集。从未治疗的荷肿瘤小鼠中获得的脾细胞也被收集作为对照免疫细胞。肿瘤细胞与来自不同小鼠的脾细胞混合,随后注射到小鼠体内。脾细胞对肿瘤细胞的比例为50,000,000:100,000/小鼠。从激光+SWNT-GC治疗的小鼠中获得的脾细胞能完全抑制肿瘤的生长;该组中的所有小鼠都存活并且没有肿瘤恶化。从激光+SWNT治愈的小鼠和对照小鼠中获得的脾细胞只能分别对受者提供30%和10%的保护作用。
[0033] 优选方案的详细描述
[0034] 材料和方法
[0035] CoMoCAT单壁碳纳米管(SWNTs)
[0036] 使用CoMoCAT SWNT是由于其均一尺寸和近红外光吸收的独特性质。CoMoCAT法用一个负载的双金属钴-钼酸盐催化剂来生产单壁碳纳米管。该产品由一个窄分布的纳米管类型组成,其平均直径为0.81nm。由于在近红外区域的吸收特性,尤其是在大约980nm处有强烈吸收,这种类型的纳米管一直备受关注。此类型的纳米管在“在非侵入式射频领域中癌细胞的碳纳米管增强热破坏”(Gannon CJ,Cherukuri P,Yakobson BL,Cognet L,Kanzius JS,Kittrell C,Wesiman RB,Pasquali M,Schmidt HK,Smalley RE,Curley SA(2007)in Cancer110:2654-2665),“生命科学中的多光子显微镜”( K(2000)in J.Microsc.(Oxford)200:83—104),“通过在双金属钴-钼催化剂上进行的CO催化分解来控制单壁碳纳米管的生产”(Kitiyanan B,Alvarez We,Harwell JH,Resasco DE(2000)in Chem.Phys.Lett.317:497—503)和“使用一种固体负载催化剂的单壁碳纳米生长的窄(n,m)分布”(Bachilo SM,Balzano L,Herrera JE,Pompeo F,Resasco DE,Weisman RB(2003)in J.Am.Chem.Soc.125:11186—11187)中有详细讨论,每篇文章都被引用为本发明的参考文献。
[0037] 糖化壳聚糖(GC)
[0038] 在本发明中,GC作为一种特殊的免疫佐剂以及SWNT的一种有效表面活性剂使用。GC作为激光免疫治疗的一种免疫刺激物开发,用于治疗转移瘤。在细胞培养和动物研究中,GC是无毒性的,如之前的试验所证实的。GC可通过使用三倍过量的半乳糖培养壳聚糖的一种水悬液来合成,随后用Schiff和Amadori产品的混合物的氢化物还原来稳定;如“激光免疫疗法:一种新型的转移瘤疗法”(Chen WR,Carubelli R,Liu H,Nordquist RE(2003)in Mol.Biotechnol.25:37-43)中讨论的,此文被引用为本发明的参考文献。壳聚糖衍生的生物材料的实例可在美国专利No.5,747,475中找到,其内容被引用为本发明的参考文献。
除了免疫佐剂的性质外,GC的分子结构也能使其成为SWNTs的一种极好的表面活性剂。
[0039] SWNT-GC和SWNT-PEG溶液的制备
[0040] 在本发明中,CoMoCAT SWNT作为碳纳米管的一个实例使用。其它纳米结构,例如纳米颗粒、纳米簇和纳米棒,能与GC一起使用来构造免疫修饰的纳米结构。为了制备SWNT-GC溶液,将2.5-2.7mg的原CoMoCAT SWNTs与7ml不同浓度的GC水溶液混合。我们估计,1—5mg范围内的任何子集范围内的量都是有效的。为了分散SWNTs,用一个声波细胞破碎仪将混合物超声处理30分钟。然后将该SWNTs悬液在30,150g下离心30分钟。GC溶液中SWNT的最终浓度,可通过将它的吸光度与已知浓度的校准SWNT溶液的吸光度对比获得。
[0041] 光谱测量
[0042] SWNT-GC的吸光度由一个紫外可见光吸收光谱仪测量。为了利用SWNTs的固有光学特性,测量期间在没有旋转或搅拌的情况下,用Raman光谱法,使用毛细管确认SWNT-GC的结合。将一个氩离子激光器(514.5nm)用于一个40×物镜的显微镜、一个光谱仪和一个CCD检测器结合中的激发。在聚焦于毛细管中心后,记录样品的Raman光谱图,其分离度为-12cm (10mW功率,20秒收集时间)。
[0043] 使用凝胶模型(phantom)的激光+SWNT-GC的选择性光热作用
[0044] 将具有978nm吸收峰的SWNT,用于SWNT-GC的悬液。将凝胶模型与SWNT-GC悬液混合,来模拟吸收增强目标。一台980nm激光器用于SWNT-GC凝胶样品和一般凝胶样品的照射。用热电偶测量凝胶表面以下4mm深度的温度升高。在激光照射期间,用一台红外热感摄像机测量带或不带SWNT-GC增强的凝胶模型的表面温度。
[0045] 在激光照射期间,用一台磁共振成像仪测量凝胶模型内部的温度分布。将明胶凝胶置于一个圆筒容器中。在激光照射之前和照射期间,也对一般凝胶内的温度分布进行测量。为了提高凝胶的吸收,将含有SWNT-GC悬液的一个0.5cm半径的凝胶球体包埋在凝胶中表面下方1mm处,来模拟深部目标肿瘤。在激光照射之前和照射期间,测量SWNT-GC增强凝胶块内的温度分布。
[0046] 细胞培养
[0047] 此实验中使用了小鼠乳腺肿瘤系EMT6细胞和小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞。在一个加湿培养箱中,于37℃,5%CO2和95%空气条件下,在添加了15%胎血清(FCS)、盘尼西林(100units/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI(GIBCO)培养基中培养细胞。
[0048] GC-FITC和SWNT-GC-FITC功能化
[0049] 将FITC(13mM,50μl)溶解于DMSO中,随后将其与1ml的GC或SWNT-GC溶液混合。在室温下,将该混合物培养过夜,避光,之后用100KDa过滤器(微孔)过滤GC-FITC或SWNT-GC-FITC以去除多余的FITC。随后用EMT6肿瘤细胞将GC-FITC和SWNT-GC-FITC培养2小时,并用激光扫描显微镜检测来自细胞的FITC荧光。
[0050] 细胞存活能力分析
[0051] 在一块24孔的组织培养板中,用不同的SWNT和GC结合方法培养肿瘤细胞4 2 2
(1×10/孔)2小时,用PBS洗,并将其暴露于60-150J/cm(于0.5-1.25W/cm 照射2分钟)照射通量的激光中。光源为一台980nm的半导体激光器。
[0052] 用基于比色四唑盐的分析法,用CCK-8试剂盒进行体内细胞毒性的测定。为了检测光热细胞毒性,用带或不带SWNT-GC培养的一台980nm激光器照射肿瘤细胞。OD450,即在450nm处的吸收值,用一块96孔平板读数器读取,以测定细胞的存活能力。
[0053] TNFα的检测
[0054] 为了检测治疗后,肿瘤细胞刺激时由巨噬细胞分泌的TNFα,用治疗的肿瘤细胞在24孔组织培养板中培养巨噬细胞。在24小时的培养后,收集上层清液用于ELISA检测。
[0055] 动物肿瘤模型。
[0056] 将0.1ml的EMT6细胞溶液(1×106)注射到6-8周大的Balb/c雌性小鼠的胁腹部3
位。在肿瘤细胞培养后的7-10天,当肿瘤达到大约300mm 的大小时,将动物用于实验中。
[0057] 用激光+SWNT-GC治疗动物肿瘤
[0058] 将荷肿瘤小鼠分为不同的治疗组(12-16只小鼠/组)。在用一台980-nm的激光器进行照射前的2小时,将0.1-ml含有5mg/ml(25mg/kg)GC或0.2mg/ml(1mg/kg)SWNT或0.2-5mg/ml(1mg-25mg/kg)SWNT-GC的溶液直接注射到每个肿瘤的中心。用一个光导纤维传输系统传输激光。对于10分钟的治疗时间,治疗部位(包含肿瘤和0.5到1cm的周围皮
2
肤)的功率密度为0.75W/cm。在激光照射期间,通过戊巴比妥钠的腹膜内注射将小鼠麻醉,并将其约束在一个特殊设计的固定器中。治疗后,在100天的期限内,每天观察小鼠,并每隔一天进行一次肿瘤的测量。
[0059] 继承性免疫转移
[0060] 用2×106细胞/小鼠的增加量的肿瘤激发激光+SWNT-GC和激光+SWNT成功治疗的小鼠。同时,相同年龄的对照小鼠用相同数量的肿瘤细胞培养。肿瘤培养的28天后,用颈椎脱臼法将小鼠处死,切割它们的脾脏,去除脂肪。用机械破碎制备脾细胞悬液,并将其倒入具有10%FCS的培养基中。混合之前,在一台血细胞计数器上对脾细胞和存活的肿瘤7
细胞进行计数。混合物中脾细胞对肿瘤细胞的比例为500∶1。用0.2-ml含有5×10 脾
5
细胞和10 肿瘤细胞的混合物培养小鼠。
[0061] 在用不同的激光、SWNT和GC结合治疗的7天后,在EMT6肿瘤细胞的存在下,将来自治疗小鼠的脾细胞培养5天,之后用CCK8评估细胞毒性。
[0062] 结果
[0063] SWNT-GC的特征
[0064] 在溶液的最终离心后,获得稳定的SWNT-GC悬液。SWNT-GC的图解在图1A中给出。SWNT-GC的近红外吸收光谱在980nm周围呈现了一个强谱带(图1B),这是CoMoCAT样品的典型表现。SWNT-GC的Roman光谱在图1C中给出。GC溶液在此光谱窗的吸光度非常低。
[0065] 测得的SWNT悬液在GC中的谐振率为0.140,能与NaCholate(具有相似的比率为0.147,文献中所报告的一种最好的表面活性剂)相比。在4℃条件下,SWNT-GC储藏超过6个月后仍可保持稳定。
[0066] 将SWNT-GC用于光吸收增强,用热电偶测量凝胶模型表面以下4mm深度的温度升高。如图2A中所示,在SWNT-GC增强凝胶和一般凝胶之间可获得一个12℃的差异。冷冻样品的表面温度升高如图2B中所示。在相同的条件下,这些增长证明了SWNT-GC在980nm处的选择性。目标样品的温度升高能通过调节SWNT-GC的浓度和激光的设置来控制。
[0067] 在激光照射之前和激光照射期间,一般凝胶块内的温度分度可通过磁共振温度测量法获得,如图3A和3B所示。在激光照射之前和激光照射期间,SWNT-GC增强凝胶块内的温度分布如图3C和3D中所示。结果显示出SWNT-GC增强目标中较高的温度升高。
[0068] 为了确认SWNT能否将GC载入肿瘤细胞,用FITC,一种荧光标记,将SWNT-GC功能化,并观察来自SWNT-GC-FITC或GC-FITC培养的肿瘤细胞的荧光发射。EMT6细胞的共轭焦点影像显示出SWNT-GC-FITC主要积聚于细胞质中,而细胞内部不存在GC-FITC(图4)。
[0069] 这些结果显示,作为一种独特的准一维材料,SWNT能将GC载入肿瘤细胞中,实现激光照射下,目标肿瘤细胞中短暂和空间同步的光热和免疫反应。
[0070] 为了测定激光照射下SWNT-GC的细胞毒性,用SWNT-GC溶液将EMT6肿瘤细胞培养2小时,随后用一台980nm的激光器进行照射。肿瘤的细胞毒性取决于SWNT-GC的浓度和激光剂量(图5)。
[0071] SWNT-GC的体外免疫刺激
[0072] 免疫学的观察显示,当用小鼠巨噬细胞培养时,在规定的浓度下GC和SWNT-GC能刺激相似水平的TNFα分泌,并且TNFα分泌的水平会随着GC浓度增长(图6A)。这些结果显示稳定的SWNT-GC悬液保持了GC的免疫能力。
[0073] 为了测定治疗的肿瘤细胞诱发的免疫反应,进行ELISA来测量巨噬细胞(在不同的治疗后,用肿瘤细胞培养24小时)分泌的TNFα。如图6B中所示,用GC或SWNT-GC培养2
的肿瘤细胞能刺激某一水平的TNFα分泌,然而,单独的低剂量激光照射(60J/cm)不能提
2
高巨噬细胞的活性。用高剂量激光照射(120或150J/cm)治疗的肿瘤细胞也能刺激巨噬细胞分泌TNFα,因为激光导致了细胞的死亡。然而,在这些高激光剂量下,用激光+SWNT-GC治疗的肿瘤细胞,其引起的TNFα分泌水平更高(图6B)。
[0074] SWNT-GC体内作用
[0075] 将EMT6细胞皮下注射到Balb/c雌性小鼠的胁腹内。当肿瘤达到大约300nm3的大小时,将动物分成8个不同的治疗组。治疗后,每天观察小鼠,并用一把卡尺每隔一天测量一次肿瘤体积。通过注射SWNT(1mg/kg,PEG)、GC(25mg/kg)或SWNT-GC(1mg-25mg/kg)治疗的小鼠,其平均肿瘤负荷与未治疗的对照小鼠的肿瘤负荷类似(图7A);在这三组中,没2
有小鼠呈现出肿瘤的消退。与之相反,用激光照射(以0.75W/cm 照射10分钟)治疗的小鼠,其平均肿瘤负荷明显小于对照小鼠的肿瘤负荷(图7B)。激光+SWNT和激光+SWNT-GC疗法引起了明显的肿瘤消退(图7B)。
[0076] 对于存活能力研究,每个治疗组使用16只小鼠,并在肿瘤培养后,对小鼠进行100天的监控。在单独注射SWNT、GC或SWNT-GC溶液治疗的小鼠之间,没有长期的存活者,尽管2
在GC和SWNT-GC组的小鼠,其平均存活时间稍微较长(图8A)。在功率密度为0.75W/cm的激光照射下,激光+SWNT-GC组中存活率为100%,激光+SWNT组中为56%,激光+GC组中为38%,仅用激光的组中为25%(图8B)。在激光+SWNT组中的16只小鼠中有9只存活,但是只在3只小鼠中观察到肿瘤的消退。总而言之,图8中的结果证实,激光+SWNT-GC的联合疗法是最有效的治疗,其存活率和肿瘤消退比激光、SWNT和GC的其它联合疗法要高很多。
[0077] 已治愈小鼠的再激发
[0078] 在初次肿瘤培养(10只小鼠/组)后,用2×106的存活肿瘤细胞激发用激光6
+SWNT-GC和激光+SWNT成功治疗的小鼠。用2×10 的存活肿瘤细胞/小鼠接种相同年龄的10只初治小鼠作为对照。如图9所示,激光+SWNT-GC治愈的所有小鼠对激发有完全的抗性。然而,激光+SWNT治愈的所有小鼠,其原发性肿瘤会恶化,并在肿瘤再激发的80天内死亡。对照组的所有小鼠,其原发性肿瘤会恶化,并在肿瘤接种的40天内死亡。激光+SWNT-GC
6
治愈的小鼠,用增加量的肿瘤进行第二次激发(3×10/小鼠)。它们再一次完全抵抗了肿瘤的再激发。
[0079] 继承性免疫转移
[0080] 将从激光+SWNT-GC或激光+SWNT成功治疗的小鼠中获得的脾细胞作为免疫细胞收获。未治疗的荷肿瘤小鼠的脾细胞也作为对照被收集。脾细胞与存活的肿瘤细胞以5 7
500∶1的比例混合。用10 的存活肿瘤细胞和5×10 的从各治疗组获得的脾细胞培养小鼠。图10显示了用脾细胞和肿瘤细胞混合物培养的小鼠的存活率。从激光+SWNT-GC治愈的小鼠中获得的脾细胞为受者提供了100%的保护,而从激光+SWNT治愈的小鼠中获得的脾细胞仅为受者提供了30%的保护。从荷肿瘤对照小鼠中获得的脾细胞仅为受者提供了
10%的保护(图10)。在继承性免疫转移后的60天,所有由来自激光+SWNT-GC治愈的小鼠
6
的脾细胞保护的小鼠都再次用2×10 的肿瘤细胞激发;所有小鼠都抵抗了第二次激发。
[0081] 讨论
[0082] 癌症,尤其是转移癌的理想疗法,应该通过微创局部干预达到系统的肿瘤特异性免疫反应。这种方法能抑制局部肿瘤,同时根除远部位的肿瘤转移灶,为受者提供抗肿瘤免疫和最低的副作用。使用激光的光热反应是一种理想的局部干预,这是因为它能精确地将能量传输至目标组织,并有效的利用肿瘤细胞对温度升高的敏感性。
[0083] 近红外区的激光,结合适当的光吸收剂,对选择性光热干预尤为有效,这是由于生物组织在近红外区的低吸光度。
[0084] SWNTs已作为治疗靶标使用,来降低对癌细胞的热损伤。它显示出能通过暴露于持续近红外光或射频照射中诱发内化的SWNTs杀死癌细胞。
[0085] 通过将免疫刺激物引入肿瘤,能显著提高抗肿瘤免疫反应,尤其是与其它干预联合使用时。在适当使用时,这样的免疫刺激物能通过刺激受者免疫系统显著提高癌症治疗的功效,比如,当短棒状杆菌、卡介苗或其它免疫佐剂皮下注射时,结合光疗法。
[0086] CoMoCAT方法制成的SWNTs,其尺寸均一,并在980nm左右有一个强吸收峰,从而成为选择性光热作用在局部干预中所需的一种理想光吸收剂。使用一台980nm激光器和CoMoCAT SWNT的选择性光热激光-组织作用已通过体外和体内的实验证实。
[0087] 之前,在动物研究中,GC也作为一种免疫佐剂用于癌症治疗中。现在提出的新型SWNT-GC系统的目的是进一步改进激光免疫疗法。CoMoCAT和GC的分子结构可产生稳定、均一的SWNT悬液,将GC作为一种有效的表面活性剂使用(图1)。实验结果清楚地显示SWNT-GC保持了SWNT的光学特性(图2和3)和GC的免疫特性。
[0088] SWNT-GC的结合是因为SWNT和GC的电子结构也为该新型系统提供了一种独特的优势:将GC载入肿瘤细胞中。通常,免疫刺激物,比如糖化壳聚糖(GC),一种长链聚合物,不能直接进入细胞中,如实验结果所证实的(图4,顶面板)。SWNT显示出一种进入细胞,并停留在不同的亚细胞成分中的能力,取决于SWNT携载的分子。当GC与SWNT结合时,它能被载入到肿瘤细胞中(图4,底面板)。肿瘤细胞内的GC能作为一种外源性免疫刺激物作用,从而进一步提高通过激光+SWNT-GC的光热和免疫反应结合诱发的免疫反应。
[0089] SWNT-GC系统的优势在于它在肿瘤治疗期间同步发生的协同光热和免疫反应。尤其是,SWNT选择性吸收980-nm的激光,引起肿瘤细胞的破坏,从而为受者提供一种外源性的细胞压力和肿瘤免疫。另外,GC在相同的光热治疗部位提高了免疫反应,这是由于它与SWNT的结合所致。因此,由于SWNT和GC的独特结合,它们能在相同的时间以相同的肿瘤细胞为目标,从而引起协同的光热和免疫反应。
[0090] 体外和体内结果证实了激光+SWNT-GC在治疗动物肿瘤中的有效性。
[0091] 然而,GC或SWNT-GC单独使用时,不能引起体外的肿瘤细胞死亡,与激光照射结合2
时,尤其是在较高的剂量(120和150J/cm)时,它们能显著提高细胞毒性(图5)。类似的,激光+SWNT-GC治疗的肿瘤细胞能从巨噬细胞中诱发更高水平的TNFα分泌,如图6中的数据所示。这些结果证实,激光照射、SWNT光吸收和GC免疫刺激的协同作用。
[0092] 体内试验结果进一步证实了激光、SWNT和GC之间的协同作用,如图7所示。SWNT,GC或SWNT-GC的皮下注射不会引起肿瘤的消退(图7A),尽管使用GC(GC或SWNT-GC)单成分的治疗延长了小鼠的中位存活时间(图8A)。这些结果可归于由GC诱发的受者非特异性免疫反应,提高了肿瘤的抗性,尽管这样的反应不能选择性的破坏肿瘤细胞,如体外(图5)和体内(图7A)的结果所证实的。当使用激光照射时,SWNT-GC的作用能被显著提高,无论在体内(图5)还是体外(图7B)。激光+SWNT-GC的治疗引起了肿瘤的完全抑制,同时,激2
光+SWNT的治疗也引起的明显的肿瘤抑制(图7B)。特别地,在使用0.75W/cm 的激光功率密度和10分钟的照射时间时,激光+SWNT-GC能达到100%的治愈率,比用激光+SWNT治疗的56%治愈率高很多(图8B)。
[0093] 激光+SWNT-GC成功治疗的小鼠能抵抗随后大量肿瘤的激发;此组中所有的治愈小鼠都显示能完全抵抗肿瘤的再激发(图9)。然而,用激光+SWNT成功治疗的小鼠,其原发性肿瘤会恶化,并在肿瘤再激发后的大约80天死亡(图9)。这些结果证实了GC在诱发长时间持续的抗肿瘤免疫中的重大作用。
[0094] 当动物注射了一种脾细胞和肿瘤细胞的混合物时,从激光+SWNT-GC治愈的小鼠中获得的脾细胞为正常的受者小鼠提供了100%的保护,如图10中所示。相比而言,从激光+SWNT治愈的小鼠中获得的脾细胞只能向受者小鼠提供部分保护(图10)。这些结果表明,激光+SWNT-GC在免疫细胞中诱发了长期记忆,这仍是由于GC的作用。
[0095] 假设激光+SWNT-GC在治疗肿瘤中的机制在于选择性光热反应和免疫刺激之间的协同反应。光热反应减少了肿瘤负荷,同时暴露了肿瘤抗原;免疫佐剂首先原位刺激受者的免疫系统,随后指引免疫系统对抗特定的肿瘤细胞。实际上,在每个单独的受者中,激光免疫疗法产生了一种原位自动疫苗。该串联效应不仅可以完全根治肿瘤,也可以引起长期的肿瘤特异性免疫。因此,该方法通过局部干预,为单个受者提供了系统性免疫疗法,而不需要通常要求的免疫交叉反应。
[0096] 在本发明中,一种免疫佐剂作为一种表面活性剂使用,有效地溶解了纳米管,从而在激光照射下提供了协同的光热和免疫作用。本发明中的该系统,由于其独特的光学特性和免疫功能,能用于肿瘤的治疗中,尤其是转移瘤的治疗中。本发明的系统,由于SWNT和GC的有力结合,使得GC能被载入到肿瘤细胞中,从而进一步提高激光+SWNT-GC的光热和免疫作用。
[0097] 总之,由激光+SWNT-GC(能同时空间和短暂地将肿瘤细胞定为目标)提供的选择性光热作用和肿瘤特异性免疫刺激,能作为一种有效的癌症疗法使用。
[0098] 因此,本发明适合进行上述的目的,并达到上述的结果和优势。虽然出于本披露的目的是描述了优选表现,仍明显可见工艺的普通技术需要大量变更和改进。
QQ群二维码
意见反馈