[0001] 本发明涉及以糖-胆甾烷醇化合物为有效成分的药品。

[0002] 在胆固醇B环的双键为饱和的胆甾烷醇上结合GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-后得到的糖-胆甾烷醇化合物具有优异的抗肿瘤活性(参照专利文献1、2和3)。

[0003] 这样的糖-胆甾烷醇化合物，从抗肿瘤活性来看糖链部分为2个以上的化合物为主体，但是糖链数多的话，存在合成变得复杂，成本增加的问题。另一方面，也报道了在糖部分仅具有半乳糖的化合物，但是在活性方面仍没有满足。并且，糖-胆甾烷醇化合物还通常存在对水为不溶性的问题。

[0004] 因此，期待着糖链数少且具有充分的抗肿瘤活性，并且溶解性优异的糖-胆甾烷醇化合物。

[0005] 另一方面，在糖链部分具有N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)的胆甾烷醇化合物是已知化合物(非专利文献1)，但其生物活性迄今为止没有任何报道。

[0006] 专利文献1：特开平11-60592号公报

[0007] 专利文献2：特开2000-191685号公报

[0008] 专利文献3：国际公开第2005/007172号文本

[0009] 非专利文献1：Studies on steroids.Part CXXXXV.Synthesis ofconjugated cholesterol and cholestanols.(1979)，27(8)，1926-31.

[0010] 本发明的目的在于提供一种简便地合成，并且具有充分抗肿瘤活性的糖-胆甾烷醇化合物。

[0011] 糖-胆甾烷醇化合物，对糖链或者胆甾烷醇单独而言完全看不到抗肿瘤活性，活性表达必须糖-胆甾烷醇化合物的整体结构，但是从结构活性相关的角度出发，对糖链数或者种类进行类推是极其困难的。然而，本发明人等意外地发现，在糖部分仅具有GlcNAc的以下述式(1)表示的胆甾烷醇化合物对癌细胞具有强的增殖抑制活性。并且，该胆甾烷醇化合物的环糊精包合物、脂质体制剂能够弥补该化合物的不溶性的缺点，并且在发挥上述活性方面是极其有效的。

[0012] 即，本发明涉及以下的发明。

[0013] 1)一种抗癌剂，以下述式(1)：

[0014]

[0015] 所示的胆甾烷醇化合物或它的环糊精包合物作为有效成分。

[0016] 2)一种脂质体制剂，含有上述胆甾烷醇化合物。

[0017] 3)一种包合物，是上述胆甾烷醇化合物的环糊精包合物。

[0018] 4)上述胆甾烷醇化合物或它的环糊精包合物在制造抗癌剂中的应用。

[0019] 5)癌的预防或治疗方法，其特征在于，给与上述胆甾烷醇化合物或它的环糊精包合物。

[0020] 本发明的胆甾烷醇化合物由于具有优异的抗肿瘤活性，并且与以往的糖-胆甾烷醇相比能够简便地合成，因此作为用于癌的预防或者治疗的医药品是有用的。并且，该化合物的环糊精包合物、脂质体制剂溶解性优异，且在发挥抗癌活性方面是极其有效的。

[0021] 本发明的胆甾烷醇化合物是已知化合物(前述非专利文献1)，可以通过例如以下的方法制备。

[0022]

[0023] 即，可以通过4个步骤由4-甲氧苯基-3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-苯二酰亚胺基-β-D-吡喃葡糖苷制备本发明的胆甾烷醇化合物(参照后述的制备例)。

[0024] 另外，本发明的胆甾烷醇化合物的糖链部分优选GlcNAcβ-，因此作为本发明的胆甾烷醇化合物，5-α-胆甾烷-3β-基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(1a)是适合的。

[0025] 本发明的胆甾烷醇化合物可以容易地被环糊精类或者其衍生物包合而形成复合体。由于考虑到与如下情况相关：待包合的客体分子的直径、或者环糊精与客体分子之间的范德华力、客体分子与来源于环糊精的羟基之间的氢键，因此环糊精不是能够适合所有不溶性化合物的，但环糊精能够与本发明的胆甾烷醇化合物形成良好的包合复合体。

[0026] 作为本发明的环糊精包合物中的环糊精，除了α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等环糊精类之外，还包括例如甲基-β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、单乙酰基-β-环糊精、2-羟丙基-γ-环糊精等环糊精衍生物。其中，从提高溶解性的角度出发，2-羟丙基-β-环糊精是适合的。

[0027] 这样的环糊精包合物可以通过如下方式进行配制：例如，配制环糊精类或其衍生物的适当水溶液(例如20～40％)，向其中添加本发明的胆甾烷醇化合物，进行搅拌。

[0028] 这里使用的胆甾烷醇化合物的浓度，只要是胆甾烷醇化合物能够与环糊精形成包合物的浓度即可，通常是1～50质量％，优选是10～30质量％左右。

[0029] 如此得到的环糊精包合物，对水为易溶性，因此能够在活体内高效发挥效果。并且，还具有能够在体外试验体系中进行稳定的评价的优点。

[0030] 此外，本发明的胆甾烷醇化合物通过制成脂质体制剂，可以更有效地到达作用表达部位。并且，还可以在体外试验体系中进行稳定的评价。

[0031] 这样的脂质体制剂优选是含有本发明的胆甾烷醇化合物、膜成分物质以及脂肪族或芳香族胺的脂质体。

[0032] 相对于膜成分物质1摩尔，脂质体制剂中的胆甾烷醇化合物的含量期望是0.3～2.0摩尔，优选0.8～1.5摩尔。

[0033] 作为膜成分物质，可列举磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等天然和合成的磷脂类以及它们的混合物，除此之外可以优选使用水性卵磷脂等加工后的天然磷脂。更适合地，可列举磷脂酰胆碱类的1α二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。

[0034] 脂肪族或者芳香族胺主要是为了使脂质膜表面带正电而添加的物质。作为这样的胺，可列举硬脂胺、油胺等脂肪族胺；芴乙基胺等芳香族胺，特别是，可以很好地使用硬脂胺。

[0035] 相对于膜成分物质(磷脂)1摩尔，优选含有该胺0.04～0.15摩尔，优选0.1～0.15摩尔。

[0036] 根据需要，在该脂质体中除了上述物质以外还可以添加作为膜结构稳定剂的胆固醇、脂肪酸、二乙酰磷酸酯(diacetyl phosphate)等。

[0037] 作为使膜成分分散的水溶液，优选使用水、生理盐水、各种缓冲液、糖类的水溶液以及它们的混合物。作为缓冲液，无论是有机类、无机类，可很好地使用在体液氢离子浓度附近具有缓冲作用的缓冲液，例如可列举磷酸缓冲液。

[0038] 脂质体的配制没有特别限定，可以使用通用的方法，例如可以依照特开昭57-82310号公报、特开昭60-12127号公报、特开昭60-58915号公报、特开平1-117824号公报、特开平1-167218号公报、特开平4-29925号公报、特开平9-87168号公报、Methods of BiochemicalAnalysis(1988)33，p337或者“脂质体”(南江堂)中所记载的方法等。

[0039] 以下，显示本发明的胆甾烷醇化合物的脂质体化的顺序。

[0040] 首先，在本发明的胆甾烷醇化合物、上述膜成分物质以及脂肪族或芳香族胺中添加有机溶剂和水进行混合后，用旋转蒸发器等将有机溶剂完全去除，接着进行水分的去除。

[0041] 膜成分物质、烷基胺以及胆甾烷醇化合物的混合比例可以示例52∶8∶20(摩尔比)，只要是其近旁的混合比例就没有特别问题。胆甾烷醇化合物的混合比例小时，可以根据需要添加以胆固醇为代表的膜结构稳定剂，但如果该混合比例高，则未必一定添加膜结构的稳定剂。

[0042] 有机溶剂只要是对水为不溶性的挥发性有机溶剂就没有特别限制，例如可以使用氯仿、氯甲烷、苯以及己烷等，当考虑到溶解性时，可以使用适当添加了乙醇或者甲醇等较高极性的有机溶剂配制成的混合有机溶剂。该混合有机溶剂和水的混合比例只要是形成均一的比例就没有特别限制。

[0043] 此外，当添加水分进行配制时，作为水分去除法极为普遍地使用冻干法，对其没有限定，还可以在减压干燥器中进行干燥。去除水分后，添加上述分散水溶液，用涡流混合器等进行振荡，由此实现脂质体化。

[0044] 在使脂质体的尺寸一致时，通过例如超声波处理、采用多孔膜过滤器的挤压处理、利用高压喷射乳化装置的处理或者将它们组合，可以使尺寸均一化。此外，要想获得更小的脂质体颗粒，可以通过例如延长超声波处理时间来实现。并且，作为脂质体的粒径，优选40nm～300nm。

[0045] 另一方面，作为以上述脂质体制剂以外的方法使用本发明的胆甾烷醇化合物的情况，可以根据各种给与方式列举各种稳定剂。

[0046] 本发明的胆甾烷醇化合物、其环糊精包合物、含有该胆甾烷醇化合物的脂质体制剂(以下也称为“胆甾烷醇化合物等”)如后述实施例所示，显示出远远强于在糖链部分具有GlcNAc-Gal-或Gal-的胆甾烷醇化合物的细胞增殖抑制效果。因此，含有这些作为有效成分的制剂作为用于癌的预防或者治疗的药品是有用的。

[0047] 本发明的抗癌剂可以根据治疗部位、治疗目的选择适当给药形式，在脂质体制剂中，只要不使用损害其形状稳定性的添加剂等，就可以采用例如口服剂、注射剂、栓剂、软膏剂、贴剂等的任何一种，可以利用各种本领域技术人员公知惯用的制剂方法进行制造。

[0048] 在配制口服用固体制剂时，可以在向本发明的胆甾烷醇化合物等中添加赋形剂、根据需要添加粘结剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂等后，根据常规方法制造片剂、包衣片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等。作为这种添加剂，是本领域通常使用的即可，例如作为赋形剂可示例乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、高岭土、微晶纤维素、硅酸等；作为粘结剂可示例水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、紫胶、磷酸钙、聚乙烯吡咯烷酮等；作为崩解剂可示例干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、十二烷基硫酸钠、单硬脂酸甘油酯、乳糖等；作为润滑剂可示例精制滑石、硬脂酸盐、硼砂、聚乙二醇等；作为矫味剂可示例白糖、橙皮、柠檬酸、酒石酸等。

[0049] 在配制口服用液体制剂时，可以向本发明的胆甾烷醇化合物等中添加矫味剂、缓冲剂、稳定剂、矫臭剂等，根据常规方法制备内服液剂、糖浆剂、酏剂等。作为此时的矫味剂，上述列举的即可；作为缓冲剂可列举柠檬酸钠等；作为稳定剂可列举黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶等。

[0050] 在配制注射剂时，可以向本发明的胆甾烷醇化合物等中添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、局麻剂等，根据常规方法制备皮下、肌内以及静脉内用注射剂。此时的pH调节剂和缓冲剂可列举柠檬酸钠、醋酸钠、磷酸钠等。作为稳定剂可列举焦亚硫酸钠、EDTA、巯基乙酸、硫代乳酸等。作为局麻剂可列举盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因等。作为等渗剂可示例氯化钠、葡萄糖等。

[0051] 在制备栓剂时，可以向本发明的胆甾烷醇化合物等中添加本领域内公知的制剂用载体，例如聚乙二醇、羊毛脂、可可脂、三脂肪酸甘油酯等，进一步根据需要添加Tween(注册商标)这类的表面活性剂等后，根据常规方法进行制备。

[0052] 在制备软膏剂时，根据需要向本发明的胆甾烷醇化合物等中配合通常使用的基剂、稳定剂、湿润剂、保存剂等，根据常规方法进行混合、制剂化。作为基剂，可列举液体石蜡、白凡士林、白蜂蜡、辛基十二烷醇、石蜡等。作为保存剂可列举过氧化苯甲酸甲酯、过氧化苯甲酸乙酯、过氧化苯甲酸丙酯等。

[0053] 在制备贴剂时，根据常规方法向通常的支撑体上涂布前述软膏、乳脂、凝胶、糊等即可。作为支撑体，由棉、人造纤维、化学纤维制成的织布、无纺布；软质氯乙烯、聚乙烯、聚氨酯等膜或者发泡体片是适合的。

[0054] 本发明的胆甾烷醇化合物等的给与量根据患者的症状、体重、年龄、性别等而不同，不能一概而定，通常作为成人每天胆甾烷醇化合物(1)的剂量，为约0.01～200mg/Kg，优选为0.1～50mg/Kg即可，优选将其1天一次或者分成2～4次左右给药。

[0055] 下面，根据实施例更具体地说明本发明。

[0056] 实施例

[0057] 制备例1GlcNAc-胆甾烷醇的制备

[0058] (1)乙基-3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-苯二酰亚胺基-1-硫代-β-D-吡喃葡糖苷(化合物(2))的制备

[0059] 在氩气环境下，将4-甲氧苯基-3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-苯二酰亚胺基-β-D-吡喃葡糖苷(2g，4.19mmol)和乙硫醇(0.40mL，5.45mmol))的干燥二氯甲烷(30ml)溶液进行冰冷却，滴加三氟化硼乙醚络合物(3.19mL，25.14mmol)后，在室温下搅拌过夜。在冰冷却下向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用硫酸钠干燥有机层，减压下蒸馏去除溶剂，将残渣用乙酸乙酯-己烷进行重结晶，得到1.62g的标题化合物。

[0060] 性状：白色粉末

[0061] 1H-NMR(CDCl3)δ：1.22(3H，t，J ＝ 7.3Hz)，1.86(3H，s)，2.04(3H，s)，2.11(3H，s)，2.61-2.76(2H，m)，3.90(1H，ddd，J＝2.4Hz，4.9Hz，10.3Hz)，4.18(1H，dd，J＝2.2Hz，12.4Hz)，4.31(1H，dd，J＝2.2Hz，12.4Hz)，4.39(1H，dd，J＝10.3Hz，10.3Hz)，5.18(1H，dd，J＝9.2Hz，10.3Hz)，5.49(1H，d，J＝10.3Hz)，5.83(1H，dd，J＝9.2Hz，10.3Hz)，7.74(2H，dd，J＝2.4Hz，5.4Hz)，7.86(2H，dd，J＝2.4Hz，5.4Hz)。

[0062] (2)5-α-胆甾烷-3β-基-2-脱氧-2-苯二酰亚胺基-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖苷(化合物(3))的制备

[0063] 在氩气环境下，向(1)中得到的化合物(2)(400mg，0.834mmol)、5-α-胆甾烷-3β-醇(389mg，1.0mmol)、活化分子筛4A(1.88g)的混合物中加入干燥二氯甲烷(4.6ml)，在室温下搅拌1小时之后，加入三氟甲磺酸甲酯(0.28mL，2.48mmol)搅拌过夜。向反应液中加入三乙胺(1mL)搅拌30分钟后，进行硅藻土(celite)过滤，用二氯甲烷清洗滤出物。合并滤液和清洗液后蒸馏去除溶剂，将残渣用硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝
3∶1，表示体积比。下同)精制，得到510mg的标题化合物。

[0064] 性状：白色粉末

[0065] 1H-NMR(CDCl3)δ：0.51-2.10(55H，m)，3.48-3.56(1H，m)，3.85(1H，ddd，J ＝2.4Hz，4.9Hz，10.3Hz)，4.15(1H，dd，J＝2.2Hz，12.2Hz)，4.26-4.34(3H，m)，5.15(1H，dd，J＝8.9Hz，10.0Hz)，5.46(1H，d，J＝8.4Hz)，5.77(1H，dd，J＝8.9Hz，10.8Hz)，7.74(2H，dd，J＝2.4Hz，5.4Hz)，7.86(2H，dd，J＝2.4Hz，5.4Hz)。

[0066] (3)5-α-胆甾烷-3β-基-2-乙酰胺基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖苷(化合物(4))的制备

[0067] 向(2)中得到的化合物(3)(510mg，0.633mmol)的1-丁醇(5.0mL)悬浮液中加入乙二胺(5.0mL)，在120℃下搅拌过夜。在减压下蒸馏去除反应液，向残渣中加入吡啶(5mL)、醋酸酐(5mL)、4-二甲基氨基吡啶(催化量)搅拌过夜。在减压下蒸馏去除反应液，将残渣溶解在乙酸乙酯中，用1M盐酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗后，用硫酸钠干燥有机层，减压下蒸馏去除溶剂，将残渣用硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝1∶4)精制，得到250mg的标题化合物。

[0068] 性状：白色粉末

[0069] 1H-NMR(CDCl3)δ：0.55-2.07(58H，m)，3.52-3.72(3H，m)，4.10(1H，dd，J＝2.2Hz，11.3Hz)，4.26(1H，dd，J ＝ 2.2Hz，12.2Hz)，4.86(1H，d，J ＝ 8.4Hz)，5.03(1H，dd，J ＝
9.7Hz，9.7Hz)，5.35-5.43(2H，m)。

[0070] (4)5-α-胆甾烷-3β-基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(化合物(1a))的制备

[0071] 向(3)中得到的化合物(4)(250mg，0.348mmol)的甲醇(5.0mL)、二氯甲烷(5.0mL)混合溶液中加入28％的甲醇钠甲醇溶液(0.07mL，0.363mmol)，在室温下搅拌过夜。加入AMBERLYST 15，中和反应液后，过滤，在减压下蒸馏去除滤液，将残渣悬浮于甲醇中，滤出不溶物，用甲醇清洗、干燥，得到159mg的标题化合物。

[0072] 性状：白色粉末

[0073] 1H-NMR(DMSO-d6+D2O)δ：0.62-1.94(49H，m)，2.99-3.05(2H，m)，3.22-3.50(4H，m)，3.66(1H，d，J＝11.6Hz)，4.40(1H，d，J＝7.6Hz)，7.64(1H，d，J＝8.4Hz)。

[0074] 实施例1脂质体以及环糊精包合物的制备

[0075] 使用20μmol/mL(溶解于氯仿/甲醇＝5/1，v/v)的GlcNAc-胆甾烷醇(化合物(1a))以及胆甾烷醇作为起始物质。

[0076] (1)脂质体制剂的制作

[0077] 以52/8/20(摩尔比)的比例混合1α二棕榈酰磷脂酰胆碱、硬脂胺以及糖-胆甾烷醇，使得成为700μl，然后，添加有机溶剂(氯仿/甲醇＝2/1，v/v)300μl以及蒸馏水1mL混合。其后，用旋转蒸发器将有机溶剂完全去除后，进行冻干操作，完全去除水分。将该冻干品溶解于PBS 1mL中，进行超声波处理(15W，15分钟)，由此将脂质体均化成粒径40～
300nm左右，供给实施例2。

[0078] (2)环糊精包合物的制备

[0079] 配制羟丙基β环糊精的20％水溶液，添加GlcNAc-胆甾烷醇，通过搅拌-混合，制作环糊精和GlcNAc-胆甾烷醇包合物。GlcNAc-胆甾烷醇由于不溶性，通过搅拌增溶，可确