[0001] 本发明属于纳米检测和高分子化学技术领域，具体涉及一种荧光碳量子点及其在检测TNP及细胞内成像方面的应用。

[0002] 近几年，碳量子点作为新型的荧光纳米材料，具有许多优良的性质：良好的光稳定性、好的水溶性、无光泛眼、上转换荧光性质和好的生物相容性等。因此，荧光碳量子点有广泛的应用前景，包括生物成像、传感、药物传递和光催化等。相比于之前的碳纳米材料，碳量子点具有独特的发光性能。尤其是传感器方面，比如用于DNA和亚硝酸盐的生物传感，以及用于磷酸盐、葡萄糖、α-胎蛋白、金属离子传感的传感器或是爆炸物的检测。由于硝基芳香爆炸物是造成水污染的严重污染源并且是国家安全的潜在威胁，所以能够快速有选择性的检测出硝基芳香爆炸物是对于国土安全的潜在威胁和环境的一个重要主题。

[0003]  2，4，6-三硝基苯酚别名苦味酸，又被称为黄色炸药，长期受2，4，6-三硝基苯酚污染的人员的皮肤、牙齿、发、甲均可出现黄染，可患增生性皮炎、咽炎、中耳炎等疾病，2，4，6-三硝基苯酚对水生生物均有致毒作用，进入环境可使水质色、嗅、味发生变化，并影响地面水的自净过程。2，4，6-三硝基苯酚（TNP）是全世界首例研发出的硝基芳香化合物具有强的爆炸性，安全系数较低。由于硝基芳香化合物结构相似，难以区分限制了在实际当中的应用。因此发展快速、简单、高选择性灵敏度检测TNP是十分迫切的。最近，很多文章报道不同探针检测分析硝基芳香化合物，特别是TNP。例如，苏和他的团队制备了BSA功能化的CuInS2量子点作为近红外荧光探针检测TNP [Liu S. Y., Shi F. P., Chen L. and Su X. G., Talanta, 2013, 116, 870-875]。Huang和他的团队使用Tb掺杂的碳量子点高效选择检测TNP，在水溶液中的检测线为200 nM [Chen B. B., Liu Z. X., Zou H. Y. and Huang C. Z., Analyst, 2016,141, 2676-2681]。Ghosh和他的团队使用多孔金属有机框架UiO-68@NH2检测TNP，水中检测浓度低至0.4 ppm [Nagarkar S. S., Desai A. V., Samanta P. and Ghosh S. K., Dalton Trans., 2015, 44, 15175-1518]。在这些方法中，由于比色法方便观察并且不需要太复杂的设备从而得到了广泛的应用。此外，荧光法在很多环境下同样具有独特的优点。

[0004] 碳量子点经常用于细胞成像时的着色探针。碳是构成生物分子的基本骨架，因此比其他的纳米材料有更好的生物相容性并不稀奇。然而一些功能化的纳米材料尺寸较大或毒性的影响限制了它们的应用。于是，小尺寸无毒的材料是被渴望的。近日，一些研究表明将叶酸嫁接到材料上可有助于材料靶向细胞，进而实现在细胞内成像的效果[Song Y. C., Shi W., Chen W., Li X. H. and Ma H. M., J. Mater. Chem., 2012, 22, 12568-12573]。

[0005] 本发明的目的是提供一种裸眼即可检测TNP，且灵敏度高、特异性强、检测限低，还可用于细胞成像的荧光碳量子点。

[0006] 一种荧光碳量子点，它是由下述方法制备的：将1-2g柠檬酸和2-4g尿素放入反应釜中，加入10-15mL二甲基甲酰胺，混合，封闭反应釜，将混合物加热至150-180°C，反应4-6h后，得到的棕色溶液，冷却到室温，加入50mg/mL的NaOH溶液20-30mL，混合搅拌1min后，离心，收集沉淀，再溶解到水中，离心，重复两次，沉淀物冷冻干燥，得到黑色固体粉末，即荧光碳量子点；
所述的柠檬酸为1g，尿素为2g，二甲基甲酰胺为10mL，NaOH溶液20mL；
所述的混合物加热至160°C；反应6h；
所述的离心速度为16000r/min，时间10min。

[0007] 一种荧光碳量子点在检测TNP的应用。

[0008] 一种荧光碳量子点在细胞成像方面的应用。

[0009] 一种细胞成像试剂，它包括上述的一种荧光碳量子点和叶酸。

[0010] 本发明提供了一种荧光碳量子点，它是由下述方法制备的：将1-2g柠檬酸和2-4g尿素放入反应釜中，加入10-15mL二甲基甲酰胺，混合，封闭反应釜，将混合物加热至150-180°C，反应4-6h后，得到的棕色溶液，冷却到室温，加入50mg/mL的NaOH溶液20-30mL，混合搅拌1min后，离心，收集沉淀，再溶解到水中，离心，重复两次，沉淀物冷冻干燥，得到黑色固体粉末，即荧光碳量子点；
一种碳量子点通过比色法和荧光法来实现对2，4，6-三硝基苯酚（TNP）的双功能检测，荧光碳量子点在紫外光源下呈橙色光发射，荧光碳量子点溶液在与TNP混合后，荧光发生淬灭现象，同时在日光灯下观察溶液由原来的粉红色变为蓝色。结果表明，碳量子点对TNP具有高的灵敏度和选择性，不需要大型仪器，通过裸眼观察或测试其光谱，即可识别检测结果。因此，本发明提供的检测方法具备成本低、合成方法简单、易操作且环境友好的特点。利用碳量子点作为检测探针检测TNP，是一种操作简单、快速定量检测TNP的方法。碳量子点具有良好的荧光性能和水溶性，可用于细胞成像领域。
附图说明

[0011] 图1 （A）TEM图；（B）红外光谱图；（C）紫外与荧光光谱图；（D）不同激发下的荧光发射谱图；图2 碳量子点的X-射线光电子能谱：C1s能谱A）和N1s能谱B)；
图3 （A）碳量子点与不同爆炸物反应的紫外吸收光谱图；（B）日光灯下碳量子点与不同爆炸物反应的图片；
图4 （A）碳量子点与不同浓度的TNP反应后的紫外吸收光谱图；（B）比色图片；
图5 （A）碳量子点与不同爆炸物反应的荧光发射柱状图；插图为紫外灯下碳量子点与不同爆炸物反应后的荧光图片；（B）碳量子点与不同浓度TNP混合的荧光发射光谱，插图为碳量子点的荧光强度与不同浓度TNP（浓度范围：0.001-1μM）的线性关系图；（C）在紫外灯下碳量子点与不同浓度TNP的荧光图片；
图6 不同浓度的碳量子点24h体外细胞存活率；
图7 （A）明场图（左）荧光成像（右）绿光激发；碳量子点与Hela细胞共培养3h的共聚焦显微成像；（B）叶酸-碳量子点与Hela细胞共培养3h的共聚焦显微成像。

[0012] 实施例1 荧光碳量子点的制备及表征 将1g柠檬酸与2g尿素放入到不锈钢反应釜中，再向其中加入10mL二甲基甲酰胺，反应釜封闭后，将混合物加热至160°C，反应进行约6h之后，将得到的棕色溶液冷却到室温，加入
20mL NaOH (50mg/mL)混合搅拌1min后，在约16000转的条件下离心约10min，收集沉淀，再溶解到水中继续离心(16000 r/min，10min)，重复洗涤两次，去除残留的盐、碱等物质，将沉淀冷冻干燥得到黑色固体粉末即碳量子点。

[0013] 利用透射电镜对其形态进行表征，（如图1A）所示，透射电镜图片中碳量子点尺寸较小、分布均匀。（如图1B）为碳量子点粉末的红外光谱图。从图中可看出在3433cm−1，1631cm−1和1394cm−1处显示明显的峰，分别归因于N-H，C=C和C-O的伸缩振动峰；（如图1C）显示激发波长为540nm时，荧光发射峰位于590nm处，此外，图中紫外吸收峰与荧光的激发峰形状相似；（如图1D）为碳量子点的荧光激发依赖行为，激发波长从500nm-580nm，荧光的发射峰都位于590nm左右，根据量子尺寸效应判断所制备的碳量子点尺寸大小较均一。

[0014] XPS谱图对碳量子点表面结构进行表征，（如图2A）可知C1s有三个主要的峰，分别位于284.3、286.1、287.9和289.2eV，归属于C=C，C-N，C-O和C=O基团；（如图2B）可知N1s有两个主要的峰，分别在399.2和400.9eV，归属于N-C-C和N-H基团。

[0015] 实施例2 荧光碳量子点检测TNP（1）选择性
比色检测：在相同条件下对九种硝基芳香化合物进行了检测，其中包括：甲苯
（toluene）、硝基苯（NB）、间硝基甲苯（3-NT）、2，4，6-三硝基苯酚（TNP）、邻硝基苯酚（2-NP）、间硝基苯酚（3-NP）、2，4-二硝基甲苯（DNT）、2，4，6-三硝基甲苯（TNT）和对硝基苯酚（4-NP）。
（如图3A）中显示，碳量子点溶液的紫外吸收光谱在548nm处有吸收峰，加入TNP后，碳量子点吸收峰红移且在605nm出现第二个吸收峰。然而，向溶液中加入等量其他硝基芳香化合物后紫外吸收峰并没有发生明显的变化。（如图3B）中可以看到，加入TNP后，碳量子点溶液由原本的粉红色在几秒内变为蓝色，而其他硝基芳香化合物和碳量子点混合的溶液并没有发生颜色的改变。通过混合溶液颜色的变化可以看出碳量子点对TNP的专一性，通过紫外-可见吸收光谱的测试可以进一步证明碳量子点对TNP具有较好的选择性。

[0016] 荧光检测：同时，测试荧光检测系统的选择性。（如图5A）为碳量子点与不同爆炸物反应的荧光发射柱状图。由图可知，TNP对碳量子点的荧光猝灭最明显，而其他硝基芳香化合物对碳量子点的荧光强度影响较小。可以说明TNP的特异性。（如图5A）中插图可以看到碳量子点与其他硝基芳香化合物混合后在紫外灯下拍摄的荧光照片，只有TNP与碳量子点的混合液荧光强度变暗。

[0017] （2）灵敏度比色检测：先配制10-3M的TNP乙醇溶液作为储备液进行灵敏度的检测，在室温下将所配制的TNP乙醇溶液稀释成浓度为10-9-10-3M的溶液进行实验。首先，在室温下，通过比色法对碳量子点进行灵敏度的测试，150µL的碳量子点溶液中加入150µL的不同浓度的TNP乙醇溶液，使检测探针和分析物按1:1等体积加入混合。通过需要紫外-可见吸收光谱和荧光光谱来探究芳香硝基化合物与碳量子点之间的相互作用。新制备的碳量子点可以直接作为比色探针来检测TNP。通过比色检测之后，在紫外-可见光谱中，碳量子点的吸收峰出现红移现象。如图4A所示，通过裸眼观察，当TNP的浓度大于5×10-5M时，碳量子点溶液的颜色由粉色变为蓝色，并且在605nm处的吸收强度明显增强了；当TNP的浓度小于5×10-5M时，碳量子点溶液的颜色仍为粉色，所以通过裸眼观察，TNP的检测限为5×10-5M。图4B为相应日光灯下拍摄的照片。

[0018] 荧光检测：将样品放置一会，在540nm波长的激发下，进行荧光光谱的测试。在确定碳量子点浓度不变的情况下，碳量子点的荧光猝灭随着TNP的浓度不断增大变得越来越明显（图5B），图5C为不同浓度的TNP与碳量子点混合溶液放置1min后在紫外灯下的照片，可以观察到随着TNP浓度的逐渐增加，碳量子点的荧光强度逐渐弱。图5B中插图为混合溶液的荧光强度与0.001-1μM的TNP溶液的线性关系（R2=0.980），最后TNP的检测限为0.19nM。经过以上的讨论可以证实利用碳量子点溶液通过比色法和荧光法对TNP的检测有着较高的灵敏度。

[0019] 实施例3 细胞荧光成像实验对Hela细胞进行培养，它是生物学与医学研究中使用的一种细胞。之后利用噻唑蓝比色法（MTT法）测试碳量子点的毒性（如图6）。可以观察到将不同浓度（0、10、20、40、50μg/mL）的碳量子点与Hela细胞培养24h，完成培养之后，进行Hela细胞的生存能力测试，其细胞的生存能力均较强，说明碳量子点对细胞的毒性较低，与其他生物探针相比较，碳量子点有着很好的细胞相容性。

[0020] 碳量子点具有较强的橙色荧光、粒子尺寸较小、稳定性高、很好的相容性、毒性低等特点，所以尝试碳量子点溶液应用到细胞成像实验中。碳量子点与Hela细胞培养3h后，细胞内并没有出现明显的橘红色荧光（如图7A）所示，这可能是由于碳量子点表面含有某些基团使其不能进入到细胞体内。于是将叶酸与碳量子点溶液混合后加入培养基中，与Hela细胞共同培养3h后，（如图7B）所示，碳量子点成功的进入到细胞内，并发射红色的荧光。由于细胞表面存在大量的叶酸受体，与叶酸分子有较强的结合力，因此成功地将荧光碳量子点靶向运输到细胞体内进行细胞成像的应用。

[0021] 应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。