通过β-乳球蛋白衍生肽结合益生菌的给药来诱导口服耐受性的方法 |
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| 申请号 | CN201680016474.2 | 申请日 | 2016-03-17 | 公开(公告)号 | CN107427553A | 公开(公告)日 | 2017-12-01 |
| 申请人 | N·V·努特里奇亚; | 发明人 | L·M·J·尼普斯; J·加森; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 益生菌 和β-乳球蛋白衍生肽用于制备用于在受试者中诱导 口服耐受 性、和/或 治疗 、 预防 或降低过敏症 风 险的产品的用途，所述过敏症特别是 牛 乳蛋白 过敏症。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于在受试者中诱导口服耐受性和/或治疗、预防或降低过敏症风险的方法，所述方法包括向所述受试者给予包含益生菌和β-乳球蛋白衍生肽的组合物，所述β-乳球蛋白衍生肽包含对应于SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。 |
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| 说明书全文 | 通过β-乳球蛋白衍生肽结合益生菌的给药来诱导口服耐受性的方法 技术领域背景技术[0002] 最常见的食物过敏症之一——特别是婴儿期和儿童期——是牛乳过敏症(CMA)。膳食蛋白是通过胃肠道呈递给免疫系统，正常反应将是诱发针对摄入的营养物质的致耐受性免疫应答。这种反应称为口服免疫耐受性或口服耐受性。口服免疫耐受性的诱导与婴儿特别相关，婴儿在出生后第一次暴露于膳食蛋白并且必须适应这种情况。如果婴儿中没有建立口服免疫耐受性，则会发生食物过敏症。 [0003] 约2％至3％的婴儿对牛乳蛋白过敏。对于患有对牛乳蛋白的过敏症的婴儿，市售的婴儿配方物包含深度水解的蛋白(深度蛋白水解产物)，或者甚至只有游离氨基酸作为氮源。在这些配方物中，不存在过敏原性蛋白或肽。因此避免暴露于乳蛋白，从而防止临床上表现的过敏反应。这被称为牛乳过敏症的二级预防。然而，一旦将牛乳蛋白重新引入饮食中，婴儿可能再次患有临床上表现的过敏反应。 [0004] 有市售的低过敏原性配方物，其包含具有降低的过敏原性的部分蛋白水解产物(部分水解蛋白)。这些配方的优点在于它们增加了获得对牛乳蛋白或肽的免疫致耐受性反应的可能性，其优点在于日后可在饮食中引入天然蛋白而过敏反应的风险降低。这被称为牛乳蛋白过敏症的一级预防，这些配方物通常用于具有发生过敏症的风险的婴儿。 发明内容[0005] 本发明人发现包含益生菌和β-乳球蛋白衍生肽的组合物在诱导口服耐受性和/或用于治疗和/或预防过敏症(包括降低过敏症发生风险)中令人惊奇地有效，合适地，所述过敏症是食物过敏症，特别是牛乳蛋白过敏症(CMA)，所述β-乳球蛋白衍生肽包含对应于SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。合适地，所述组合物还包含益生元。 [0006] 因此，本发明涉及在受试者中诱导口服耐受性和/或治疗、预防和/或降低发生过敏症的风险的方法，其包括对受试者给予包含益生菌和β-乳球蛋白衍生肽的组合物，所述β-乳球蛋白衍生肽包含对应于SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。合适地，所述组合物还包含益生元。在一个实施方案中，所述方法为用于诱导口服耐受性。在一个实施方案中，所述方法为用于治疗和/或预防过敏症，合适地，所述过敏症是食物过敏症，更合适地，所述过敏症是CMA。 [0007] 本发明还可以表述为益生菌和β-乳球蛋白衍生肽用于制备用于在受试者中诱导口服耐受性和/或治疗、预防和/或降低发生过敏症的风险的组合物的用途，所述β-乳球蛋白衍生肽包含对应于SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。合适地，所述组合物还包含益生元。在一个实施方案中，所述用途是用于制备用于诱导口服耐受性的组合物。在一个实施方案中，所述用途是用于制备用于治疗和/或预防过敏症的组合物，合适地，所述过敏症是食物过敏症，更合适地，所述过敏症是CMA。 [0008] 换言之，本发明涉及用于在受试者中诱导口服耐受性和/或治疗、预防和/或降低发生过敏症的风险的组合物，所述组合物包含益生菌和β-乳球蛋白衍生肽，所述β-乳球蛋白衍生肽包含对应于SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。合适地，所述组合物还包含益生元。换言之，本发明涉及用于在受试者中诱导口服耐受性和/或治疗、预防或降低过敏症风险的包含益生菌和β-乳球蛋白衍生肽的组合物，所述肽包含对应于氨基酸序列SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。合适地，所述组合物还包含益生元。在一个实施方案中，所述用途是用于诱导口服耐受性。在一个实施方案中，所述用途是用于治疗和/或预防过敏症，合适地，所述过敏症是食物过敏症，更合适地，所述过敏症是CMA。 [0009] 本发明还涉及包含益生菌和β-乳球蛋白衍生肽的组合物，所述β-乳球蛋白衍生肽包含对应于SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。 [0010] 本发明还涉及包含第一容器和第二容器的组件试剂盒，所述第一容器包含婴儿营养物，所述第二容器包含β-乳球蛋白衍生肽，所述β-乳球蛋白衍生肽包含对应于SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述婴儿营养物包含益生菌或其中所述组件试剂盒包含第三容器，所述第三容器包含益生菌。 [0011] 在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物或组合物的一个实施方案中，β-乳球蛋白衍生肽包含由跨越SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的13至48位氨基酸的区域的12-30个连续氨基酸组成的氨基酸序列。在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物或组合物的一个实施方案中，β-乳球蛋白衍生肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，任选地在其C-端和/或N-端与1-6个其它氨基酸偶联。在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物或组合物的一个实施方案中，所述组合物还包含益生元。在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物或组合物的一个实施方案中，所述益生元选自：低聚果糖、非消化性糊精、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚阿拉伯糖、低聚阿拉伯半乳糖、低聚葡萄糖、低聚葡甘露糖、低聚半乳甘露糖、低聚甘露糖、壳低聚糖、糖醛酸低聚糖、唾液酸低聚糖和低聚岩藻糖。在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物或组合物的一个实施方案中，所述益生元包含平均聚合度为2-8的短链低聚糖与平均聚合度为10-60的长链低聚糖的混合物。在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物或组合物的一个实施方案中，所述益生元包含低聚半乳糖和/或低聚果糖。在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物或组合物的一个实施方案中，所述益生菌包含双歧杆菌属(Bifidobacteria)、乳杆菌属(Lactobacillus)或链球菌属(Streptococcus)的菌株。在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物或组合物的一个实施方案中，所述益生菌包含选自以下的菌株：短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)。在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物或组合物的一个实施方案中，所述益生菌包含短双歧杆菌和/或长双歧杆菌。在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物或组合物的一个实施方案中，所述组合物包含10-5000μgβ-乳球蛋白衍生肽/克总蛋白。在根据本发明的方法、用途、用于用途的组合物的一个实施方案中，所述过敏症是牛乳蛋白过敏症。 具体实施方式[0012] 本发明涉及用于在受试者中诱导口服耐受性和/或治疗和/或预防过敏症的方法，其中所述方法包括向所述受试者给予组合物，所述组合物包含益生菌和β-乳球蛋白衍生肽，所述β-乳球蛋白衍生肽包含对应于SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。 [0013] 在实验中，使小鼠对完整的乳清蛋白过敏，因此在用完整的乳清蛋白进行皮内激发后小鼠表现出急性过敏症性皮肤反应，即小鼠已变得对乳清蛋白过敏，这也通过乳清特异性IgE的增加而得到证实(数据未显示)。本发明人惊奇地发现，当在乳清蛋白激发之前给予本发明的组合物时，则进一步给予乳清蛋白后对乳清蛋白的过敏反应被显著抑制(或减少)。换言之，给予本发明的组合物诱导了口服耐受性。 [0014] 在本文件及其权利要求中，动词“包含”及其词形变化以其非限制性含义使用，意指包括该单词后面的项目，但不排除未具体提及的项目。另外，通过不定冠词“一”或“一个”提及一个元素时，不排除存在多于一个所述元素的可能性，除非上下文清楚地要求有且只有一个所述元素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。 [0015] 在本发明的上下文中，提及以下氨基酸序列： [0016] [0017] [0018] 组合物 [0019] 在第一方面，本发明涉及包含益生菌和β-乳球蛋白衍生肽的组合物，所述β-乳球蛋白衍生肽包含对应于SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。根据本发明的组合物将用于根据本发明的方法或用途或用于用途的组合物，其包括给予根据本发明的组合物。根据本发明的组合物可以用作药物产品或营养产品。 [0020] 益生菌和β-乳球蛋白衍生肽，以及合适地益生元，以治疗有效量存在。 [0021] 在一个方面，根据本发明的组合物可以用作包含一种或多种药学上可接受的载体材料的药物产品。这样的产品可以在一个或多个剂量单位中包含如下定义的日剂量。剂量单位可以是液体形式或固体形式，其中在后一种情况下，日剂量可由一个或多个固体剂量单位提供，例如在一个或多个胶囊或片剂中。适合用于肠内施用的药物产品可以是固体或液体盖仑制剂。固体盖仑制剂的实例是含有活性成分和常规盖仑载体的片剂、胶囊(例如硬壳或软壳明胶胶囊)、丸剂、小药囊(sachet)、粉剂、颗粒剂等。可以使用任何常规载体材料。载体材料可以是适于口服给药的有机或无机惰性载体材料。合适的载体包括水、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油等。此外，可以根据药物配制的公认实践加入添加剂如调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等。当单独的活性成分在单一组合物中合适地给予时，它们也可在单独的剂量单位中给予。 [0022] 在一个方面，根据本发明的组合物可以用作营养产品，例如作为营养补充剂(例如作为正常饮食的添加剂、作为增强剂)添加到正常饮食中，作为完全营养物或作为适合喂养婴儿的婴儿营养物(例如婴儿配方物或后续配方物)。营养产品合适地包含脂肪、蛋白和碳水化合物。应当理解，营养产品与药物产品的区别在于存在营养物，所述营养物向被给予所述组合物的受试者提供营养，例如营养产品存在蛋白、脂肪、消化性碳水化合物和膳食纤维。营养产品还可含有成分如矿物质、维生素、有机酸和调味剂。虽然术语“营养制品产品(nutraceutical product)”通常用于文献中，但它表示具有药物成分或药物目的的营养产品。因此，根据本发明的营养组合物也可用于营养制品产品中。 [0023] 本发明的组合物通常是肠内组合物，即意欲用于口服给药。合适地，其以液体形式给予。例如，所述组合物可以包含水，其它成分被溶解或悬浮在水中。因此，合适地，所述组合物是液体、或用液体(合适地，用水)复原以获得液体组合物的固体(通常为粉末或片剂)。合适地，所述液体组合物的粘度小于100mPa.s，更合适地小于60mPa.s，更合适地小于 35mPa.s，甚至更合适地小于6mPa.s，如在20℃下在100s-1剪切率下在布氏粘度计中测量的。 [0024] 所述组合物通常包含脂质级分、蛋白组分和消化性碳水化合物组分。当所述组合物为液体形式时，合适地，其热量含量包含60-85kcal/100ml液体，更合适地60-70kcal/100ml液体。合适地，本发明组合物的克分子渗透压浓度合适地为150-420mOsmol/l，更合适地为260-360mOsmol/l。 [0025] 合适地，脂质组分提供2.9-6g脂质/100kcal的所述组合物，合适地，蛋白组分提供1.8-5.5g/100kcal的所述组合物(合适地，1.8-2.5g/100kcal的所述组合物)，合适地，消化性碳水化合物组分提供9-14g/100kcal的所述组合物。总卡路里的量是由来源于蛋白、脂质、消化性碳水化合物和非消化性低聚糖的卡路里的总和确定。 [0026] 蛋白 [0027] 根据本发明的组合物包含蛋白级分，其至少包含上述β-乳球蛋白衍生肽。β-乳球蛋白是牛和羊乳中两种主要的乳清蛋白之一，但在人乳中未发现。通常在牛乳蛋白过敏症的情况下，β-乳球蛋白是过敏原。 [0028] 根据本发明的β-乳球蛋白衍生肽是一种肽，其包含对应于SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的至少8个(合适地10-50个氨基酸，更合适地12-30个，更合适地14-25个，更合适地16-20个，最合适地18个)连续氨基酸的氨基酸序列。 [0029] 在本发明的上下文中，“对应于”β-乳球蛋白蛋白质的氨基酸序列允许在氨基酸序列中有最多三个(更合适地，最多两个，甚至更合适地，一个)氨基酸置换，合适地，所述置换是保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。合适的保守性氨基酸置换基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的置换变体是其中所公开序列中的至少一个残基已被移除并且一个不同残基插入其位置的那些。合适地，氨基酸改变是保守性的。每个天然存在的氨基酸的合适的保守性置换如下：Ala至Ser；Arg至Lys；Asn至Gln或His；Asp至Glu；Cys至Ser或Ala；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Pro；His至Asn或Gln；Ile至Leu或Val；Leu至Ile或Val；Lys至Arg；Gln至Glu；Met至Leu或Ile；Phe至Met、Leu或Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp或Phe；和Val至Ile或Leu。特别地，本发明涵盖了SEQ ID No.1的45位氨基酸由Glu(E)至Gln(Q)的置换。SEQ ID No.1表示β-乳球蛋白蛋白质的B变体，而45位氨基酸处由Glu至Gln的置换得到D变体，它们均适用于本发明的上下文中。在一个实施方案中，不允许在SEQ ID No.1的合适的氨基酸序列区域内的修饰(包括除45位氨基酸由Glu至Gln的置换以外的保守性氨基酸置换在内)。在一个实施方案中，不允许在合适的氨基酸序列区域中的修饰(包括保守氨基酸置换在内)。 [0030] 合适地，所述氨基酸序列含有来自跨越β-乳球蛋白蛋白质的3至117位氨基酸(更合适地10至63位氨基酸，最合适地13至48位氨基酸)的区域的保守性氨基酸。 [0031] 合适地，所述肽的分子量最多为5kDa，特别地0.1-4.9kDa，合适地0.5-4.5kDa，更合适地2-4kDa，最合适地约2.4kDa。在一个合适的实施方案中，β-乳球蛋白衍生肽由12至30个氨基酸组成，合适地，由14至25个氨基酸组成，更合适地，由16至20个氨基酸组成，最合适地，由18个氨基酸组成。适合的β-乳球蛋白衍生肽包含由以下序列表示的氨基酸序列(最适合地，由以下序列表示的氨基酸序列组成)：SEQ ID No.2(SEQ ID No.1的13至30位氨基酸)，SEQ ID No.3(SEQ ID No.1的19至36位氨基酸)，SEQ ID No.4(SEQ ID No.1的25至42位氨基酸)和SEQ ID No.5(SEQ ID No.1的31至48位氨基酸)，其中SEQ ID No.5的15位氨基酸(对应于SEQ ID No.1的45位氨基酸)可以被Gln(Q)置换。 [0032] β-乳球蛋白衍生肽可以在对应于β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列的C-端和/或N-端包含其它氨基酸。换言之，对应于β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列任选地在其C-端和/或N-端与其它氨基酸偶联。通常，可存在1-6个其它氨基酸，合适地1-5个，更合适地1-4个，最合适地1-3个其它氨基酸，其它氨基酸可以是任何氨基酸(的组合)。在一个实施方案中，在β-乳球蛋白蛋白质的至少8个连续氨基酸的C-端和/或N-端不存在其它氨基酸。合适地，β-乳球蛋白衍生肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、和SEQ ID No.5，其中SEQ ID No.5的15位氨基酸被Gln(Q)置换。最合适地，β-乳球蛋白衍生肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。 [0033] 所述组合物可以包含多于一种不同的β-乳球蛋白衍生肽，例如2、3、4、5或甚至更多种，例如最多达2种或最多达10种不同的β-乳球蛋白衍生肽。合适地，所述组合物包含1-10种不同的β-乳球蛋白衍生肽，更合适地，2-5种不同的β-乳球蛋白衍生肽，最合适地，4种不同的β-乳球蛋白衍生肽。本文中，每种不同的β-乳球蛋白衍生肽包含SEQ ID No.1表示的β-乳球蛋白蛋白质的不同氨基酸序列。所述不同可能在于来自β-乳球蛋白序列的氨基酸的数量和/或β-乳球蛋白蛋白质序列内的氨基酸序列的位置，合适地，在于β-乳球蛋白蛋白质内的氨基酸序列的位置。 [0034] 多于一种不同的β-乳球蛋白衍生肽的混合物合适地包含至少一种，更合适地2-4种，甚至更合适地3或4种，最合适地所有4种β-乳球蛋白衍生肽，其由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。 [0035] 根据本发明，β-乳球蛋白衍生肽可以为化学合成，如本领域中已知的，或在由经遗传修饰的宿主(例如大肠杆菌菌株或乳杆菌菌株)表达后分离的。或者，从乳清蛋白或β-乳球蛋白水解产物中分离和纯化所述肽。 [0036] 除了β-乳球蛋白衍生肽之外，根据本发明的组合物还可以包含另外的蛋白材料，尽管β-乳球蛋白衍生肽也可以是唯一的蛋白来源。在本发明的上下文中，额外的“蛋白”或“蛋白材料”包括蛋白、肽、游离氨基酸以及部分或深度水解的蛋白。通常，深度的蛋白水解产物的游离氨基酸含量高于10g/100g蛋白。合适地，本发明中任何额外的深度水解蛋白涉及已经水解并且小于3wt％的肽的尺寸大于5kDa的蛋白。通常，通过蛋白酶水解然后通过在截留分子量2-5kDa的膜上过滤的超滤步骤来获得深度水解的蛋白。合适地，这些深度的蛋白水解产物几乎不包含尺寸大于1.5kDa的肽。 [0037] 合适地，所述另外的蛋白材料——除β-乳球蛋白衍生肽之外——不会引起过敏反应，例如游离氨基酸、部分水解的蛋白和/或深度水解的蛋白。作为另外的蛋白组分，即除β-乳球蛋白衍生肽之外的蛋白组分，根据本发明的组合物合适地包含游离氨基酸、部分水解的乳清蛋白和/或深度水解的乳清蛋白。 [0038] 在一些实施方案中，根据本发明的组合物不含有完整的牛乳蛋白。所述组合物可以包含完整形式、部分水解形式和/或深度水解形式的选自以下的另外的蛋白组分：游离氨基酸，深度水解的乳清蛋白和来自其它来源(例如大豆、豌豆、水稻、胶原等)的蛋白。 [0039] 本发明组合物合适地含有至少50wt％的来自非人乳的蛋白组分，更合适地至少90wt％，基于总蛋白的干重计。 [0040] 本发明的组合物合适地含有4-25％，更合适地5-20％，更合适地7-16％，最合适地7-12％的蛋白，基于总卡路里计。本发明的组合物为液体形式时，合适地含有0.5-6.0g，更合适地含有0.8-3.0g，甚至更合适地1.0-2.5g蛋白/100ml。本发明的组合物合适地包含至少7.0wt％，更合适地至少8.0wt％，最合适地至少9或至少10wt％的蛋白，基于总组合物的干重计。合适地，本发明的组合物包含最多40wt％，更合适地最多15wt％，合适地最多 20wt％的蛋白，基于总组合物的干重计。 [0041] 在本发明的一个合适的实施方案中，本发明的组合物包含至少10μg，更合适地至少30μg，合适地至少50μg，合适地10-5000μg，更合适地20-2000μg，更合适地30-500μg，特别合适地50-250μgβ-乳球蛋白衍生肽/克总蛋白。 [0042] 碳水化合物 [0043] 根据本发明的组合物可以包含碳水化合物级分，其可以包括益生元。在本发明的上下文中，术语“益生元”是指一种或多种非消化性低聚糖。有利地，非消化性低聚糖是水溶性的(根据L.Prosky et al,J.Assoc.Anal.Chem 71:1017-1023,1988中公开的方法)。非消化性低聚糖不是通过存在于人上消化道(小肠和胃)中的消化酶的作用在肠中消化，而是由人肠道微生物丛发酵。 [0044] 合适的非消化性低聚糖选自低聚果糖、非消化性糊精、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚阿拉伯糖、低聚阿拉伯半乳糖、低聚葡萄糖、低聚葡甘露糖、低聚半乳甘露糖、低聚甘露糖、壳低聚糖、糖醛酸低聚糖、唾液酸低聚糖和低聚岩藻糖。尤其合适的非消化性低聚糖是低聚果糖和/或低聚半乳糖。合适地，低聚糖的聚合度为2-200。在一个实施方案中，DP为2-200的低聚果糖和多聚果糖(及其混合物)是本发明上下文中的合适的益生元。 [0045] 一种合适类型的低聚糖是短链低聚糖，其平均聚合度小于10，合适地最多为8，合适地为2-7。短链低聚糖合适地包含低聚半乳糖和/或低聚果糖。在一个实施方案中，所述组合物包含低聚半乳糖，特别是β-低聚半乳糖，更特别是反式低聚半乳糖。合适地，低聚半乳糖的平均聚合度为2-8，即为本发明上下文中的短链低聚糖。 [0046] 合适地，所述组合物包含短链低聚果糖和/或短链低聚半乳糖，合适地，至少包含短链低聚果糖。(反式)低聚半乳糖例如可以商品名 (Borculo Domo Ingredients，Zwolle，荷兰)、Bimuno(Clasado)、Cup-oligo(Nissin Sugar)和Oligomate55(Yakult)获得。低聚果糖可以是平均DP在上述(亚)范围内的菊粉水解产物；这样的FOS产品例如可商购获得，如Raftilose P95(Orafti)或Cosucra。 [0047] 另一种合适类型的低聚糖是长链低聚果糖，其平均聚合度在10以上，通常为10-100，合适地为15-50，最适合地在20以上。特定类型的长链低聚果糖是菊粉，如Raftilin HP。 [0048] 本发明的组合物可以包含一种类型的非消化性低聚糖或者两种或更多种类型的非消化性低聚糖的混合物，合适地，其包含两种或更多种非消化性低聚糖的混合物，最合适地包含两种非消化性低聚糖的混合物。在益生元包含两种不同低聚糖的混合物或由两种不同低聚糖的混合物组成的情况下，一种低聚糖可以是如上定义的短链，一种低聚糖可以是如上所定义的长链。合适地，短链低聚糖和长链低聚糖以1:99-99:1的短链与长链重量比存在，更合适地1:1-99:1，更合适地4:1-97:3，甚至更合适地5:1-95:5，甚至更合适地7:1-95:5，甚至更合适地8:1-10:1，最合适地约9:1。 [0049] 在一个实施方案中，所述益生元包括低聚果糖和/或低聚半乳糖的混合物。合适的混合物包括长链低聚果糖与短链低聚果糖或短链低聚半乳糖的混合物，最合适地，长链低聚果糖与短链低聚果糖的混合物。 [0050] 在一个实施方案中，所述益生元包含低聚果糖的混合物，最合适地，短链低聚果糖(sc-FOS)和长链低聚果糖(lc-FOS)的混合物。这些低聚果糖合适地占所述益生元的至少80wt％，更合适地至少90wt％。在一个最合适的实施方案中，所述益生元级分由sc-FOS和lc-FOS的混合物组成。 [0051] 合适地，所述益生元可能会以任何合适的浓度存在于所述组合物中。本发明的组合物合适地包含0.05-20wt％的所述非消化性低聚糖，更合适地0.5-15wt％，甚至更合适地1-10wt％最合适地，2-10wt％，基于本发明的组合物的干重计。当本发明的组合物为液体形式时，其合适地包含0.01-2.5wt％的不消化性低聚糖，更合适地0.05-1.5wt％，甚至更合适地0.25-1.5wt％，基于100ml计。 [0052] 根据本发明的组合物可以包含另外的碳水化合物，合适地，本发明的组合物包含消化性碳水化合物。通常，使用本领域中已知的适合用于婴儿营养组合物的消化性碳水化合物。合适地，消化性碳水化合物选自消化性多糖(例如淀粉、麦芽糊精)、消化性单糖(例如葡萄糖、果糖)和消化性二糖(例如乳糖、蔗糖)。特别合适的是乳糖和/或麦芽糊精。在一个实施方案中，所述组合物不包含乳糖。 [0053] 所述消化性碳水化合物组分合适地包含至少60wt％的乳糖，基于总消化性碳水化合物计，更合适地至少75wt％，甚至更合适地至少90wt％的乳糖，基于总消化性碳水化合物计。 [0054] 脂质 [0055] 根据本发明的组合物合适地包含脂质组分，合适地，本领域中已知的适于婴儿营养的脂质组分。本发明组合物的脂质组分合适地提供2.9-6.0g，更合适地4至6g/100kcal的所述组合物。当所述组合物为液体形式时，其合适地包含2.1-6.5g脂质/100ml，更合适地3.0-4.0g/100ml。基于干重计，本发明的婴儿配方物或后续配方物合适地包含12.5-40wt％的脂质，更合适地19至30wt％。 [0056] 所述脂质组分通常包含必需脂肪酸α-亚麻酸(ALA)、亚油酸(LA)和合适的长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)。LC-PUFA、LA和/或ALA可能以游离脂肪酸形式、以甘油三酯形式、以甘油二酯形式、以甘油一酯形式、以磷脂形式或以上述的一种或多种的混合物形式提供。合适地，本发明的组合物含有选自以下的至少一种，合适地，至少两种脂质来源：油菜籽油(如菜籽油、低芥酸菜籽油和芥花油(canola oil))、高油酸向日葵油、高油酸红花油、橄榄油、海洋油(marine oil)、微生物油、椰子油、棕榈仁油和乳脂。 [0057] 益生菌 [0058] 根据本发明的组合物包含益生菌。在本发明的上下文中，术语“益生菌”是指益生菌的菌株。益生菌是本领域中已知的。合适地，益生菌是未经遗传修饰的。 [0059] 合适的益生菌包括以下属的细菌：双歧杆菌属(例如短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌)、乳杆菌属(例如嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、约氏乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌)和链球菌(例如嗜热链球菌)。短双歧杆菌和长双歧杆菌是特别合适的益生菌。 [0060] 最适合地，所述益生菌包含短双歧杆菌的菌株。合适地，所述短双歧杆菌的16S rRNA序列与短双歧杆菌ATCC 15700的模式菌株的16S rRNA序列具有至少95％的同一性，更合适地，至少97％的同一性(Stackebrandt&Goebel,1994,Int.J.Syst.Bacteriol.44:846-849)。合适的短双歧杆菌菌株可从健康人乳喂养的婴儿的粪便中分离。通常，这些菌株可商购自乳酸菌的生产者，但也可以直接从粪便中分离、鉴定、表征和生产。根据一个实施方案，本发明的组合物含有选自以下的短双歧杆菌：短双歧杆菌Bb-03(Rhodia/Danisco)、短双歧杆菌M-16V(Morinaga)、短双歧杆菌R0070(Institute Rosell，Lallemand)、短双歧杆菌BR03(Probiotical)、短双歧杆菌BR92(Cell Biotech)、DSM20091、LMG 11613、YIT4065、FERM BP-6223和CNCM I-2219。最适合地，所述短双歧杆菌选自短双歧杆菌M-16V和短双歧杆菌CNCM I-2219，最合适地短双歧杆菌M-16V。短双歧杆菌I-2219公开于WO2004/093899中并由Compagnie Gervais Danone于1999年5月31日保藏于法国巴黎巴斯德研究所(Institute Pasteur)的国家微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganisms)。短双歧杆菌M-16V保藏为BCCM/LMG23729和可商购自Morinaga Milk Industry Co.,Ltd.。 [0061] 益生元和益生菌的组合也称为“合生素(synbiotic)”。 [0062] 在本发明的上下文中，益生菌可能以任何合适的浓度，合适地以治疗有效量或“对于治疗有效的量”存在于组合物中。合适地，所述益生菌以102-1013cfu/g组合物的干重，合适地以105-1012cfu/g，最合适地以107-1010cfu/g的量包含在本发明的组合物中。 [0063] 应用 [0064] 根据本发明的组合物用于在受试者中诱导口服耐受性和/或治疗、预防和/或降低发生过敏症的风险。所述过敏症可能是牛乳蛋白过敏症，合适地，对乳清蛋白的过敏症。过敏症的(预防性)治疗优选地包括降低与摄入过敏原相关的(急性)症状，特别是其中过敏原是牛乳蛋白。合适地，当再次摄入过敏原时，(急性)症状减轻。合适地，过敏原是牛乳蛋白。在本发明的上下文中，术语“治疗”应理解为意指在部分或完全治愈过敏症和/或减轻或改善过敏症症状方面治疗性治疗人或动物患者，合适地人，特别是婴儿。合适地，所述治疗是口服免疫治疗。在本发明的上下文中，“预防”也可以称为“降低发生的风险”，并且应理解为是指人或动物患者(合适地是人，特别是婴儿)的预防性治疗。 [0065] 根据本发明的组合物可以用作营养组合物、营养疗法、营养支持物、作为医疗食品、作为用于特殊医疗目的的食物或作为营养补充剂。本发明的组合物合适地为肠内组合物。将所述组合物给予或意欲给予需要其的受试者，特别是儿童和婴儿，包括学步儿(toddle)，合适地，最多达6岁的儿童，合适地，通常为0至36个月龄的婴儿，合适地，0-12个月龄，最合适地，0-6个月龄。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物是婴儿配方物、后续配方物或成长奶，最合适地，其是婴儿配方物。 [0066] 在一个具体的实施方案中，所述组合物用于给予处于发生过敏症的风险或患有过敏症(特别是牛乳蛋白过敏症)的受试者，特别是婴儿。已知处于发生过敏症的风险的婴儿包括父母中至少一位患有或已经患有特应性疾病(例如湿疹)和/或过敏症(最特别是CMA)的婴儿。 [0067] 本发明的组合物合适地以0.01mg-1gβ-乳球蛋白衍生肽的日剂量给予，更合适地，0.1-100mg，甚至更合适地，0.5-5mg，最合适地，1-2.5mg。 [0068] 在另一方面，本发明还涉及包含以下两个或三个不同容器和使用说明书的组件试剂盒或由以下两个或三个不同容器和使用说明书组成的组件试剂盒：包含婴儿营养物的第一容器、包含如上文定义的β-乳球蛋白衍生肽的第二容器和任选地包含如上文定义的益生菌的第三容器。或者，所述益生菌可以包含在第一容器中。 [0069] 婴儿营养物合适地是本领域中已知的婴儿配方物、后续配方物或成长奶。最合适地，所述婴幼儿营养物是专门针对患过敏症的婴儿和/或处于发生过敏症的风险的婴儿，特别地，其中所述过敏症是CMA。这种过敏症配方物是本领域中已知的。婴儿营养物也可以称为如上文定义的根据本发明的组合物，尽管不包含β-乳球蛋白衍生肽，并且任选地不包含益生菌。 [0070] 婴儿营养物可以包含或可以不包含如上文定义的益生菌。如果婴儿营养物不包含益生菌，则所述组件试剂盒包含含有益生菌的第三容器。第三容器通常为小袋(sachet)或粘袋(stickpack)的形式，并且合适地包含由益生菌和可接受的载体(通常为乳糖)组成的粉末。如果婴儿营养物含有益生菌，则所述试剂盒可限于第一和第二容器。第二容器通常为小袋或粘袋，并合适地包含由β-乳球蛋白衍生肽和可接受的载体(通常为乳糖)组成的粉末。使用说明书方便地指示用户以适当的方式合并两个或三个容器的内容物，并将所得混合物用液体(通常为水)复原，以获得即用型液体组合物。 [0073] 图2显示了实施例1的过敏性休克评分。测试组为：1＝阴性对照；2＝阳性对照；3＝肽饮食组；4＝合生素饮食组；5＝肽+合生素饮食组。 [0074] 图3示出了实施例3的T细胞亚群(subset)分析结果。通过流式细胞术对从小肠固有层(SI-LP)分离的淋巴细胞的Th1和Th2表型进行分析。测试组为：1＝阴性对照；2＝阳性对照；3＝肽饮食组；4＝合生素饮食组；5＝肽+合生素饮食组。饲喂合生素饮食的测试组用实心灰色柱显示。对于每个测试组，示出具有活化的Th1表型的CD4+细胞(图A)或具有活化的Th2表型(图B)的CD4+细胞的百分数，还示出个体的CD4+群体中的Th1/Th2的比率(图C)。在n＝4的阴性对照组和n＝6-8的所有其他组中，数据表示为平均值±SEM。对于选定的组，*P< 0.05，**P<0.01，如用ANOVA随后用Bonferroni事后检验分析的。 [0075] 图4显示了实施例3的离体脾细胞细胞因子产生的结果。测试组是：1＝阴性对照；2＝阳性对照；3＝肽饮食组；4＝合生素饮食组；5＝肽+合生素饮食组。饲喂合生素饮食的测试组用实心灰色柱显示。测试的细胞因子是：IL-13(图A)、IL-10(图B)、IL-5(图C)、IL-17A(图D)和IFN-γ(图E)。在n＝4的PBS/CT组和n＝6-8的所有其他组中，数据表示为平均值±SEM。对于选定的组，*P<0.05，**P<0.01，如用Kruskal-Wallis非参数检验随后用Dunn事后检验分析的。 [0076] 图5显示了实施例4的皮肤反应(耳肿胀)结果。测试组是：1＝阴性对照；2＝阳性对照；3＝肽饮食组(实心灰色柱)；4＝益生菌饮食组(斜条纹柱(diagnonally striped bar))；5＝肽+益生菌饮食组(斜条纹柱及灰色背景)。在n＝6-8的所有其他组中，数据表示为平均值±SEM。对于选定的组，****P<0.0001，**P<0.01，如用ANOVA随后用Dunnette事后检验分析的。 [0077] 实施例 [0078] 实施例1 [0079] 材料与方法 [0080] 肽：β-乳球蛋白的18个氨基酸(AA)长度的肽是由JPT Peptide Technologies(德国柏林)以合成方法生产的。合成的肽含有12-AA-长度的重叠，其序列跨越β-乳球蛋白的B变体。四种肽是此前在由Meulenbroek等人(Pediatr.Allergy Immunol.2013:7:656-664)用人T细胞系进行的测定中筛选的，并且基于它们的T细胞反应性进行选择以在动物模型中进一步测试。在动物实验之前，将肽溶解于PBS中，制备所有四种肽的混合物，其中每种肽的浓度为0.08mg/ml(“PepMix”)。肽序列在表1中给出。 [0081] 表1：肽序列 [0082] [0083] 饮食：半纯化的不含牛乳蛋白的标准鼠粮(mouse chow)基于AIN-93G食谱(对照饮食)组成，并补充合生素(合生素饮食)(Research Diet Services，Wijk bij Duurstede，荷兰)。合生素补充剂由1wt％的非消化性短链(sc-)和长链(lc-)低聚果糖(FOS)(分别为Raftilose P95(Orafti)和Raftiline HP)(scFOS/lcFOS的比率＝9:1)和2wt％的2×109CFU/g短双歧杆菌M-16V(Morinaga Milk Industry Co.,Ltd，东京，日本)组成。通过饮食混合合生素成分，将混合物压成小球(pellet)。饮食在使用前储存在-4℃。 [0084] 动物：三周龄无病原体的雌性C3H/HeOuJ小鼠购自查尔斯河实验室(苏尔茨费尔德，德国)，并以不含牛乳蛋白的标准鼠粮(AIN-93G soy，Research Diet Services)供养。小鼠被安置在乌得勒支大学的动物设施中。动物护理和使用符合荷兰动物实验委员会的指导方针。 [0085] 研究方案：为了研究合成肽与合生素饮食的致耐受性的特性，如Van Esch等人描述的使用牛乳过敏症的小鼠模型(Pediatr Allergy Immunol 2011；22:820-826)。在致敏之前(每天；从第-7天到第-2天)，使小鼠口服暴露(使用钝的针)于0.5ml的PepMix或磷酸盐缓冲盐水(PBS，Lonza，Walkerville，MD，美国)。在同一周(从第-9天到第0天)给小鼠喂食对照饮食或合生素饮食，随意获取。接着，在第0、7、14、21和28天，通过口服20mg乳清蛋白(DMV International，Veghel，荷兰)来使小鼠致敏，所述乳清蛋白是在0.5ml PBS中均质化并与10μg作为佐剂的霍乱毒素(CT；List Biological Laboratories,Inc.California，美国)混合。非致敏小鼠仅接受溶于0.5ml PBS中的10μg霍乱毒素。表2总结了五个测试组。 [0086] 最后一次致敏后5天，对小鼠进行皮内乳清激发(将溶于20μL PBS中的10μg乳清蛋白注入耳廓内)并记录急性过敏性皮肤反应。在皮内激发之前或皮内激发后1h使用数字千分尺(Mitutoyo，Veenendaal，荷兰)测量耳厚度，重复两次。过敏原特异性耳肿胀是1h时的平均耳厚度与平均基础耳厚度的差(Δ＝1h时的耳厚度–基础耳厚度)，以微米表示。局部注射导致的耳肿胀反映在非致敏小鼠的“Δ耳肿胀”中(组1)。根据如Van Esch等人(Pediatr Allergy Immunol 2011；22:820-826)此前所述的表格，在耳朵肿胀后，接着监测和评分临床症状，例如过敏性休克。 [0087] 表2.不同组中的干预 [0088] [0089] 统计分析：使用GraphPad Prism 6.0c软件进行所有的统计分析。用单因素ANOVA和事后Bonferroni多项比较检验分析数据。由于数据的非参数性质，使用Kruskal-Wallis检验来分析过敏性休克评分。所有数据表示为每组5-8只动物的平均值±SEM。P<0.05被认为具有统计学显著性。 [0090] 结果 [0091] 图1中总结了皮肤反应结果，图2中是过敏性休克评分的结果。致敏但未经治疗的动物(组2)与未致敏的动物(组1)相比发生显著更高的过敏反应。将动物预先暴露于致耐受性肽与含有合生素的饮食的混合物(组5)后，过敏反应显著降低。肽混合物的治疗(组3)和合生素饮食的治疗(组4)在单独施用时不足以降低过敏反应，只有组合暴露被证明为有效的(组5)。此外，致敏动物在皮内注射过敏原后20-40min发生严重的过敏性休克症状。然而，与非致敏对照(组1)相比，仅组合的肽-合生素(组5)暴露阻止发生显著更高的过敏性休克症状。与组1相比，组2、3和4的过敏性休克评分显著增加。 [0092] 重复上述实验，除了用1wt％的scGOS/lcFOS比例＝9：1的sc-低聚半乳糖(GOS)和lc-FOS(分别为 和Raftiline HP)替换1wt％的sc-FOS/lc-FOS用于饲喂动物的合生素。该实验的结果表明，与对照相比，用该合生素和致耐受性肽的混合物组合预暴露于动物还降低了对皮内乳清激发的过敏反应。 [0093] 实施例2 [0094] 用于处于牛乳蛋白过敏症风险的婴儿或对牛乳蛋白过敏的婴儿的婴儿配方物：能量密度：0.6-0.77kcal/ml。蛋白以游离氨基酸和本发明的β-乳球蛋白衍生肽的形式存在。每g蛋白中存在如实施例1中测试的约100μg肽混合物。其他特征见表3。 [0095] 表3：营养信息 [0096] 每100ml* 能量(kJ) 293 能量(kcal) 70 蛋白(g) 1.9(11en％) 碳水化合物(g) 7.9(45en％) 脂质(g) 3.4(44en％) -LA(g) 0.6 -ALA(mg) 60 -AA(mg) 12 -DHA(mg) 7 实施例1的预混物(g) 190 短双歧杆菌 2×107cfu [0097] *或每14.7g粉末在水中复原至总共100ml [0098] 所述组合物还包含对婴儿配方物规定的矿物质、维生素，克分子渗透压浓度为324mOsm/L。 [0099] 实施例3 [0100] 材料与方法 [0101] 肽、饮食、动物和治疗方案：同实施例1。 [0102] b组织分离细胞：淋巴细胞是从脾、肠系膜淋巴结(MLN)和小肠固有层中分离。将脾脏和MLN通过70μm细胞滤网(strainer)粉碎。将脾细胞悬液孵育5min。在冰上用裂解缓冲液去除红细胞。将脾细胞和MLN细胞用补充有10％FCS和青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的RPMI 1640提取。为了分离固有层细胞，去除整个小肠，清除派伊尔淋巴集结(PP)，在冷PBS中洗涤，纵向打开，切成0.5cm片段。然后将样品用补充有15μM HEPES(Gibco，Life Technologies，Carlsbad，CA，美国)的Hank平衡盐溶液(HBSS；Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，CA，美国)(pH＝7.2)洗涤，然后用补充有15μM HEPES、5μM Na2-EDTA、10％FCS和青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的HBSS(pH＝7.2)孵育4×15min。然后将片段在补充有5％FCS和青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的RPMI 1640中洗涤，并用含有RPMI 1640、5％FCS、青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)和0.25mg/mL VIII型胶原酶(Sigma-Aldrich)的酶溶液孵育2×45min。为了收集小肠固有层细胞，在每次孵育后将片段涡旋10s并倒至70μm细胞滤网上。将细胞洗涤一次并用于流式细胞术。 [0103] T细胞亚群的流式细胞术分析：通过流式细胞术进行T细胞亚群的表型表征。将细胞重悬于PBS/1％BSA中，并用抗小鼠CD16/CD32(Mouse BD Fc Block；BD Pharmingen，San Jose，CA，美国)孵育15min。为确定Th1/Th2子集，将细胞用CD4-PerCp-Cy5.5、CD69-APC、CXCR3-PE(eBiosciences，San Diego，CA，美国)和T1ST2-FITC(MD Biosciences，St.Paul，MN，美国)进行细胞外染色。用染色细胞外标记物后，将细胞用可固定的活力染料AlexaFluor780(eBioscience)染色。用BD FACSCanto II流式细胞仪(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，美国)收集结果，并用FlowLogic软件(Inivai Technologies，Mentone，VIC，Australia)进行分析。 [0104] 体外再刺激测定和细胞因子水平：处死后，取出脾并获得单细胞悬液。然后将脾细5 胞(6×10个细胞)用培养基或500μg/mL乳清蛋白在37℃，5％CO2下培养。孵育5天后，收集上清液并储存在-20℃直到进一步分析。通过流式小珠阵列(Cytometric Bead Array，CBA)Flex Set测定(BD Biosciences)根据生厂商的说明书对IL-5、IL-13、IL-10、IL-17A和IFN-γ进行细胞因子定量。用BD FACSCanto II流式细胞仪分析小珠，并在FCAP v.3.0软件(Becton Dickinson)中获得结果。 [0105] 统计分析：所有的统计分析使用用于Macintosh的GraphPad Prism 6.0c软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)进行。分析所有数据的正态性和方差齐性(equality of variance)。如果可能，对选定的组(7组预先选择的比较)使用单因素ANOVA，随后进行Bonferroni多重比较事后检验。当数据非正态分布时，如在细胞因子水平的情况下，它首先进行LOG变换并再次测试。如果LOG变换没有改善正态性，那么对选定的组和7组预先选择的比较使用非参数Kruskal-Wallis检验，接着使用Dunn事后检验。所有数据表示为每组4-8只动物的平均值±SEM。P<0.05被认为具有统计学显著性。 [0106] 结果 [0107] 为了研究肠内局部作用，从小肠中分离固有层淋巴细胞(SI-LP)，并通过流式细胞术分析不同的T细胞亚群。与过敏症影响Th1和Th2淋巴细胞之间的平衡使平衡向Th2环境偏移(Cox，HE，J Pediatr Gastroenterol Nutr 2008；47Suppl 2，S45-48)的例子一致，观察到患过敏症的小鼠显示出激活的Th1细胞数量显著降低，同时活化的Th2细胞数量似乎增加(图3)。结果是，在患过敏症的对照小鼠(组2)中，活化的Th1/Th2细胞的比率向有利于Th2的方向转变，而用肽和合生素(组5)的提前饲喂阻止了这种转变。仅给小鼠饲喂合生元补充的饮食(组4)趋向于保护Th1/Th2平衡，但相比与肽的组合较不明显，这表明合生元在抗原呈递细胞呈递肽的过程中确保有利的环境。 [0108] 为了研究预防性治疗是否影响全身腔室(systemic compartment)中的细胞的功能，口服激发后18h收集治疗组的脾，将脾淋巴细胞用过敏原离体刺激5天，以确定其产生细胞因子的能力。图4中显示的结果表明，脾细胞的功能受到预先暴露于富含肽和合生素的饮食的组合的影响(组5)。通过测定过敏症相关的Th2细胞因子(IL-13、IL-5、IL-10)以及为-(IFN-γ)和Th17-相关细胞因子(IL-17A)来评估功能。值得注意的是，患过敏症的对照的细胞(组2)显著产生了所有这些细胞因子；不仅有Th2相关细胞因子。然而，与单独的肽混合物(组3)相比，用肽混合物和合生素的组合处理的动物的细胞(组5)趋向于诱导较少的IL-17A、IL-10和IL-13。 [0109] 这些结果表明，组合的暴露于肽混合物和合生素降低过敏原诱导的细胞因子的产生，并防止肠固有层中Th1/Th2平衡的不利的转变。 [0110] 实施例4 [0111] 材料与方法 [0112] 肽：同实施例1，除了在动物实验之前，将肽溶解在PBS中并制备所有四种肽的混合物，其中每种肽的浓度是0.8mg/mL(“PepMix”) [0113] 动物：同实施例1。 [0114] 统计分析：统计分析使用用于Macintosh的GraphPad Prism 6.0c软件进行(GraphPad Software，San Diego，CA，美国)。数据用单因素ANOVA和事后Dunnett多重比较检验进行分析。数据表示为每组6-8只动物的平均值±SEM。P<0.05被认为具有统计学显著性。 [0115] 饮食：半纯化的不含牛乳蛋白的标准鼠粮基于AIN-93G食谱(对照饮食)组成，并补充2wt％2×109CFU/g短双歧杆菌M-16V(Morinaga Milk Industry Co.,Ltd，东京，日本)(益生菌饮食)。通过饮食混合益生菌成分，将混合物压成小丸。在使用前将饮食储存在-4℃。 [0116] 研究方案：在致敏前使小鼠口服暴露于(使用钝针)0.5mL的PepMix或磷酸盐缓冲盐水(PBS，Lonza，Walkerville，MD，美国)中(每日；从第-7天至第-2天)。在同一周(从第-9天到第0天)给小鼠喂食对照饮食或益生菌饮食，随意获取。接着，在第0、7、14、21和28天，通过口服20mg乳清蛋白(DMV International，Veghel，荷兰)来使小鼠致敏，所述乳清蛋白是在0.5ml PBS中均质化并与10μg作为佐剂的霍乱毒素(CT；List Biological Laboratories,Inc.California，美国)混合。非致敏小鼠仅接受溶解在0.5ml PBS中的10μg霍乱毒素。表3总结了五个测试组。 [0117] 最后一次致敏后5天，对小鼠进行皮内乳清激发(将溶解在20μL PBS中的10μg乳清蛋白注入耳廓内)并记录急性过敏性皮肤反应，如实施例1中所述。 [0118] 表3.不同组中的干预 [0119] [0120] [0121] 结果 [0122] 皮肤反应结果总结在图5中。与非致敏动物(组1)相比，致敏但未处理的动物(组2)发生显著更高的过敏反应。单独用益生菌进行的治疗(组4)没有显著降低过敏反应。然而，在将动物预先暴露于单独的致耐受性肽的混合物(组3)之后，过敏反应显著降低，并且当将致耐受性肽与含有益生菌的饮食(组5)组合时，这种降低更加明显。 |
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