一种具有溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物及其制备方法与应用 |
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| 申请号 | CN201610110810.1 | 申请日 | 2016-02-29 | 公开(公告)号 | CN105747113A | 公开(公告)日 | 2016-07-13 |
| 申请人 | 武汉大学; | 发明人 | 王业富; 董艳山; 胡诗梦; 刘秋晨; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种具有溶栓降血脂功效的纳豆 益生菌 组合物及其制备方法与应用，属于 生物 医药领域。本发明的纳豆益生菌组合物包含如下按 质量 百分比含量计的组分：双歧杆菌干粉20～30%，嗜酸乳杆菌干粉20～30%，纳豆粉40～50%。通过将所述质量百分比含量原料混合至色泽均匀一致、无色差，即得到纳豆益生菌组合物。本发明的纳豆益生菌组合物同时具有纳豆的溶栓功效以及益生菌的降血脂功效，效果良好，可以协同全面 预防 和 治疗 心脑 血管 疾病 的发生，避免高血脂症和血栓性疾病的相互影响。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种具有溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物，其特征在于：包含如下按质量百分比含量计的组分：双歧杆菌干粉20～30％，嗜酸乳杆菌干粉20～30％，纳豆粉40～50％。 |
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| 说明书全文 | 一种具有溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物及其制备方法与应用 技术领域背景技术[0002] 全球每年直接死于心脑疾病的人数就高达1800万，已经成为人类健康的头号杀手。我国人口众多，人口老龄化速度加快，心脑血管疾病的发病率和死亡率不断上升，每年因患心脑血管疾病死亡的人数高达700万人，心脑血管疾病患病人数已经超过3亿。仅我国整个心脑血管疾病相关市场已经超过1万亿元。心脑血管疾病背后主要致病原因是血栓的形成。而血栓性疾病常常伴随有高血脂症。 [0003] 全世界每天因高血脂症引发的心脑血管疾病死亡人数近4000人之多，我国每年因高血脂引起的动脉粥样硬化、冠心病、高血压、脑中风等心脑血管疾病所导致的死亡人数以每年12％的速度递增。世界卫生组织(WHO)已预测，到2030年，全球直接死于心脑血管疾病人数将会达到3000万人。有报告指出，比正常胆固醇水平高出1mmol/L，患心脑血管疾病的风险增加35％；同时，降低血清中胆固醇水平的1％，可以降低患心脑血管疾病的风险降低3％-5％。 [0004] 大量的研究表明，益生菌具有降低血脂的作用。嗜酸乳杆菌菌体细胞在肠道内对胆固醇有吸收作用，从而降低对胆固醇的吸收。科学家通过扫描电镜发现了胆固醇黏附于乳酸菌的细胞表面，受细胞壁肽聚糖结构和化学性质影响，肽聚糖包含能够与胆固醇结合的氨基酸。此外，嗜酸乳杆菌和双歧杆菌两种乳酸菌能够抑制合成胆固醇的关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的活性，从而降低胆固醇的合成量，达到降血脂的作用。 [0005] 纳豆由黄豆通过枯草芽孢杆菌固体发酵得到，其中含有的纳豆激酶由枯草芽孢杆菌分泌产生，是一种天然的、安全无毒副作用的纤溶酶，可以靶向溶解血栓中的网状交联纤维蛋白，从而达到瓦解血栓，再通血管的目的。枯草杆菌纤溶酶被认为是新一代溶栓药物，具有非常广阔应用价值和市场发张前景。 [0006] 目前溶栓、降血脂药物以西药为主，对人体有非常严重的毒副作用。通常高血脂和血栓相伴而生，二者需要同时治疗才能起到很好的治疗效果。市场上还没有一款产品可以同时达到溶解血栓、降低血脂的功效，从而达到全面预防和治疗心脑血管疾病的目的。 发明内容[0007] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷与不足，提供一种具有溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物及其制备方法与应用。益生菌和纳豆是两类国际公认的益生物质，两者在基本理论观点上极为相似、一脉相通。本发明将益生菌与纳豆完美结合制备纳豆益生菌组合物，该组合物同时具有溶解血栓、降低血脂的功效，且安全无毒副作用，能起到全面预防和治疗心脑血管疾病的目的。 [0008] 本发明通过下述技术方案实现： [0009] 一种具有溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物，包含如下按质量百分比含量计的组分：双歧杆菌干粉20～30％，嗜酸乳杆菌干粉20～30％，纳豆粉40～50％。所述的双歧杆菌干粉为青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌中的一种或多种菌干粉的混合物；优选的，所述的双歧杆菌干粉为青春双歧杆菌干粉或青春双歧杆菌干粉与婴儿双歧杆菌干粉的混合物。所述的双歧杆菌干粉中不同双歧杆菌干粉的质量优选相同。所述的双歧杆菌干粉或嗜酸乳杆菌干粉中益生菌含量优选为5～10×108cfu/g。 [0010] 优选的，所述的具有溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物，包含如下按质量百分比含量计的组分：双歧杆菌干粉30％，嗜酸乳杆菌干粉30％，纳豆粉40％。 [0011] 所述的嗜酸乳杆菌干粉或双歧杆菌干粉优选通过包括如下步骤的方法制备： [0012] (1)将嗜酸乳杆菌种子液或双歧杆菌种子液接种于MRS培养基(MRS培养基配方为每升水中添加如下质量物质：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g。培养基灭菌的条件为：0.10～0.15MPa，121℃灭菌30分钟。)中，37℃、180rpm振荡培养，使菌液浓度达到0.5～1.0×109cfu/mL。 [0013] (2)将各菌种培养液单独或混合后离心，弃上清，菌体沉淀用纯净水洗涤，离心，得菌泥。 [0014] (3)按如下配比配制干粉保护剂：分别称取β-环状糊精10g、乳糖2.5g、海藻糖1.5g、谷氨酸钠1.5g、维生素E 0.1g溶于100mL蒸馏水中。 [0015] (4)将干粉保护剂和菌泥直接混合进行成膜反应，反应时间为20min，将混合物-80℃预冻6h，再在-60℃、真空度10Pa条件下冷冻干燥180min，制成具有包埋层的活性益生菌干粉，干粉中益生菌含量优选为5～10×108cfu/g。 [0016] 步骤(1)中所述的双歧杆菌种子液优选通过包括如下步骤的方法制备：取出保藏菌种，用MRS固体培养基划平板进行复苏，37℃厌氧培养72小时。在平板下挑取单个菌落接种到50mL MRS培养基中，在培养箱中37℃厌氧培养48小时；再采用5％的接种量接种至10L大三角瓶中(装液量为9.5L)，37℃厌氧培养20～28小时，检测其菌液浓度，菌含量超过10亿/毫升，即可作为双歧杆菌种子液接种。MRS固体培养基的配方为往MRS培养基中加入琼脂2％。 [0017] 步骤(1)中所述的嗜酸乳杆菌种子液优选通过包括如下步骤的方法制备：取出保藏菌种，用MRS固体培养基划平板进行复苏，37℃厌氧培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种到250mL MRS培养基中，在培养箱中37℃厌氧培养24小时；再采用5％的接种量接种至10L大三角瓶中(装液量为9L)，37℃厌氧培养20～28小时，检测其菌液浓度，菌含量超过100亿/毫升，即可作为嗜酸乳杆菌种子液接种。 [0018] 所述的纳豆粉优选通过包括如下步骤的方法制备： [0019] (1)按大豆与培养液的质量体积比为1:3(kg:L)的比例将大豆浸泡到培养液中。所述的浸泡的条件为25℃浸泡18h；所述的培养液的配方为：乳糖10g/L、胰蛋白酶20g/L、Na2HPO4·12H2O 5g/L、NaH2PO4·2H2O 1.0g/L、MgSO40.5g/L、CaCl20.3g/L，pH 7.0-7.5。 [0020] (2)将浸泡的大豆进行蒸煮，蒸煮的条件为0.1Mpa、121℃蒸煮35min。 [0021] (3)蒸煮后的大豆自然冷却至40～50℃后，按大豆重量10％的接种量接种枯草芽孢杆菌种子液进行发酵，发酵产物即为纳豆。 [0022] 所述的枯草芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO：M 203078的Bacillus subtilis QK；所述的枯草芽孢杆菌种子液是由Bacillus subtilis QK在LB培养基中37℃培养得到。 [0024] (4)纳豆于-80℃冻结，然后放入真空冷冻干燥机中，于真空度为10Pa、冷阱温度-50℃条件下干燥24h，制备得到纳豆粉。 [0025] 上述具有溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物的制备方法，包括如下步骤： [0026] (1)将嗜酸乳杆菌干粉、双歧杆菌干粉、纳豆粉分别过80～100目筛。 [0027] (2)将过筛后的嗜酸乳杆菌干粉、双歧杆菌干粉、纳豆粉按所述质量百分比称量备用。 [0028] (3)将配好的原料于三维混合机中混合至色泽均匀一致、无色差，即得到具有溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物。 [0029] 上述具有溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物在制备溶栓降血脂食品/保健品中的应用。对食品的应用没有限制，可以为粉剂、片剂、胶囊剂(包括软胶囊和硬胶囊)、颗粒、冲剂、果冻、饮料、乳制品、酸奶或小点心烘烤品等。保健品可以为粉剂、片剂、胶囊剂(包括软胶囊和硬胶囊)、液体剂、悬浮液、乳剂、口服液、果冻或冲剂等；如该组合物可以加一种或多种药学上可接受的载体制成片剂、胶囊、颗粒、口服液等剂型。 [0030] 一种溶栓降血脂功效的食品/保健品，包含上述溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物。 [0031] 本发明的纳豆益生菌组合物有益效果在于：本发明的益生菌组合物以益生菌干粉、纳豆粉为原料，可直接配比投料，按重量科学配比而成。制备工艺简单，避免了提取时造成的药物损失和由于原药材质量差异造成的不同产品质量差异较大的缺点。纳豆益生菌组合物同时具有纳豆的溶栓功效以及益生菌的降血脂功效，且组合物降血脂效果显著由于益生菌。本发明的益生菌组合物可以协同全面预防和治疗心脑血管疾病的发生，避免高血脂症和血栓性疾病的相互影响。 具体实施方式[0032] 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 [0033] 实施例1纳豆益生菌组合物的制备 [0034] (1)益生菌干粉的制备 [0035] 1)取出保藏的青春双歧杆菌菌种，用MRS固体培养基划平板进行复苏，37℃厌氧培养72小时。在平板下挑取单个菌落接种到50mL MRS培养基中，在培养箱中37℃厌氧培养48小时；再采用5％的接种量接种至10L大三角瓶中(装液量为9.5L)，37℃厌氧培养20～28小时，检测其菌液浓度，菌含量超过10亿/毫升，即可作为青春双歧杆菌种子液接种。 [0036] 取出保藏的嗜酸乳杆菌菌种，用MRS固体培养基划平板进行复苏，37℃厌氧培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种到250mL MRS培养基中，在培养箱中37℃厌氧培养24小时；再采用5％的接种量接种至10L大三角瓶中(装液量为9L)，37℃厌氧培养20～28小时，检测其菌液浓度，菌含量超过100亿/毫升，即可作为嗜酸乳杆菌种子液接种。 [0037] 将嗜酸乳杆菌种子液或青春双歧杆菌种子液接种于MRS培养基中，37℃、180rpm振荡培养，使菌体菌液浓度达到0.5～1.0×109cfu/mL。 [0038] 2)将各菌种培养液离心，弃上清，菌体沉淀用纯净水洗涤，离心，得菌泥。 [0039] 3)按如下配比配制干粉保护剂：分别称取β-环状糊精10g、乳糖2.5g、海藻糖1.5g、谷氨酸钠1.5g、维生素E 0.1g溶于100mL蒸馏水中。 [0040] 4)将干粉保护剂和菌泥直接混合进行成膜反应，反应时间为20min，将混合物-80℃预冻6h，再在-60℃、真空度10Pa条件下冷冻干燥180min，制成具有包埋层的活性益生菌8 干粉。所制备的干粉中益生菌含量为5～10×10cfu/g。 [0041] (2)纳豆粉的制备 [0042] 1)按大豆与培养液的质量体积比为1:3(kg:L)的比例将大豆浸泡到培养液中。所述的浸泡的条件为25℃浸泡18h；所述的培养液的配方为：乳糖10g/L、胰蛋白酶20g/L、Na2HPO4·12H2O 5g/L、NaH2PO4·2H2O 1.0g/L、MgSO40.5g/L、CaCl20.3g/L，pH 7.0-7.5。 [0043] 2)将浸泡的大豆进行蒸煮，蒸煮的条件为0.1Mpa、121℃蒸煮35min。 [0044] 3)蒸煮后的大豆自然冷却至40～50℃后，按大豆重量10％的接种量接种枯草芽孢杆菌种子液进行发酵，发酵产物即为纳豆。 [0045] 所述的枯草芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO：M 203078的Bacillus subtilis QK；所述的枯草芽孢杆菌种子液是由Bacillus subtilis QK在LB培养基中37℃培养得到。 [0046] 所述的发酵的条件为：温度37℃、湿度75％～85％、物料厚度2～3cm，发酵时间为24h。 [0047] 4)纳豆于-80℃冻结，然后放入真空冷冻干燥机中，于真空度为10Pa、冷阱温度-50℃条件下干燥24h，制备得到纳豆粉。 [0048] (3)纳豆益生菌组合物的制备 [0049] 1)将嗜酸乳杆菌干粉、双歧杆菌干粉、纳豆粉分别过100目筛。 [0050] 2)称量过筛后的嗜酸乳杆菌干粉、双歧杆菌干粉、纳豆粉，按嗜酸乳杆菌干粉30％、青春双歧杆菌干粉30％、纳豆粉40％配料组合，以上含量均为质量百分比含量。 [0051] 3)将配好的益生菌干粉、纳豆粉于三维混合机中混合至色泽均匀一致，无色差，即得到具有溶栓降血脂功效的纳豆益生菌组合物。 [0052] (4)不同对照的制备 [0053] 纳豆粉对照：将纳豆粉与冷冻干燥后的干粉保护剂于三维混合机中混合至色泽均匀一致，无色差，得到纳豆粉对照。等质量纳豆粉对照、纳豆益生菌组合物中纳豆粉的含量相同。 [0054] 益生菌对照：将嗜酸乳杆菌菌泥、青春双歧杆菌菌泥与干粉保护剂按一定比例混合，冷冻干燥得益生菌对照。等质量益生菌对照、纳豆益生菌组合物中嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌的含量相同。 [0055] 实施例2纳豆益生菌组合物纤溶活性验证 [0056] 纳豆益生菌组合物溶栓活性的测定使用琼脂糖纤维蛋白平板法，将不同浓度的尿激酶配制成20、40、60、80、100、120、140、160IU/mL系列浓度，点样于平板上，置于37℃培养18h，测定纤溶圈面积，制作酶活-面积标准曲线。 [0057] 取实施例1制备的纳豆益生菌组合物0.1g，置于琼脂糖纤维蛋白平板37℃培养18h，测定纤溶圈面积，根据尿激酶活性标准曲线计算相应的酶活。 [0058] 酶活测定结果显示，纳豆益生菌组合物的纤溶活性高达为4725IU/g，而传统大豆固体发酵纤溶酶活性一般在1000～2000IU/g。 [0059] 实施例3纳豆益生菌组合物对大鼠的降血脂作用验证 [0060] (1)大鼠分组与试验 [0061] 大鼠，雄性，6-8周龄，体重160-200g，共30只。抽签法随机分为5组：基础饲料对照组(6只)，高脂对照组(6只)，高脂模型加纳豆益生菌组合物大剂量组(6只)，高脂模型加纳豆益生菌组合物中剂量组(6只)，高脂模型加纳豆益生菌组合物小剂量组(6只)。用基础饲料饲喂3d后，再饲喂高脂饲料(含质量百分含量10％猪油、0.5％猪胆盐和2％胆固醇的基础饲料)，除基础饲料对照组外，其余各组均用高脂饲料喂饲，同时各实验组大鼠灌胃给予纳豆益生菌组合物，组合物使用生理盐水溶解每天灌胃一次，连续30d，基础饲料对照组和高脂对照组灌胃等量的生理盐水。高脂模型加纳豆益生菌组合物大、中、小剂量组纳豆益生菌组合物给药量分别为10g/kg体重、5g/kg体重、2.5g/kg体重。30d后采血按酶法测定血清TC(总胆固醇)、TG(血清甘油三酯)、HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)含量，结果见表1。本实施例中所用基础饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，符合国家实验动物小鼠大鼠配合饲料标准GB 14924.3-2001。 [0062] (2)结果 [0063] 由表1中结果可以看出，高脂对照组TC、TG含量高于基础对照组，表明高血脂模型成立；同时纳豆益生菌组合物各剂量组大鼠的TC与TG含量均显著低于高脂对照组，具有统计学意义；纳豆益生菌组合物三个剂量组的HDL-C值与高脂对照组相比没有统计学意义。以上表明纳豆益生菌组合物具有降低高血脂模型大鼠的血清总胆固醇和甘油三酯含量的作用。 [0064] 表1.纳豆益生菌组合物对高血脂大鼠的影响 [0065] [0066] 实施例4纳豆益生菌组合物降血脂功效优于单独益生菌的降血脂功效 [0067] 方法同实施例3。将大鼠分为基础饲料对照组(6只)，高脂模型对照组(6只)，高脂模型加纳豆益生菌组合物组(6只)，高脂模型加纳豆粉对照组(6只)，高脂模型加益生菌对照组(6只)。高脂模型加纳豆益生菌组合物组(组合物组)、高脂模型加纳豆粉对照组(纳豆粉组)、高脂模型加益生菌对照组(益生菌组)的给药量均为10g/kg体重，即纳豆粉组、组合 |
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