[0001] 引言

[0002] 本发明涉及双歧杆菌菌株及其作为益生菌，具体地讲作为免疫调节生物治疗剂的应用。

[0003] 保护人胃肠道不被肠细菌定植的防御机制是高度复杂的并涉及免疫和非免疫的方面(1)。先天的防御机制包括胃的低pH、胆汁盐、蠕动、粘蛋白层和抗微生物化合物如溶菌酶(2)。免疫学机制包括在M细胞下面的特定淋巴聚集体，称为派伊尔氏淋巴集结(peyers patches)，其遍布在小肠和结肠(3)。在这些位置存在的内腔抗原对合适的T和B细胞亚群产生刺激，建立细胞因子网络并分泌抗体到胃肠道中(4)。此外，可经由上皮细胞将抗原递呈到上皮内的淋巴细胞和下面的固有层免疫细胞(5)。因此，宿主在胃肠道的免疫防御上投入巨大。然而，因为胃肠粘膜是宿主与外部环境相互作用的最大表面，其中必须有特定的控制机制以调控对100吨食物的免疫应答，这是胃肠道经平均寿命处理的食物数11 12
量。此外，超过500种菌种定植在肠内，它们在结肠上的数量为10 -10 /g。因此，这些控制机制必须能够分辨非病原的粘附细菌与侵入的病原菌，所述病原菌将引起对宿主的显著伤害。事实上，肠内菌群通过与新摄取的潜在病原微生物竞争，有助于宿主防御它们。

[0004] 据信益生菌当衍生自旨在治疗的菌种或密切相关菌种时更加有效。因此，需要来源于伴侣动物的益生菌菌株，所述菌株用于伴侣动物，它们不同于那些来源于人的菌株。

[0005] WO 01/90311公开了分离自排泄物样品的益生菌微生物，所述样品得自具有益生菌活性的猫。然而，这些细菌得自排泄物样品，并且不可能形成存在于胃肠道上部的天然肠微生物区系的部分。

[0006] 因此，需要通过从胃肠道上部存在的天然肠微生物区系中分离细菌菌株来提供可获得的菌株，所述菌株尤其适用于猫，并且选择它们的益生菌特性和经加工后存活的能力，以及将这些菌株掺入适用的组合物。

[0007] 发明声明

[0008] 根据本发明，提供了分离的双歧杆菌菌株NCIMB 41675。

[0009] 双歧杆菌菌株可为活体细胞形式，双歧杆菌菌株可为非活体细胞形式。

[0010] 双歧杆菌可分离自猫科动物受试者的结肠活组织。

[0011] 双歧杆菌菌株在口服后可具有显著的免疫调节功能。

[0012] 如本文所述，本发明也提供包含双歧杆菌菌株的制剂。

[0013] 所述制剂还可包含益生菌材料。所述制剂还可包含益生元材料。所述制剂还可包含可摄取的载体。可摄取的载体可为药用载体如胶囊、片剂或粉末。可摄取的载体可为食物产品如油悬浮液、乳基悬浮液、乳酪、可可油基组合物、肉汁和/或酸奶基组合物。

[0014] 本发明还提供包含双歧杆菌菌株或如本文所述制剂的食品。

[0015] 所述食品可为干食品。所述食品可为湿食品。所述食品还可包含益生菌材料。所述食品还可包含益生元材料。所述食品可为伴侣动物食品。

[0016] 本发明还提供如本文所述用作药物的双歧杆菌菌株或制剂或食品。

[0017] 本发明还提供如本文所述用于预防和/或治疗不良炎活性的双歧杆菌菌株或制剂或食品。

[0018] 本发明还提供如本文所述用于预防和/或治疗不良胃肠炎活性的双歧杆菌菌株或制剂或食品。

[0019] 本发明还提供如本文所述用于预防和/或治疗由于不良炎活性引起的自身免疫失调的双歧杆菌菌株或制剂或食品。

[0020] 本发明还提供如本文所述用于预防和/或治疗由于不良炎活性引起的腹泻疾病的双歧杆菌菌株或制剂或食品。

[0021] 本发明还提供如本文所述用于调节或改善伴侣动物免疫系统的双歧杆菌菌株或制剂或食品。

[0022] 本发明还提供如本文所述用于预防和/或治疗伴侣动物自身免疫疾病的双歧杆菌菌株或制剂或食品。

[0023] 本发明还提供如本文所述用于预防和/或治疗伴侣动物炎症的双歧杆菌菌株或制剂或食品。

[0024] 我们描述了双歧杆菌菌株AH121A(NCIMB 41675)或其突变体或其变体。

[0025] 所述菌株可通过从切除并洗涤的猫科动物胃肠道分离获得。

[0026] 所述突变体可为经基因修饰的突变体。所述变体可为天然存在的双歧杆菌变体。

[0027] 所述菌株可为益生菌。它可为生物学纯培养物形式。

[0028] 我们也描述了分离的双歧杆菌菌株NCIMB 41675。

[0029] 双歧杆菌菌株可为活体细胞形式。作为另外一种选择，双歧杆菌菌株可为非活体细胞形式。

[0030] 益生菌的一般使用形式可为活体细胞。然而，也可将它扩展到非活体细胞例如杀灭过的培养物或益生菌表达的包含有益因子的组合物。这可包括热灭活的微生物，或者通过暴露于改变的pH或经过加压灭活的微生物。因为非活体细胞产物制剂可较简单，可将细胞容易地掺入药物且贮藏要求与活体细胞相比受的限制要少得多。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)YIT 9018提供25个加热灭活细胞的有效利用样品，这作为治疗和/或防止肿瘤生长的方法在美国专利US4347240中进行了描述。

[0031] 我们也描述了利用通过从切除并洗涤的猫科动物胃肠道中分离的可获得细菌保持并改善伴侣动物健康状态的方法和包含乳酸菌的组合物。

[0032] 我们描述了包含如本文所述的双歧杆菌菌株的制剂，该制剂可包括另一种益生菌材料，该制剂可包括益生元材料。

[0033] 双歧杆菌是共生微生物。它们已经从人胃肠道内的微生物区系中分离出来。因为引起的炎活性也将破坏宿主细胞和组织功能，所以胃肠道内的免疫系统不可能对这种区系有显著的反应。因此，存在一些机制，从而免疫系统能够识别共生的非病原胃肠微生物区系，它们与病原生物不同。这确保对宿主组织的伤害受到限制并且仍旧保持防御屏障。

[0034] 在整个说明书中术语突变体、变体和经基因修饰的突变体包括双歧杆菌菌株，其基因特性和/或表型特性与亲本菌株相比发生改变。天然存在的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)变体包括选择性分离的靶向特性的自发改变。通过常规(体外)基因操纵技术如基因分裂、接合转移等完成亲本菌株特性的有意改变。基因修饰包括将外来和/或内源DNA序列导入双歧杆菌菌株基因组，例如通过载体插入细菌菌株基因组，所述载体包括质粒DNA或噬菌体。

[0035] 天然或诱导的突变包括至少单个碱基的改变例如缺失、插入、颠换或可引起所述DNA序列编码的氨基酸序列改变的其他DNA修饰。

[0036] 术语突变体、变体和经基因修饰的突变体也包括已经发生基因改变的双歧杆菌菌株，所述基因改变在基因组中积聚的速率与所有微生物的30天然一致，和/或通过自发突变和/或基因获取和/或基因丢失发生的基因改变，其不是通过有意(体外)操纵基因组完成，而是通过变体和/或突变体的天然选择完成，所述天然选择提供当暴露于环境压力如抗生素时在保持细菌存活率方面的选择性优势。可通过有意地(体外)将特定基因插入到基因组中制备突变体，其不会根本改变生物体的生物化学功能，但是其产物可用于细菌的鉴定或选择，例如抗生素抗性。

[0037] 本领域的技术人员将认识到双歧杆菌菌株的突变体或变体能够通过与亲本菌株的DNA序列同源性分析进行鉴定。双歧杆菌菌株具有与亲本菌株相近的序列同一性，认为它们是突变体或变体菌株。可认为与亲本DNA序列具有96％或更高的序列同一性(同源性)，例如97％或更高，或98％或更高，或99％或更高的序列同一性的双歧杆菌菌株是突变体或变体。序列同源性可使用在线同源性算法“BLAST”程序进行测定，其在http://www.ncbi.nlm.nih，gov/BLAST/上公开可用。

[0038] 亲本菌株的突变体也包括衍生的双歧杆菌菌株，其具有与亲本菌株的16s-23s基因间隔区多核苷酸序列至少85％的序列同源性，例如至少90％的序列同源性，或至少95％的序列同源性。这些突变体还可包含在细菌基因组的其他DNA序列中的DNA突变。

[0039] 附图简述

[0040] 由以下描述将会更清楚地理解本发明，其仅以举例的方式提供其中的参考附图；

[0041] 图1是长双歧杆菌(B.longum)AH121A在刚果红琼脂平板上生长的照片；

[0042] 图2是示出受刺激的PBMC与长双歧杆菌菌株121A(双歧杆菌121A)的IL-10∶IL-12p70比率的柱形图；

[0043] 图3是示出菌株121A在低pH环境中的存活率的曲线图。菌株在pH2.5挑战6小时，并且使用平板计数评估它们的存活率；

[0044] 图4至6是从体外培养的外周血单核细胞(PBMC)中分泌的细胞因子的曲线图；

[0045] 图7A至E是在用浓度增加的121A和Bif 35624体外刺激后PBMC中的IL-10诱导特征曲线图；

[0046] 图8A至D是在用浓度增加的121A和Bif 35624体外刺激后PBMC中的IL-β诱导特征曲线图；

[0047] 图9A至D是在用浓度增加的121A和Bif 35624体外刺激后PBMC中的IL-6诱导特征曲线图；

[0048] 图10A至D是在用浓度增加的121A和Bif.35624体外刺激后PBMC中的IL-8诱导特征曲线图；

[0049] 图11A至D是在用浓度增加的121A和Bif.35624体外刺激后PBMC中的IL-12p70诱导特征曲线图；

[0050] 图12A至E是在用浓度增加的121A和Bif.35624体外刺激后PMBC中的TNF-α诱导特征曲线图；

[0051] 图13A至C是在用浓度增加的121A和Bif.35624体外刺激后PMBC中的IFN-γ诱导特征曲线图；

[0052] 图14A至D是在用浓度增加的121A和Bif.35624体外刺激后PBMC中的G-CSF诱导特征曲线图；

[0053] 图15是示出121A对人髓样树突状细胞分泌IL-10和IL-12p70的效应的柱状图；并且

[0054] 图16是示出121A对人天然CD4+T细胞效应的柱状图。

[0055] 发明详述

[0056] 将长双歧杆菌菌株AH121A于2009年11月5日保存在National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)FergusonBuilding，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB219Y A，Scotland，UK，并且授予编号NCIMB 41675。

[0057] 将长双歧杆菌菌株UCC 35624于1999年1月13日保存在National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB219YA，Scotland，UK，并且授予编号NCIMB 41003。

[0058] 长双歧杆菌可为经基因修饰的突变体或它可为其天然存在的变体。

[0059] 优选地，长双歧杆菌是活体细胞的形式。

[0060] 作为另外一种选择，长双歧杆菌可为非活体细胞形式。

[0061] 本文所用，“伴侣动物”是指家畜。优选地，“伴侣动物”指家养猫科动物(猫)、犬科动物(狗)、兔子、雪貂、马、奶牛等。更优选地，“伴侣动物”指家养猫科动物。

[0062] 乳酸双歧杆菌(Lactic Acid Bifidobacteria)菌株

[0063] 本发明的第一方面包括双歧杆菌属乳酸菌菌株，其可通过从切除并洗涤的猫科动物胃肠道中分离获得，该胃肠道在动物中具有益生菌活性。益生菌是或活体或死亡的微生物、微生物的加工组合物、它们的组分如蛋白或碳水化合物、或对宿主有有益影响的细菌发酵产物的纯化组分。益生菌的一般使用形式为活体细胞。然而，可将它扩展到非活体细胞例如杀灭过的培养物或益生菌表达的包含有益因子的组合物。这可包括热灭活的微生物，或者通过暴露于改变的pH或经过加压灭活的微生物。就本发明目的而言，除非另外指明，“益生菌”还旨在包括本发明微生物在发酵期间生成的代谢产物。可将这些代谢物释放到发酵培养基中，或可将它们储存在微生物中。如本文所用，“益生菌”还包括细菌、细菌匀浆、细菌蛋白、细菌提取物、细菌发酵悬浮液、以及它们的混合物，它们当以治疗剂量提供时对宿主动物行使有益功能。

[0064] 已发现，可通过从哺乳动物切除并洗涤的胃肠道中直接分离获得的双歧杆菌属乳酸菌在喂食活体细菌细胞后粘附到胃肠道上，并且当以活体、非活体或破碎形式喂食给动物时也具有显著的免疫调节功能。不受理论的约束，据信双歧杆菌可通过从切除并洗涤的胃肠道中分离获得，所述胃肠道与肠粘膜组织紧密缔合。不受理论的约束，据信这导致本发明的益生菌双歧杆菌产生选择性的宿主反应，此反应导致它的益生行为。已经发现，分离自切除并洗涤的胃肠道的益生菌通过直接作用于粘膜上皮和宿主的免疫细胞能调节宿主的免疫系统。这种免疫调节，与益生菌传统的作用机制相结合，例如通过闭合和竞争营养物质阻止病原菌粘附在肠上，致使本发明的双歧杆菌作为益生菌生物体是高度有效的。

[0065] 分离自切除并洗涤的猫科动物胃肠道的本发明双歧杆菌具有对许多病原菌菌株/菌种的体外抗菌活性。不受理论的约束，据信这种体外抗微生物活性是动物体内的潜在益生菌活性的指示，所述动物优选地是伴侣动物如猫科动物。本发明的乳酸菌优选地具有体外抗微生物活性，其对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)，无害李斯特菌(Listeria innocua)或大肠杆菌(Eschericia coli)，更优选这些菌株的混合物，更优选所有这些菌株具有抗性。

[0066] 不受理论的约束，据信本发明乳酸菌的抗微生物活性可为本文乳酸菌的许多不同作用的结果。本领域以前提出分离自排泄物样品的几种细菌菌株通过闭合作用阻止病原生物体附着在肠上，从而在口服后发挥其在胃肠道中的益生菌功效。为了能在肠中建立菌群，这需要口服“活的”或活体细菌细胞。然而，据信本发明的由切除并洗涤的猫科动物胃肠道分离获得的双歧杆菌，如提供其活体形式的话同时由于闭合作用发挥一些益生菌功效，可以活体或非活体的形式递送基本的益生菌功效，这是由于其在体外发酵过程中产生一种或多种能抑制病原微生物生长或杀死病原微生物和/或改变宿主动物的免疫能力的物质。此益生菌活性的形式是人们所期望的，因为本发明的细菌能以活性或非活性培养基或者纯化发酵产物的形式提供，这些形式仍递送有益治疗效果给宿主动物。

[0067] 优选地，本发明的乳酸菌在通过胃肠道后能够保持存活。为了能口服细菌的活性培养基和细菌在通过食管与胃后能寄居在肠内，这是人们所期望的。为了长期递送益生菌有益效果给宿主，期望本发明的乳酸菌能寄居在肠内。非活体细胞或其纯化分离物的口服剂量诱导出暂时的有益效果，但是因为细菌不是活体，它们不能够生长并持续地原位递送益生菌效应。因此这可能需要宿主定期给药以保持健康状态有益效果。反之，活体细胞能以活体形式通过胃，随后附着在肠粘膜上增生扩散，从而能就地持续递送益生菌效果。因此，本发明的乳酸菌优选在悬浮于pH2.5的介质中1小时后仍保持存活。如本文所用，“保持存活”指至少25％的最初悬浮于测试介质的细菌当使用本领域的技术人员已知的平板计数法计数时是活体。优选地，“保持存活”指至少50％的最初悬浮的细菌是活体。本发明的乳酸菌期望在暴露于低pH环境后保持存活，这种低pH环境模拟动物口服后暴露于胃和小肠上部的胃液中的体内环境。

[0068] 通过从切除并洗涤的猫科动物胃肠道中分离得到的双歧杆菌属乳酸菌菌株可用于在由动物，优选伴侣动物或人口服后递送益生菌有益效果。此益生菌有益效果通常保持并改善动物的总体健康状态。有益于或者治疗学上减轻以下疾病症状或者通过预防防止以下疾病的动物健康状态和生理的非限制性要素包括炎性失调、免疫缺陷、炎性肠疾病、过敏性肠综合症、癌症(尤其是那些胃肠和免疫系统癌症)、腹泻疾病、抗生素相关的腹泻、阑尾炎、自身免疫失调、多发性硬化症、阿兹海默病、淀粉样变性病、类风湿性关节炎、关节炎、关节运动性、糖尿病、胰岛素抗性、细菌感染、病毒感染、真菌感染、牙周病、泌尿生殖器疾病、外科手术相关的创伤、外科手术诱导的转移性疾病、败血病、重量损失、重量增加、过多脂肪组织积聚、厌食症、发烧控制、恶病质、伤口痊愈、溃疡、肠屏障感染、过敏、哮喘、呼吸失调、循环障碍、冠心病、贫血、凝血系统失调、肾病、中枢神经系统失调、肝病、局部缺血、营养失调、骨质疏松、内分泌失调和表皮失调，优选地是治疗胃肠道，包括治疗或预防腹泻；免疫系统调节，优选地治疗或预防自身免疫疾病和炎症；保持或改善皮肤和/或毛皮系统的健康状态，优选地治疗或预防皮肤特应性疾病；改善或减轻衰老效应，包括精神意识和活性水平；预防与下丘脑-垂体-肾上腺轴相关的失调，以及改善关节健康状态从而改善运动性。

[0069] 上文公开的失调治疗可使用本领域的技术人员已知的技术进行测量。例如包括自身免疫疾病和炎症的炎性失调可使用体内免疫功能测试进行检测和监控，例如淋巴细胞母细胞化、自然杀伤细胞活性、疫苗抗体反应、迟发型超敏反应、以及它们的混合物。本文简要描述了这些方法，但这是本领域的技术人员所熟知的。

[0070] 1.淋巴细胞转化：此检测分析法测量分离自测试和对照动物新鲜全血的淋巴细胞对不同分裂素的体外增殖反应，是对全体T-和B-细胞功能的测量方法。简而言之，通过本领域的技术人员已知的Ficoll-Hypaque密度离心法从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。分离的PBMC在补充加入HEPES、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI1640细胞介质中洗涤两次。洗涤后的细胞被重悬浮在RPMI1640中，计数，将细胞密度进行适当调整。三5
等分试样的2×10 个细胞在被暴露于一定浓度范围(0.1μg/mL至100μg/mL)的不同分裂素下，一些实例包括美洲商陆分裂素(Gibco)、植物血凝素(Gibco)和伴刀豆素A(Sigma)，在37℃下和5％的CO2以及10％的胎牛血清(Sigma)中，培养72小时。在54小时细胞用
1μCi H-胸腺嘧啶核苷进行冲击，72小时在TopCount NXT上读出细胞收获量。

[0071] 2.自然杀伤细胞活性：如美国专利6,310,090所述，此检测分析法测量分离自测试和对照动物新鲜全血的自然杀伤细胞的体外效应活性。自然杀伤细胞是哺乳动物天然免疫功能的组分。猫科动物甲状腺癌细胞在评估NK细胞毒性活性时被用作靶细胞。此细胞系以前显示易于被猫科动物NK细胞杀伤。靶细胞在T75烧瓶中培养，烧瓶中有20niL的最小必需培养基(MEM；Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)，其中补充有10％胎牛血清(FCS)，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。当细胞铺满时，靶细胞被胰蛋白酶处理，洗涤3次，
5
以5×10 个细胞/mL再悬浮于完全培养基(RPMI-1640+10％FCS+100U/mL的青霉素+100的10μg/mL的链霉素)中。将三等份靶细胞的100μL等分试样吸到96孔U形底平板(Costar，Cambridge，Mass.)中并孵育8小时以使细胞附着。然后将通过Ficoll-Hypaque分离法分离淋巴细胞(效应细胞；100μL)(如上所述)加入靶细胞以提供10∶1的效应/靶细胞(E∶T)比率。在37℃下孵育10小时后，加入20μL包含5.μg的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)的底物。将混合物在37℃下孵育4小时，然后吸除未代谢的MTT。加入200μL的95％乙醇溶解甲复晶体。使用微板读数计在570nm测量光密度。如下计算NK细胞特异性溶解百分比：特异性细胞毒性(％)＝100×{1-[(靶细胞和效应细胞的OD-效应细胞的OD)/(靶细胞的OD)]}。

[0072] 3.疫苗抗体反应：在至少12周的益生菌或对照物喂食后，给予测试受试者一系列(至多5)疫苗。疫苗可以是新型疫苗和多余疫苗的混合物。可使用的疫苗组的非限制性实例包括Fort Dodge Animal Health制备的疫苗混合物。本文适用的疫苗的非限制性实例包括猫热病疫苗、腺病毒疫苗、冠状病毒疫苗、副流感病毒疫苗和细小病毒疫苗。受试者的疫苗史将决定使用的疫苗。给定疫苗的特异性抗体在血液中测量3周，比较对照组和益生菌喂食组反应的长度和强度。4.迟发型超敏反应：体外评估免疫系统状态的非侵入性方法。此测试包括皮内注射多克隆有丝分裂原植物血凝素(PHA)和绵羊红细胞多价疫苗、组胺(100μL的0.0275g/L的磷酸组胺；Greer，Lenoir，NC)或PBS(100μL的磷酸盐缓冲液，8.5g/L；Sigma)。对抗原的免疫反应被记录为皮肤褶厚度，使用测径器在注射后0、24、48和
72小时进行测量。皮肤褶厚度的增加指示更强的超敏反应，它使用本发明的细菌进行治疗后将会降低。

[0073] 测定本发明双歧杆菌效应的其他方法在US6,133,323和US6,310,090中进行了描述。

[0074] 此外，衰老改善功效可以使用双X-线吸收仪或CT扫描进行测定，这些仪器用于测量机体组合物，包括机体脂肪量、非脂肪量和骨矿物含量。同样的，此方法可用于测量解剖学改变如受试者感染后的体重丧失或骨密度下降。

[0075] 本发明的双歧杆菌也可用于减轻伴侣动物压力水平的方法。血液压力激素包括肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、皮质醇、C-反应蛋白和其他急性时相蛋白，可测量这些激素以测定压力水平和其减轻或保持。这些激素被认为是压力的生物标记，使用本领域的技术人员已知的技术可以被容易的测量。此外，可通过CT成像直接测量肾上腺大小作为下丘脑-垂体-肾上腺轴活性的体内标记。

[0076] 此外，对伴侣动物皮肤和/或毛皮系统健康状态的保持或改善包括治疗皮肤特应性疾病，这可通过由两个经过培训的人员进行的皮肤和毛皮评估进行测量。在此类评估期间的检查标准实例包括：a)脱落指数：通过收集每个测试受试者在标准梳理期间产生的毛发给予其脱落指数。保留毛发并称重，并且比较对照受试者和测试受试者。b)皮肤/毛皮主观评估：由经培训的专门小组成员主观评估皮肤和毛皮情况，这通过评估脱落、皮屑、光亮性、均匀度、柔软性和密度来进行。c)皮肤功能评估：可通过用丙酮浸泡过的纱布擦拭皮肤表面来评估皮肤的屏障功能。此技术通过移除单细胞层和相连的角质层类脂部分有效地破坏了皮肤屏障。使用本领域的技术人员已知的方法，通过测量经表皮失水(TEWL)的增加情况和侵害位点的变红程度，可对屏障破坏进行量化。使用前述照相机和照明系统获得变红(红斑)计分。在皮肤破坏前和破坏后立即获取TEWL读数和变红计分，并且在五小时和24-小时的端点时也获取这些数据以评估皮肤的保护性能和愈合性能。

[0077] 此外，伴侣动物的胃肠道感染治疗可包括改善伴侣动物的微生物生态。改善伴侣动物的微生物生态优选地包括降低伴侣动物粪便中的病原菌水平。伴侣动物粪便中存在的病原菌含量可使用本领域的技术人员已知的标准平板计数法进行计数。更优选地，病原菌选自由下列组成的组：梭状芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、拟杆菌以及它们的混合物。合适的病原菌菌株的非限制性实例包括产气荚膜梭菌、难辨梭状芽孢杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及它们的混合物。

[0078] 本发明的细菌的使用方法也可包括治疗，或预防或治疗哺乳动物(优选伴侣动物)的尿道。尿道治疗的非限制性实例包括治疗或预防尿道感染、治疗或预防肾病包括尿道结石、治疗或预防膀胱感染等。不受理论的约束，据信本发明的双歧杆菌用于预防这些疾病是因为它们能够降解草酸，这点在体外得到展示。草酸是尿代谢的副产物，它能够形成不溶解的沉淀，导致肾、膀胱和其他尿道感染。通过降解草酸，并因此潜在的预防其沉淀和在尿道中累积，本发明的细菌可治疗并预防尿道感染和其它疾病。草酸降解可在体外使用草酸测试试剂盒cat#755699进行测量，所述试剂盒可从Boehringer Mannheirn/R-Biopharm商购获得。

[0079] 本发明的双歧杆菌可用于改善或保持伴侣动物健康状态的方法，包括改善纤维消化。改善纤维消化是值得期待的，因为它促进所述益生菌以及有益内源菌群的生长，这有助于抑制一些潜在的病原菌。此外，文献已经证明了人体内由结肠发酵产生的毒性代谢物和有害酶的量的减少(6)。可使用Vickers等人描述的方法测定纤维消化(7)，不同的是使用稀释的排泄物样品而不是接种，每次实验使用受关注的细菌菌株的纯培养物。

[0080] 通过减少粪便和尿液中引起气味的化合物的产量，本发明的猫科动物益生菌可用于减少粪便和尿液的气味并且附带地减少猫砂盆中的气味。产生气味的化合物的非限制性实例包括氨、吲哚、酚、胺、支链脂肪酸和挥发性的含硫化合物。不受理论的束缚，据信降低伴侣动物粪便和尿液中的这些化合物的水平减少了与粪便和尿液相关联的气味。此外，就使用猫砂盆的伴侣动物而言，同时减少了猫砂盆的气味。

[0081] 本发明的乳酸菌的使用方法典型地涉及动物口服。口服可作为正常饮食摄取的一部分，或作为它的补充。口服典型地至少一月一次，优选至少每周一次，更优选至少每天一次。可提供治疗有效量的本发明乳酸菌给伴侣动物以保持或改善动物，优选伴侣动物的健康状态。如本文所用术语关于乳酸菌的“治疗有效量”是指足以向需30次治疗的宿主动物提供所需功效或有益效果的细菌的量，但所述量又足够低，以避免不利影响如毒性、发炎或变应性反应，相当于以本发明的方法使用时提供合理的效/险比。具体的“治疗有效量”将根据例如治疗的具体症状、使用者的身体状况、治疗持续时间、协同治疗的性能(如果存在)、欲使用的具体剂型、使用的载体、剂型的溶解度和具体的剂量疗程这些因素的不同而异。

[0082] 优选地，提供给伴侣动物的乳酸菌剂量为每天1.0E+04至1.0E+14的CFU，更优选每天1.0E+06至1.0E+12的CFU。所述组合物优选地可包含至少0.001％的1.0E+04至1.0E+12的CFU/g的双歧杆菌属乳酸菌，所述乳酸菌可通过从切除并洗涤的猫科动物胃肠道中分离得到。乳酸菌提供给动物的形式可以是活体形式，或者灭活细胞的形式，或者馏出液的形式，或本发明乳酸菌的发酵产物的分离物或其它片段的形式，或它们的任何混合物。

[0083] 优选地，乳酸菌或其纯化或分离部分用于制备旨在保持或改善动物健康状态的组合物。如上文所述，所述组合物可作为正常饮食摄取的部分，或作为补充。在所述组合物包含部分正常膳食摄取的情况下，该组合物可为以下形式：干动物食物如饼干或粗磨食物、加工谷物饲料、湿动物食物、酸奶、肉汁、咀嚼物、犒赏食物等。

[0084] 这些组合物可包含更多的组分。其它组分对本文使用的组合物中的内含物是有益的，但是对于本发明而言是任选的。例如，食物组合物优选地是营养平衡的。在一个实施方案中，所述组分基于干燥物质可包含按所述食物组合物重量计约20％至约50％的粗蛋白，优选约22％至约40％的粗蛋白。粗蛋白物质可包括任何具有按重量计至少约15％蛋白含量的物质，其非限制性实例包括植物蛋白如大豆、棉籽和花生，动物蛋白如酪蛋白、白蛋白和肉类组织。可用于本发明的肉类组织的非限制性实例包括新鲜肉类以及干的或精炼肉类例如鱼粉、禽肉粉、肉粉、骨粉等。其它适用的粗蛋白源包括小麦面筋或玉米面筋，以及提取自微生物来源如酵母的蛋白质。

[0085] 此外，所述食品组合物基于干燥物质可包含按所述食品组合物的重量计约5％至约35％的脂肪，优选地约10％至约30％的脂肪。此外，包含本发明乳酸菌的食物组合物也可包含约4％至约25％的总膳食纤维。所述组合物也可包含如WO99/51108所述的多种淀粉源。

[0086] 本发明的组合物还可包含碳水化合物源。谷物或谷类如大米、玉米、蜀黍、高粱、大麦、紫花苜蓿、小麦等是说明性的来源。此外，所述组合物也可以包含其它物质，例如干燥乳清粉和其它奶制副产品。

[0087] 包含本发明的细菌的组合物也可以包含益生元。“益生元”包括伴侣动物的肠菌落发酵产生的物质或化合物，因此其促进伴侣动物胃肠道中的乳酸菌的生长或发展，抑制病原菌的生长。发酵的结果是脂肪酸的释放，具体地讲结肠中的短链脂肪酸。这有降低结肠中的pH值的效果。合适的益生元的非限制性实施例包括低聚糖，例如菊粉及其水解产物，通常称为低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖或低聚淀粉衍生物。益生元可以任何合适的形式提供。例如，益生元可由包含纤维的植物材料形式提供。合适的植物材料包括芦笋、朝鲜蓟、洋葱、小麦或菊苣、或这些植物材料的渣滓。可供选择地，益生元纤维可以菊粉提取物形式提供，例如菊苣的提取物是合适的。合适的菊粉提取物可获取自Orafti SA of Tirlemont3300，Belgium，商标“Raftiline”。例如，菊粉可以Raftiline(g)ST形式提供，这是精炼白色粉末，其包含按重量计约90％至约94％的菊粉，按重量计至多约4％的葡萄糖和果糖，以及按重量计约4％至9％的蔗糖。

[0088] 可供选择地，纤维可以是低聚果糖的形式，例如获取自Orafti SA of Tirlemont3300，Belgium，商标“Raftilose”。例如，菊粉可由Raftilose(g)P95形式提供另外，低聚果糖可通过水解菊粉、酶法或使用微生物获得。

[0089] 对于干燥伴侣动物食物，适用的加工方法是挤出蒸煮，然而也可使用烘焙和其他适用的加工方法。当挤出蒸煮干燥伴侣动物食物时，所述食物通常以粗磨食物的形式提供。如果使用益生元，在加工前所述益生元可与干燥伴侣动物食物的其他成分混合。在欧洲专利申请0850569中描述了适用的方法。如果使用益生菌微生物，最好将所述生物涂覆到或填充到干燥伴侣动物食物上。在欧洲专利公布EP 0862863中描述了适用的方法。

[0090] 对于湿食物，描述于美国专利4,781,939和5,132,137中的方法可用于制备仿肉产品。也可使用制备块型产品的其他方法；例如在蒸气炉中蒸煮。作为另外一种选择，罗夫(loaf)型产品可通过以下方法制备：乳化合适的肉类材料制备肉糜，加入合适的胶凝剂，并加热肉糜，随后将其装入罐头或其他容器。典型的湿食物组合物可包含约5％至约15％的蛋白，约1％至约10％的脂肪，以及约1％至约7％的纤维。可用于湿食物组合物的非限制性成分包括鸡肉、火鸡、牛肉、白鲑、鸡肉肉汤、火鸡肉汤、牛肉肉汤、鸡肝、酿酒米、粗磨玉米粉、鱼粉、鸡蛋、甜菜浆、氯化物、亚麻粗粉、羊羔肉、牛肉副产品、鸡肉副产品以及它们的混合物。在另一个实施方案中，补充组合物如饼干、咀嚼物、以及其它制剂，所述其它制剂基于干燥物质可包含按补充组合物的重量计约20％至约60％的蛋白质，或约22％至约40％的蛋白质。又如，所述补充组合物基于干燥物质可包含按所述补充组合物的重量计约5％至约35％的脂肪，或约10％至约30％的脂肪。旨在用于猫科动物的食物和补充组合物或猫科动物通常是本领域已知的。

[0091] 伴侣动物食物可包含其他活性剂如长链脂肪酸和锌。合适的长链脂肪酸包括α-亚油酸、γ亚麻酸、亚油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。鱼油是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的合适来源。

[0092] 琉璃苣油、黑加仑种子油和月见草油是γ亚麻酸的合适来源。红花油、向日葵油、玉米油和大豆油是亚油酸的合适来源。这些油也可被用在上文的包衣中。锌可由多种合适的形式提供，例如硫酸锌或氧化锌。此外，常用于伴侣动物食物的多种成分是脂肪酸和锌的来源。已经观察到作为益生元来源的菊苣与富含亚油酸的油如大豆油的组合提供意料不到的有益效果，提示了它们的协同效应。

[0093] 当组合物为肉汁形式时，所述组合物优选地包含至少10％的肉汤或老汤，其非限制性实例包括蔬菜牛肉汤、鸡肉汤或火腿肉汤。典型的肉汁组合物可包含约0.5％至约5％的粗蛋白和约2％至约5％的粗脂肪，以及约1％至约5％的纤维。

[0094] 此外，适用于本文的补充的非限制性实例包括粉末、油悬浮液、乳基悬浮液、乳酪、可可油基组合物和药丸或胶囊。在所述组合物是药丸形式的情况下，需要合适的粘合剂以保持药丸处于紧实的固体形式。合适粘合剂的非限制性实例包括天然树胶如黄原胶、果胶、卵磷脂、海藻酸盐和其它本领域的技术人员已知的那些。在所述组合物是胶囊形式的情况下，该组合物优选地使用本领域的技术人员已知的技术进行胶囊包封。合适的胶囊包封材料的非限制性实例包括聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、海藻酸盐和明胶。酸奶基组合物可包含约1％至约5％的蛋白质，约10％至约20％的碳水化合物，约1％至约5％的纤维，约1％至约5％的脂肪和约50％至约90％的液体载体如牛奶。实施例

[0095] 给出下述实施例是为了举例说明本发明，并且不是以任何方式来限制其范围。

[0096] 实施例1：长双歧杆菌AH121A10的分离

[0097] 长双歧杆菌菌株AH121a分离自猫科动物肠组织。

[0098] 猫科动物肠样品获取自由当地兽医提供的健康猫，猫主人发起并批准安乐死。所有动物是健康的和无疾病的。解剖每只猫的结肠、中结肠、盲肠和回肠以暴露粘膜。

[0099] 在搅拌粘膜组织(涡旋处理1分钟)并随后将所述组织机械匀化后移除上清液。将每个上清液置于de Mann Rogosa Sharpe(MRS)琼脂上。在37℃下使用Anerocult GasPak系统厌氧孵育这些上清液48小时。将从所述平板中分离的菌落再划线接种到每个MRS上并在相同条件下再次厌氧培养。将分离的菌落再次划线接种4次以纯化单菌株。评估菌落形态和微观外观。测试合适分离物的革兰氏反应和过氧化氢酶活性。使用API测试(API5OCHL，25BioMerieux)进行革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性杆菌的鉴定。用0.05M磷酸盐缓冲液(pH6.5)和半胱氨酸-盐酸(500mg/L)洗涤收获的细胞两次，然后进行超声处理。离心移除细胞碎片。用NaF(6mg/mL)和碘醋酸钠(10mg/mL)在37℃下孵育上清液30分钟。用盐酸羟胺(pH6.5)在室温下孵育10分钟终止反应。在加入HCl(4M)，FeCl3.6H2O(在0.1M HCl中5％(w/v))和果糖-6-磷酸(钠盐)后监测颜色变化。从果糖-6-磷酸中形成乙酰磷酸通过其氧肟酸盐的铁螯合物形成微红色来证明。

[0100] 菌种鉴定

[0101] 进行16s基因间隔区(IGS)测序以鉴定分离的双歧杆菌菌种。简而言之，使用100μL提取液和25μL组织制备溶液(Sigma，XNAT2试剂盒)从AH121A中分离DNA。将样品在室温下孵育5分钟，然后在95℃下孵育2小时。然后加入100μL中和溶液(XNAT2试剂盒)。使用Nanodrop分光光度计对基因组DNA溶液定量并在4℃贮存。使用IGS引物进行PCR，所述引物为IGS L：5’-GCTGGATCACCTCCTTTCT-3’(SEQ ID NO.3)，其鉴定SEQ ID NO.1，以及IGS R：5’-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3’(SEQ ID NO.4)，其鉴定SEQ ID NO.2。循环条件为94℃下3min(1个循环)，94℃下30sec，53℃下30sec，72℃下30sec(28个循环)。
PCR反应包含4μL(50ng)DNA，PCR混合物(XNAT2试剂盒)，0.4μM的IGS L和R引物(MWG Biotech，Germany)。PCR反应在Eppendorf热循环仪上进行。PCR产物(10μL)与分子量标记(100bp Ladder，Roche)一起在TAE中进行2％琼脂糖EtBr染色凝胶电泳以测定IGS图谱。使用Promega Wizard PCR纯化试剂盒纯化双歧杆菌的PCR产物(单条带)。使用基因间隔区的引物序列(如上所述)为纯化的PCR产物测序。然后用序列数据搜索NCBI核苷酸数据库以通过核苷酸同源性确定菌株的同一性。所得DNA序列数据经NCBI标准核苷酸-核苷酸同源性BLAST搜索引擎(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行处理。鉴定与序列最接近的匹配，然后使用DNASTAR MegAlign软件进行序列比对。获得的序列(SEQ ID NO.1[IGS正向序列]和SEQ ID NO.2[IGS反向序列])在序列表中可见。NCIMB数据库的搜索结果表明AH121A具有与长双歧杆菌序列同源性最接近的唯一IGS(SEQ ID NO.1[正向序列]和SEQ ID NO.2[反向序列])序列。

[0102] 实施例2：刚果红琼脂筛选

[0103] 使用刚果红琼脂筛选用于EPS表达细菌菌株的表型筛选。简而言之，将细菌菌株的新生菌落无菌接种到10mL改良的Rogosa肉汤培养基(+0.05％半胱氨酸)，并在37℃厌氧培养至浑浊(约16小时至约24小时)。将肉汤培养物无菌划线接种到刚果红琼脂平板上，并在37℃厌氧培养48小时。据信EPS作为某些菌株生长和/或代谢副产物而被产生出来，EPS阻止刚果红染料的摄取，产生奶油状/白色的菌落形态。产生较少EPS的菌株容易吸收刚果红染料，产生粉红色/红色的菌落形态。不产生10EPS的菌株染上红色，在红色琼脂背景中看上去几乎是透明的。

[0104] 参见图1，长双歧杆菌AH121A的菌落形态是凸形粘液状亮白色菌落。

[0105] 实施例3

[0106] 为了测定猫科动物分离细菌AHF121A对不同浓度猪胆汁的抗性并使用不同浓度的胆汁评估猫科动物分离细菌AHF121A在pH2.5下6小时的存活率以及随后的胆汁抗性。

[0107] 实验设计：

[0108] 测试菌株是AHF121A长双歧杆菌。使用补充有猪胆汁(0.3％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、7.5％和10％)的MRS/RCA琼脂平板检查胆汁抗性。在-5min、5min、30min、
60min、120min、180min和360min时使用平板计数方法监测pH2.5下菌株的存活率。在pH2.5下挑战菌株6小时后检查胆汁抗性。

[0109] 方法：

[0110] 下文概述了测定猫科动物胆汁抗性的方法。

[0111] 在0.3％至10％范围内的不同猫科动物胆汁浓度下评估冷冻干燥细菌的存活率。

[0112] 不同浓度的合成猫科动物胆汁平板通过以下方法制备：制备45％的合成胆汁原液，在80℃热处理胆汁原液10min以杀灭任何存活的细胞。

[0113] 使用的不同胆汁浓度是：

[0114] 2％＝6.67mL胆汁原液+143.33合适的琼脂

[0115] 1％＝3.33mL胆汁原液+146.67mL琼脂

[0116] 0.5％＝1.67mL胆汁原液+148.33mL琼脂

[0117] 对于每次稀释，在高压蒸汽灭菌后移除不需要的熔融琼脂并用适当体积的胆汁原液置换。

[0118] 每日新鲜制备胆汁平板，但是其可贮存至多一周。

[0119] 每个冷冻干燥测试菌株的CFU/g通过平板涂布技术进行定量。

[0120] 通过以下方法将测试菌株点样到猪胆汁平板上：在10mL无菌PBS中重悬109CFU/mL的冷冻干燥菌株，将所述猪胆汁平板分成1/4并点样为4菌株(10μL)/板。

[0121] 在工作台上干燥所述平板30min(或者直到菌斑已经干燥进入琼脂内)并在合适条件下孵育。

[0122] 下文概述了评估在低pH环境下(pH2.5)细菌菌株存活率的方法。

[0123] 冷冻干燥粉末的计算使用平板涂布技术进行。将6M HCl加入到100mL肉汤中，调节至pH2.5以酸化培养基。记录调节所需的体积并使用无菌技术，利用相同体积的酸调节4×100mL的MRS肉汤(剩余肉汤)的pH。每个冷冻干燥测试菌株的CFU/g使用平板涂布技术进行定量。

[0124] 将109CFU/mL的冷冻干燥细菌重悬在酸化的培养基中并在合适的厌氧条件下孵育。在5min、30min、60min、120min、180min、240min和360min时移出等分试样测量存活率，并使用平板涂布技术测定CFU/ml。

[0125] 结果：

[0126] 表1：在猫科动物胆汁的存在下分离细菌的生长

[0127]

[0128] +++＝生长极好～100％

[0129] ++＝生长良好～66％

[0130] 结论：

[0131] ○表1展示猫科动物胆汁对菌株生长的效应。猫科动物细菌菌株能够忍受≤2％的猫科动物胆汁浓度。

[0132] ○图3示出了在pH2.5的酸耐受性。

[0133] 实施例4：121A对IL-10∶IL-12比率的效应

[0134] 使用BD Vacutainer CPT管(BD目录362761)，按照制造商的说明书，从健康人外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)。洗涤PBMC并将其重悬在Dulbecco′s Modified Eagle TMMedium-Glutamax (Glutamax(谷氨酰胺替代品)+丙酮酸+4.5g/L葡萄糖(Gibco目录
10569-010)10％胎牛血清(Sigma目录F4135)，以及1％青霉素/链霉素(Sigma目录P0781)
5
中。PBMC在(2×10 个细胞/孔)平底96孔板中培养，并加入20μL细菌悬浮液(浓度为
7
1×10CFU/mL)。PBMC与细菌在37℃/5％的CO2的培养箱中共5培养48小时。培养2天后，将平板以300×g离心，并且移除上清液并冷藏在-80℃直至分析。使用96孔测定试剂盒测定培养上清液中的白介素-10(IL-10)和白介素-12p70(IL-12p70)水平，该试剂盒来自Meso Scale Discovery(Gaithersburg，MD；目录K15008B-1)

[0135] 制备两种形式的细菌用于共培养实验。(a)新生的细菌在Difco MRS培养基中生长，并且在进入稳定期后收获。所有细胞在37℃厌氧条件下生长。(b)细菌在37℃厌氧条件下在Difco MRS培养基中生长并在进入稳定期后收获。这些细菌中的每个生成冻干粉，并在-80℃储存于预15等分的100mg小瓶中。在使用它们前，从冷冻机中取出每个菌株的一个等分试样并恢复至室温。每个菌株在10mL的ringer中洗涤3次，然后进行离心。每次使用新的小瓶。绘制每个生长条件下的生长曲线(OD对活细胞数)，并且通过细胞计数在加到PBMC前将洗涤细胞归一化。所有实验也包括无细菌对照。所有测定重复三次。

[0136] 图2示出菌株121A对IL-10∶IL-12诱导的效应。新生的和冷冻干燥的培养物显示出相似的效应。

[0137] 实施例5：121A对IL-10分泌的效应

[0138] 对微生物的正确免疫应答是宿主总体健康状态的重要决定因素。过度应答可能导致炎性疾病(例如结肠炎)，而不充分的应答导致病原体保持并传播。本文所述的免疫学测定法在文献中进行了充分的描述，它是用于测定响应于特定微生物的宿主免疫学活性的有用方法。

[0139] 人外周血单核细胞(PBMC-包含单核细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞)获取自健康的志愿者并用每个细菌菌株体外刺激。然后移除培养上清液并对细胞因子水平定量。

[0140] IL-10是非常重要的细胞因子，用于控制异常的前炎性免疫应答。IL-10敲除动物的结肠炎和胃肠肿瘤，并且在免疫系统内调节细胞分泌并利用IL-10以控制潜在的伤害免疫应答。因此，这种细胞因子的分泌的提高将保护不良炎活性和对病原菌的过度免疫应答。

[0141] 体外培养的外周血单核细胞(PBMC)分泌的IL-10在与每个细菌菌株共孵育48小时后进行测定。诱导IL-10分泌的菌株是AHF121A和35624，其IL-10水平相似。(图4至图6)。

[0142] 实施例6：当与人免疫系统细胞体外共培养时，双歧杆菌AH121a具有免疫调节活性，这不同于双歧杆菌AH35624。

[0143] 材料&方法

[0144] 婴儿长双歧杆菌(Bifidobacterium longum infantis)菌株UCC35624(B624)和长双歧杆菌菌株121a使用PBMC细胞因子诱导测定法进行测定。制备以下形式的细菌用于共培养实验。细菌在37℃厌氧条件下在Difco MRS培养基中生长并在进入稳定期后收获。这些细菌中的每个制成冷冻干燥粉末，并且在-80℃储存于预等分的100mg小瓶中。在使用它们前，从冷冻机中取出每个菌株的一个等分试样并恢复至室温。每个菌株在10ml的ringer中洗涤3次，然后进行离心。每次使用新的小瓶。

[0145] 使用Petroff-Hausser计数室，按照制造商的说明书进行直接显微镜计数，并且在将细胞加入PBMC测定之前，通过细胞数目进行洗涤细胞的归一化。将细菌(20μl的磷酸盐缓冲液(PBS))加到PBMC的每个孔中以提供每个实验指示的细菌总数。

[0146] PBMC(外周血单核细胞)细胞因子诱导测定

[0147] 使用BD Vacutainer CPT管(BD目录362761)，按照制造商的说明书，从健康人外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)。洗涤PBMC并将其重悬在Dulbecco′s Modified Eagle Medium-Glutamax TM(Glutamax(谷氨酰胺替代品)+丙酮酸+4.5g/L葡萄糖(Gibco目录10569-010)10％胎牛血清(Sigma目录F4135)，以及1％青霉素/链霉素(Sigma目录P0781)
5
中。PBMC在平底96孔板中(2×10 个细胞/孔)孵育并加入20μL细菌悬浮液(浓度介
6-8
于1×10 CFU/mL的范围内)。测试至多6种不同量的细菌：2.5E+08、1.0E+08、5.0E+07、
2.5E+07、1.0E+07和1.0E+06。还进行无细菌对照。所有测定重复三次。在37℃培养2天后，将平板以300×g旋转，并且移除上清液并冷藏在-80℃直至分析。将PBMC与细菌在
37℃/5％CO2的培养箱中共培养48小时。在培养上清液中的细胞因子使用96孔测定试剂盒进行测定，所述试剂盒得自Meso Scale Discovery(Gaithersburg，MD；目录K15008B-1)。
人白介素1β20(B-1β)、人白介素6(Il-β)、人白介素8(Il-8)、人白介素10(Il-10)、人白介素12p70(Il12p70)、人干扰素-γ(IFN-γ)、人肿瘤坏死因子α(TNFa)和人G-CSF被定量并报告为皮克每毫升(pg/mL)。每个样品重复测定3-5次(A至E)。

[0148] 结果

[0149] 使用PBMC细胞因子诱导测定法测定婴儿长双歧杆菌菌株UCC35624(B624)和长双歧杆菌菌株121a的免疫调节以生成扩展的剂量响应曲线，测试至多6种不同量的细菌：2.5E+08、301.0E+08、5.0E+07、2.5E+07、1.0E+07和1.0E+06。测定上清液的细胞因子范围，包括IL-β、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12、TNF-α、IFN-γ以及G-CSF。来自至多5个单个受试者(A至E)的细胞因子测量结果用平均值(+/-SEM)表示。

[0150] 通过与35624的比较，菌株121a显示具有非常相似的大多数细胞因子(包括IL-10)的诱导模式，但是IL-6和IL-8的诱导模式相当不同并且产量提高。

[0151] IL-10：在体外刺激后，与121a一起孵育诱导PBMC中的抗炎细胞因子IL-10剂量响应提高(图7)。IL-10的诱导在数量和性质上类似于与35624一起孵育。IL-10的最大9
诱导不出现在至多1.0×10 个细菌/孔的情况下。

[0152] IL-1β：在体外刺激后，与121a一起孵育诱导PBMC中的前炎性细胞因子IL-β剂量响应提高(图8)。IL-1β的诱导在数量和性质上类似于与35624一起孵育。IL-β的最9
大诱导不出现在至多1.0×10 个细菌/孔的情况下。

[0153] IL-6：在体外刺激后，与121a一起孵育诱导PBMC中的细胞因子IL-6剂量响应提高(图9)。121a与35624相比定量模式不同；121a测得的IL-6水平较高，尤其是在较低剂量的细菌/20孔情况下更是如此。

[0154] IL-8：在体外刺激后，与121a一起孵育诱导PBMC中的细胞因子IL-8剂量响应提高(图10)。121a与35624相比定量模式不同；在所有剂量的细菌/孔中121a测得的IL-8水平较高。

[0155] IL-12：在体外刺激后，与121a一起孵育诱导PBMC中的前炎性细胞因子IL-12剂量响应提高(图11)。121a和35624的IL-12调节模式是钟形的，随着细菌浓度的提高其升高到峰值然后降低。IL-12的定量模式有点容易变化，但是121a的平衡性类似于35624。

[0156] TNF-α：在体外刺激后，与121a一起孵育诱导PBMC中的前炎性细胞因子TNF-α剂量响应提高(图12)。5个重复实验中有3个TNF-α的诱导在数量和性质上类似于与35624一起孵育，较高水平的TNF-α存在于5个重复实验中的2个(参见C&E)。IL-10的
8
最大诱导出现在至多1.0×10 个细菌/孔的情况下。

[0157] INF-γ在体外刺激后，与121a一起孵育诱导PBMC中的前炎性细胞因子INF-γ剂量响应提高(图13)。INF-γ的定量模式有点容易变化，但是121a的平衡性类似于35624。

[0158] G-CSF：在体外刺激后，与121a一起孵育诱导PBMC中的细胞因子G-CSF剂量响应提高(图14)。G-CSF的诱导在数量和性质上类似于与35624一起孵育。

[0159] 实施例7：121A对树突状细胞的细胞因子产量的效应

[0160] 概述

[0161] 免疫应答严格调控的过程，其正常情况下保护生物免于感染并容忍无害的环境抗原。然而，在炎性疾病中激活的免疫应答导致慢性前炎性状态，其特征在于激活固有的免疫应答并扩增极化的T细胞亚群。目前炎性疾病的治疗集中在抑制关键的炎性调节剂或炎性细胞群。然而，这些方法仅提供对疾病症状的暂时抑制。成功的长期治疗或预防仅能通过促进调节细胞过程来提供，所述细胞过程保护生物免受前炎性应答的伤害。双歧杆菌AHF121A是益生菌微生物，其选择性地刺激IL-10从固有的免疫系统(即树突状细胞)中分泌并诱导Foxp-3正调节T细胞体外极化。体内，IL-10分泌并调节30T细胞是异常炎性应答的强抑制子。

[0162] Treg细胞

[0163] T调节(Treg)细胞在保持免疫耐受性方面的基本功能已经在众多动物模型中得到证明，其中Treg细胞的过继转移或有意扩增显示通过恢复对过敏原、自身抗原或同种异体抗原的免疫耐受性防止或治疗多个T细胞介导的疾病，包括过敏、气喘性肺部炎症、自身免疫疾病和同种异体移植排斥[8]。Treg介导的免疫抑制的多种分子机制已经描述了IL-10分泌的特殊重要性[9]。Treg细胞的功能缺失或缺陷也已经与人的高IgE综合征、嗜酸粒细胞过多和自身免疫相关联，而它们的存在已经与免疫耐受性相关联[10]。对导致或者过敏或者无害免疫的非病原环境抗原免疫应答机制的研究已经表明过敏原特异性的IL-10产生Tregs(TR1细胞)是健康个体中的主要T细胞亚群[11，12]。在养蜂季节反复暴露于蜜蜂毒液抗原的非过敏的健康养蜂人提供有价值的体内模型以确定对毒液抗原的免疫耐受性的机制[13]。在多次被蜜蜂蛰后，毒液抗原特异性TH1和TH2细胞转变为IL-10分泌TR1细胞。这与皮肤对过敏原的后期反应抑制与过敏原特异性TH1和TH2细胞抑制同时发生。一旦毒液暴露持续，所述反应被观察到并在养蜂季节结束后2个月至3个月内恢复到初始水平。

[0164] 当前正在研究设计用于增强体内Treg功能的多种方法。这些方法包括过继转移诱导型或组成型Treg细胞，并且它们的诱导通过特定辅剂或免疫调节剂进行。这些方法比常规的治疗方法更有吸引力，因为Treg细胞的抗原特异性抑制能力一般来讲不引起免疫抑制并且实际上可引起长期的体内抗原特异性调节。此外，副作用有限的个体患者特异性治疗是可能的。已经开发出或正在开发多种免疫调节剂，例如雷帕霉素、CD80/CD86：CD28协同刺激阻隔剂阿巴西普(Orencia；Bristol-myers Squibb)、非-30促分裂型抗CD3单克隆抗体、T细胞去除和抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mAbs，它们表现出对Treg细胞的直接或间接效应，这可增强或抑制它们的功能[14-18]。通过识别在小鼠模型中发炎器官中表达的过敏原或自身抗原扩增一组能够靶向器官(或连通器官的淋巴结)的Treg细胞具有选择性优势[19]。因此，器官特异性Treg细胞的转移能够有效地抑制持续的疾病，但是那些Treg细胞不一定需要确切地识别与自身攻击性效应T细胞相同的自身抗原[20]。这暗示治疗方法目的在于靶向Treg细胞臂对过敏原、自身抗原或移植抗原的免疫耐受性。研究了过继转移Treg细胞或诱导组织中Treg细胞的小分子化合物的可能性[19]，但是迄今尚未报道双盲、安慰剂对照的研究。迄今为止，过敏原-SIT是诱导人Treg细胞产生和活化的仅有的抗原特异性方法。过敏原-SIT诱导Treg和IL-10分泌TR1-样细胞，并且用糖皮质激素和β2肾上腺素能激动剂进行治疗似乎提高了这些细胞的数量和活性[21-23]。近来已经报道了调节Foxp3启动子表达的必需转录元件并且这些元件将提供用于开发新治疗剂的新目标[24，25]。

[0165] 作为新治疗剂选择的微生物

[0166] 对有意消费治疗异常炎活性的微生物或微生物代谢物的关注正在持续增加。目前受到检查的典型微生物包括双歧杆菌、乳杆菌、非病原大肠杆菌和拟杆菌菌株[26-31]。与这些微生物相关联的保护效应可能由涉及上皮细胞、树突状细胞和T细胞的多种机制调节。然而，其报道正逐渐增多的这些微生物的共有特性是它们诱导Treg细胞的能力。例如，在小鼠肠内的共生微生物的混合物(VSL#3混合型益生菌)已经显示促进粘膜Treg细胞的发育，所述Treg细胞与小鼠结肠炎模型中的炎症减轻相关联[32]。此外，消费婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)菌株促进体内的Treg细胞转化并保护宿主免遭LPS诱导的NF-kB活化，而消费罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)诱导保护小鼠免遭气道变应性的Treg细胞[33，34]。Treg细胞来源于胸腺，但是也可在包括肠粘膜在内的周边器官中被诱导出来[35，36]。在粘膜内的CD103+树突状细胞很大程度上响应于Treg细胞经由TGF-β和视黄酸依赖过程的转化[37，38]。所述转化可能由与大量共生生物相关联的胃肠特异性环境因素相关联。然而，所有共生微生物在诱导体内Treg细胞上等效是不可能的。比较多种共生生物(长双歧杆菌AH1206、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)AH1205&唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)AH102)的近来的研究已经表明长双歧杆菌AH1206诱导Treg细胞且还能够保护宿主免遭嗜酸粒细胞聚集在肺部，以及阻断小鼠模型中血清IgE的诱导[39]。其他细菌菌株在相同模型中不会有效地诱导Treg细胞且不能保护宿主免遭过敏炎。因此，Treg细胞的诱导可为健康微生物区系的关键特性，所述微生物区系保护宿主免遭对潜在过敏原的异常免疫反应。除了使用活体微生物治疗过敏外，还使用另一种令人兴奋的方法鉴定引起有益效应的微生物因子并单独使用这些分离的因子。例如，来源于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的多糖A在出现粘膜树突状细胞后促进无菌小鼠中的适当+
TH1/TH2平衡并在动物模型中经由IL-10分泌CD4T细胞保护动物不患结肠炎[29，40]。持续鉴定诱导致耐受性的树突状细胞和Treg活性的新微生物化合物无疑将产生新治疗分子供临床研究评估。

[0167] 树突状细胞的分化和成熟

[0168] 使用Ficoll密度离心和利用涂覆CD14特异性抗体的微磁珠(MiltentyiBiotec)的细胞分离的组合将人单核细胞从血液中分离出来。在所有实验中分离的CD14+细胞部分的纯度大于90％。为了产生不成熟的DC(iDC)，纯化的CD14+细胞在IL-4(R&D systems)和GM-CFS(R&D systems)的存在下培养5天以分化成髓样树突状细胞。在第6天，所述细胞保持未受刺激(iDC)，或用LPS(1mg/mL)5×105MDDC进行刺激，或用细菌细胞进行刺激24小6
时。长双歧杆菌AHF121A菌株(10∶1的细菌对DC比率(5×10)，1∶1的细菌对DC比率
5
(5×10)24小时。如预期的那样，因为施用了抗生素，在这期间未观察到细菌生长。在这时分离上清液并用Luminex多重分析平台分析IL-10和IL-12p70水平。

[0169] 分离人CD4+T细胞并与DC共培养

[0170] 通过在Lymphoprep梯度上离心白细胞层分离PBMC。使用反向选择亲和柱(R&D Systems)，按照制造商说明书分离CD4+T细胞。在分离后，洗涤所述T细胞并将其重悬在RPMI 1640culture培养基中，所述培养基补充有10％加热灭活的胎牛血清，100IU/mL的青霉素，100μg/mL的链霉素和2mmol/L的L-谷氨酰胺。通过固化抗-CD3(1μg/mL)和可溶6
解抗-CD28(5μg/mL)mAbs(Pharmingen)的组合刺激纯化的CD4+T细胞(1×10/mL)。随后，纯化的CD4+T细胞与上文DC一起培养。在48小时后，将CD4+T细胞透化并染色CD25和Foxp-3。使用流式细胞术评估细胞。

[0171] 结果显示AHF121A刺激的树突状细胞促进极化和/或扩增表达CD25和Foxp-3的调节T细胞亚群。

[0172] 益生菌具有诱导DC产生细胞因子的不同能力

[0173] 释放的细胞因子类型可能对T细胞极化具有影响。因此，在用上文的细菌处理24小时后，我们分析MoDC的IL-12p70和IL-10产量。LPS是所有测试细胞因子的强诱导剂，而AHF121A引导不同的细胞因子释放(图15)。在与LPS进行比较时，AHF121A诱导更低水平的IL-10，但是不诱导可检测水平的IL-12p70。因此AHF121A显示出降低的炎性趋势[0174] 在细胞因子产量上的差异反映出不同的T细胞极化能力

[0175] DC释放的细胞因子对促进T细胞极化成Th1、Th2、Th17或T调节细胞来说是重要的。如果观察到细胞因子产量的差异，我们进一步测试是否由AHF121A产生的MDDC具有诱导Foxp3+Tregs的潜力。DC与AHF121A一起孵育5天，然后与高纯度的同种异体天然CD4+T细胞共培养。然后通过FACS分析CD4+Foxp3+Treg细胞群。结果显示AHF121A刺激的树突状细胞促进极化和/或扩增表达CD25和Foxp-3的调节T细胞亚群。(图16)

[0176] 我们假定AHF121A产生耐受性的DC，其继而诱导CD4+Foxp3+Tregs的产生。实际上，我们证明与AHF121A一起培养的MDDC能够将CD4+CD25-T细胞转化成CD4+CD25-Foxp3+T细胞。概括地说，AHF121A通过体外上调或加强MDDC的Tregs产生施加强免疫调节效应。结果提供了10响应于体外AHF121A产生CD4+CD25-Foxp3+Tregs的证明，该效应在治疗学上可用于调节体内的炎性免疫失调。(图16)

[0177] 以前已经证明一些益生菌(即干酪乳杆菌(L.casei)和罗伊氏乳杆菌(L.reuteri))能够诱导T调节细胞的发育(32，41，42)。在3个不同的动物模型中双歧杆菌AH1206显示调节T调节细胞的有效活化。此外，消费双歧杆菌AH1206保护生物免遭嗜酸粒细胞聚集在肺部并阻断血清IgE的诱导。这里假定T调节细胞在调节过敏原特异性炎性反应方面起到重要作用(39)。动物模型中的多项研究指明CD4CD25Foxp3细胞聚集在肺部和连通的淋巴结并能够抑制过敏原诱导的嗜酸粒细胞性气道炎、粘液高分泌和气道高反应(43-48)。

[0178] 目前多项人和动物研究指明IBD由共生细菌的耐受性丧失引起；The Round and Mazmanian研究(49)表明PSA引导在保护期间Tregs的发育并治愈实验性结肠炎。这些发+现与以下研究一致：所述研究表明由Foxp3T细胞产生的诱导型IL-10对调节粘膜表面的耐受性并预防肠炎来说是重要的(49，50)。

[0179] 实施例8：组合物实例

[0180] 以下是干燥粗磨食物组合物的实例，所述组合物包含本发明的益生菌双歧杆菌。

[0181]

[0182]

[0183] 以下是湿伴侣动物食物组合物的实例，所述组合物包含本发明的益生菌长双歧杆菌。

[0184]

[0185] 以下是酸奶补充组合物的实例，所述组合物包含本发明的益生菌长双歧杆菌。

[0186]

[0187] 尽管已用具体实施方案来举例说明和描述了本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出许多其它的改变和变型。因此，随附权利要求书中旨在涵盖本发明范围内的所有这些改变和变型。

[0188] 参考文献

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[0239] 布达佩斯条约下的供专利申请用的微生物国际保藏证明

[0240]

[0241] 保藏人姓名和地址

[0242]

[0243] 适用于条约6/4(d)时，这类日期是国际保藏机构获得状态的日期表BP/4(单独页)