[0001] 本发明涉及通过使具有细胞壁局部存在性蛋白酶(cell wall-enveloped proteinase，PrtP)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、和双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌共发酵而得到的发酵乳的制造方法。

[0002] 本申请要求2008年6月11日在日本申请的日本特愿2008-152949号的优先权，并将其内容援引于此。

[0003] 已知双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌、即双歧杆菌是在人的肠道内形成的肠道菌群的优势菌种之一，具有恢复肠内细菌平衡的整肠作用、免疫增强作用、抗肿瘤作用等。

[0004] 因此，近年来，随着消费者的健康意识的提高，对双歧杆菌发酵乳等含有活双歧杆菌的食品的需求正在增加。

[0005] 双歧杆菌在乳类培养基中的增殖性差。 因此，为了使发酵乳中含有一定量的、7
例如1×10CFU/mL的双歧杆菌，通常需要添加酵母提取物等各种增殖促进物质。 但是，前述增殖促进物质通常价格昂贵，还可能有损风味。

[0006] 公开了：通过使其与除双歧杆菌以外的乳酸菌的混合发酵来改善双歧杆菌的生长性、保存存活性而不必添加前述生长促进物质等的各种方法。 关于改善制造发酵乳时的双歧杆菌的生长性的方法，例如公开了(1)一种酸奶及其制造方法，其特征在于，含有乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)及双歧杆菌属(例如参照专利文献1。 )。

[0007] 此外，关于改善发酵乳的双歧杆菌的保存存活性的方法，例如公开了(2)一种双歧杆菌发酵乳的制造方法，其特征在于，在以乳作为主要成分的培养基中，混合培养短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、以及不生成丁二酮及乙偶姻的乳酸乳球菌乳酸亚种(例如参照专利文献2。 )。

[0008] 专利文献1：日本专利第3364491号公报

[0009] 专利文献2：日本专利第3068484号公报

[0010] 发明要解决的问题

[0011] 然而，在上述(1)的方法中，未必可以说具有充分的促进双歧杆菌的生长及缩短发酵时间的效果。 另外，在存在乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种这2种菌的条件下可促进双歧杆菌的生长，但关于分别单独使用乳酸乳球菌乳酸亚种或乳酸乳球菌乳脂亚种时的效果，完全没有记载。

[0012] 另一方面，在上述(2)的方法中，通过使用由特定的双歧杆菌和特定的乳酸菌组成的混合菌，确认到增殖促进效果和存活性改善效果这两方面，但关于除短双歧杆菌以外的双歧杆菌、例如食品中通用的长双歧杆菌，完全没有记载。

[0013] 本发明的目的在于提供一种发酵乳的制造方法、及通过前述制造方法制造得到的发酵乳，其使用了能够改善双歧杆菌的增殖性的乳酸菌。

[0014] 用于解决问题的方案

[0015] 本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，使具有细胞壁局部存在性蛋白酶PrtP的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)与双歧杆菌混合发酵时，能够促进双歧杆菌的增殖，从而完成了本发明。

[0016] 即，本发明提供一种发酵乳的制造方法，其特征在于，使用具有细胞壁局部存在性蛋白酶(cell wall-enveloped proteinase，PrtP)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、和双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌使发酵底物(fermentation base)发酵。

[0017] 另外，本发明提供一种发酵乳的制造方法，在前述方法中，前述双歧杆菌属菌为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。

[0018] 另外，本发明提供一种发酵乳的制造方法，在前述方法中，前述长双歧杆菌为长双歧杆菌ATCC BAA-999菌株和/或长双歧杆菌模式菌株(type strain)ATCC15700菌株。

[0019] 另外，本发明提供通过前述任一项记载的发酵乳的制造方法制造得到的发酵乳。

[0020] 发明的效果

[0021] 根据本发明的发酵乳的制造方法，能够有效地制造含有前所未有的大量双歧杆菌、特别是长双歧杆菌的发酵乳。 另外，通过本发明的发酵乳的制造方法制造得到的发酵乳，其整肠效果更好，在健康管理上也有用。附图说明

[0022] 图1是表示将PCR产物通过电泳法进行分离并通过染色进行检测而得到的区带图案的图，所述PCR产物是以来源于乳酸乳球菌各菌株的DNA作为模板、并使用检测PrtP酶基因的引物进行PCR而得到的。

[0023] 本发明中所用的乳酸菌是具有PrtP酶的乳酸乳球菌。 PrtP酶是存在于细胞膜且活性部位露出细胞表面的酶。 作为具有PrtP酶的乳酸菌，报道了例如乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)等乳球菌属菌中若干具有PrtP的菌株。

[0024] 迄今为止，来源于乳酸乳球菌的PrtP酶中，已知的有PI型(几乎不分解α-酪蛋白，且从C末端的附近很好地分解β-酪蛋白)、PIII型(从C末端及N末端这两个方向很好地分解α-酪蛋白及β-酪蛋白)及其中间型(PI/PIII型)(例如参照Reid，JR.等，Applied and Environmental Microbiology，1994年、第60卷第3号、第801～806页。)。

[0025] 具体而言，作为来源于乳酸乳球菌的PrtP酶，可列举出NCBI(National center for Biotechnology Information)中基因序列登录号为AY542690、AY542691等的PrtP酶等。

[0026] 某种乳酸菌是否是具有PrtP酶的乳酸菌，可如下进行确认：例如利用PCR(Polymerase Chain Reaction)等基因分析技术，调查是否具有编码PrtP酶的PrtP基因。

[0027] 由于PrtP酶在细胞外具有酶活性部位，因此能够分解培养基中的蛋白质。 例如乳酸菌在乳类培养基中增殖时，PrtP酶分解乳类培养基中的乳蛋白质，提供乳酸菌的生长所需要的寡肽、氨基酸。 因此，具有PrtP酶的乳酸乳球菌具有增殖快、发酵性强的特征，在10％(W/W)还原脱脂奶粉培养基中在25～30℃的温度范围内培养16小时时，即能够使培养基凝固。 利用这种增殖性、发酵性高的特征，能够检测具有PrtP酶的乳酸乳球菌。 此外，通过检测PrtP酶活性，也能够检测具有PrtP酶的乳酸乳球菌。

[0028] 本发明中使用的乳酸乳球菌只要具有PrtP酶，则没有特别限定，优选为乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种等。 这是由于，在发酵乳等以双歧杆菌作为原料的乳制品中，它们一直以来作为原料而被使用，因此认为安全性高。 作为具有PrtP酶T的乳酸乳球菌，例如有乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676 菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株等。

[0029] 以下，对本发明中使用的具有PrtP酶的乳酸乳球菌及双歧杆菌增殖促进作用进行更详细的说明。

[0030] 1.乳酸乳球菌的菌株是否具有PrtP酶的检测

[0031] 对乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC 100676T(ATCC 19257T)菌株、乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007(NCDO 497)菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株、及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株是否具有PrtP酶进行确认。

[0032] 具体而言，在添加有0.5％乳糖及葡萄糖的Difco(注册商标)M17 Broth(Becton，Dickinson公司制造)中接种各菌株3％，在30℃下培养16小时。 通过离心分离得到菌体，使用DNeasy血液和组织试剂盒(DNeasy Blood and Tissue kit)(QIAGEN公司制造)提取DNA，通过PCR法确认是否存在PrtP基因。 PCR根据参考文献 (Journal of Appieid Microbiology、2006 年、 第 100 卷、 第 1307 ～ 1317 页。 )中记载的方法进行。 引物使用正向引物GBf(GCAAATACGGTGACGGCTGCGA)
及 反 向 引 物 GB2r(TGAGCATTATAATAGGTCTTCTTCC) 的 引 物 对、
或 正 向 引 物 GHf(CAAATACGGTGACGGCTGCTAA) 及 反 向 引 物
GH2r(TAGCATTATAATAGGTCTTCGTCA)的引物对。

[0033] 图1是表示通过电泳法分离PCR产物并通过染色检测到的区带图案的图。 图1中，“1”是分子量标准(molecular weight marker)跑出来的条带，“2”是乳酸乳球菌T乳脂亚种NBRC100676 菌株的PCR产物跑出来的条带，“3”是乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株的PCR产物跑出来的条带，“4”是乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007菌株的PCR产物跑出来的条带，“5”是乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株的PCR产物跑出来的条带，“6”是乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株的PCR产物跑出来的条带。
T
该结果确认乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676 菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株中存在PrtP基因。另一方面，确认乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株各菌株中不存在PrtP基因。

[0034] 2.乳酸乳球菌在乳类培养基中的发酵性试验

[0035] 首先，在添加有0.5％乳糖及葡萄糖的Difco(注册商标)M17 Broth(Becton，Dickinson公司制造)中接种各菌株3％，在30℃下培养16小时。 通过离心分离收集菌体，洗涤后，悬浮于与原先的培养液等量的下述组成的乳类培养基中，得到种子培养物(seed culture)。

[0036] 接着，将含有1％(W/W)葡萄糖、10％(W/W)还原脱脂奶粉的乳类培养基在95℃下杀菌30分钟，接种前述各菌株的种子培养物3％，在30℃下培养16小时。 将所得培养液骤冷，测定凝固状况、pH及所含的乳酸菌数。乳酸菌数的测定通过市售的加有BCP的平板计数琼脂培养基(荣研器材公司制造)平板来进行。

[0037] 测定结果示于表1中。具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676T菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株中，pH降低至5.0以下，培养基凝固。 另外，8
所含的乳酸菌数也为3×10CFU/g以上，获知增殖性和发酵性非常良好。 相对地，不具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007菌株、及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株的各菌株中，pH为5.5以上，培养基没有
8
凝固，乳酸菌数为1×10CFU/g以下。

[0038] [表1]

[0039]

[0040] 3.与双歧杆菌的混合培养试验

[0041] 首先，通过下述实施例1中记载的方法，调制长双歧杆菌ATCC BAA-999菌株。

[0042] 另外，在添加有0.5％乳糖及葡萄糖的Difco(注册商标)M17 Broth(Becton，Dickinson公司制造)中接种乳酸乳球菌各菌株3％，在30℃下培养16小时。 通过离心分离收集菌体，洗涤后，悬浮于与原先的培养液等量的下述组成的乳类培养基中，得到种子培养物。

[0043] 将含有1％葡萄糖(W/W)、10％(W/W)还原脱脂奶粉的乳类培养基在90℃下杀菌10分钟，接种如上所述调制的乳酸乳球菌的各菌株的种子培养物1％、和长双歧杆菌ATCC BAA-999菌株的培养物1％，在37℃下培养16小时，得到发酵乳。 将前述发酵乳骤冷，测定pH及所含的双歧杆菌数。 测定结果示于表2中。 另外，双歧杆菌数的测定通过TOS丙酸琼脂培养基(ヤクルト药品工业公司制造)平板来进行。

[0044] 测定结果示于表2中。与具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676T菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株混合培养时，pH降低至5.0以下，制得凝固8
的发酵乳，双歧杆菌数达到2×10CFU/g以上。 与此相对，与不具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株分别混合培养时，pH为5.5以上，发酵底物没有凝固，双歧杆
7
菌数为2×10CFU/g以下。

[0045] 即获知，具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌与不具有PrtP酶基因的菌相比，对双歧杆菌的增殖促进性优异，通过将具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌与双歧杆菌混合培养，能够获得双歧杆菌的增殖促进效果。

[0046] [表2]

[0047]

[0048] 4.专利文献1、2记载的乳酸菌与本发明的乳酸乳球菌的比较

[0049] 首先，通过上述3记载的方法，调制具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌乳脂亚种TNBRC100676 菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株的种子培养物。

[0050] 接着，通过下述实施例1中记载的方法，调制长双歧杆菌ATCC BAA-999菌株的培养物。

[0051] 另外，将加有0.2％(W/W)酵母提取物(Difco公司制造)的10％(W/W)还原脱脂奶粉培养基1000mL在90℃下杀菌30分钟，接种专利文献2记载的乳酸乳球菌乳酸亚种的模式菌株ATCC19435菌株的培养物30mL，在30℃下培养16小时，调制乳酸乳球菌乳酸亚种的模式菌株ATCC19435菌株的培养物。

[0052] 另外，将10％(W/W)还原脱脂奶粉培养基在90℃下杀菌10分钟，接种如上T所述调制的乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676 菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株、或乳酸乳球菌乳酸亚种的模式菌株ATCC19435菌株的培养物1％、和长双歧杆菌ATCC BAA-999菌株的培养物1％，在37℃下培养16小时，得到发酵乳。将前述发酵乳骤冷，测定pH及所含的双歧杆菌数。

[0053] 另一方面，将10％(W/W)还原脱脂奶粉培养基在90℃下杀菌10分钟，接种如上所述调制的长双歧杆菌ATCC BAA-999菌株的培养物1％、和专利文献1记载的乳酸乳球菌乳酸亚种以及乳酸乳球菌乳脂亚种的混合物“EZAL MA14”(Rhodia公司制造)2％，在37℃下培养至pH达到4.6，同样地测定所得到的发酵乳的双歧杆菌数。 另外，“EZAL MA14”是相当于专利文献1中记载的“EZAL MR014”(Rhodia公司制造)的混合物。

[0054] 测定结果示于表3中。具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676T菌8
株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株中，双歧杆菌数达到3×10CFU/g左右。 与此相对，使用“EZAL MA14”的发酵乳中，pH降低至5.0以下，发酵底物凝固，但从将发
6
酵乳稀释至10 倍的稀释溶液中完全未检测到双歧杆菌，判断前述发酵乳中所含的双歧杆
6
菌数为1×10CFU/g以下。

[0055] 即明确，将专利文献1记载的乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种与长双歧杆菌混合培养时，不能充分得到促进双歧杆菌的生长及缩短发酵时间的效果。

[0056] 另外，在使用专利文献2记载的乳酸乳球菌乳酸亚种的模式菌株ATCC19435菌株的发酵乳中，即使进行16时间发酵，pH也为5.0以上，且未凝固，没有形成发酵乳。8
发酵结束后的双歧杆菌数为1×10CFU/g以下，与本发明的具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌菌株相比，双歧杆菌的增殖促进作用明显较弱。

[0057] 从这些结果获知，具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌即乳酸乳球菌乳脂亚种TNBRC100676 菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株对双歧杆菌属菌的增殖促进作用优异。

[0058] [表3]

[0059]

[0060] 本发明中，通过将具有PrtP酶的乳酸乳球菌与双歧杆菌混合培养，能够得到双歧杆菌的增殖促进效果，其原因并不清楚，推测是由于：利用乳酸乳球菌所具有的PrtP，使得乳类培养基中的乳蛋白质水解，从而得到具有双歧杆菌增殖促进作用的寡肽。

[0061] 本发明中所用的双歧杆菌没有特别限定，但优选为长双歧杆菌。 这是由于，具有PrtP酶的乳酸乳球菌所带来的增殖促进效果更为显著。 特别优选为长双歧杆菌ATC C BAA-999菌株、长双歧杆菌模式菌株ATCC 15700菌株。

[0062] 本发明中，具有PrtP酶的乳酸乳球菌、双歧杆菌的预培养时所用的培养基只要是通常使用的培养基，则没有特别限定，优选为乳类培养基。 由于处理简便，而特别优选还原脱脂奶粉培养基。前述还原脱脂奶粉培养基的浓度优选为3％(W/W)以上，特别优选为8％(W/W)以上。此外，可在预培养时所用的培养基中添加酵母提取物等生长促进物质、L-半胱氨酸等还原剂等。 尤其由于双歧杆菌在乳类培养基中的增殖性低，因此优选添加有生长促进物质的培养基。 例如可使用含有0.1～1％(W/W)的酵母提取物的培养基。另外，预培养时所用的培养基使用经杀菌处理的培养基。 前述杀菌处理可通过通常使用的方法来进行，例如可通过80～122℃下5～40分钟、优选85～95℃下5～35分钟的加热处理来进行。

[0063] 本发明中，使用双歧杆菌和具有PrtP酶的乳酸乳球菌的发酵中所用的发酵底物只要是发酵乳的制造中通常使用的底物，则没有特别限定。 前述底物可如下进行调制：例如，在奶牛乳、脱脂乳、鲜奶油、黄油、全脂奶粉、脱脂奶粉等中根据需要配合蔗糖等甜味料、果胶、果实、果汁、琼脂、明胶、油脂、香料、着色剂、稳定剂、还原剂等，根据常规方法进行杀菌、均质化、冷却等。

[0064] 双歧杆菌与乳酸乳球菌的引子在发酵底物中的接种比率没有特别限定，优选100∶1～1∶10，特别优选10∶1～1∶1。 另外，添加至发酵底物中的量也没有特别限定，双歧杆菌与乳球菌属菌的总计添加量，优选相对于发酵底物为0.01～10(V/V)％，特别优选为0.1～5(V/V)％。

[0065] 本发明中所用的乳酸菌中，在不阻碍乳酸乳球菌对双歧杆菌的生长促进效果及保存存活性促进效果的范围内，除双歧杆菌和乳酸乳球菌以外，还可含有其他乳酸菌。前述其他乳酸菌只要是通常发酵乳的制造中使用的乳酸菌，则没有特别限定，优选嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。 关于双歧杆菌和乳酸乳球菌的总计摄取量与其他乳酸菌的总计摄取量的、作为引子向发酵底物的接种比率，只要不阻碍乳酸乳球菌对双歧杆菌的效果，则没有特别限定，优选1000∶1～10∶1。

[0066] 本发明的发酵乳的制造方法中的混合培养的温度优选为30℃～40℃，特别优选为36℃～38℃。这是由于，其是双歧杆菌和本发明中使用的乳酸乳球菌这两者能够充分生长的温度范围。 另外，培养时间根据所制造的发酵乳的种类而适当决定，优选5～18小时。

[0067] 培养后所得发酵乳可直接作为食品，例如也可均质化而加工成液状。 此外，也可适当添加例如果汁、果实等。 另外，向容器中的填充等没有特别限定，可通过通常使用的方法来进行。实施例

[0068] 接下来，示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。

[0069] [实施例1]

[0070] 将10％(W/W)还原脱脂奶粉培养基1000mL在90℃下杀菌30分钟，接种30mLT乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676 菌株的种子培养物，在25℃下培养16小时。 另一方面，将加有0.2％(W/W)酵母提取物的11％(W/W)脱脂奶粉培养基1000mL在90℃下杀菌30分钟，接种100mL长双歧杆菌ATCC BAA-999菌株的种子培养物，在37℃下培养6小时。

[0071] 此外，将脱脂奶粉、全脂奶粉及蔗糖等原料混合溶解，并将由乳脂肪0.5％(W/W)、非脂乳固体成分8.0％(W/W)、蔗糖8.0％(W/W)、果胶0.2％(W/W)组成的底物50L在90℃下杀菌10分钟，冷却至40℃。在前述经杀菌的底物中接种如上所述进行了预T
培养的乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676 的培养物50mL和长双歧杆菌ATCC BAA-999菌株的培养物500mL，在37℃下培养16小时，得到发酵乳。 立即将前述发酵乳搅拌冷却，以15MPa的压力将冷却发酵乳均质化，填充至200mL容量的玻璃容器中，密封，得
8
到酸乳饮料。 所得酸乳饮料的乳酸酸度为0.7％，pH为4.6，含有5.0×10CFU/g的双歧
8
杆菌。该前述酸乳饮料在10℃下保存14天时的双歧杆菌数为2.5×10CFU/g，存活率为
50％。

[0072] [实施例2]

[0073] 将加有1％葡萄糖的10％(W/W)还原脱脂奶粉培养基1000mL在90℃下杀菌30分钟，接种30mL乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株的种子培养物，在25℃下培养
16小时。 另一方面，将加有0.2％(W/W)酵母提取物的11％(W/W)脱脂奶粉培养基
1000mL在90℃下杀菌30分钟，接种100mL短双歧杆菌ATCC15700菌株的种子培养物，在37℃下培养16小时。 另外，将10％(W/W)还原脱脂奶粉培养基1500mL在90℃下杀菌30分钟，接种嗜热链球菌(ハンゼン公司制造)和保加利亚乳杆菌(ハンゼン公司制造)的混合培养物50mL，在37℃下培养5小时。

[0074] 此外，将由乳脂肪3.0％(W/W)、非脂乳固体成分9.0％(W/W)组成的生乳50L加热至70℃，以15MPa的压力进行均质化后，在90℃下杀菌10分钟，冷却至40℃。 在前述经杀菌的底物中接种如上所述进行了预培养的乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株的培养物500mL、短双歧杆菌ATCC15700菌株的培养物500mL、及嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的混合培养物5mL，填充至容积500mL的树脂容器中，密封，在37℃下培养6小8
时后，立即冷却。 所得发酵乳的乳酸酸度为0.7％，pH为4.6，含有4.8×10CFU/g的双
8
歧杆菌。该前述发酵乳在10℃下保存14天时的双歧杆菌数为1.8×10CFU/g，存活率为
38％。

[0075] 产业上的可利用性

[0076] 根据本发明的制造方法，能够制造含有前所未有的大量活双歧杆菌的发酵乳，因此，能够利用于发酵乳等的制造领域中。